Platné znění

Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků

vyhlášené znění

Provokační expozice (challenge): experimentální expozice subjektu dříve vystaveného testované látce po indukčním období pro stanovení, zda subjekt odpoví reakcí přecitlivělosti.

  1. 1.3 Referenční látky

    Citlivost a spolehlivost použité experimentální metody by měla být ověřována každých šest měsíců s použitím látek, o kterých je známo, že mají mírný až středně silný senzibilizační účinek pro kůži.

    U správně provedeného testu se očekává reakce na mírné/střední senzibilátory nejméně 30 % u metody s adjuvans, a nejméně 15 % u metody bez adjuvans.

    Přednost se dává následujícím látkám:

    Číslo CASČíslo EINECSchemický názevgenerický /obchodní název
    101-86-0202-983-32-hexyl-3-fenyl-2-propenalalfa-hexylcinnamaldehyd
    149-30-4205-736-82-merkaptobenzothiazolkaptax
    94-07-7202-303-5Ethyl ester kyseliny p-aminobenzoovébenzokain

    Mohou nastat okolnosti, kdy při dostatečném odborném zdůvodnění mohou být použity jiné kontrolní látky splňující výše uvedená kritéria.

  1. 1.4 Princip testovací metody

    Pokusná zvířata jsou nejprve exponována testované látce intradermálními injekcemi případně epidermální aplikací (indukční expozice). Po období 10 až 14 dnů (indukční období), v průběhu kterého se může rozvinout imunitní reakce, jsou zvířata exponována provokační dávce. Rozsah a stupeň kožní reakce na provokační expozici u testovaných zvířat je porovnáván s rozsahem a stupněm reakce u kontrolních zvířat, která podstoupí klamnou expozici v době indukce a je jim aplikována provokační dávka.

  1. 1.5 Popis testovacích metod

    Jestliže je považováno za nezbytné odstranit testovanou látku, provede se to s použitím vody nebo vhodného rozpouštědla tak, aby nebyla narušena vzniklá kožní reakce nebo integrita pokožky.

    1. 1.5.1 Maximizační test na morčatech (GPMT)
      1. 1.5.1.1 Příprava

        Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

      1. 1.5.1.2 Experimentální podmínky
        1. 1.5.1.2.1. Pokusná zvířata

          Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

        1. 1.5.1.2.2. Počet a pohlaví

          Lze použít samce i samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Exponovanou skupinu tvoří nejméně 10 zvířat a nejméně 5 zvířat je třeba v kontrolní skupině. Použije-li se menšího počtu než 20 testovaných a 10 kontrolních morčat a není možné dojít k závěru, že testovaná látka je senzibilizátor, doporučuje se testování na dalších zvířatech, aby se dosáhlo celkového počtu nejméně 20 testovaných a 10 kontrolních zvířat.

        1. 1.5.1.2.3 Dávkové úrovně

          Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, kterou zvířata celkově dobře snášejí a která je nejvyšší působící mírné až střední podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech. Pro tento účel lze uvážit použití zvířat, kterým bylo aplikováno FCA.

      1. 1.5.1.3. Popis postupu
        1. 1.5.1.3.1. Indukce

          Den 0 - Testovaná skupina

          Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do lopatkové oblasti zbavené srsti symetricky podle střední linie:

          Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;

          Injekce 2: testovaná látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncentraci;

          Injekce 3: testovaná látka ve zvolené koncentraci připravená ve směsi FCA s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1.

          Pro injekci 3 se látky ve vodě rozpustné rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo látky nerozpustné se rozptýlí v nezředěném FCA. Konečná koncentrace testované látky pro injekci 3 má být stejná jako pro injekci 2.

          Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 směrem ke kaudální části testovací plochy.

          Den 0 - Kontrolní skupina

          Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do stejných míst jako u testovaných zvířat:

          Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;

          Injekce 2: neředěné vehikulum;

          Injekce 3: Směs vehikula (50 %, váha / objem) se směsí FCA/vody nebo fyziologického roztoku v poměru 1 : 1 (objem / objem).

          5. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny

          Přibližně dvacet čtyři hodin před lokální indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se na testovací plochu po důkladném ostříhání případně oholení natře 0,5 ml 10 % laurylsulfátu sodného ve vazelíně, za účelem navození místního podráždění.

          6. - 8. den - Testovaná skupina

          Testovací plocha se zbaví srsti. Testovanou látkou ve vhodném vehikulu je napuštěn filtrační papír (2 x 4 cm), který se pak přiloží na testovací plochu a fixuje pomocí okluzivního obvazu na dobu 48 hodin. Výběr vehikula se řídí odbornými důvody; pevné látky jsou jemně rozetřeny a převedeny do vhodného vehikula; kapaliny lze aplikovat přímo.

          6. - 8. den - Kontrolní skupina

          Testovací plocha se znovu zbaví srsti. Samotné vehikulum se nanese a zafixuje podobně jako u exponované skupiny na dobu 48 hodin.

        1. 1.5.1.3.2. Provokace

          20. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny

          Boky exponovaných i kontrolních zvířat jsou zbaveny srsti. Na jeden bok zvířete je aplikována testovaná látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se stejným způsobem aplikuje pouze vehikulum (pokud je to třeba). Plátky se pomocí okluzivního obvazu udržují v kontaktu s kůží po 24 hodiny.

        1. 1.5.1.3.3. Pozorování a vyhodnocení: testované a kontrolní skupiny
          1. — přibližně 21 hodin po odstranění náplasti se provokační plocha vyčistí, důkladně ostříhá případně oholí a v případě potřeby depiluje;
          2. — přibližně po dalších třech hodinách (přibližně 48 hodin od začátku aplikace provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamenává se podle stupnice uvedené v dodatku;
          3. — přibližně 24 hodin po tomto pozorování se provede druhé pozorování a záznam reakce kůže (72 hodin).

          Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

          Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině. Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona / Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

    1. 1.5.2 Buehlerův test
      1. 1.5.2.1 Příprava

        Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

      1. 1.5.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.5.2.2.1. Pokusná zvířata

          Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

        1. 1.5.2.2.2. Počet a pohlaví

          Lze použít samce a/nebo samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

          Použije se minimálně 20 zvířat v testované skupině a nejméně 10 zvířat v kontrolní skupině.

        1. 1.5.2.2.3 Dávkové úrovně

          Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, která je nejvyšší působící mírné ale ne velmi silné podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech.

          Pro testované látky rozpustné ve vodě je vhodné použít vodu nebo zředěný nedráždící roztok detergentu jako vehikula. Pro jiné látky je preferován 80 % roztok etanol / voda pro indukci a aceton pro provokaci.

      1. 1.5.2.3 Postup
        1. 1.5.2.3.1. Indukce

          Den 0 - Testovaná skupina

          Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Systém plátkového testu se dokonale nasytí testovanou látkou ve vhodném vehikulu (výběr vehikula se řídí odbornými důvody; kapaliny lze případně aplikovat přímo).

          Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

          Systém plátkového testu musí být okluzivní. Vhodný je bavlněný polštářek, ať už kruhový nebo čtverhranný, s plochou přibližně 4 - 6 cm2. Je preferováno přidržení s použitím vhodného přidržovače, aby se zajistila okluze. Jestliže je použito obvázání, mohou být nutné další expozice.

          Den 0 – Kontrolní skupina

          Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Na testovací plochu je naneseno pouze vehikulum, a to podobným způsobem jako u testované skupiny. Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin. Pokud je možno prokázat, že negativní kontrolní skupina není nutná, lze použít čisté kontrolní skupiny bez aplikace.

          6. - 8. a 13. - 15. den -Testovaná a kontrolní skupina

          Stejná aplikace jako v den 0 se provede na stejnou testovací plochu na tomtéž boku (zbavenou případně srsti) 6.-8. den a znovu 13.-15. den.

        1. 1..5.2.3.2. Provokace

          27. - 29. den - Testovaná a kontrolní skupina

          Neošetřený bok testovaných a kontrolních zvířat je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Okluzivní plátek obsahující příslušné množství testované látky v maximální nedráždivé koncentraci se aplikuje na zadní část neošetřeného bok testovaných a kontrolních zvířat. Na přední část neošetřeného boku testovaných a kontrolních zvířat se případně může aplikovat okluzní plátek s vehikulem. Překrývací plátky nebo komůrky jsou přidržovány v kontaktu s kůží vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

        1. 1.5.2.3.3. Pozorování a hodnocení
          1. — přibližně 21 hodin po odstranění plátku se provokační plocha zbaví srsti;
          2. — přibližně o tři hodiny později (přibližně 30 hodin po aplikaci provokačního plátku) se pozorují kožní reakce a zaznamenávají podle stupnice uvedené v dodatku;
          3. — přibližně po dalších 24 hodinách (tj. přibližně 54 hodin po aplikaci provokačního plátku) se kožní reakce znovu pozorují a zaznamenají.

          Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

          Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.

          Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona/Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

  1. 2. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ (GPMT A BUEHLERŮV TEST)

    Údaje se sestaví do tabulky, ze které musí být pro každé pokusné zvíře patrná reakce kůže při každém pozorování.

  1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA (GPMP A BUEHLERŮV TEST)

    Pokud byl proveden před zahájením testu na morčatech test screeningový, je třeba uvést popis tohoto testu nebo jeho citaci (např. LLNA - test regionálních lymfatických uzlin, MEST - test ztluštění ucha u myší) včetně všech podrobností postupu a výsledků získaných pro testované a referenční látky.

    1. 3.1. Zpráva o průběhu pokusu (GPMT a Buehlerův test)

      Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

      Pokusná zvířata:

      1. — použitý kmen morčat;
      2. — počet, stáří a pohlaví zvířat;
      3. — podmínky chovu, strava atd.;
      4. — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a konci testu.

      Experimentální podmínky:

      1. — způsob přípravy místa pro plátkový test;
      2. — podrobné informace o materiálech a technice plátkového testu;
      3. — výsledek pilotní studie se závěrem o indukčních a provokačních koncentracích pro vlastní test;
      4. — podrobné informace o přípravě, aplikaci a odstranění testované látky;
      5. — zdůvodnění výběru vehikula;
      6. — koncentrace a celková množství testované látky a vehikula, použitá pro indukci a provokaci.

      Výsledky:

      1. — souhrn výsledků poslední kontroly citlivosti a spolehlivosti (viz 1.3.) včetně použité referenční látky, její koncentrace a vehikula;
      2. — všechna pozorování pro každé zvíře včetně systému klasifikace;
      3. — slovní popis charakteru a stupně pozorovaných účinků;
      4. — všechny histopatologické nálezy.

      Diskuse výsledku

      Závěry

  1. 4. LITERATURA

    Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 406.

Dodatek

  1. 5.1 Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení vyvolaných patologických reakcí
    1. 0 = žádná viditelná změna;
    2. 1 = slabé nebo skvrnité zarudnutí kůže;
    3. 2 = středně výrazné a splývající zarudnutí kůže;
    4. 3 = intenzívní zarudnutí a zduření kůže.
  1. 5.2 Klasifikace potenciálu senzibilizace

    Podle frekvence pozitivity při provokační expozici, tj. podle toho kolik zvířat v rámci pokusu bylo danou látkou senzibilizováno, se látka klasifikuje jako

    1. slabý alergen (I.st.) - 0-8% zvířat
    2. mírný alergen (II.st.) - 9-28% zvířat
    3. středně silný alergen (III.st.) - 29-64% zvířat
    4. silný alergen (IV.st.) - 65-80% zvířat
    5. extrémní alergen (V.st.) - 81-100% zvířat
  1. B.7. SUBAKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ

    (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)

    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip testovací metody

        Testovaná látka se podává denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Pitva se provede u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během pokusu; také zvířata, která přežijí konec pokusu, se utratí a pitvají.

      1. 1.2. Popis metody
        1. 1.2.1. Příprava

          Zdravá mladá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní skupiny a jednotlivých experimentálních skupin. Klece jsou uspořádány tak, aby se co nejvíce vyloučil vliv umístění klece. Každé jednotlivé zvíře je jednoznačně označeno. Nejméně 5 dní před začátkem studie jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu.

          Testovanou látku lze podávat sondou nebo v potravě nebo v pitné vodě, podle účelu studie a fyzikálně-chemických vlastností látky.

          Pokud je to třeba, rozpustí nebo suspenduje se testovaná látka ve vhodném nosiči (vehikulu). Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku / suspenze, pak použití roztoku / emulze v jedlém rostlinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem. Je nezbytné ověřit stabilitu látky v zvoleném vehikulu.

        1. 1.2.2. Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1. Pokusná zvířata

            Dává se přednost potkanům, ale je možno použít i jiného druhu hlodavců. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavu a v každém případě dříve než zvířata dosáhnou věku 9 týdnů.

            Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

            Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít zvířata stejného kmene a ze stejného zdroje.

          1. 1.2.2.2. Počet a pohlaví

            Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu.

            Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

          1. 1.2.2.3. Volba dávek

            Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

            Pokud se podle dostupných informací nedá očekávat účinek při denní dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, je možno provést limitní test. Nejsou-li taková data k dispozici, lze provést předběžnou vyhledávací studii za účelem stanovení dávek.

            Při výběru dávek je třeba vzít v úvahu všechny existující údaje z toxikologických a toxikokinetických studií o testované látce případně látkách příbuzných.

            Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí ani velké utrpení. Dále se vyberou dávky v klesající řadě tak, aby umožnily prokázat závislost účinku na dávce. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity (NOAEL). Obvykle je vhodný dvoj- až čtyřnásobný odstup mezi sousedními dávkami; pokud je potřeba pokrýt větší rozsah dávek, je lepší přidat čtvrtou dávkovou skupinu, než zvolit příliš velký odstup mezi dávkami (např. faktor větší než 10).

            Pokud se testovaná látka podává v potravě nebo pitné vodě, je důležité zajistit, aby podávané množství látky neovlivňovalo výživu a vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.

            Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít stejné potravy.

          1. 1.2.2.4. Limitní test

            Neprokáže-li test provedený zde popisovaným způsobem žádné toxické účinky při dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti za den nebo při takové koncentraci v potravě nebo vodě, která této dávce odpovídá, a pokud toxicita testované látky nevyplývá z analogie s příbuznými látkami, je možno od provedení kompletního testování při třech dávkových úrovních upustit. Toto pravidlo limitního testu platí, pokud údaje o expozici lidí nenaznačují, že je třeba testovat při vyšších dávkách.

          1. 1.2.2.5. Doba pozorování

            Doba pozorování je 28 dní. Zvířata satelitní skupiny jsou pozorována nejméně dalších 14 dnů bez aplikace s cílem zachytit případné zpožděné účinky a pro posouzení přetrvávání nebo vratnosti účinku.

        1. 1.2.3. Popis postupu

          Zvířatům se podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů, ve zdůvodněných případech 5 dní v týdnu. Denní dávka se podává jednorázově žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. Objem by neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Neplatí to u látek dráždivých a leptavých, u kterých je třeba obvykle počítat se stupňovanými účinky při vyšších koncentracích.

          1. 1.2.3.1 Všeobecné pozorování

            Všeobecné klinické pozorování se provádí nejméně jednou denně, nejlépe v tutéž denní dobu a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po aplikaci. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede zběžná prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata moribundní a zvířata projevující silnou bolest nebo stres jsou vyřazena, utracena humánním způsobem a pitvána.

            Důkladné klinické vyšetření všech zvířat se provede před první aplikací (za účelem intraindividuálního porovnání) a dále nejméně jednou týdně. Toto pozorování se děje mimo chovnou klec v standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou denní dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému, standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily co nejméně; osoba, provádějící pozorování by nejlépe neměla znát příslušnost zvířat do dávkových skupin.

            Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů, změny dýchání a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic) a případně další. Zaznamenávají se změny chůze, polohy, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (vytrvalé čisticí pohyby nebo kroužení) nebo bizarních vzorců chování (např. sebepoškozování, pohyb pozadu).

            Ve čtvrtém týdnu aplikace se otestují reakce na různé senzorické podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), změří se síla úchopu a celková motorická aktivita. Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v literatuře (viz Všeobecný úvod, část B).

            Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu aplikace lze případně vynechat, pokud 28-denní studie slouží jako předběžná studie pro následující studii subchronickou (90-denní); v tom případě je pozorování funkčních poruch zařazeno do této dlouhodobé studie. Ovšem i v tomto případě jsou údaje o funkčních poruchách ve čtvrtém týdnu 28-denní studie vhodným východiskem pro výběr dávek pro subchronickou studii.

            Výjimečně lze vynechat pozorování funkčních poruch u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu zvířete vadily.

          1. 1.2.3.2 Tělesná hmotnost a příjem potravy a vody

            Zvířata se váží nejméně jednou týdně. Spotřeba potravy a vody se měří nejméně jednou týdně, také v případě aplikace v pitné vodě.

          1. 1.2.3.3 Hematologie

            Hematologické vyšetření na konci pokusu zahrnuje stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a změření srážlivosti krve.

            Krev se odebere těsně před nebo v průběhu utracení zvířete, místo odkud se krev odebrala se zaznamená. Krev se skladuje za vhodných podmínek.

          1. 1.2.3.4 Biochemická analýza

            Biochemická analýz krve za účelem posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na játra a ledviny, se provede u všech zvířat těsně před nebo v průběhu utracení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Doporučuje se nechat zvířata bez potravy přes noc před odběrem krve(11). Vyšetření plazmy a sera zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových proteinů, albuminu, aktivity alespoň dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky ( jako alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama glutamyltranspeptidáza, sorbitoldehydrogenáza). Změření dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v některých případech poskytnout užitečné informace.

            Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev příp. krvinky.

            Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru.

            Další charakteristiky je třeba stanovit u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce: stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno, lipidů, specifických hormonů, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

            Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované nebo očekávané účinky dané látky.

            Pokud nejsou k dispozici údaje o normálních hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba uvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie.

          1. 1.2.3.5. Pitva

            U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů, dutiny lební, hrudní a břišní, a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat se řádně očistí od ulpěných tkání a co nejdříve po sekci se zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

            Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými změnami, mozek (reprezentativní oblasti včetně hemisfér, mozečku a mostu), míchu, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezinu, srdce, brzlík, štítnou žlázu, průdušnici a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a pak ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. dělohu, prostatu), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zvolit i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba uchovat.

          1. 1.2.3.6. Histopatologická vyšetření

            U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

            Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

            U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

    1. 2. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

      K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úmrtí jednotlivých zvířat, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

      Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

      Pokusná zvířata:

      1. — živočišný druh / kmen;
      2. — počet, stáří a pohlaví zvířat;
      3. — zdroj, podmínky chovu, potrava atd.;
      4. — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu, dále v týdenních intervalech a na konci testu.

      Podmínky testování:

      1. — zdůvodnění výběru vehikula, pokud je jiné než voda;
      2. — zdůvodnění výběru dávek;
      3. — podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě diety, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku;
      4. — podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
      5. — přepočet z koncentrace látky v dietě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg na kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v dietě nebo vodě);
      6. — podrobné údaje o potravě a kvalitě vody (včetně druhu a zdroje);

      Výsledky:

      1. — tělesná hmotnost a její změny;
      2. — spotřeba potravy a vody;
      3. — údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávkové úrovně, včetně popisu příznaků toxicity;
      4. — povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda jsou vratné nebo nevratné;
      5. — posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity;
      6. — výsledky hematologického vyšetření s příslušnými normami;
      7. — výsledky biochemického vyšetření s příslušnými normami;
      8. — tělesná hmotnost při utracení a hmotnosti orgánů;
      9. — pitevní nálezy;
      10. — podrobný popis všech histopatologických nálezů;
      11. — údaje o absorpci, pokud byly získány;
      12. — statistické zpracování výsledků.

      Diskuse výsledků:

      Závěry:

    1. 4. LITERATURA

      Tato metoda je analogická metodě OECD TG 407.

  1. B.8. SUBAKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Úvod

        Před pokusem je třeba získat údaje o testované látce: rozdělení velikosti částic, tenze par, bod tání, bod varu, bod vzplanutí a výbušnost (jsou-li stanovitelné).

      1. 1.2 Princip metody

        Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 28 dní. Použije-li se pro dosažení vhodné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

      1. 1.3 Popis metody
        1. 1.3.1 Příprava

          Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

        1. 1.3.2 Experimentální podmínky
          1. 1.3.2.1 Pokusná zvířata

            Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).

          1. 1.3.2.2 Počet a pohlaví

            Pro každou testovanou skupinu je třeba použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat vysoké koncentraci satelitní skupinu 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů a během následujících 14 dnů sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

          1. 1.3.2.3 Expoziční koncentrace

            Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina, případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se užije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší koncentrace by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

          1. 1.3.2.4 Trvání expozice

            Trvání expozice má být 6 hodin denně; v případě specifických požadavků je možné použit i jiných dob expozice.

          1. 1.3.2.5 Expoziční zařízení

            Pro pokusy se zvířaty se používá dynamické expoziční zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se zamezilo co nejvíce shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5% objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

          1. 1.3.2.6 Doba pozorování

            Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozice i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

        1. 1.3.3 Popis postupu

          Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 28 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 14 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírně negativního tlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.

          Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací.

          Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

          Měření nebo monitorování podmínek expozice:

          1. a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
          2. b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zoně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15%.. U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic týdně v každé testované skupině.
          3. c) Teplota a vlhkost vzduchu pokud možno kontinuálně.

          Během expozice a po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.

          Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

          Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:

          1. 1. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
          2. 2. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferasa v séru (dříve známá jako glutamátpyruvát-transaminasa), aspartátaminotransferasa séra (dříve známá jako glutamátoxalacetát-transaminasa), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.

          Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.

          Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

          1. 1.3.3.1 Pitva

            U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně (dýchací systém, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny a srdce, i všechny orgány s makroskopickými změnami nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření. Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným mediem, tak aby se zachovala struktura.

          1. 1.3.3.2 Histopatologické vyšetření

            U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší koncentrace, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.

      Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

        Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto k informace:

        1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ústájení, krmení atd.,
        2. - podmínky pokusu: popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis likvidace odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu,
        3. - údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají pokud možno obsahovat tyto údaje: a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením; b) teplota a vlhkost vzduchu; c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu); d) povaha vehikula, pokud bylo užito; e) skutečná koncentrace v dýchací zóně; f) hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (GSD),
        4. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
        5. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
        6. - popis toxických nebo jiných účinků,
        7. - úroveň bez účinku,
        8. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky, a jejich další vývoj,
        9. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
        10. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
        11. - biochemická vyšetření a jejich výsledky,
        12. - pitevní nálezy,
        13. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
        14. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
        15. - diskuse výsledků,
        16. - interpretace výsledků.
  1. B.9. SUBAKUTNÍ TOXICITA - DERMÁLNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip testovací metody

        Testovaná látka se nanáší na kůži denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava

          Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10% povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu. Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba danou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

            Je možno používat dospělé potkany, králíky nebo morčata. Je možno použít i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty.

          1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

            Pro každou hladinu dávek použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

          1. 1.2.2.3 Dávkování

            Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které se aplikuje skupině s nejvyšší dávkou. Nejvyšší dávka má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední dávkou a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

            Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové úrovně může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.

          1. 1.2.2.4 Limitní test

            Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.

          1. 1.2.2.5 Doba pozorování

            Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky otravy. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a dobu, kdy se objeví a případně opět odezní příznaky otravy.

        1. 1.2.3 Popis postupu

          Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 28 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 14 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.

          Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla; u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.

          Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou immobilizaci však nelze doporučit. Jako alternativní metody je možno použít " ochranného límce“.

          Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo s použitím jiného vhodného způsobu očištění pokožky.

          Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

          Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:

          1. 1. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
          2. 2. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferasa v séru (dříve známá jako glutamátpyruvát-transaminasa), aspartátaminotransferasa séra (dříve glutamát-oxalacetáttransaminasa), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.

          Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.

          Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

          1. 1.2.3.1 Pitva

            U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně např. normální a exponovaná kůže, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny, srdce i všechny orgány s makroskopickými lézemi nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření.

          1. 1.2.3.2 Histopatologické vyšetření

            U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou, objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.

      Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

        Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

        1. - údaje o zvířatech (druh, kmen, původ, podmínkách chovu, krmení atd.),
        2. - experimentální podmínky ( včetně druhu obvazu; okluzivní nebo neokluzivní),
        3. - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
        4. - úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
        5. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a dávky,
        6. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
        7. - toxické nebo jiné účinky,
        8. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
        9. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
        10. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
        11. - biochemická vyšetření a jejich výsledky,
        12. - pitevní nálezy,
        13. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
        14. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
        15. - diskuse výsledků,
        16. - interpretace výsledků.
  1. B.10. MUTAGENITA (“IN VITRO“ CYTOGENETICKÝ TEST NA SAVČÍCH BUŇKÁCH)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Tento cytogenetický test in vitro je krátkodobý test mutagenity pro detekci strukturálních aberací chromozomů v kultivovaných savčích buňkách. Lze použít jak kultur stabilizovaných buněčných linií, tak primárních kultur. Po expozici testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti savčího exogenního metabolického aktivačního systému je do buněčné kultury aplikován mitotický jed (např. kolchidin) ke kumulaci dělících se buněk (C metafáze). Buňky jsou ve vhodné době zpracovány a pak připraveny mikroskopické preparáty. Preparáty jsou obarveny a metafáze jsou analyzovány z hlediska chromozomálních abnormalit.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava
          1. 1.2.1.1 Buňky

            Používají se stabilizované buněčné linie, nebo kultury primárních buněk, např. buňky čínského křečka nebo lidské lymfocyty. Před aplikací na buňky se testované chemické látky rozpustí v kultivačním médiu nebo ve vhodném vehikulu.

          1. 1.2.1.2 Metabolický aktivační systém

            Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i za absence vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji je používána post-mitochondriální frakce doplněná kofaktory, připravená z jater hlodavců ovlivněných enzymatickým induktorem.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky

          Počet kultur

          Pro každý experimentální bod se používají nejméně dvě kultury.

          Negativní a positivní kontroly

          Rozpouštědlo (jestliže jako rozpouštědlo není použito kultivační médium nebo voda), aktivační směs, aktivační směs a rozpouštědlo, a neovlivněná kultura jsou použity jako negativní kontroly.

          Mimoto zahrnuje každý experiment pozitivní kontrolu. Použije-li se k aktivaci testované chemické látky směs pro metabolickou aktivaci, je třeba jako pozitivní kontrolu použít sloučeninu, která prokazatelně vyžaduje metabolickou aktivaci.

          Koncentrace

          Je třeba použít nejméně tři koncentrace studované látky. Rozpětí koncentrací by mělo být takové, aby se hodnota dekadického logaritmu lišila nejméně o jednu, přičemž nejvyšší koncentrace by měla blokovat mitotickou aktivitu asi o 50 %, nebo vykazovat jiné známky cytotoxicity. Jestliže není látka toxická, měla by být testována až na hranici rozpustnosti, nebo do maximální koncentrace 5 mg/ml.

          Kultivační podmínky

          Je třeba používat vhodná kultivační média a dodržovat kultivační podmínky (např. teplotu, kultivační nádoby, koncentraci CO2 a vlhkost).

        1. 1.2.3 Popis postupu
          1. 1.2.3.1 Příprava kultur

            Stabilizované buněčné linie: Buňky se získají ze zásobních kultur (např. trypsinací nebo setřepáním), vysejí se ve vhodné hustotě do kultivačních nádob a kultivují při 37 °C.

            Lidské lymfocyty: ke kultivačnímu médiu se přidá fytohemaglutinin, bovinní sérum, antibiotika a plná heparinizovaná krev. Kultivace probíhá při 37 °C.

          1. 1.2.3.2 Expozice kultur testované látce

            (a) Expozice bez směsi pro metabolickou aktivaci

            Je třeba, aby všechny expozice pokrývaly nejméně trvání jednoho celého buněčného cyklu. Okamžik fixace je třeba volit tak, aby byly analyzovány první vyskytnuvší se mitózy po expozici.

            Pokud expozice nepokrývá celou dobu buněčného cyklu, je třeba volit různé doby fixace, aby se akumulovaly buňky, které byly během expozice v různých fázích buněčného cyklu (tj. G1, S a G2).

            Testované chemické látky se přidávají ke kulturám stabilizovaných buněčných linií v exponenciální fázi růstu. Kultury lidských lymfocytů se exponují v semisynchronní fázi růstu.

            (b) Expozice se směsí pro metabolickou aktivaci

            Testovaná látka by měla být přítomna spolu s aktivačním systémem co nejdéle, aniž by přitom vyvolávala toxický účinek na buňky. Pokud by tato expozice neměla z důvodu toxicity obsáhnout dobu celého buněčného cyklu, je třeba volit různé doby fixace, aby se akumulovaly buňky, které byly během expozice v různých fázích buněčného cyklu (např.G1, S a G2).

            Zpracování buněk:

            Buněčné kultury jsou ovlivněny inhibitorem dělícího vřeténka po odpovídající dobu před jejich zpracováním. Každá kultura je zpracovávána pro přípravu preparátů k analýze chromozómů samostatně.

            Je potřeba buňky zpracovat nejméně ve dvou časových bodech. Doporučuje se, aby jeden časový bod odpovídal přibližně jednomu buněčnému cyklu a druhý byl později. Tím se mají pokrýt všechny fáze buněčného cyklu a počítat s jeho případným zpožděním.

          1. 1.2.3.3 Analýza chromozómů - příprava mikroskopických preparátů

            Příprava zahrnuje vystavení buněk hypotonizaci, fixaci, nanesení na podložní sklíčko a obarvení.

            Analýza

            Nejméně 100 dobře rozprostřených metafází na kulturu se analyzuje na chromozomové aberace. Podložní sklíčka se před analýzou zakódují. U lidských lymfocytů se analyzují pouze metafáze se 46 centromerami.

            Ve stabilizovaných buněčných liniích se vyhodnocují metafáze, jejichž počet se od modálního počtu liší o ± 2 centromery.

            Kromě toho je třeba pro každou dávkovou úroveň zhodnotit mitotický index nebo jiný ukazatel cytotoxicity.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se shrnou do tabulky. Aberace chromatidového typu (gapy, zlomy, výměny), aberace chromozomového typu (gapy, zlomy, minutes, prstence, dicentrické a polycentrické chromozomy) a počet aberantních metafází (včetně gapů a bez gapů) se uvedou samostatně pro všechny exponované kultury a kontrolní kultury.

      Údaje se zpracují odpovídajícími statistickými metodami.

      Výsledky se porovnají s odpovídajícími negativními kontrolami.

      Provádějí se nejméně 2 nezávislé experimenty. Jeden experiment bude postačující, je-li to vědecky zdůvodnitelné. Není nezbytně nutné provádět druhý experiment za zcela identických podmínek jako první experiment. K získání užitečných údajů je možné některé podmínky druhého experimentu pozměnit.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

      1. - použité buňky,
      2. - experimentální podmínky: složení média, koncentrace CO2, teplota při kultivaci, doba kultivace, dávkování, doba expozice, doba působení a koncentrace mitotického jedu, typ metabolického aktivačního systému, pozitivní a negativní kontroly,
      3. - počet buněčných kultur,
      4. - počet analyzovaných metafází (samostatné údaje pro jednotlivé kultury,
      5. - mitotický index nebo jiné známky cytotoxicity
      6. - typ a počet aberací pro exponovanou a kontrolní kulturu, modální počet chromozomů v použitých stabilizovaných buněčných liniích,
      7. - statistické vyhodnocení,
      8. - diskuse výsledků,
      9. - vyhodnocení výsledků.
  1. B.11. MUTAGENITA (“IN VIVO“ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA CHROMOSOMŮ KOSTNÍ DŘENĚ SAVCŮ)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Tento cytogenetický test in vivo je krátkodobý test mutagenity pro detekci strukturálních chromozomových aberací. Všeobecně se analyzují chromozomové aberace v prvních mitózách po expozici. U chemických mutagenů je většina indukovaných aberací chromatidového typu.

        Při této metodě se používají savci, kterým se vhodnou cestou aplikují testované látky a kteří se v určitých okamžicích usmrtí pro zpracování buněk kostní dřeně. Před usmrcením zvířat se tato navíc exponují mitotickému jedu, např. kolchicinu, ke kumulaci dělících se buněk (C-metafáze). Z buněk se připraví mikroskopické preparáty sušené na vzduchu a obarví se. Metafáze se mikroskopicky vyšetřují k určení chromozomových aberací.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava

          Testované látky se rozpustí ve fyziologickém roztoku. Pokud jsou v něm nerozpustné, rozpustí se nebo suspendují ve vhodném vehikulu.

          Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Použije-li se pro usnadnění dávkování vehikulum, nesmí ani reagovat s testovanou látkou, ani působit toxicky.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

            Používají se hlodavci, např. potkani, myši nebo čínští křečci. Zdravá dospělá zvířata v mladém věku se náhodně rozdělí do exponovaných a kontrolních skupin.

          1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

            V každé experimentální i kontrolní skupině se používá nejméně pět samic a pět samců. Pokud plán experimentu předpokládá více intervalů zpracování po expozici, je třeba použít 10 zvířat na každý interval zpracování a skupinu.

            Pro skupinu positivní kontroly postačuje jeden časový interval zpracování buněk.

          1. 1.2.2.3 Způsob aplikace

            Obvykle by se měly testované látky aplikovat jen jednou. Na základě toxikologických informací jsou možné opakované aplikace. Jsou však na místě jen tam, kde testovaná látka nemá žádné cytotoxické účinky na buňky kostní dřeně. Obvyklými způsoby aplikace jsou orální aplikace nebo intraperitoneální injekce. Podle potřeby jsou vhodné i jiné způsoby aplikace.

          1. 1.2.2.4 Negativní a positivní kontroly

            Pro pozitivní kontrolu se používá látka, o které je známo, že způsobuje in vivo chromozomové aberace. Negativní kontrolní skupina (s rozpouštědlem) tvoří rovněž součást každého experimentu.

          1. 1.2.2.5 Volba dávek

            V základním kroku se používá jedna dávka testované látky. Jde o maximální tolerovanou dávku nebo takovou dávku, která vyvolává určité příznaky cytotoxicity, např. částečnou inhibici mitózy.

            Maximální (limitní) dávka u „netoxických“ sloučenin, jejíž efekt po jednorázové aplikaci musí být zhodnocen, je 2 000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.

            Jestliže se použije opakované dávkování, limitní dávka je 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti a den.

            Je možno zvolit další dávky, je-li pro to vědecký podklad.

            Pokud test slouží jako verifikační metoda, měla by se použít nejméně dvě další dávkování.

        1. 1.2.3 Popis postupu

          Test může být proveden dvěmi různými způsoby:

          (a) Zvířatům se jednou aplikuje maximální tolerovaná dávka. Buňky jsou odebírány 24 h po aplikaci. Jestliže výsledky jsou v této fázi jasně positivní, další odběr buněk není nutný. Jestliže však výsledky jsou negativní, nebo pochybné, zvolí se dva časové intervaly odběru buněk v rozmezí 6 - 48 h, aby testovanou látkou byl ovlivněn celý buněčný cyklus.

          Jestliže jsou použity další úrovně dávek, zpracování by se mělo provést v nejcitlivějším časovém intervalu a pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.

          (b) Pokud z informací o farmakokinetice a metabolismu vyplývá, že jsou vhodné opakované aplikace, jsou možné. Zvířata by se pak měla usmrtit 6 a 24 hodin po poslední aplikaci.

          Zpracování kostní dřeně

          Před usmrcením zvířat se jim intraperitoneálně vstříkne vhodná dávka mitotického jedu, aby se získal dostatečně velký počet buněk, které jsou v C-metafázi. Kostní dřeň se získá vypláchnutím izotonickým roztokem z obou stehenních kostí zvířat, která byla usmrcena bezprostředně předtím. Po vhodném hypotonickém zpracování se buňky fixují, nakapou na sklíčko a po vysušení na vzduchu se obarví.

          Analýza

          Podložní sklíčka se před mikroskopickou analýzou zakódují. Na jedno zvíře se vyšetřuje na strukturální chromozómové aberace nejméně 50 dobře rozprostřených metafází s úplným počtem centromer. Mimoto je možno pro každé zvíře stanovit mitotický index.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se shrnou do tabulky. Chromatidové a izochromatidové aberace (gapy, zlomy, výměny), a mitotické indexy, pokud byly zjištěny, se uvedou samostatně pro všechna exponovaná i kontrolní zvířata. Mimoto je třeba pro každou experimentální i kontrolní skupinu uvést průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

      1. - druh, kmen a stáří použitých zvířat,
      2. - počet zvířat (samců/samic) v experimentálních a kontrolních skupinách,
      3. - experimentální podmínky: detailní popis expozice resp. odběr vzorků, dávkování, trvání expozice, použitý mitotický jed a jeho koncentrace,
      4. - počet analyzovaných metafází na jedno zvíře,
      5. - mitotický index, pokud je znám,
      6. - druh a počet aberací samostatně pro exponovaná a kontrolní zvířata,
      7. - statistické vyhodnocení,
      8. - diskuse výsledků,
      9. - vyhodnocení výsledků.
  1. B.12. MUTAGENITA (MICRONUCLEUS TEST)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Mikronukleus test je krátkodobý test pro důkaz poškození chromozomů nebo poškození dělicího aparátu chemickými látkami in vivo. Základem této metody je zvýšený výskyt mikrojader v polychromatických erytrocytech exponovaných zvířat ve srovnání s kontrolními zvířaty.

        Mikrojádra se tvoří z fragmentů chromozomů nebo celých chromozómů opožděných v mitóse. Při vývoji erytrocytů z erytroblastů je jádro vytlačeno, zatímco mikronukleus může zůstat v cytoplasmě. V tomto testu se proto vyhodnocují mladé polychromní erytrocyty z kostní dřeně laboratorních savců, kterým byla vhodnou cestou aplikována testovaná látka. Kostní dřeň se vypláchne ze stehenních kostí zvířat, zhotoví se nátěry a obarví se. Mikroskopicky se zjišťuje počet mikrojader v polychromních erytrocytech a mimoto se stanoví poměr polychromních erytrocytů k normochromním.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava

          Testované látky se rozpustí v isotonickém roztoku. Pokud jsou v něm nerozpustné, rozpustí se nebo se suspendují ve vhodném vehikulu. Použije-li se vehikulum, nesmí ani reagovat s testovanou látkou, ani působit toxicky. Obvykle se používají čerstvě připravené roztoky testované látky.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

            Doporučuje se používat myši, je však možno používat i jiné savce. Zdravá dospělá zvířata v mladém věku se náhodně rozdělí do exponovaných a kontrolních skupin.

          1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

            V každé experimentální i kontrolní skupině se používá nejméně pět samic a pět samců. Pokud plán experimentu předpokládá více intervalů zpracování po expozici, je třeba použít 10 zvířat na každý interval zpracování a skupinu. Pro skupinu positivní kontroly postačuje jeden časový interval zpracování buněk.

          1. 1.2.2.3 Způsob aplikace

            Obvykle by se měly testované látky aplikovat jen jednou. Na základě toxikologických informací jsou možné opakované aplikace. Jsou však na místě jen tam, kde testovaná látka nemá žádné cytotoxické účinky na buňky kostní dřeně. Obvyklými způsoby aplikace jsou orální aplikace nebo intraperitoneální injekce. Podle potřeby jsou vhodné i jiné způsoby aplikace.

          1. 1.2.2.4 Negativní a positivní kontroly

            Při každém experimentu se používají jak pozitivní, tak negativní (s rozpouštědlem) kontroly.

          1. 1.2.2.5 Volba dávek

            V základním kroku se používá jedna dávka testované látky. Jde o maximální tolerovanou dávku nebo takovou dávku, která vyvolává určité příznaky cytotoxicity, např. změnu v poměru polychromních a normochromních erytrocytů

            Maximální (limitní) dávka u „netoxických“ sloučenin, jejíž efekt po jednorázové aplikaci musí být zhodnocen, je 2 000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.

            Jestliže se použije opakované dávkování, limitní dávka je 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti a den.

            Je možno zvolit další dávky, je-li pro to vědecký podklad.

            Pokud test slouží jako verifikační metoda, měla by se použít nejméně dvě další dávkování.

        1. 1.2.3 Popis postupu

          Test může probíhat dvěma různými způsoby:

          (a) Zvířata jsou exponována testované látce jednou. Zpracování by se mělo provést v okamžiku nejvyšší četnosti mikrojader, který se však může lišit u různých látek. Proto je kostní dřeň odebírána nejméně ve dvou intervalech ne však dříve než 12 h a ne později než 48 h po aplikaci testované látky.

          Jestliže jsou použity další úrovně dávek, zpracování by se mělo provést v nejcitlivějším okamžiku a pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.

          (b) Pokud z informací o farmakokinetice a metabolismu vyplývá, že jsou vhodné opakované aplikace, je možné je použít. Zvířata by se pak měla usmrtit v jednom intervalu ne dříve, než 12 h po poslední aplikaci.

          Zpracování kostní dřeně

          Kostní dřeň se získá vypláchnutím bovinním sérem z obou stehenních kostí zvířat, která byla usmrcena bezprostředně předtím. Sedimentace buněk se provádí centrifugováním, supernatant se odstraní. Kapky homogenní buněčné suspenze se nanesou na podložní sklíčko, připraví se nátěry a po vysušení na vzduchu se obarví.

          Analýza

          Podložní sklíčka se před mikroskopickou analýzou zakódují. Na jedno zvíře se pro stanovení četnosti mikronukleů analyzuje nejméně 1000 polychromních erytrocytů.

          Poměr normochromních erytrocytů k polychromním se stanoví pro každé jednotlivé zvíře z 1000 erytrocytů.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se shrnou do tabulky. Počet vyhodnocených polychromních erytrocytů, počet polychromních erytrocytů s mikronukley, procento buněk s mikronukley a poměr normochromních a polychromních erytrocytů se uvedou samostatně pro všechna exponovaná zvířata i pro kontrolní zvířata. Mimoto je třeba pro každou experimentální i kontrolní skupinu uvést průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

      1. - druh, kmen a stáří použitých zvířat,
      2. - počet zvířat (samců/samic) v experimentálních a kontrolních skupinách,
      3. - experimentální podmínky: detailní popis expozice a odběru vzorků, dávkování, údaje o toxicitě, o negativních a pozitivních kontrolách,
      4. - kritéria pro klasifikaci mikronukleů,
      5. - vztah dávka-účinek, je-li to možné
      6. - statistické vyhodnocení,
      7. - diskuse výsledků,
      8. - vyhodnocení výsledků.
  1. B.13. MUTAGENITA (ESCHERICHIA COLI - TEST ZPĚTNÉ MUTACE)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Reverzní systém na tryptofanu (trp) závislých kmenů E. coli je mikrobiální test, v němž se měří změna trp- → trp+ indukovaná chemickými látkami, které způsobují záměny bazí v genomu organismu.

        Bakterie se vystaví působení testované látky s přídavkem a bez přídavku systému metabolické aktivace. Po přiměřené inkubační době na minimálním médiu se spočítají kolonie revertant a porovnají s počtem spontánních revertujících buněk v neovlivněné kontrolní kultuře a v kontrolní kultuře s přídavkem pouze rozpouštědla.

      1. 1.2 Popis metody

        K provedení experimentu je možno použít dvou metod:

        (1) metody s předinkubací

        (2) přímý miskový test; při něm se smísí bakterie a testovaná látka s vrchním agarem a vylije se na povrch Petriho misky se selektivním médiem.

        1. 1.2.1 Příprava
          1. 1.2.1.1 Bakterie

            Bakterie se kultivují při 37 °C do pozdní exponenciální, resp. do časné stacionární fáze. Hustota buněk má činit asi 108 - 109 na 1 ml.

          1. 1.2.1.2 Metabolická aktivace

            Bakterie mají být vystaveny působení testované látky jak s přídavkem, tak i bez přídavku vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaný systém je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Testovací kmeny

            Používají se tři kmeny - WP2, WP2 uvr A a WP2 uvr A pKM 101. Je nezbytné používat standardizované metody kultivace a uchovávání kultur kmenů. Je třeba kontrolovat podmínky růstu a genetické vlastnosti kmenů, jejich citlivost vůči ultrafialovému záření a mitomycinu C a rezistenci kmene WP2 uvr A pKM 101 vůči ampicilinu. Počet spontánních revertant má být pro všechny kmeny v rozmezí očekávaného rozptylu.

          1. 1.2.2.2 Média

            Pro růst a selekci mutantů se používá vhodné selektivní médium společně s vhodným vrchním agarem.

          1. 1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

            Je nutno současně nasadit jak neexponované kultury, tak kultury doplněné rozpouštědly. Pozitivní kontroly je nutno provádět pro tyto dva účely:

            1. a) Potvrzení citlivosti bakteriálních kmenů. Pro testy bez metabolické aktivace je možno jako positivní kontroly používat metylmetansulfonát, 4-nitrochinolinoxid nebo etylnitrosomočovinu.
            2. b) Důkaz aktivity odpovídajícího metabolického aktivačního systému. Jako pozitivní kontrolní látka je pro ověření metabolické aktivity pro všechny kmeny vhodný 2-aminoantracen. Pokud je to možné, měla by se pozitivní kontrola provést s látkou, která patří ke stejné třídě chemických látek jako testovaná látka.
          1. 1.2.2.4 Koncentrace testované látky na jednu misku

            Použije se nejméně pět různých koncentrací testované látky, které se od sebe liší o semilogaritmické rozdíly. Látky se zkoušejí až po mez rozpustnosti resp. toxicity. Toxicita se prokáže snížením počtu spontánních revertant, sníženým růstem pozadí nebo na základě přežívání bakterií v exponovaných kulturách. Netoxické látky je třeba testovat až do koncentrace 5 mg/misku, než je možno je považovat za negativní.

          1. 1.2.2.5 Podmínky inkubace

            Inkubace misek se provádí při 37 °C 48 až 72 hodin.

        1. 1.2.3 Popis postupu

          Při přímém miskovém testu bez metabolické aktivace se přidá testovaná látka a 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury k 2,0 ml vrchního agaru. Při testech s metabolickou aktivací se po přidání testované látky a bakterií k vrchnímu agaru přidá 0,5 ml aktivační směsi s vhodným množstvím postmitochondriální frakce. Obsah každé zkumavky se promísí a vylije na povrch misky se selektivním médiem. Po ztuhnutí vrchního agaru se misky inkubují při 37 °C 48 až 72 hodin. Po uplynutí inkubační doby se spočítají revertantní kolonie na misku.

          Při metodě s předinkubací se připraví směs z testované látky, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury a vhodného množství aktivační směsi nebo stejného množství tlumivého roztoku a určitou dobu se inkubuje, než se přidá 2,0 ml vrchního agaru. Další průběh se neliší od miskové metody.

          U obou metod je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci.

    1. 2. ÚDAJE

      Uvedou se počty revertantních kolonií na misku jak pro kontrolní série, tak pro série s testovanou látkou. Je třeba uvést jednotlivé i průměrné hodnoty revertant na misku a směrodatné odchylky jak pro testovanou látku, tak pro kontrolní stanovení.

      Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.

      Je třeba provést nejméně dva nezávislé pokusy. Není nutné, aby druhý pokus proběhl identicky s prvním experimentem. Může být výhodné změnit určité podmínky testu a získat tak další důležité údaje.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

      1. - bakterie a použité kmeny;
      2. - experimentální podmínky: koncentrace, toxicita, složení médií, metodika (preinkubace - inkubace), metabolický aktivační systém, referenční látky, negativní kontroly;
      3. - počet kolonií na misku, průměrná hodnota revertant na misku, směrodatná odchylka, vztah dávka-účinek, pokud je to možné;
      4. - diskuse výsledků;
      5. - vyhodnocení výsledků.
  1. B.14. MUTAGENITA (SALMONELLA TYPHIMURIUM - TEST ZPĚTNÉ MUTACE)
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Reverzní systém na histidinu (his) závislých kmenů Salmonelly typhimurium je mikrobiální test, ve kterém se měří změna his- → his+ indukovaná chemickými látkami typu záměny bazí nebo posunových mutací v genomu organismu.

        Bakterie se vystaví působení testované látky s přídavkem a bez přídavku metabolického aktivačního systému a nanesou se na minimální médium. Po přiměřené inkubační době se spočítají kolonie revertovaných buněk a porovnají s počtem spontánních revertant v neexponované kontrolní kultuře a v kontrolní kultuře s přídavkem pouze rozpouštědla.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava
          1. 1.2.1.1 Bakterie

            Čerstvě připravené bakteriální kultury se kultivují při 37 °C do pozdní exponenciální, resp. do časné stacionární fáze růstu. Hustota buněk má činit asi 108 - 109 buněk na ml.

          1. 1.2.1.2 Metabolická aktivace

            Bakterie mají být vystaveny působení testované látky jak s přídavkem, tak i bez přídavku vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaný systém je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Testovací kmeny

            Je třeba použít nejméně čtyři kmeny - TA 1535, TA 1537 nebo TA 97, TA 98 a TA 100. Doplňkově je možno používat další kmeny jako TA 1538 a TA102. Je nezbytné používat jednotné metody kultivace a uchovávání kultur kmenů. Musí být kontrolovány podmínky růstu a genetické vlastnosti kmenů, jejich citlivost vůči ultrafialovému záření a krystalové violeti a jejich rezistenci vůči ampicilinu. Počet spontánních revertant se má pohybovat pro všechny kmeny v rozmezí očekávaného rozptylu.

          1. 1.2.2.2 Média

            Je třeba používat vhodné selektivní médium v kombinaci s vhodným vrchním agarem.

          1. 1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

            Je nutno současně nasadit jak neexponované kultury, tak kontrolní kultury exponované rozpouštědlům.

            Pozitivní kontroly je nutno provádět pro tyto dva účely:

            1. a) Potvrzení citlivosti bakteriálních kmenů. Pro testy bez metabolické aktivace je možno používat tyto látky:
              Dodatek Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace: Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu
              KmenLátka používaná pro reverzi
              TA 1535, TA 100azid sodný
              TA 1538, TA 98, TA 972-nitrofluoren
              TA 15379-aminoakridin
              TA 102kumenhydroperoxid
            1. b) Důkaz aktivity vhodného metabolizujícího systému. Jako pozitivní kontrolní látka je pro ověření metabolické aktivity pro všechny kmeny vhodný 2-aminoantracen. Pokud je to možné, měla by se pozitivní kontrola provést s látkou, která patří ke stejné třídě chemických látek jako testovaná látka.
          1. 1.2.2.4 Koncentrace testované látky na jednu misku

            Použije se nejméně pět různých koncentrací testované látky, které se od sebe liší o semilogaritmické rozdíly. Látky se zkoušejí až po mez rozpustnosti resp. toxicity. Toxicita se prokáže snížením počtu spontánních revertant, sníženým růstem pozadí nebo podle přežívání bakterií v exponovaných kulturách. Netoxické látky je třeba zkoušet až do koncentrace 5 mg/misku, než je možno je považovat za negativní.

          1. 1.2.2.5 Podmínky inkubace

            Inkubace misek se provádí při 37 °C 48 až 72 hodin.

        1. 1.2.3 Popis postupu

          Při přímém miskovém testu bez metabolické aktivace se přidá testovaná látka a 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury k 2,0 ml vrchního agaru. Při testech s metabolickou aktivací se po přidání testované látky a bakterií k vrchnímu agaru přidá 0,5 ml aktivační směsi s vhodným množstvím postmitochondriální frakce. Obsah každé zkumavky se promísí a vylije na povrch misky se selektivním médiem. Po ztuhnutí vrchního agaru se misky inkubují při 37 °C 48 až 72 hodiny. Po uplynutí inkubační doby se spočítají revertantní kolonie na misku. Při metodě s předinkubací se připraví směs sledované látky, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury, vhodného množství aktivační směsi nebo stejného množství tlumivého roztoku a předběžně se inkubuje, načež se přidá 2,0 ml vrchního agaru. Další průběh se neliší od miskové metody.

          U obou metod je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci.

    1. 2. ÚDAJE

      Uvedou se počty revertantních kolonií na misku jak pro kontrolní série, tak pro série s testovanou látkou.

      Je třeba uvést jednotlivé i průměrné hodnoty revertantních kolonií na misku a směrodatné odchylky jak pro testovanou látku, tak pro kontrolní stanovení.

      Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.

      Je třeba provést nejméně dva nezávislé pokusy. Není nutné, aby druhý pokus proběhl identicky s prvním experimentem. Může být výhodné změnit určité podmínky testu a získat tak další důležité údaje.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje pokud možno tyto informace:

      1. - bakterie a použitý kmen,
      2. - experimentální podmínky: koncentrace, toxicita, složení médií, metody (preinkubace - inkubace), metabolický aktivační systém, referenční látky, negativní kontroly,
      3. - počet kolonií na misku, průměrná hodnota revertantních kolonií na misku, směrodatná odchylka, vztah dávka-účinek, pokud je to možné,
      4. - diskuse výsledků,
      5. - vyhodnocení výsledků.
  1. B.15 GENOVÉ MUTACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip metody

        Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být užity pro určení produkce genových mutací indukovaných chemickými látkami bez a s metabolickou aktivací.

        Jsou využívány forward mutační systémy u haploidních kmenů, jako je míravznikumutací z červených, adenin vyžadujících mutant (ade-l, ade-2) na dvojité, adenin vyžadující bílé mutanty a selektivní systémy jako je indukce resistence ke canavaninu a cykloheximidu.

        Nejlépe ověřený reversní mutační systém zahrnuje využití haploidního kmene XV 185-14C s okrovými (ochre) nonsense mutacemi ade 2-l, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Mutace jsou vratné působením mutagenů typu záměny bazí, které indukují mutace ve specifickém místě, nebo okrové supresorové mutace. XV 185-14C nese rovněž his 1 -7 marker, missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.

        U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D7, který je homozygotní pro ilv 1-92.

      1. 1.2 Popis metody
        1. 1.2.1 Příprava

          Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.

          Metabolická aktivace

          Buňky mají být exponovány testovaným látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

          Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Testovací kmeny

            Haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D7 jsou nejužívanější pro studie genových mutací. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.

          1. 1.2.2.2 Media

            Odpovídající kultivační media jsou užívána pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk.

          1. 1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

            Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

          1. 1.2.2.4 Koncentrace

            Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

          1. 1.2.2.5 Kultivační podmínky

            Misky jsou inkubovány po sedm dní při 28 až 30 °C ve tmě.

          1. 1.2.2.6 Frekvence spontánních mutací

            Frekvence spontánních mutací u subkultur má být v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

          1. 1.2.2.7 Počet replikací

            Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu s prototrofními buňkami a u životnosti buněk. U experimentů užívajících markery jako hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí musí být počet misek zvýšen, aby byly získány statisticky relevantní údaje.

        1. 1.2.3 Popis postupu