Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

zrušený předpis

  1. — specifická analytická data o chemické látce, pokud existují;
  2. — analytická data o meziproduktech, pokud existují;
  3. — graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkušební a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnici (příloha I). Vyhovuje-li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít střední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkušební látku;
  4. — rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkoušky.
  1. IVA. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) – metoda C.4-A podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVA.1 PODSTATA METODY

      Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

      Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace.

    1. IVA 2 POPIS METODY
      1. IVA 2.1 Aparatura
        1. a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;
        2. b) Třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;
        3. c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;
        4. d) Analyzátor DOC;
        5. e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;
        6. f) Odstředivka;
      1. IVA 2.2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v bodě I.6.2.

        Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

      1. IVA 2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

        Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

        Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

      1. IVA 2.4 Příprava baněk

        Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných látek na litr. Připraví se rovněž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

        Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.

        Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).

        Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.

        Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

      1. IVA 2.5 Počet baněk v typické zkoušce
        1. Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
        2. Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
        3. Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
        4. Dále se doporučují nebo se podle potřeby použijí:
          1. Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
          2. Baňka 7: Kontrola adsorpce
          3. Baňka 8: Kontrola toxicity
          4. Viz také bod I.6.7.
      1. IVA 2.6 Provedení zkoušky

        Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.

        Před každým odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

    1. IVA 3 DATA A ZPRÁVY
      1. IVA 3.1 Zpracování výsledků

        Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

        Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledu dat.

      1. IVA 3.2 Platnost výsledků

        Viz bod I.5.2.

      1. IVA 3.3 Zprávy

        Viz bod I.8.

    1. IVA 4 PŘEHLED DAT

      Dále je uveden příklad přehledu dat.

      ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC

      1. 1. LABORATOŘ
      2. 2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY
      3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
        1. Název:
          1. Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1
          2. Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l-1
      1. 4. INOKULUM
        1. Zdroj:
          1. Provedená úprava:
            1. Předběžná úprava, pokud byla provedena:
              1. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1
      1. 5. STANOVENÍ UHLÍKU
        1. Analyzátor uhlíku:
          ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
          Baňka č.DOC po n dnech (mg·l-1)
          0n1n2n3nx
          Zkušební látka a inokulum1a1
          a2
          a, střední hodnota
          Ca(t)
          2b1
          b2
          b, střední hodnota
          Cb(t)
          Slepá zkouška s inokulem
          bez zkušební látky          		3c1
          c2
          c, střední hodnota
          Cc(t)
          4d1
          d2
          d, střední hodnota
          Cd(t)
      1. 6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
        Baňka č.Rozklad v % po n dnech
        0n1n2n3nx
        10
        20
        Střední hodnota*0
      2. * Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.
      3. Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.
      1. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
        Čas (dny)
        0t
        DOC (mg·l-1) ve sterilní kontroleCs(0)Cs(t)

      1. 8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
        Zbylé množství zkušební
        chemické látky na konci
        zkoušky (mg·l-1)        		Primární rozklad
        v procentech
        Sterilní kontrolaSb
        Inokulované zkušební médiumSa
  1. IVB. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD – metoda C.4-B podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVB.1 PODSTATA METODY

      Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

      Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace.

    1. IVB.2 POPIS METODY
      1. IVB.2.1 Aparatura
        1. a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;
        2. b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;
        3. c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;
        4. d) Analyzátor DOC;
        5. e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;
        6. f) Odstředivka.
      1. IVB.2.2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsaná v bodě I.6.2.

        Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

        1. V této metodě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na jeden litr výsledného média:
          1. Roztok stopových prvků:
            ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
            Síran manganatý tetrahydrát, MnSO4·4H2O39,9 mg
            Kyselina boritá, H3BO357,2 mg
            Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO4·7H2O42,8 mg
            Heptamolybdenan hexaamonný, (NH4)6Mo7O2434,7 mg
            Chelát Fe (FeCl3 s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou)100,0 mg

        Rozpustí se v ředicí vodě a doplní se touto vodou na 1 000 ml.

        1. Vitaminový roztok:
          ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
          Kvasničný extrakt15,0 mg

        Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 μm, nebo se připraví čerstvě.

      1. IVB.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

        Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.

        Viz I.6.4.2 a I.6.5.

        Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.

      1. IVB.2.4 Příprava baněk

        Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Připraví se rovněž slepé zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

        Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.

        Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6).

        Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.

        Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

      1. IVB.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
        1. Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
        2. Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
        3. Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
        4. Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
          1. Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
          2. Baňka 7: Kontrola adsorpce
          3. Baňka 8: Kontrola toxicity
          4. Viz také bod I.6.7.
      1. IVB.2.6 Provedení zkoušky

        Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.

        Před odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované resp. odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

    1. IVB.3 DATA A ZPRÁVY
      1. IVB.3.1 Zpracování výsledků

        Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

        Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledů dat.

      1. IVB.3.2 Platnost výsledků

        Viz bod I.5.2.

      1. IVB.3.3 Zprávy

        Viz bod I.8.

    1. IVB.4 PŘEHLED DAT

      Dále je uveden příklad přehledu dat.

      MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD

      1. 1. LABORATOŘ
      2. 2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY
      3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
        1. Název:
          1. Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1
          2. Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l-1
      1. 4. INOKULUM
        1. Zdroj:
          1. Provedená úprava:
            1. Předběžná úprava, pokud byla provedena:
              1. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi; mg·l-1
      1. 5. STANOVENÍ UHLÍKU
        1. Analyzátor uhlíku:
          ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD
          Baňka č.DOC po n dnech (mg·l-1)
          0n1n2n3nx
          Zkušební látka a inokulum1a1
          a2
          a, střední hodnota
          Ca(t)
          2b1
          b2
          b, střední hodnota
          Cb(t)
          Slepá zkouška s inokulem
          bez zkušební látky          		3c1
          c2
          c, střední hodnota
          Cc(t)
          4d1
          d2
          d, střední hodnota
          Cd(t)
      1. 6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD
        Baňka č.Rozklad po n dnech
        0n1n2n3n4
        10
        20
        Střední hodnota*0
      2. * Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.
      3. Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.
      1. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD
        Čas (dny)
        0t
        DOC (mg·l-1) ve sterilní kontroleCs(0)Cs(t)

      1. 8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)
        ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD
        Zbylé množství zkušební
        chemické látky na konci
        zkoušky (mg·l-1)        		Primární rozklad
        v procentech
        Sterilní kontrolasb
        Inokulované zkušební médiumsa
  1. IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO2) – MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA – metoda C.4-C podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVC.1 PODSTATA METODY

      Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební látky (10 – 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle regulovaným proudem vzduchu bez CO2. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím vznikajícího CO2 jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO2 vzniklého ze zkušební látky (po korekci na CO2 pocházející z čistého inokula) se vyjádří v procentech TCO2. Stupeň biologického rozkladu může být také vypočten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace.

    1. IVC.2 POPIS METODY
      1. IVC.2.1 Přístroje
        1. a) Baňky na 2 – 5 l vybavené provzdušňovací trubicí dosahující až ke dnu nádoby a výstupnímo tvorem;
        2. b) Magnetické míchačky pro zkoušení špatně rozpustných látek;
        3. c) Absorpční lahv;
        4. d) Zařízení pro regulaci a měření průtoku vzduchu;
        5. e) Zařízení pro odstraňování CO2 při přípravě vzduchu bez CO2, popřípadě může být použita směs kyslíku bez CO2 a dusíku bez CO2 ve správném poměru (20 % O2 a 80 % N2) z lahví se stlačenými plyny;
        6. f) Zařízení na stanovení CO2 buď titračně nebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku;
        7. g) Zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);
        8. h) Analyzátor DOC (podle volby).
      1. IVC.2.2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

        Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

      1. IVC.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

        Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

        Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

      1. IVC.2.4 Příprava baněk

        Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V případě použití menších objemů se hodnoty úměrně upraví, musí být ovšem zajištěno, aby bylo možné přesně měřit vznikající CO2.

        Do každé baňky na 5 litrů se přenese 2 400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v konečném objemu 3 l inokulované směsi byla 30 mg·l-1. Eventuálně lze nejdříve zředit připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 500 – 1 000 mg·l-1 a poté přidat alikvotní části do baňky na 5 litrů, aby byla dosažena koncentrace 30 mg·l-1; zajistí se tím větší přesnost. Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2).

        Inokulovaná směs se přes noc provzdušňuje vzduchem bez CO2, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý.

        Odděleně do dvojic baněk se ze zásobních roztoků přidá zkušební látka a referenční látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; některé lahve se nasadí jako kontrola inokula bez přidání chemických látek. Špatně rozpustné látky se odváží nebo odměří přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III.

        Podle potřeby se jedna baňka použije ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky, a to přidáním zkušební i referenční látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách.

        Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky.

        Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média bez CO2. Podle potřeby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynů u baněk připojí absorpční lahve.

        V případě použití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrů zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)2 o koncentraci 0,0125 mol·l-1. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostředně před použitím. Je-li použit hydroxid sodný, spojí se 2 absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl veškerý CO2 zachycen v první absorpční lahvi. K tomuto účelu se hodí absorpční lahve opatřené sérovými uzávěry. Do každé absorpční lahve se přidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol·l-1, což postačuje k absorpci veškerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odečtením množství uhličitanů ve slepém pokusu.

      1. IVC.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
        1. Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
        2. Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
        3. Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
        4. Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
          1. Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
          2. Baňka 7: Kontrola toxicity
          3. Viz také bod I.6.7.
      1. IVC.2.6 Provedení zkoušky

        Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO2 suspensí při průtoku 30 – 100 ml·min-1. Za účelem analýzy obsahu CO2 se pravidelně odebírají vzorky absorbentu. Doporučuje se, aby se v průběhu prvních 10 dnů prováděly analýzy každý druhý až třetí den a dále pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 10denního období rozkladu.

        28. den se (nepovinně) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo pro specifickou analýzu, změří se pH suspensí a poté se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl; provzdušňuje se přes noc, aby se odstranil CO2 přítomný v suspensi. Poslední analýza uvolněného CO2 se provede 29. den.

        Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO2, se odpojí absorpční lahev s hydroxidem barnatým bližší zkušební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za přítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvě absorpční lahve se posunou k baňce a na konec řady se zařadí nová absorpční lahev se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádějí podle potřeby, např. je-li pozorována v první absorpční lahvi zřetelná sraženina a před tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoň jednou týdně. Jinou možností je provést při použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekční stříkačky (podle použitého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíže k baňce. Vzorek se nastříkne přímo do IC-části analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku.

        Obsah druhé absorpční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky s cílem stanovit korekci na možný únik CO2.

    1. IVC.3 DATA A ZPRÁVY
      1. IVC.3.1 Zpracování výsledků
        1. Množství CO2 zachyceného v absorpční lahvi je v případě titračního stanovení dáno vztahem:

          1. kde
            1. V = objem HCl spotřebovaný při titraci 100 ml obsahu absorpční lahve (ml),
            2. CB = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol·l-1),
            3. CA = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol·l-1).
        1. Je-li CB 0,0125 mol·l-1 a CA 0,05 mol·l-1, je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)2 50 ml a hmotnost CO2 je dána vztahem:

        V tomto případě se tedy k přepočtu objemu HCl spotřebovaného při titraci na hmotnost vzniklého CO2 použije faktor 1,1.

        S použitím příslušných výsledků titrace se vypočte hmotnost CO2 vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkušební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO2 vzniklého ze samotné zkušební látky.

        Je-li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkušební látkou 45 ml, je množství

        a tedy hmotnost CO2 vzniklého ze zkušební látky 3,3 mg.

        1. Biologický rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

          1. nebo

          1. přičemž 3,67 je převodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhličitý.

        Rozklad v procentech se po každém období vypočte dosazením hodnoty TCO2 vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl měřen.

        Při zachytávání do NaOH se vypočte hmotnost vzniklého CO2, vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpční lahvi objemem absorpčního roztoku.

        1. Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

        Úbytky DOC se (nepovinně) vypočítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

      1. IVC.3.2 Platnost výsledků

        Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním médiu na začátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové množství CO2 vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za normálních okolností překročit 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty větší než 70 mg CO2 na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky přehodnoceny.

        Viz také I.5.2.

      1. IVC.3.3 Zprávy

        Viz I.8.

    1. IVC.4 PŘEHLED DAT

      Dále je uveden příklad přehledu dat:

      ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

      1. 1. LABORATOŘ
      2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
      3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
        1. Název:
          1. Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1
          2. Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg·l-1
          3. Celkové množství uhlíku přidaného do baňky: mg C
          4. TCO2: mg CO2
      1. 4. INOKULUM
        1. Zdroj:
          1. Provedená úprava:
            1. Předběžná úprava, pokud byla provedena:
              1. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1
      1. 5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST
        1. Metoda: Ba(OH)2 / NaOH/jiná
          ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO
          Čas (dny) CO2 uvolněný
          ve zkoušce (mg)           		CO2 uvolněný
          ve slepé zkoušce
          (mg)          		Celkové množství
          CO2 (průměr ve
          zkoušce minus
          průměr ve slepé
          zkoušce) (mg)          		TCO2

          12průměr34průměr1212průměr
          0
          n1
          n2
          n3
          28
        2. Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.
      1. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
        1. Analyzátor uhlíku:
          ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO
          Čas (dny)Slepý pokus (mg·l-1)Zkušební látka (mg·l-1)
          0Cb(0)C0
          28*Cb(t)Ct
          * nebo na konci kultivace

      1. 7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

  1. IVD. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4-D podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVD.1 PODSTATA METODY

      Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební chemické látky (100 mg zkušební látky na litr, dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) na dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanoví buď měřením množství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce, nebo ze změn objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuře. Uvolněný CO2 se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spotřebováno (korigované na spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí současně), se vyjádří v procentech TSK nebo CHSK. Popřípadě může být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad.

    1. IVD.2 POPIS METODY
      1. IVD.2.1 Přístroje
        1. a) vhodný respirometr;
        2. b) regulátor teploty s přesností na ±1 °C nebo lepší;
        3. c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);
        4. d) analyzátor uhlíku (nepovinné).
      1. IVD.2.2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

        Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

      1. IVD.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

        Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

        Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

      1. IVD.2.4 Příprava baněk

        S použitím zásobních roztoků se připraví samostatné sady roztoků zkušební chemické látky a referenční chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr).

        TSK se vypočte z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném případě by měl být výpočet založen na tvorbě dusičnanů (viz příloha II, bod 2).

        Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.

        Špatně rozpustné látky se přidají v pozdějším stádiu (viz dále).

        Má-li se stanovit toxicita zkušební látky, připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční i zkušební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.

        Požaduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).

        Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.

        Je-li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO2 se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.

      1. IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
        1. Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
        2. Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
        3. Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
        4. Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
          1. Baňka 6: Sterilní kontrola
          2. Baňka 7: Kontrola toxicity
          3. Viz také bod I.6.7.
      1. IVD.2.6 Provedení zkoušky

        V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l-1. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.

        Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSKNH4 (platí pro látky obsahující dusík).