Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 208/2001 Sb., účinné od 22. 6. 2001

Předchozí stránka

Bakterie se působení testované látky vystaví jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti vhodného systému metabolické aktivace. Nejčastěji se používá kofaktorem suplementovaná post-mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců po indukci enzymů látkami jako je Aroclor 1254 (1) (2) nebo kombinace fenobarbitalu a (β-naftoflavonu (18) (20) (21). Post-mitochondriální frakce se obvykle používá v koncentracích mezi 5 a 30 % v/v ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému mohou záviset na třídě testované chemikálie. V některých případech může být vhodné použít post-mitochondriální frakci v několika koncentracích. U azobarviv a diazosloučenin může být vhodnější použít redukční systém metabolické aktivace (6) (13).

1.5.1.4 Testovaná látka / příprava
Pevné látky se před působením na bakterie rozpustí nebo se připraví jejich suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné látky se mohou do pokusného systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stabilitě prokazují, že jejich delší skladování je přijatelné.

1.5.2 Podmínky testu

1.5.2.1 Pokusné kmeny (viz 1.5.1.1.)
1.5.2.2 Koncentrace
Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.
Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.
Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.
Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půllogaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

1.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.

U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.

Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:

Látka	CAS	EINECS
9,10-dimethylantracen	781-43-1	212-308-4
7,12-dimethylbenz[a]antracen	57-97-6	200-359-5
benz[a]pyren	50-32-8	200-028-5
2-aminoantracen	613-13-8	210-330-9
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4

Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:

Látka CAS EINECS
Kongo červeň 573-58-0 209-358-4

Látka	CAS	EINECS
Kongo červeň	573-58-0	209-358-4

2-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.

Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:

Látka	CAS	EINECS
azid sodný	26628-22-8	247-852-1	TA 1535 a TA 100
2-nitrofluoren	607-57-8	210-138-5	TA 98
9-aminoakridin	90-45-9	201-995-6	TA 1537, TA 97 a TA 97a
ICR 191	17070-45-0	241-129-4	TA 1537, TA 97 a TA 97a
kumen-hydroperoxid	80-15-9	201-254-7	TA 102
mitomycin C	50-07-7	200-008-6	WP2 uvrA a TA 102
N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin	70-25-7	200-730-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
4-nitrochinolin-1-oxid	56-57-5	200-281-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
Furylfuramid (AF2)	3688-53-7		kmeny obsahující plazmidy

K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.

Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.

1.5.3 Postup
Při klasické miskové metodě (1) (2) (3) (4) bez metabolické aktivace se obvykle smísí 0,05 nebo 0,1 ml testovaného roztoku, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující zhruba 10⁸ životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru a 2,0 ml vrchního agaru. V testech s metabolickou aktivací se obvykle mísí 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství post-mitochondriální frakce (v rozmezí 5 - 30 % v/v v metabolické aktivační směsi) s 2,0 ml vrchního agaru společně s bakteriemi a testovanou látkou /testovaným roztokem. Obsah každé zkumavky se promísí a nalije na povrch misky s minimálním agarem. Vrchní agar se nechá před inkubací ztuhnout.
Při preinkubační metodě (2) (3) (5) (6) se testovaná látka / testovaný roztok nechá preinkubovat s pokusným kmenem (obsahujícím zhruba 10⁸ životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) obvykle po dobu 20 min nebo déle při 30 - 37 °C; potom se smísí s vrchním agarem a nalije na misku s minimálním agarem. Obvykle se mísí 0,05 nebo 0,1 ml testované látky / testovaného roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky se během preinkubace provzdušňují třepáním.
Pro adekvátní odhad variací se pro každou dávku očkují tři misky. Duplicitní očkování je přijatelné, je-li vědecky zdůvodněno. Dojde-li náhodně ke ztrátě misky, nemusí to test nutně znehodnotit.
Plynné nebo těkavé látky se testují za použití vhodných postupů, například v zatavených nádobách (12) (14) (15) (16).

1.5.4 Inkubace
Všechny misky v rámci daného testu se inkubují při teplotě 37°C po dobu 48 - 72 hodin, načež se spočítají revertantní kolonie na každé misce.

2. ÚDAJE
1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
  Údaje se prezentují jako počet revertantních kolonií na jednu misku. Rovněž se uvede počet revertantních kolonií jak z negativní kontroly (rozpouštědlo, popřípadě kontrola bez působení, byla-li použita), tak z kontroly pozitivní. Pro testovanou látku i pro pozitivní a negativní kontrolu (resp. bez působení rozpouštědlo) se uvedou počty pro jednotlivé misky a průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku včetně směrodatné odchylky.
  Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musejí potvrdit případ od případu. Pokud se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba to zdůvodnit. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci studijních parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. Ke studijním parametrům, které se dají modifikovat, patří rozdíly mezi koncentracemi, metoda působení („plate incorporation“ nebo preinkubace v tekutém prostředí) a podmínky metabolické aktivace.
1. 2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
  Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například dávkově závislý nárůst ve sledovaném rozmezí a/nebo reprodukovatelný nárůst počtu revertantních kolonií na jednu misku při jedné nebo více koncentracích u minimálně jednoho kmene s metabolickým aktivačním systémem nebo bez něj (23). Jako první se uvažuje biologická relevance výsledků. Jako pomůcku při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody (24), statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní reakci.
  Testovaná látka, jejíž výsledky výše uvedená kritéria nesplňují, se v tomto testu považuje za nemutagenní.
  Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
  Pozitivní výsledky bakteriálního testu na reverzní mutace ukazují, že látka vyvolává genové mutace typu substitucí bází nebo posunových mutací v genomu Salmonella typhimurium resp. Escherichia coli. Negativní výsledky ukazují, že za daných zkušebních podmínek není testovaná látka ve zkušebním druhu mutagenní.

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby rozpouštědla,
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v tomto rozpouštědle, pokud je známa.
  1. Kmeny:
    1. - použité kmeny,
    2. - počet buněk v kultuře,
    3. - charakteristika kmene.,
  1. Podmínky pokusu:
    1. - množství testované látky na jednu misku (v mg nebo μl) se zdůvodněním volby dávky a počtu misek pro jednu koncentraci,
    2. - použitá média,
    3. - typ a složení sytému metabolické aktivace (včetně kritérií akceptovatelnosti),
    4. - postupy působení (zpracování).
  1. Výsledky:
    1. - známky toxicity,
    2. - známky srážení,
    3. - počty na jednotlivých miskách,
    4. - průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku a směrodatná odchylka,
    5. - vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
    6. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
    7. - údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
    8. - údaje z historických negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
    Diskuse výsledků.
    Závěry.“.

4. Metoda B.17 zní:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO

1. METODA

Metoda je replikací OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).

1.1 ÚVOD
Test genových mutací in vitro se dá používat ke zjišťování genových mutací vyvolaných chemickými látkami. Mezi vhodné buněčné linie patří myší lymfomové buňky L5178Y, linie CHO, CHO-AS52 a V79 buněk čínského křečka a lidské lymfoblastoidní buňky TK6 (1). U těchto buněčných linií se nejčastěji jako konečný genetický efekt zjišťují mutace v thymidinkináze (TK) a hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáze (HPRT) a v transgenní xanthin-guanin fosforibosyltransferáze (XPRT). Testy mutací v TK, HPRT a XPRT se zjišťují různá spektra genetických změn. Autosomální lokalizace TK a XPRT může umožnit detekci i takové genetické změny (např. velké delece), které se na lokusu HPRT chromozomů X nezjistí (2) (3) (4) (5) (6).
K testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro se dají použít kultury stabilizovaných buněčných linií nebo buněčných kmenů. Při volbě buněk se berou v úvahu růstové schopnosti dané kultury a stabilita frekvence spontánních mutací.
Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Takový systém metabolické aktivace nedokáže imitovat savčí podmínky in vivo dokonale. Je třeba vzniku takových podmínek, za kterých by výsledky neodrážely vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledkům, jež nejsou důsledkem vlastní mutagenity může dojít v důsledku změny pH, osmolality či vysoké cytotoxicity (7).
Tento test se používá ke screeningu možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada sloučenin, které jsou v tomto testu pozitivní, jsou savčími karcinogeny, neexistuje však dokonalá korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu chemické látky a existuje stále více dokladů toho, že existují karcinogeny, které se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí nějakým jiným, negenotoxickým mechanismem či mechanismem, který v bakteriálních buňkách nepůsobí (6).

1.2 DEFINICE
Forward mutace: genová mutace výchozího typu mutantní formy, jež vede ke změně nebo ztrátě enzymatické aktivity kódovaného proteinu.
Mutageny vyvolávající substituci páru bází: látky způsobující substituci jednoho nebo několika páru bází v DNA.
Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace): látky, jež způsobují přidání nebo ztrátu jednoho nebo více párů bází v DNA.
Doba fenotypické exprese: období, během kterého jsou z nově zmutovaných buněk odstraňovány nezměněné genové produkty.
Frekvence mutací: počet pozorovaných mutovaných buněk dělený počtem živých buněk.
Relativní celkový růst: nárůst počtu buněk v čase v porovnání s kontrolní populací buněk; vypočítává se jako součin poměrného suspenzního růstu (v porovnání s negativní kontrolou) a poměrné klonovací účinnosti cloning efficiency (v porovnání s negativní kontrolou).
Relativní suspenzní růst: poměrný nárůst počtu buněk během období exprese v porovnání s negativní kontrolou.
Životnost (viabilita): klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk v době inokulace na miskách v selekčních podmínkách po období exprese.
Přežití: klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk inokulovaných na miskách na konci působení látky; vyjadřuje se obvykle v porovnání s přežitím kontrolní buněčné populace.

1.3 PRINCIP METODY
Buňky, deficientní na thymidinkinázu (TK) v důsledku mutace TK^+/-→ TK^-/-, jsou rezistentní vůči cytotoxickému působení pyrimidinového analogu trifluorthymidinu (TFT). Buňky produkující thymidinkinázu jsou vůči TFT citlivé, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Za přítomnosti TFT proto mohou proliferovat mutované buňky, zatímco normální buňky, obsahující thymidinkinázu, proliferovat nemohou. Podobně jsou buňky s deficientní HPRT nebo XPRT selekčně rezistentní vůči 6-thioguaninu (TG) nebo 8-azaguaninu (AG). Pokud je analog báze nebo sloučenina příbuzná se selekčním činidlem analyzována v některém testu na genové mutace v savčích buňkách, je třeba vlastnosti testované látky bedlivě zvážit. Například je třeba prozkoumat každé podezření na selekční toxicitu testované látky vůči buňkám s mutacemi i bez nich. Testují-li se tedy chemikálie strukturně příbuzné se selekčním činidlem, je třeba potvrdit, že je selekční systém/činidlo vhodné (8).
Buňky v suspenzi nebo jednovrstevné kultuře se po vhodnou dobu vystaví působení testované látky s metabolickou aktivací i bez ní a kultivují se ke stanovení cytotoxicity a k detekci fenotypické exprese před výběrem mutantů (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxicita se stanoví obvykle hodnocením relativní klonovací účinnosti (přežití) (cloning efficiency) nebo relativního celkového nárůstu kultur po působení látky. Kultury se ponechají v růstovém médiu po dostatečnou dobu, charakteristickou pro daný lokus a typ buňky, aby mohlo dojít k co nejoptimálnější fenotypické expresi indukovaných mutací. Frekvence mutantů se stanoví inokulací známého počtu buněk v médiu obsahujícím selekční činidlo pro detekci mutovaných buněk a v médiu bez tohoto činidla, ke stanovení klonovací účinnosti (cloning efficiency), (životnosti). Po vhodné inkubační době se kolonie spočítají. Mutační frekvence se odvodí z počtu kolonií mutovaných buněk v selekčním médiu a z počtu kolonií v neselekčním médiu.

1.4 POPIS METODY

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Buňky
  Dá se použít celá řada buněčných typů, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 a TK6. U buněčných typů používaných v tomto testu musí být prokázaná citlivost vůči chemickým mutagenům, vysoká klonovací účinnost (cloning efficiency) a stabilní frekvence spontánních mutací. U buněk se kontroluje, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty; infikované buňky se použít nesmějí.
  Test je třeba naplánovat tak, aby měl zvolenou citlivost a efektivnost (power). Počet buněk, počet kultur a koncentrace testované látky musí těmto definovaným parametrům vyhovovat (14). Minimální počet vitálních buněk, které přežijí expozici a použijí se v jednotlivých stadiích testu, je dán frekvencí spontánních mutací. Obecným vodítkem je, že počet buněk má být minimálně desetinásobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací. Doporučuje se však použít alespoň 10⁶buněk. Měly by být k dispozici adekvátní historické údaje, kterými by se prokázala bezproblémové zvládnutí testu.
1. 1.4.1.2 Média a kultivační podmínky
  Je třeba použít vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentraci CO₂, teplotu a vlhkost). Média se pro test volí podle selekčního systému a typu buňky. Zvláště důležité je, aby podmínky kultivace zajišťovaly optimální růst buněk během expresní periody a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.
1. 1.4.1.3 Příprava kultur
  Buňky se namnoží ze zásobních kultur, inokulují do kultivačního média a inkubují při teplotě 37°C. Před provedením testu, je třeba kultury zbavit dříve vzniklých mutovaných buněk.
1. 1.4.1.4 Metabolická aktivace
  Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18), nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu (19) (20).
  Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 - 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná chemikálie. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.
  Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1. 1.4.1.5 Příprava testované látky
  Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

1.4.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10-20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 1,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem.. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

1.4.2.3 Kontroly

V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO
Metabolická aktivace	Lokus	Látka	CAS	EINECS
Ne	HPRT	ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
	HPRT	ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
	TK (malé a velké kolonie)	methyl methansulfonát	66-27-3	200-625-0
	XPRT	ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
	XPRT	ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
Ano	HPRT	3-methylcholantren	56-49-5	200-276-4
		N-nitrosodimethylamin	62-75-9	200-549-8
		7,12-dimethylbenzantracen	57-97-6	200-359-5
	TK (malé a velké kolonie)	cyklofosfamid	50-18-0	200-015-4
		monohydrát cyklofosfamidu	6055-19-2
		benzo[a]pyren	50-32-8	200-028-5
		3 -methylcholantren	56-49-5	200-276-5
	XPRT	N-nitrosodimethylamin (pro vysoké koncentrace S-9)	62-75-9	200-549-8
	XPRT	benzo[a]pyren	50-32-8	200-028-5

Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historickou údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.

1.4.3 Postup
1. 1.4.3.1 Expozice testovanou látkou
  Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3-6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.
  Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.
  V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob (21, 22).
1. 1.4.3.2 Hodnocení přežívání, viability a mutační frekvence
  Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.
  Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 – 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.
  Pokud je látka v testu L5178Y TK⁺/^- pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s TK6TK⁺/^-.

2. ÚDAJE
1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
  Jako data slouží výsledky stanovení cytotoxicity a životnosti, počty kolonií a mutační frekvence u experimentálních a kontrolních kultur. V případě pozitivní reakce v testu L5178TK⁺/^- se kolonie hodnotí pomocí kritérií malých a velkých kolonií přinejmenším v jedné koncentraci testované látky (nejvyšší pozitivní koncentrace) a v negativní a pozitivní kontrole. Molekulární a cytogenetické vlastnosti velkých i malých kolonií byly podrobně prostudovány v publikacích (23) (24). Při testu TK⁺/^- se kolonie hodnotí podle kritéria kolonií normálního růstu (velké) a pomalého růstu (malé) (25). Mutanty, které utrpěly nejrozsáhlejší genetické poškození, mají delší dobu zdvojení a proto tvoří malé kolonie. Rozmezí tohoto poškození obvykle sahá od ztráty celého genu po karyotypicky viditelné chromozómové aberace. Tvorba malých kolonií je asociována s expozicí látkám indukujících hrubé chromozómové aberace (26). Méně závažně postižené mutanty rostou podobnou rychlostí jako buňky rodičovské a vytvářejí velké kolonie.
  Je třeba uvádět také přežití (relativní klonovací účinnost - relative cloning efficiency) nebo relativní celkový růst. Mutační frekvence se vyjadřuje jako počet mutovaných buněk dělený počtem přežívajících buněk.
  Uvádějí se individuální údaje o kultivačních podmínkách; nakonec se všechna data shrnou v tabelární formě.
  Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musí potvrdit případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba podat zdůvodnění. V případě nejednoznačných nebo negativních výsledků je třeba v následných experimentech zvážit modifikaci parametrů studie tak, aby se rozšířilo rozmezí podmínek. K parametrům, které se dají v experimentu modifikovat, patří rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a podmínky metabolické aktivace.
1. 2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
  Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislý nárůst nebo reprodukovatelný nárůst mutační frekvence. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní. Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
  Pozitivní výsledky testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích buněk genové mutace. Nejprůkaznější je reprodukovatelný pozitivní efekt dávka-účinek. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích buněk nevyvolává genové mutace.

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula,
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Buňky:
    1. - typ a zdroj buněk,
    2. - počet buněčných kultur,
    3. - případně počet pasáží,
    4. - případně metody kultivace buněčné kultury,
    5. - absence mykoplazmat.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - zdůvodnění volby použitých koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a limitech v rozpustnosti, jsou-li k dispozici,
    2. - složení média, koncentrace CO₂,
    3. - koncentrace testované látky,
    4. - objem vehikula a přidané testované látky,
    5. - inkubační teplota,
    6. - doba inkubace,
    7. - doba působení látky,
    8. - hustota buněk během působení látky,
    9. - typ a složení systému metabolické aktivace, včetně kritérií akceptovatelnosti,
    10. - pozitivní a negativní kontroly,
    11. - délka expresní periody (případně včetně počtu inokulovaných buněk, subkultur )
    12. - selekční činidla,
    13. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná,
    14. - metody zjišťování počtu živých a mutovaných buněk,
    15. - definice kolonií, u nichž se hodnotí velikost a typ (včetně případných kritérií pro rozlišování mezi „malými“ a „velkými“ koloniemi).
  1. Výsledky:
    1. - známky toxicity,
    2. - známky srážení,
    3. - údaje o pH a osmolalitě během působení testované látky, jsou-li stanoveny,
    4. - velikost kolonií, je-li hodnocena, minimálně pro negativní a pozitivní kontrolu,
    5. - případné možnosti laboratoře zjistit malé kolonie mutantů pomocí systému L5178Y TK⁺/^-
    6. - vztah dávka- účinek, je-li to možné,
    7. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
    8. - souběžné údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol,
    9. - historické údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol, včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
  Diskuse výsledků.
  Závěry.“.

5. Metoda B.23 zní:

„B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH

1. METODA

Metoda je replikací OECD TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).

1.1 ÚVOD
Účelem testu je in vivo identifikovat látky způsobující strukturální chromozómové aberace v savčích spermatogoniích (1) (2) (3) (4) (5). Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Tato metoda není určena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou u člověka příčinou řady genetických chorob.
Tímto testem se analyzují chromozómové aberace v spermatogoniích a proto se předpokládá, že dokáže predikovat indukci dědičných mutací v zárodečných buňkách.
K testu se obvykle používají hlodavci. Tímto cytogenetickým testem in vivo se zjišťují chromozómové aberace v mitózách spermatogonií.Tato metoda nepoužívá jiné cílové buňky.
Aby se ve spermatogoniích zjistily aberace chromatidového typu, je třeba analyzovat první mitózu po působení testované látky, dříve než se poškození ztratí v následujícím buněčném dělení. Další informace z ovlivněných spermatogonií lze získat analýzou meiotických chromozómů, kde se zjišťují aberace chromozómového typu v diakinéze I, když se ovlivněné buňky mění ve spermatocyty.
Tento test in vivo je určen ke zjišťování, zda jsou mutageny aktivní v somatických buňkách také aktivní v buňkách zárodečných. Mimoto má test význam také pro hodnocení rizika mutagenity tím, že umožňuje posuzovat faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a reparačních procesů DNA.
V testes je přítomna řada generací spermatogonií se širokým spektrem citlivosti vůči chemickým látkám. Zjištěné aberace tedy představují souhrn reakcí ovlivněných populací spermatogonií, kde převládají diferencované spermatogonie. Podle jejich polohy ve varleti pak různé generace spermatogonií mohou, ale nemusejí být exponovány krevním oběhem kvůli anatomické a fyziologické bariéře Sertoliho buněk a hemato-testikulární bariéře.
Existují-li doklady toho, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není tato látka pro test vhodná.

1.2 DEFINICE
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty, a výměny.

1.3 PRINCIP METODY
Zvířata se vhodným způsobem exponují testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Ze zárodečných buněk se pak připraví preparáty a po obarvení se v metafázích analyzují chromozómové aberace.

1.4 POPIS METODY

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Běžně se používají samci čínských křečků a myší, lze ovšem použít samce jakéhokoliv jiného vhodného savčího druhu. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1. 1.4.1.2 Podmínky chovu
  Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.
  Vlhkost by měla být 50 - 60 %.
1. 1.4.1.3 Příprava zvířat
  Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.
1. 1.4.1.4 Příprava dávek
  Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo / vehikulum
Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

1.4.2.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly ve spermatogoniích vykazovat chromozómové aberace in vivo při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň.

Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu.

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO „B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH
Látka	CAS	EINECS
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
cyklohexylamin	108-91-8	203-629-0
mitomycin C	50-07-7	200-008-6
akrylamid monomer	79-06-1	201-173-7
triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s aberacemi a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky

1.5 POSTUP
1. 1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
  V každé zkušební a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných samců.
1. 1.5.2 Dávkovací schéma
  Testovaná látka se podává nejlépe jednorázově nebo ve dvou dávkách. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace rozdělit, tj. na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.
  V případě skupiny s nejvyšší dávkou se vzorky po expozici látce odebírají dvakrát. Jelikož testovaná látka může ovlivňovat kinetiku buněčného dělení, provádí se jeden dřívější a jeden pozdější odběr zhruba 24 a 48 hodin po expozici. U ostatních dávek (tj. mimo dávku nejvyšší) se odběr vzorků provádí po 24 hodinách nebo po 1,5-násobku délky buněčného cyklu po expozici, ledaže je znám vhodnější časový interval pro detekci účinku (6).
  Kromě toho mohou být použity jiné časové intervaly odběru vzorků. Např. jedná-li se o látku zpomalující pohyb chromozómů během mitósy, nebo látku s účinky nezávislými na S-fázi cyklu, jsou vhodnější dřívější doba odběru vzorku (1).
  Zda je vhodné nechat látku působit opakovaně, se posuzuje případ od případu. Pokud se provádí aplikace látky opakovaně, usmrcují se zvířata po 24 hodinách (1,5-násobku buněčného cyklu) od poslední aplikace. Odběry lze provádět i v dalších intervalech, považuje-li se to za účelné.
  Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3-5 hodin, u čínských křečků zhruba 4-5 hodin.
1. 1.5.3 Dávkování
  Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii (7). Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější čas odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální.
  Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity ve spermatogoniích (např. pokles poměru mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi; tento pokles nemá být vyšší než 50 %).
1. 1.5.4 Limitní test
  Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Podle očekávané humánní expozice se může použít v limitním testu vyšší dávky.
1. 1.5.5 Aplikace látky
  Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.
1. 1.5.6 Příprava chromozómů
  Okamžitě po usmrcení zvířete se připraví z jednoho nebo z obou varlat připraví buněčná suspenze, na kterou se působí hypotonickým roztokem a fixuje se. Buněčná suspenze se nakape na podložní sklo a obarví.
1. 1.5.7 Analýza
  U každého jedince se analyzuje minimálně 100 dobře rozprostřených metafází (tj. minimálně 500 metafází v jedné skupině). Tento počet se dá snížit, je-li počet pozorovaných aberací vysoký. Všechny mikroskopické preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven číslu 2n ± 2.

2. ÚDAJE
1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
  Údaje z jednotlivých zvířat se prezentují v tabelární formě. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého jedince se vyhodnocuje počet buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi a počet aberací na jednu buňku. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť, uvádějí se, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.
  Je-li analyzována mitóza i meióza, stanoví se u všech pokusných zvířat i zvířat z negativní kontroly jakožto míra cytotoxicity poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi, a to tak, že se z každého jedince použije 100 dělících se buněk. Je-li analyzována pouze mitóza, stanoví se mitotický index u minimálně 1000 buněk z každého jedince.
1. 2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině ovlivněné jednorázovou dávkou a s jedním časovým intervalem odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody (8); statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů.
  Pozitivní výsledky testu ukazují, že testovaná látka vyvolává v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.
  Je třeba diskutovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo / vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby vehikula,
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Pokusná zvířata:
    1. - použitý živočišný druh/kmen,
    2. - počet a věk zvířat,
    3. - původ, chovné podmínky, strava apod.,
    4. - hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - údaje ze studie pro určení rozpětí toxicity, byla-li provedena,
    2. - zdůvodnění volby velikosti dávek,
    3. - zdůvodnění způsobu aplikace látky,
    4. - podrobnosti o přípravě testované látky,
    5. - podrobnosti o podávání testované látky,
    6. - zdůvodnění doby usmrcení zvířat,
    7. - případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti /den),
    8. - podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
    9. - podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
    10. - metody zjišťování toxicity,
    11. - látka blokující metafázi, její koncentrace a délka působení,
    12. - metody přípravy mikroskopických preparátů
    13. - kritéria pro hodnocení aberací,
    14. - počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,
    15. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
  1. Výsledky:
    1. - známky toxicity,
    2. - mitotický index,
    3. - poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi,
    4. - typ a počet aberací pro každého jedince zvlášť,
    5. - celkový počet aberací v dané skupině,
    6. - počet buněk s aberacemi na jednu skupinu,
    7. - vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
    8. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
    9. - údaje ze souběžných negativních kontrol,
    10. - historické údaje z negativních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
    11. - údaje ze souběžných pozitivních kontrol,
    12. - případně pozorované změny ploidie.
  Diskuse výsledků.
  Závěry.“.

6. Za metodu B.38 se doplňují metody B.39., B.40. a B.41, které znějí:

„B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO

1. METODA

Metoda je replikací OECD TG 486, Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).

1.1 ÚVOD
Účelem testu neplánované syntézy DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS) v savčích jaterních buňkách in vivo je určit látky, vyvolávající reparaci DNA v jaterních buňkách pokusných zvířat (1) (2) (3) (4).
Tento test in vivo představuje metodu pro zjišťování genotoxických účinků chemických látek v játrech. Výsledek testu indikuje poškození DNA v jaterních buňkách a její následnou reparaci. Játra jsou obvykle hlavním místem metabolismu absorbovaných sloučenin; jsou proto vhodným objektem pro detekci poškození DNA in vivo.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka do cílové tkáně nedostane, není tento test vhodný.
Výsledek neplánované syntézy DNA (UDS) se hodnotí tak, že se stanoví absorpce značených nukleosidů v buňkách, které neprocházejí plánovanou (S-fáze) syntézou DNA. Nejběžnější je metoda, při které se autoradiograficky stanoví thymidin značený tritiem (³H-TdR). Pro testy UDS in vivo se nejčastěji používají potkaní játra. Jiné tkáně než játra se sice také mohou použít, nejsou však předmětem této metody.
Detekce odpovědi závisí na počtu bází DNA, jež jsou v místě poškození odstraněny a nahrazeny. Proto je metoda UDS zvláště vhodná k detekci látek indukujících „longpatch repair“ (20 – 30 bází), zatímco pro látky indukující „shortpatch repair“ (1 – 3 báze) je méně citlivá. Dále může docházet k mutacím v důsledku neopravení, chybného opravení nebo chybné replikace lézí DNA. Rozsah odpovědi UDS neříká nic o přesnosti procesu reparace. Mimoto je možné, že mutagen bude sice s DNA reagovat, ale poškození DNA není opraveno excizním reparačním procesem. To, že UDS test neposkytuje o mutagenní aktivitě specifické informace, je vyváženo jeho potenciální citlivostí, protože poskytuje výsledek v celém genomu.

1.2 DEFINICE
Buňky v reparaci: net nuclear grain (NNG) vyšší než určitá, předem stanovená hodnota, kterou zdůvodní laboratoř provádějící test.
Net nuclear grains (NNG): kvantitativní míra UDS aktivity buněk při autoradiografických testech UDS, vypočtená jako rozdíl mezi počtem zrn v jádře (NG) a průměrným počtem zrn v cytoplasmě (CG): NNG = NG - CG. Počty NNG se vypočítávají pro jednotlivé buňky a následně přepočítány na buňky v kultuře, v paralelních kulturách apod.
Neplánovaná syntéza DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS): opravná syntéza DNA po excizi a odstranění úseku DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním činidlem.

1.3 PRINCIP METODY
Test UDS v savčích jaterních buňkách in vivo indikuje reparační syntézu DNA po excizi a odstranění segmentu DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním působením. Test vychází obvykle z inkorporace ³H-TdR do DNA jaterních buněk, charakteristických nízkým počtem buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace ³H-TdR se obvykle stanoví autoradiograficky, protože tato technika není tak náchylná k interferenci s buňkami v S-fázi, jako je např. scintilační metoda.

1.4 POPIS METODY

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Běžně se používají potkani, lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

1.4.2 Podmínky chovu
Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.
Vlhkost by měla být 50 - 60 %.
1. 1.4.2.1 Příprava zvířat
  Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.
1. 1.4.2.2 Testovaná látka/příprava
  Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.3 Podmínky testu

1.4.3.1 Rozpouštědlo/vehikulum
Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

1.4.3.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly indukovat UDS při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci se používají v dávkách vedoucích ke středně vysoké odezvě (4). Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO „B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH „B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO
Doba odběru vzorku	Látka	CAS	EINECS
odběr v intervalu (2 – 4 hodiny)	N-nitrosodimethylamin	62-75-9	200-249-8
odběr v intervalu (12 – 16 hodin)	N-2-fluorenylacetamid (2-AAF)	53-96-3	200-188-6

Je možno použít i jiné vhodné látky. Je možná aplikace pozitivní kontroly jinou cestou, než je podávána testovaná látka.

1.5 POSTUP
1. 1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
  V každé skupině musí být minimálně tři analyzovatelní jedinci. Pokud existuje historická databáze, pak pro souběžné skupiny negativní a pozitivní kontroly postačují jeden, nebo dva jedinci.
  Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje ze studií s týmž živočišným druhem využívajících týž expozičních cest, prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je možné provést testování pouze na jednom pohlaví, nejlépe na samcích. Tam, kde humánní expozice testovaným látkám může být pohlavně specifická, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.
1. 1.5.2 Dávkovací schéma
  Testovaná látka se obvykle podává jednorázově.
1. 1.5.3 Dávkování
  Obvykle se používají dvě různé dávky. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšší dávce ve stejném režimu by se očekával letální účinek. Nižší dávka představuje obecně 50–25 % dávky vyšší.
  Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože potřebné údaje nejsou k dispozici, je třeba ji realizovat v téže laboratoři a za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se pak použijí v hlavní studii.
  Jako nejvyšší dávku lze také definovat dávku vyvolávající určité známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).
1. 1.5.4 Limitní test
  Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti podané v jedné dávce nebo ve dvou dávkách v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o strukturně příbuzných látkách neočekává genotoxicita, nemusí se provést úplná studie. Podle očekávané humánní expozice může být použita v limitním testu vyšší dávka.
1. 1.5.5 Aplikace látky
  Testovaná látka se obvykle vpravuje žaludeční sondou. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné expoziční cesty. Intraperitoneální aplikace se však nedoporučuje, protože by se tím mohla játra vystavit působení testované látky přímo, nikoli krevním oběhem. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti organismu; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.
1. 1.5.6 Příprava jaterních buněk
  Jaterní buňky se z pokusných zvířat zpracovávají obvykle 12 – 16 hodin po podání dávky testované látky. Obvykle je zapotřebí ještě další odběr (obvykle 2 – 4 hodiny po podání látky), ledaže je po 12 – 16 hodinách pozitivní reakce zjevná. Je ovšem možno použít i jiné časy odběru vzorků, je-li to odůvodněné na základě toxokinetických údajů.
  Krátkodobé kultury savčích jaterních buněk se obvykle zakládají perfuzí jater in situ kolagenázou. Je třeba zajistit, aby se čerstvě disociované jaterní buňky mohly přichytit ke vhodnému povrchu. Jaterní buňky ze zvířat z negativní kontroly mají mít minimálně 50 % životaschopnost (5).
1. 1.5.7 Stanovení UDS
  Čerstvě izolované savčí jaterní buňky se po vhodnou dobu (např. 3 – 8 hodin) obvykle inkubují v médiu obsahujícím ³H-TdR. Po inkubaci se médium odstraní; buňky se potom mohou inkubovat v médiu obsahujícím nadbytek neznačeného thymidinu, aby se snížila neinkorporovaná radioaktivita (tzv. „cold chase“). Buňky se pak promyjí, fixují a vysuší. Při delších inkubačních intervalech nemusí se „cold chase“ provádět. Sklíčka s preparáty se ponoří do autoradiografické emulze, exponují ve tmě (např. po dobu jednoho nebo dvou týdnů v chladničce), vyvolají, obarví a počítají se exponovaná stříbrná zrna. Z každého jedince se připraví dva nebo tři preparáty.
1. 1.5.8 Analýza
  Mikroskopické preparáty musí obsahovat dostatečný počet buněk s normální morfologií, aby bylo možno UDS vyhodnotit. Mikroskopicky se hodnotí zjevné známky cytotoxicity (např. pyknóza, snížená úroveň radioaktivního značení).
  Preparáty se před počítáním zrn zakódují. Vždy na minimálně dvou preparátech z každého jedince se obvykle hodnotí 100 buněk; pokud je buněk méně než 100 na jednoho jedince, musí to být zdůvodněné. Při počítání zrn se nevyhodnocují jádra v S-fázi, ale podíl buněk v S-fázi se registruje.
  Vhodnou metodou se stanoví stupeň inkorporace ³H-TdR do jader a cytoplazmy v morfologicky normálních buňkách, zjištěných podle depozice stříbrných zrnek.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Výsledky zahrnují údaje z jednotlivých preparátů a zvířat. Mimoto se všechna data shrnou v tabelární formě. Pro každou buňku, každého jedince a každou dávku a čas se stanoví čistý počet „nuclear grain“ (NNG) odečtením počtu CG od počtu NG. Počítají-li se „buňky v opravě“, musí být kritéria, kterými se tyto buňky určují, zdůvodněna a podložena daty z historických nebo souběžných negativních kontrol.
Numerické výsledky se mohou vyhodnotit statistickými metodami; pokud se statistické testy použijí, je třeba je vybrat a zdůvodnit ještě před započetím studie.

2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Kritéria pro pozitivní / negativní reakci zahrnují:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO „B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH „B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO
pozitivní	(I)	hodnoty NNG nad předem stanoveným prahem, zdůvodněným na základě historických dat dané laboratoře
nebo	(II)	hodnoty NNG významně vyšší než u souběžné kontroly
negativní	(I)	hodnoty NNG na úrovni/pod úrovní historického prahu u kontrol
nebo	(II)	hodnoty NNG nejsou signifikantně vyšší než souběžná kontrola

Je třeba uvážit biologickou významnost získaných dat, což znamená, že je třeba vzít v úvahu parametry, jako jsou variabilita mezi jednotlivými jedinci, vztah dávka-odpověď a cytotoxicita. Při vyhodnocování výsledků lze použít statistické metody; statistická významnost by však neměla být pro pozitivní reakci rozhodujícím faktorem.

Většina experimentů poskytuje jednoznačné pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

Pozitivní výsledek testu UDS se savčími jaterními buňkami in vivo ukazuje, že testovaná látka vyvolává v savčích jaterních buňkách in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledek ukazuje, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka nevyvolává takové poškození DNA, jež je tímto testem zjistitelná.

Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo / vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby vehikula
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Pokusná zvířata:
    1. - použitý živočišný druh/kmen,
    2. - počet, věk a pohlaví jedinců,
    3. - původ, chovné podmínky, strava apod.,
    4. - hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly,
    2. - údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
    3. - zdůvodnění volby i dávek,
    4. - podrobnosti o přípravě testované látky,
    5. - podrobnosti o podávání testované látky,
    6. - zdůvodnění způsobu podávání,
    7. - případné metody k ověření, že se látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,
    8. - případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti /den ),
    9. - podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
    10. - podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
    11. - metody zjišťování toxicity,
    12. - metoda přípravy a kultivace jaterních buněk,
    13. - použitá autoradiografická metoda,
    14. - počet připravených preparátů a počet hodnocených buněk,
    15. - kritéria analýzy,
    16. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
  1. Výsledky:
    1. - průměrné hodnoty počtů stříbrných zrn v jádrech, cytoplazmě a „net nuclear grains“ pro jednotlivé preparáty, zvířata a skupiny,
    2. - vztah dávka-odpověď, pokud je k dispozici,
    3. - statistické hodnocení, bylo-li provedeno,
    4. - známky toxicity,
    5. - údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol,
    6. - historické údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
    7. - počet „buněk v opravě“, byl-li stanoven,
    8. - počet buněk v S-fázi, byl-li stanoven,
    9. - životaschopnost buněk.
  Diskuse výsledků.
  Závěry.

B.40. LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

1. METODA

1.1 ÚVOD
Evropské centrum pro validizaci alternativních metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM, Joint Research Centre, European Commission) schválilo jakožto vědecky validní dva testy in vitro na leptavé účinky na kůži: test na principu měření transkutánního elektrického odporu kůže potkana (transcutaneous electrical resistance, TER) a test využívající modelu lidské kůže. Validizační studie ECVAM prokázala, že oba testy dokáží spolehlivě rozlišovat mezi známými látkami leptajícími a neleptajícími kůži. Mimoto test vycházející z modelu lidské kůže umožňuje správně rozlišovat jednotlivé stupně leptavých účinků (známé látky způsobující těžké poleptání kůže R35, a ostatní látky způsobující poleptání kůže, R34). Je uveden popis a postupy obou testů; výběr mezi oběma testy závisí na konkrétních požadavcích a na preferencích uživatele.

1.2 DEFINICE
Poleptání kůže: způsobení nevratného poškození tkáně kůže po aplikaci testované látky.

1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Žádná referenční látka není specifikována, viz však odst. 1.5.3.4 a 1.7.2.3.

1.4 PRINCIP METODY - TEST TER NA KŮŽI POTKANA
Testovaný materiál se nanese na dobu až 24 hodin na epidermální povrch terčíků kůže odebrané z mladých potkanů utracených humánním způsobem. Látky, které mají leptavé účinky, jsou identifikovány podle své schopnost porušit normální integritu a bariérové funkce stratum corneum. Tato schopnost se měří jakožto pokles inherentního transkutánního elektrického odporu (TER) pod určitou prahovou hodnotu (5 kΩ) (4) (5). Dráždivé a nedráždivé látky TER pod prahovou hodnotu nesnižují. V případě detergentů a neutrálních organických látek (jejichž definici viz v lit. (6)) je možno do zkušebního postupu zařadit test fixace barviva, aby se snížil počet falešných pozitivních výsledků, jež se u těchto typů chemických látek vyskytují (2) (7).

1.5 POPIS METODY - TEST TER NA KŮŽI POTKANA

1.5.1 Pokusná zvířata
Pro přípravu kožních terčíků jsou používáni mladí (20- až 23-denní) potkani, Wistar nebo srovnatelný kmen. Malými nůžkami na zvířata se pečlivě odstraní srst z dorzální a boční plochy. Zvířata se pak omyjí pečlivým otíráním a oblast se ponoří do roztoku antibiotika, například streptomycinu, penicilinu, chloramfenikolu nebo amfotericinu, v koncentracích inhibujících růst bakterií. Třetí nebo čtvrtý den po prvním omytí se zvířata omyjí antibiotiky znovu a během 3 dní se použijí. Pro přípravu kožních vzorků nesmějí být zvířata starší než 31 dní.

1.5.2 Příprava terčíků kůže
Zvířata se humánním způsobem usmrtí, sejme se kůže z dorzální plochy a z té se opatrně sloupne přebytečný tuk. Kůže se přiloží přes konec polytetrafluorethylenové (PTFE) trubice, a to epidermální stranou k trubici. Přes konec trubice se přetáhne gumový O-kroužek, kterým se kůže připne, a přebytečná tkáň se odřízne. Rozměry trubice a O-kroužku ukazuje obr. 1. Gumový O-kroužek se pak zatěsní pečlivě ke konci PTFE trubice žlutou vazelínou. Trubice se ponoří do nádoby obsahující roztok síranu hořečnatého (154 mM), kde je přidržována pružinovou sponou (obr. 2).

1.5.3 Popis postupu

1.5.3.1 Nanesení testované látky
Je-li testovaná látka v tekutém stavu, nanese se na epidermální povrch uvnitř trubice (obr. 2). Je-li ve stavu pevném, nanese se na terčík v takovém množství, aby se pokryl celý povrch epidermis, na povrch látky se přidá 150 μl deionizované vody a trubicemi se jemně zatřepe. Testovaná látka musí mít s kůží maximální možný kontakt. U některých pevných látek toho lze dosáhnout zahřátím látky na 30°C, aby se roztavila, nebo rozetřením zrnitého materiálu na jemný prášek. Použijí se vždy tři terčíky pro každou látku. Látka se nanáší na dobu 24 hodin (viz též 1.5.3.4) a odstraní se promýváním proudem vodovodní vody teplé maximálně 30°C tak dlouho, dokud se látka vyplavuje. Odstranění testované látky, která v trubici ztuhla, se dá napomoci vymýváním prudkým proudem vody teplé zhruba 30°C.

1.5.3.2 Měření TER

Transkutánní elektrický odpor (TER) se měří pomocí nízkonapěťového impedančního můstku pro střídavý proud (např. AIM 401 nebo 6401 či ekvivalentního). Před měřením elektrického odporu se sníží povrchové napětí kůže přídavkem dostatečného objemu 70% ethanolu, kterým se pokryje epidermis. Po několika sekundách se ethanol odstraní tak, že se trubice otočí, a tkáň se hydratuje přídavkem tří mililitrů 154 mM roztoku síranu hořečnatého. Elektrody můstku se přiloží na obě strany kůže a změří se odpor v kΩ/terčík (obr. 2). Rozměry elektrod a délku holé elektrody pod krokosvorkou ukazuje obr. 1. Svorka vnitřní (silné) elektrody se během měření uloží navrch PTFE trubice tak, aby byla do roztoku síranu hořečnatého ponořena vždy stejná délka elektrody. Vnější (tenká) elektroda se uloží do receptorové komůrky tak, aby ležela na dně. Je třeba dodržovat konstantní vzdálenost mezi spodní hranou pružinové svorky a spodkem PTFE trubice (obr. 1), tato vzdálenost má vliv na získanou hodnotu odporu.

Upozorňujeme, že je-li naměřený odpor vyšší než 20 kΩ, může to být důsledek toho, že testovaná látka překrývá epidermální povrch terčíku kůže. Je možno se pokusit tento povlak odstranit, například tak, že se PTFE trubice utěsní palcem v rukavici a zhruba 10 sekund se protřepává, roztok síranu hořečnatého se vylije a měření odporu se opakuje s čerstvým roztokem.

Průměrná naměřená hodnota TER je akceptována, pokud hodnoty ze souběžné pozitivní a negativní kontroly leží v rozmezích přijatelných pro tuto metodu. Navrhované kontrolní látky a příslušná akceptovatelná rozmezí odporu pro popisovanou metodu a aparaturu jsou tyto:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO „B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH „B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO B.40. LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
Kontrola	Látka	Rozmezí odporu (kΩ)
Pozitivní	10 M kyselina chlorovodíková (36%)	0,5 – 1,0
Negativní	destilovaná voda	10 – 25

1.5.3.3 Modifikovaný postup pro povrchově aktivní látky a neutrální organické látky

Pokud je při testování povrchově aktivních látek (detergentů) nebo neutrálních organických látek hodnota TER menší nebo rovna 5 kΩ, lze na této tkáni provést hodnocení průniku (penetrace) barviva. Tímto postupem se zjistí, zda se nejedná o výsledky falešně pozitivní (2).

1.5.3.3.1 Nanesení a odstranění barviva sulforhodaminu B
Po prvotním ošetření testovanou látkou se na epidermální povrch všech terčíků nanese na 2 hodiny po 150 μl 10% (w/v) roztoku sulforhodaminu B v destilované vodě. Terčíky kůže se pak zhruba po dobu 10 sekund oplachují prudkým proudem vodovodní vody, která má nejvýše pokojovou teplotu. Tím se má odstranit přebytečné (nenavázané) barvivo. Každý terčík kůže se pak opatrně sejme z PTFE trubice a uloží do nádobky (např. do 20 ml skleněných kyvet pro scintilaci) obsahující 8 ml deionizované vody. Nádobky se po dobu 5 minut jemně třepou, aby se odstranily veškeré zbytky přebytečného (nenavázaného) barviva. Tento oplach se opakuje. Pak se terčíky vyjmou a vloží do nádobek s 5 ml 30 % (w/v) roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) v destilované vodě, kde se přes noc inkubují při teplotě 60°C. Po inkubaci se terčíky vyjmou a zlikvidují a zbývající roztok se odstřeďuje po dobu 8 minut při teplotě 21°C (relativní odstředivá síla ~175). Vzorek 1 ml supernatantu se pak zředí 30 % (w/v) roztokem SDS v destilované vodě v objemovém poměru 1 v 5 (v/v) (tj. 1 ml supernatantu + 4 ml roztoku SDS). Optická denzita (OD) roztoku se měří při cca 565 nm.

1.5.3.3.2 Výpočet obsahu barviva

Obsah sulforhodaminu B v terčíku se vypočítá z hodnoty OD (molární extinkční koeficient sulforhodaminu B při 565 nm činí 8,7.10⁴; molekulová hmotnost = 580). Obsah sulforhodaminu B se vypočítá pro každý terčík kůže zvlášť a stanoví se průměrná hodnota. Průměrná hodnota navázaného barviva je akceptována za podmínky, že souběžné kontrolní hodnoty spadají do akceptovatelného rozsahu této metody. Za akceptovatelná rozmezí obsahu barviva se u kontrolních látek při této metodě a experimentálním uspořádání považují:

„B.17. MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO „B.23. ANALÝZA CHROMOSÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH „B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO B.40. LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
Kontrola	Látka	Rozmezí obsahu barviva (μg/ terčík)
Pozitivní	10 M kyselina chlorovodíková	40 – 100
Negativní	destilovaná voda	15 – 35

1.5.3.4 Doplňující informace
Je možné zvolit kratší dobu působení testované látky na terčík kůže (např. 2 hodiny) za účelem rozlišení silně leptajících látek. Ve validizační studii však bylo zjištěno, že test TER přeceňuje leptavé schopnosti některých testovaných látek aplikovaných na terčíky kůže na 2 hodiny (2), jakkoliv umožňuje správnou identifikaci leptajících a neleptajících látek po 24-hodinovém působení.
Získané hodnoty TER mohou být ovlivněny vlastnostmi a rozměry zkušební aparatury a experimentálním postupem. Prahová hodnota pro leptavé účinky 5 kΩ byla stanovena na základě údajů získaných na konkrétní aparatuře a při aplikaci postupu uvedeného zde. Pokud by se zkušební podmínky výrazně změnily, mohlo by být třeba použít jiných prahových a kontrolních hodnot. Proto se doporučuje okalibrovat metodiku i prahovou hodnotu otestováním řady referenčních standardů vybraných z látek, jež byly použity při validační studii (3).

1.6 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY - TEST S MODELEM LIDSKÉ KŮŽE
Testovaný materiál se nanáší topicky na dobu až 4 hodin na trojrozměrný model lidské kůže, sestávající z rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum. Leptající materiál se pozná podle schopnosti vyvolat pokles životnosti buněk stanovené například testem „MTT reduction assay“ (MTT = 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5 difenyl tetrazolium bromid) pod prahovou hodnotu definovanou pro danou expoziční dobu. Princip testu vychází z předpokladu, že látky způsobující poleptání kůže jsou ty, které dokáží proniknout skrze stratum corneum (difúzí nebo erozí) a jsou dostatečně cytotoxické, aby přivodily smrt buněk v hlubších buněčných vrstvách.

1.7 POPIS METODY - TEST S MODELEM LIDSKÉ KŮŽE
1. 1.7.1 Modely lidské kůže
  Modely lidské kůže mohou pocházet z různých zdrojů, musí však splňovat určitá kritéria. Model musí mít funkční stratum corneum s podkladovou vrstvou živých buněk. Bariérová funkce stratum corneum musí být přiměřeně zachována. To lze prokázat tím, že model bude rezistentní vůči cytotoxicitě po nanesení látek, o nichž je známo, že jsou pro buňky cytotoxické, které však normálně skrze stratum corneum neprocházejí. Model musí za definovaných experimentálních podmínek vykazovat reprodukovatelné výsledky.
  Životnost živých buněk v modelu musí být dostačující k tomu, aby se dalo dobře rozlišit mezi látkami pozitivní a negativní kontroly. Životnost buněk (měřená například velikostí redukce MTT, tj. OD hodnotou) po expozici látce použité jako negativní kontrola musí ležet v přijatelných mezích pro daný model. Podobně v případě látky pro pozitivní kontrolu (ve srovnání s látkami pro negativní kontrolu) musí hodnoty životnosti spadat do určených mezí. Je velmi důležité, aby bylo prokázáno, že použitý predikční model odpovídá mezinárodnímu validačnímu standardu (2).
1. 1.7.2 Popis postupu
  1. 1.7.2.1 Nanesení testovaného materiálu
    Je-li testovaná látka tekutá, nanese se tak, aby pokrývala povrch kůže (minimální množství 25 μl/cm²). Je-li pevná, nanese se tak, aby pokrývala kůži, a následně se zvlhčí, aby se s kůží zajistil dobrý styk. Pokud je to třeba, pevné látky se před aplikací roztírají na prášek. U metody nanášení musí být prokázáno, že je vhodná pro široký rozsah látek (2). Po uplynutí doby expozice se materiál z povrchu kůže pečlivě smyje fyziologickým roztokem.
  1. 1.7.2.2 Měření životnosti buněk
    K měření životnosti buněk se dá použít jakákoliv validizovaná kvantitativní metoda. Nejčastěji se používá redukce MTT, o které bylo prokázáno že v různých laboratořích poskytuje přesné a reprodukovatelné výsledky (2). Terčík kůže se na dobu 3 hodin ponoří do roztoku MTT o koncentraci 0,3 mg/ml při teplotě 20 - 28°C. Vyloučený modrý formazanový produkt se pak extrahuje (extrakce rozpouštědlem) a koncentrace formazanu se stanoví měřením OD při vlnové délce 545 a 595 nm.
  1. 1.7.2.3 Doplňující informace
    Použitý model kůže i přesné dodržení doby působení, promývacího postupu atd. mají na životnost buněk významný vliv. Doporučuje se metodu i predikční model okalibrovat za použití řady referenčních standardů vybraných z látek použitých ve validizační studii ECVAM (3). Je nezbytně nutné, aby bylo prokázáno, že je použitá metoda za použití široké škály látek reprodukovatelná podle mezinárodních standardů jak v rámci dané laboratoře, tak mezi různými laboratořemi. Minimálně musí metoda splňovat kritéria vědecké validity definované dříve (2) a výsledky takové validizační studie musí být zveřejněny ve takovém vědeckém časopise, ve kterém články před zveřejněním procházejí odbornou revizí.

2. ÚDAJE
1. 1.8 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
  1. 1.8.1 Test TER na kůži potkana
    Hodnoty odporu (v kΩ) pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontrolu a pro případné standardní referenční látky se uvádějí v tabelární formě, a to data pro všechny replikace a opakované experimenty, průměrné hodnoty a z nich vyvozená klasifikace.
  1. 1.8.2 Test s modelem lidské kůže
    Hodnoty OD a vypočtené procento životaschopných buněk se pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontroly a případné standardní referenční látky uvádějí v tabelární formě, a to data pro všechny replikace a opakované experimenty, průměrné hodnoty a z nich vyvozená klasifikace.
1. 1.9 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
  1. 1.9.1 Test TER na kůži potkana
    Pokud je průměrná hodnota TER pro testovaný materiál vyšší než 5 kΩ, je látka neleptající. Je-li hodnota TER nižší nebo rovna 5 kΩ a nejedná se přitom o povrchově aktivní látku (detergent) či neutrální organickou látku, pak testovaná látka leptavé účinky má.
    U povrchově aktivních látek (detergentů) a neutrálních organických látek, jež poskytují hodnoty TER nepřesahující 5 kΩ, lze provést zkoušku penetrace barviva. Je-li obsah barviva v terčíku vyšší nebo rovný průměrnému obsahu barviva v terčíku při souběžně provedené pozitivní kontrole s 36 % HCl, je testovaná látka skutečně pozitivní a tedy má leptavé účinky, kdežto je-li obsah barviva v terčíku menší, je testovaná látka falešně pozitivní a tedy leptavé účinky nemá.
  1. 1.9.2 Test s modelem lidské kůže
    Hodnota OD pro negativní kontrolu představuje 100 % životaschopnost buněk. Z hodnot OD pro jednotlivé zkušební vzorky se vypočte procentuální životnost vůči negativní kontrole. Hraniční procentický podíl životaschopných buněk, který odděluje látky, které nezpůsobují poleptání kůže, od těch, které poleptání způsobují, respektive odlišuje jednotlivé třídy leptavých vlastností,, musí být v predikčním modelu jasně definován předtím, než je metoda validována, a následnou validační studií se musí prokázat, že je tato hraniční hodnota odpovídající.

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Testovaná látka:
    1. - identifikační údaje, fyzikální stav, popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti; pokud se používají referenční látky, uvedou se tyto údaje i pro ně.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - podrobný popis použitého postupu,
    2. - popis a zdůvodnění všech případných modifikací.
  1. Výsledky:
    1. - tabulka hodnot odporu (test TER) nebo procentuální podíl životaschopných buněk (test s modelem lidské kůže) pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontroly a případné standardní referenční látky, a to údaje pro všechny replikace resp. opakované experimenty a průměrné hodnoty;
    2. - popis všech jiných pozorovaných efektů.
  Diskuse výsledků.
  Závěry.
  Obrázek 1
  Rozměry PTFE trubice
  Rozměry elektrod
  Obrázek 2
  Aparatura pro test TER s kůží potkana

B.41. FOTOTOXICITA – TEST FOTOTOXICITY 3T3 NRU IN VITRO

1. METODA
1. 1.1 ÚVOD
  Fototoxicita je definována jako toxická odezva (reakce), k níž dochází, je-li kůže poprvé vystavena určitým chemickým látkám a následně pak světlu, nebo je-li podobně kůže ozářena po celkovém podání určité látky.
  Informace získané v rámci testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro slouží ke stanovení fototoxického potenciálu dané testované látky, tedy ke zjištění, zda daná látka ve spojení s expozicí ultrafialovému a viditelnému záření představuje možné nebezpečí nebo nikoli.

Následující stránka