Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 251/1998 Sb., účinné od 1. 1. 1999

Předchozí stránka

B.17 “IN VITRO“ TEST NA GENOVÉ MUTACE V SAVČÍCH BUŇKÁCH
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Buněčné kultury savčích buněk mohou být použity k detekci mutací indukovaných chemickými látkami. Nejširší použití mají buněčné linie včetně myších lymfomových buněk L5178Y, CHO a V-79 linie buněk čínského křečka. V těchto buněčných liniích jsou nejčastěji užívanými systémy detekce mutací v lokusech thymidin kinasy (TK), hypoxanthin guanin phosphoribosyl transferasy (HPRT), (dříve HGPRT) a Na⁺/K⁺ ATPasy. Systémy TK a HPRT detekují mutace párování basí; frameshift mutace a malé delece. Systém Na⁺/K⁺ detekuje pouze mutace párování basí.
    Buňky s deficiencí thymidin kinasy (TK), vyvolanou forward mutací TK⁺ - TK^-, jsou resistentní k bromodeoxyuridinu (BrDU), fluorodeoxyuridinu (FdU) nebo trifluorothymidinu (TFT), protože tyto antimetabolity nejsou inkorporovány do buněčných nukleotidů “salvage“ enzymatickým systémem thymidin kinasy. Nukleotidy potřebné pro buněčný metabolismus jsou získávány výhradně syntésou de novo. Jestliže v přítomnosti thymidin kinasy jsou BrDU, FdU, nebo TFT inkorporovány do nukleotidů, je výsledkem inhibice buněčného metabolismu a cytotoxický efekt. Proto jsou mutované buňky schopné proliferace v přítomnosti BrDU, FdU, nebo TFT, zatímco normální buňky obsahující thymidin kinasu nejsou proliferace schopny. Podobně buňky s deficiencí HPRT jsou selektivně resistentní k 8-azaguaninu (AG) nebo k 6-thioguaninu (TG). Buňky s alterací Na⁺/K⁺ ATPasy jsou selektivně resistentní k ouabainu.
    Cytotoxicita je stanovena měřením účinku testovaného materiálu na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency) nebo rychlostí růstu kultury. Frekvence mutací je určována inokulací známého počtu buněk jak do média obsahujícího selektivní látky k detekci mutovaných buněk, tak do média bez selektivních látek k určení počtu přežívajících buněk. Po ukončení kultivace jsou počítány kolonie. Frekvence mutací je určována z počtu kolonií mutovaných buněk korigovaného počtem přežívajících buněk.
  1. 1.2 Kriteria kvality
    Žádná.
  1. 1.3 Popis metody
    1. 1.3.1 Příprava
      1. 1.3.1.1 Buňky
        Pro tento test je dostupná řada buněčných linií. Patří mezi ně sublinie L5178Y, buňky čínského křečka CHO, nebo V-79 s výraznou citlivostí k chemickým mutagenům, s vysokou schopností vytvářet kolonie (cloning efficiency) a s nízkou frekvencí spontánních mutací. U buněk musí být pravidelně kontrolována stabilita karyotypu a měly by být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty. Ostatní typy buněk mohou být použity pouze s podmínkou, že oprávněnost jejich použití jako testu pro chemicky indukované genové mutace je plně prokázána.
      1. 1.3.1.2 Médium
        Musí být použita vhodná kultivační média a dodrženy vhodné kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost). Média a séra musí být vybrána s ohledem na selektivní system a typ buněk použitých v testu.
      1. 1.3.1.3 Testovaná látka
        Testované látky se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu nebo ve vhodném rozpouštědle. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk nebo rychlost růstu.
      1. 1.3.1.4 Metabolický aktivační systém
        Buňky musí být exponovány testované látce jak v přítomnosti, tak i bez použití exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.
    1. 1.3.2 Experimentální podmínky
      1. 1.3.2.1 Negativní a positivní kontroly
        Do každého experimentu musí být zařazeny positivní kontroly zahrnující jak přímo působící látky, tak látky vyžadující metabolickou aktivaci. Zároveň musí být také použity negativní kontroly (s rozpouštědlem).
        Dále jsou uvedeny příklady látek, které mohou být použity jako positivní kontroly:
        - přímo působící látky: etylmetansulfonát, hycanthon,
        - nepřímo působící látky (vyžadující metabolickou aktivaci): 2-acetylaminofluoren, 7,12-dimetylbenzantracen, N-nitrosodimetylamin.
        Je-li to potřeba, zařazuje se dodatečná positivní kontrola ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka.
      1. 1.3.2.2 Koncentrace
        Musí být použito několik koncentrací testované látky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace indukuje nízkou úroveň přežívajících buněk a počet přežívajících buněk v nejnižší koncentraci má být přibližně stejný jako v negativní kontrole.
        Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.
    1. 1.3.3 Vlastní experiment
      Počet buněk použitých pro jednu kulturu musí být odvozen od spontánní frekvence mutací. Obvykle se používá počet živých buněk, který je 10ti násobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací.
      Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu, ve většině případů postačuje délka expozice v délce 2 - 5 hodin. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce společně jak s vhodným metabolickým systémem, tak i bez něho. Po ukončení expozice jsou buňky promyty čistým médiem bez testované látky a dále kultivovány, aby mohla být zhodnocena jejich viabilita a projev mutačního fenotypu.
      Ke konci fáze exprese, která by měla být dostatečně dlouhá k vyvolání optimální fenotypické exprese indukovaných mutací, jsou buňky kultivovány v médiu s a bez selektivních látek ke zhodnocení počtu mutací a životnosti buněk.
      Všechny výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje se shrnou do tabulky. Počet mutací a přežívání buněk musí být vyjádřeno pro testovanou látku i pro kontroly a pro každou misku samostatně. Dále je třeba uvést průměrný počet kolonií na misku a směrodatnou odchylku. Frekvence mutací musí být vyjádřena jako počet mutantů na počet přežívajících buněk. Přežívání buněk a schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency se vyjadřuje jako procento hodnot kontrolní skupiny.
  Údaje musí být vyhodnoceny pomocí vhodných statistických metod.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
2. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
  Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
  1. - použité buněčné linii, počtu kultur v pokusu, metodách udržování buněčných kultur,
  2. - podmínkách experimentu: složení média, koncentrace CO₂, koncentrace testované látky, použité rozpouštědlo, kultivační teplota, délka kultivace, trvání fáze exprese (včetně počtu inokulovaných buněk a subkultur), trvání expozice, hustota buněk během expozice, druh použitého metabolického aktivačního systému, positivní a negativní kontroly, použité selektivní látky,
  3. - zdůvodnění výběru koncentrací,
  4. - metodě použití k výpočtu živých a mutovaných buněk,
  5. - statistickém vyhodnocení,
  6. - diskusi výsledků,
  7. - interpretaci výsledků.

B.18 POŠKOZENÍ DNA REPARACE - NEPLÁNOVANÁ SYNTÉZA DNA - SAVČÍ BUŇKY IN VITRO
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Test neplánované syntézy DNA (UDS) umožňuje měřit reperační syntézu DNA po excizi a odstranění části DNA obsahující oblast poškození indukovaného chemickými, nebo fyzikálními faktory. Test je založen na inkorporaci značeného tymidínu (³H-TdR) do DNA savčích buněk, které nejsou v S fázi buněčného cyklu. Vzestup ³H-TdR je stanoven autoradiograficky, nebo kapalnou scintilační metodou (LSC) v exponovaných buňkách. Používají se primární buněčné kultury potkaních hepatocytů, které jsou exponovány testovanou látkou jak v přítomnosti tak i v nepřítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému. UDS může být také stanovena v systému in vivo.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Testované látky a sloučeniny použité jako kontrolní, nebo referenční se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Další ředění se provádí jenom kultivačním médiem. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk.
      Používají se pouze primokultury potkaních hepatocytů, lidských lymfocytů, nebo stabilizovaných buněčných linií (lidské diploidní fibroblasty).
      Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Počet kultur
        Pro každý experimentální bod je potřeba nejméně dvou buněčných kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo méně, je-li to vědecky zdůvodnitelné) pro LSC UDS.
      1. 1.2.2.2 Negativní a positivní kontroly
        V každém experimentu musí být současně zařazeny negativní a positivní kontroly v přítomnosti i v nepřítomnosti metabolického aktivačního systému.
        Jako positivní kontrolu lze pro potkaní hepatocyty použít 7,12-dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA), nebo 2-acetylaminofluoren (2-AAF). Jako positivní kontrolu pro stabilisované buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC bez metabolické aktivace lze použít 4-nitroquinolin-N-oxid (4-NQO). Jako positivní kontrolu při použití metabolického aktivačního systému lze použít N-dimethylnitrosamin.
      1. 1.2.2.3 Koncentrace testované látky
        Musí být použito několik koncentrací testované látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat toxický efekt.
        Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.
      1. 1.2.2.4 Buňky
        Pro udržování kultur musí být použito vhodné růstové médium, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost. Stabilizované buněčné linie musí být pravidelně kontrolovány na přítomnost Mycoplasmat.
      1. 1.2.2.5 Metabolická aktivace
        Pro primokultury hepatocytů se metabolický aktivační systém nepoužívá. Stabilizované buněčné linie a lymfocyty jsou exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
    1. 1.2.3 Vlastní experiment
      1. 1.2.3.1 Příprava kultur
        Stabilizovaná buněčná linie se připravuje ze zásobní kultury (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C.
        Krátkodobé kultury potkanních hepatocytů se připravují tak, že se umožní čerstvě isolovaným hepatocytům přichytit se ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.
        Kultury lidských lymfocytů jsou založeny pomocí vhodné metody.
      1. 1.2.3.2 Expozice kultur testované látce
        Primární hepatocyty potkana. Čerstvě isolované hepatocyty potkana jsou exponovány testované látce v médiu obsahujícím ³H-TdR po vhodnou dobu. Po ukončené expozici je médium odstraněno, buňky promyty, fixovány a sušeny. Sklíčka jsou ponořena do autoradiografické emulse (alternativně může být použit stripping film), exponována, vyvolána, obarvena a vyhodnocena.
        Stabilizované buněčné linie a lymfocyty
        Autoradiografické techniky: Buněčné kultury jsou exponovány testované látce po vhodnou dobu a pak jsou vystaveny působení ³H-TdR. Doba působení je závislá na druhu testované látky, aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení nejvyššího vrcholu UDS je třeba ³H-TdR přidat současně s testovanou látkou, nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy je ovlivněn možnou interakcí mezi testovanou látkou a ³H-TdR. K odlišení mezi UDS a semikonzervativní replikací DNA se užívá arginin deficientní médium, nízký obsah séra, nebo aplikace hydroxyurey do kultivačního média což způsobí inhibici semikonzervativní replikace DNA.
        Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí testované látce je třeba blokovat vstup buněk do S-fáze, jak bylo shora uvedeno. Buňky jsou pak exponovány testované látce jak bylo popsáno pro autoradiografii. Na konci kultivace je DNA extrahována z buněk a stanoven celkový obsah DNA a určen rozsah inkorporace ³H-TdR.
        Jestliže jsou použity ve shora uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.
    1. 1.2.4 Analýza
      1. 1.2.4.1 Vyhodnocení autoradiografie
        Při vyhodnocování UDS v buněčné kultuře se jádra v S-fázi nehodnotí. Hodnotí se nejméně 50 buněk v každém experimentálním bodě. Preparáty je třeba zakódovat před vyhodnocováním. V každém preparátu se hodnotí několik náhodně vybraných polí. Množství inkorporovaného ³H-TdR v cytoplasmě se určí v zóně o velikostí tří jader v cytoplasmě každé hodnocené buňky.
      1. 1.2.4.2 Vyhodnocení LSC
        Pro stanovení LSC UDS se použije přiměřený počet kultur pro každou koncentraci testované látky a pro kontroly.
        Výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje musí být uvedeny v tabulkách.
  1. 2.1 Vyhodnocení autoradiografie
    Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn nalezených mimo buněčné jádro se zaznamenávají odděleně.
    Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn v jádře je hodnocen pomocí průměru, mediánu a modu.
  1. 2.2 Vyhodnocení LSC
    Inkorporace ³H-TdR se zaznamenává jako dpm/μg DNA. Průměrná hodnota dpm/μpg DNA spolu se směrodatnou odchylkou se používají k vyjádření distribuce inkorporace.
    Údaje se vyhodnocují vhodnými statistickými metodami.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - použitých buňkách, jejich hustotě a číslu pasáže v době ovlivnění kultury, počtu buněčných kultur,
    2. - metodách použitých k udržování kultury, médiu, teplotě, koncentraci CO₂,
    3. - testované látce, rozpouštědle, koncentracích a zdůvodnění jejich výběru v experimentu,
    4. - metabolickém aktivačním systému,
    5. - pokusném schématu,
    6. - positivních a negativních kontrolách,
    7. - použitých autoradiografických metodách,
    8. - způsobech blokování vstupu buněk do S-fáze,
    9. - postupech použitých k extrakci DNA, a k vyhodnocení celkového obsahu DNA při metodě LSC,
    10. - vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
    11. - statistickém vyhodnocení,
    12. - diskusi výsledků,
    13. - interpretaci výsledků.

B.19 SCE - VÝMĚNA SESTERSKÝCH CHROMATID IN VITRO
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    SCE je krátkodobý test pro detekci recipročních výměn DNA mezi dvěma sesterskými chromatidami chromozómu. SCE representují výměny identických sekvencí DNA mezi replikačními produkty v identických (homologních) lokusech. SCE pravděpodobně vyžaduje zlom a opětovné spojení, ale je zatím málo znalostí o molekulárním základě tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje diferenční značení sesterských chromatid. Toho se dosahuje inkorporací bromodeoxyuridinu (BrdU) do chromozomální DNA na dobu dvou buněčných cyklů.
    Savčí buňky in vitro jsou exponovány testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému, je-li to potřebné. Kultivují se po dobu dvou replikačních cyklů v médiu obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se buňky ovlivní inhibitorem dělícího vřeténka (např. kolchicín) k akumulaci buněk v c-metafázi mitózy. Po ukončení kultivace jsou buňky zpracovány a připraveny preparáty pro analýzu chromozómů.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Používají se primokultury, (lidské lymfocyty) nebo stabilizované buněčné linie (ovariální buňky čínského křečka). Buněčné linie musí být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty,
      Používají se vhodná kultivační média a kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost),
      Testovaná látka se rozpouští, nebo suspenduje v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Výsledná koncentrace rozpouštědla nesmí významně ovlivnit životnost buněk, rychlost růstu nebo frekvenci SCE,
      Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti vhodného exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Počet kultur
        Pro každý experimentální bod se použijí nejméně dvě kultury.
      1. 1.2.2.2 Negativní a pozitivní kontroly
        V každém experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s látkami s přímým mutagenním účinkem a látky vyžadující metabolickou aktivaci. Dále musí být použita negativní kontrola s použitým rozpouštědlem.
        Jako positivní kontrolu lze použít:
        - přímo působící mutageny: etylmetansulfonát
        - nepřímo působící mutageny: cyklofosfamid
        Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.
      1. 1.2.2.3 Koncentrace
        Testují se nejméně tři dávky. Nejvyšší koncentrace testované látky musí mít signifikantní toxický účinek, ale zároveň musí umožnit adekvátní replikaci buněk. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      1. 1.2.3.1 Příprava kultur
        Stabilizovaná buněčná linie se připravuje se zásobní kultury (trypsinací, nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C. Pro monovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby na konci kultivace nevytvářely více než z 50 % konfluentní vrstvu. Lze také použít suspensních kultur. Lidské lymfocytární kultury se připraví z heparinizované krve běžnými postupy a inkubují při 37 °C.
      1. 1.2.3.2 Uxpozice kultur
        Buňky jsou exponovány testované látce v exponenciální fázi růstu po vhodnou dobu. Ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, ale expozice může být prodloužena až na dva buněčné cykly, je-li to třeba. Buňky, které nemají dostatečnou vlastní metabolickou aktivitu, musí být exponovány testovanou látkou v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je testovaná látka z média odstraněna, buňky vymyty a dále kultivovány v růstovém médiu s BrdU dva replikační cykly. Alternativně mohou být buňky exponovány současně s testovanou látkou a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.
        Lidské lymfocytární kultury jsou exponovány testovanou látkou dokud jsou v semisynchronizovaných podmínkách.
        Buňky jsou analyzovány v druhém mitotickém dělení po expozici testované látce, která proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s BrdU je třeba udržovat v temnu, nebo ve světle zastíněné žárovky, aby se zabránilo fotolýze DNA ve které je inkorporovaný BrdU.
      1. 1.2.3.3 Zpracování buněk
        Jednu až čtyři hodniny před ukončením kultivace se do kultur přidá inhibitor dělícího vřeténka (např. kolchicín). Každá kultura se zpracovává samostatně.
      1. 1.2.3.4 Příprava preparátů a barvení
        Preparáty se připraví standardní cytogenetickou technikou. Barvení preparátů ke znázornění SCE může být provedeno několika technikami (např. fluorescenční plus Giemsa).
      1. 1.2.3.5 Analýza
        Počet analyzovaných buněk je závislý na spontánní frekvenci SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na každou kulturu. Preparáty musí být zakódovány před analýzou. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U stabilizovaných linií pouze metafáze, které se liší o ±2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se budou analyzovat SCE v oblasti centromery. Výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje se zpracovávají tabulkovou formou. Zaznamenává se počet SCE v každé metafázi a počet SCE/chromozóm zvlášť pro každou metafázi v exponovaných i kontrolních skupinách.
  Údaje se hodnotí vhodnými statistickými metodami.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury,
    2. - kultivačních podmínkách: složení média, teplotě, koncentraci CO₂, koncentraci testované látky, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce expozice, inhibitoru mitozy a jeho koncentraci i jeho délce působení, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách,
    3. - počtu kultur pro každý experimentální bod,
    4. - způsobu přípravy mikroskopických preparátů
    5. - počtu analyzovaných metafází (odděleně pro každou kulturu)
    6. - průměrném počtu SCE/buňku a SCE/chromozóm (odděleně pro každou kulturu
    7. - kritériích hodnocení SCE
    8. - zdůvodnění výběru koncentrací
    9. - vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
    10. - statistickém vyhodnocení,
    11. - diskusi výsledků,
    12. - interpretaci výsledků.

B.20 RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ NA POHLAVÍ U DROSOPHILA MELANOGASTER
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Test na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) na Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, jak genových, tak i malých delecí, v zárodečných buňkách hmyzu. Je to test na forward mutace vhodný pro skríning mutací v přibližně 800 lokusech chromozómu X. Tyto representují asi 80 % všech lokusů X-chromozómu. X-chromozóm representuje přibližně 1/5 celého haploidního genómu.
    Mutace v X-chromozómu se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se normálně rodí heterozygotní samici. SRLS test je výhodný vzhledem k zvláštnímu vzhledu a uspořádání chromozómů.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      1. 1.2.1.1 Zdroje
        Používají se samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodné dobře popsané linie samic s vícenásobnou inversí X-chromozómu.
      1. 1.2.1.2 Testované látky
        Testované látky se rozpouštějí ve vodě. Látky ve vodě nerozpustné se rozpouštějí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle (např. směs etanolu a Tweenu-60, nebo 80), před aplikací se dále ředí vodou, nebo fyziologickým roztokem. Doporučuje se nepoužívat dimetylsulfoxid (DMSO) jako vehikulum.
      1. 1.2.1.3 Počet zvířat
        Test má předem určenou citlivost. Spontánní frekvence mutací v kontrolní skupině významně ovlivňuje nutný počet ovlivněných chromozómů, které je třeba analyzovat.
      1. 1.2.1.4 Způsob aplikace
        Expozice testované látce se uskutečňuje per os, injekčně, nebo expozicí plynům nebo parám. Zkrmování testované látky se provádí v cukerném roztoku. Je-li to nutné, testovaná látka se rozpustí v 0,7 % roztoku NaCl a injikuje se do hrudní nebo břišní dutiny.
      1. 1.2.1.5 Negativní a positivní kontroly
        V každém pokusu se zařazují negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly. Jestliže má laboratoř k dispozici vhodné historické kontrolní údaje, není třeba zařazovat do experimentu souběžné kontroly.
      1. 1.2.1.6 Dávkování
        Používají se tři dávky testované látky. Pro předběžný orientační odhad se používá jedna dávka rovnající se maximální tolerované koncentraci, nebo vyvolávající známky toxicity. Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce.
    1. 1.2.2 Popis postupu
      Samci divokého typu (ve stáří 3-5 dnů) jsou ovlivněni testovanou látkou a individuálně kříženi s virginními samicemi z linie Muller-5 nebo z jiné vhodné markerové linie (vícenásobná inverse X-chromozómu). Samice jsou vyměněny za čerstvé virginní samice každé dva až tři dny aby byl pokryt celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic je sledován letální efekt korespondující s účinkem testované látky v době expozice na zralé spermie, na spermatidy ve středním, nebo pozdním stádiu, časné spermatidy, spermatocyty a spermatogonie.
      Heterozygotní F₁ samice narozené z tohoto křížení jsou dále kříženy individuálně (t.j. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V F₂ generaci je v každé kultuře zaznamenávána absence samců divokého typu. Jestliže v kultuře vznikají F₁ samice nesoucí letální mutaci v rodičovském X-chromozómu ( nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromozómem), dcery těchto samic se stejným genotypem jsou dále testovány aby se zjistilo, zda letalita se opakuje v dalších generacích.
1. 2. ÚDAJE
  Získané údaje se zpracují do formy tabulky. Uvádí se počet hodnocených X-chromozómů, počet afertilních samců a počet chromozómů s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období křížení a pro každého testovaného samce. Zaznamenává se počet clusterů různých velikostí pro každého samce. Výsledky se mají potvrdit v nezávislém experimentu.
  Údaje se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Nahromadění recesivních letálních mutací vzniklých v jednom samci má být vzato v úvahu a zhodnoceno vhodným statistickým způsobem.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - použitých liniích, nebo kmenech Drosophily, věku, počtu ovlivněných samců, počtu sterilních samců, počtu vzniklých F₂ kultur, počtu F₂ kultur bez potomků, počtu chromozómů nesoucích letální mutaci pro každé stádium zárodečných buněk,
    2. - kritériích pro velikost ovlivněných skupin,
    3. - podmínkách testu: detailní popis ovlivňování a schéma odběru vzorků, výše dávek, údaje o toxicitě, negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly,
    4. - kritériích počítání letálních mutací,
    5. - vztahu expozice/účinek, je-li to možné,
    6. - hodnocení údajů,
    7. - diskusi výsledků,
    8. - interpretaci výsledků.

B.21 TEST TRANSFORMACE SAVČÍCH BUNĚK - IN VITRO
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Savčí buňky lze použít pro detekci fenotypických změn in vitro indukovaných chemickými látkami spojených s maligní transformací in vivo. Nejčastěji se používají buňky C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischerových potkanů a test se opírá o změny buněčné morfologie, tvorbu ložisek, nebo změny v uchycení v semisolidním agaru. Méně se používají systémy detekující ostatní fyziologické či morfologické změny v buňkách po expozici karcinogenním látkám. Žádný výsledek in vitro testu není důkazem karcinogenity. Některé systémy jsou schopné detekce promotorů. Cytotoxicita může být zjištěna hodnocením účinku testované látky na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency), nebo ovlivněním rychlosti růstu kultury. Při hodnocení cytotoxicity se vychází ze skutečnosti, že expozice testované látce byla toxikologicky relevantní, ale přesto ji nelze použít k určení frekvence transformace ve všech experimentech, protože u některých mohlo dojít k prodloužení inkubace, nebo k replatingu.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      1. 1.2.1.1 Buňky
        Existuje řada buněčných linií a primokultur použitelných k testu transformace. Experimentátor musí zajistit, že buňky použité v testu transformace vykazují příslušné fenotypické změny po expozici známým karcinogenem a že test používaný laboratoří je ověřen a že je dokumentována jeho oprávněnost a spolehlivost.
      1. 1.2.1.2 Médium
        Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro použitý test transformace.
      1. 1.2.1.3 Testované látky
        Testované látky se rozpouštějí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle před ovlivněním buněk. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí ovlivnit životnost buněk, růstovou rychlost nebo výskyt transformace.
      1. 1.2.1.4 Metabolická aktivace
        Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a bez přítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Alternativně mohou být použity buňky s vlastní metabolickou aktivitou, jestliže její vlastnosti jsou vhodné pro testované látky.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Negativní a positivní kontroly
        Do každého experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s použitím látek přímo působících, i vyžadujících metabolickou aktivaci. Musí být zařazeny také negativní kontroly (s rozpouštědlem).
        Příklady látek pro positivní kontroly:
        - přímo působící látky: etylmetansulfonát, β-propiolakton,
        - látky vyžadující metabolickou aktivaci: 2-acetylaminofluoren, 4-dimetylaminoazobenzen, 7,12-dimetylbenzantracen.
        Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.
      1. 1.2.2.2 Koncentrace
        Testují se nejméně tři dávky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace způsobují nízkou úroveň přežívání buněk, v nejnižší koncentraci je přežívání buněk přibližně stejné jako v negativní kontrole. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu závislou na použitém testovacím systému. Ta může zahrnovat i opakovanou expozici testované látce spojenou s výměnou média (ev. výměnou čerstvé metabolické aktivační směsi) jestliže se jedná o prolongovanou expozici. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je z buněk propláchnutím odstraněna testovaná látka a kultivace probíhá dále za vhodných podmínek pro transformaci. Pak je zaznamenáván výskyt transformace. Všechny výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje musí být presentovány v tabulkové formě. Je vhodné vyjadřovat přežívání buněk jako procento kontrolní úrovně a frekvenci transformací jako počet transformací na počet přežívajících buněk. Data je třeba zpracovat vhodnými statistickými metodami.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury, počtu kultur,
    2. - kultivačních podmínkách: koncentraci testované látky, době inkubace, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce a frekvenci expozice, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách, hustotě buněk během expozice, specifikaci sledovaného fenotypu, použití selektivního systému (je-li to vhodné), zdůvodnění výběru koncentrací,
    3. - metodách vyčíslení živých a transformovaných buněk,
    4. - statistickém vyhodnocení,
    5. - diskusi výsledků,
    6. - interpretaci výsledků.

B.22 DOMINANTNÍ LETÁLNÍ TEST U HLODAVCŮ
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Dominantní letalita způsobuje embryonální, nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárodečné tkáně exponovaného zvířecího druhu. Obecně se přijímá, že dominantní letální mutace jsou způsobeny poškozením chromozómů (strukturální a numerické abnormality). Smrt embrya exponované samice může být také výsledkem toxického účinku.
    Samci jsou exponováni testované látce a pářeni s neovlivněnými, intaktními samicemi. Vzestup mrtvých implantací na samičku v exponované skupině nad počet mrtvých imlantací v kontrolní skupině vyjadřuje postimplantační ztráty. Preimplantační ztráty se hodnotí na základě počtu žlutých tělísek, nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině. Celková dominantní letalita je součet pre- a postimplantačních ztrát. Výpočet celkové dominantní letality je založen na srovnání živých implantací na samici v exponované skupině k živým implantacím na samici v kontrolní skupině. Snížení počtu implantací v některém intervalu může být způsobeno zánikem buněk (t.j. spermatocytů a/nebo spermatogonií).
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Testovanou látku rozpustit, nebo suspendovat ve fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě se ředí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle. Použité rozpouštědlo nesmí reagovat s testovanou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Před aplikací je třeba připravovat čerstvě naředěnou testovanou látku.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Způsob aplikace
        Testovaná látka se obvykle podává pouze jednou. Na základě toxikologických informací je možné podávat látku opakovaně. Obvyklý způsob aplikace je orální sondou nebo intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné způsoby aplikace.
      1. 1.2.2.2 Experimentální zvířata
        Pro test se doporučují použít potkani, nebo myši. Zdravá, pohlavně dospělá zvířata jsou náhodně rozdělena na exponované a kontrolní skupiny.
      1. 1.2.2.3 Počet a pohlaví
        Je třeba použít dostatečný počet exponovaných samců s ohledem na spontánní variabilitu hodnocené biologické charkteristiky. Počet se řídí předem zjištěnou detekční citlivostí a silou statistického testu. V typickém případě se na příklad volí takový počet samců, aby se dosáhlo 30 - 50 březích samic na připouštěcí interval.
      1. 1.2.2.4 Negativní a positivní kontroly
        Positivní a negativní (s rozpouštědlem) kontroly musí být zařazeny do každého experimentu. Jestliže však má laboratoř k dispozici přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávných experimentů, mohou být použity. Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných, nízkých dávkách aby byla prokázána citlivost testu (např. MMS, intraperitoneálně, 10 mg.kg^-1).
      1. 1.2.2.5 Dávkování
        Nejčastěji se používají tři dávkové hladiny. Nejvyšší dávka má vyvolávat známky toxicity, nebo snížené fertility u exponovaných zvířat. V některých případech je postačující jedna vysoká dávka.
      1. 1.2.2.6 Limitní test
        Netoxické látky se podávají v jedné dávce 5 g.kg^-1, nebo v dávce 1 g.kg^-1.den^-1 při opakované aplikaci.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      Existuje několik postupů. Nejčastěji se používá jednorázová aplikace. Může však být použito jiné schéma.
      Jeden samec je opakovaně křížen s jednou, nebo dvěmi neovlivněnými, intaktními samičkami ve vhodných intervalech po aplikaci látky. Samičky musí být u samců nejméně po dobu trvání jednoho cyklu říje, nebo pokud se neprokáží spermie ve vagině, či vaginální zátka.
      Počet páření po expozici je dán schématem expozice a musí zahrnovat všechna stádia zárodečných buněk sledovaných po expozici.
      Samice jsou utraceny cervikální dislokací ve druhé polovině březosti a obsah dělohy je vyšetřen k určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaječníky musí být vyšetřeny k určení počtu žlutých tělísek.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje o počtu samců, počtu březích samic, a počtu nezabřezlých samic jsou uváděny v tabulkách. Výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice jsou uváděny samostatně. Každá samice musí mít záznam o týdnu páření, o dávce podané samci, o počtu živých a mrtvých implantacích.
  Zhodnocení celkového dominantního letálního efektu je založeno na srovnání počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací v kontrolní skupině. Poměr mrtvých ku živým implantacím v exponované skupině ke stejnému poměru v kontrolní skupině po analýze vypovídá o postimplantačních ztrátách.
  V tabulce musí být jasně odlišeny časná a pozdní letalita. Musí být zaznamenány i preimplantační ztráty. Ty mohou být vypočítány jako rozdíl mezi počtem corpora lutea a počtem implantací, nebo jako snížení průměrného počtu implantací na dělohu ve srovnání s kontrolou.
  Údaje jsou vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - druhu, kmeni, věku a váze zvířat, počet zvířat od každého pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
    2. - testované látce, rozpouštědlu, dávkových hladinách a důvodech jejich výběru, negativních a positivních kontrolách, údajích o toxicitě,
    3. - způsobu podání a schematu expozice,
    4. - schéma páření,
    5. - metodách k průkazu páření,
    6. - doba usmrcení,
    7. - kriteria pro počítání dominantních letálních efektů,
    8. - vztah dávka/odpověď,
    9. - statistické hodnocení,
    10. - diskuse výsledků,
    11. - interpretace výsledků.

B.23 CYTOGENETICKÁ ANALÝZA SAVČÍCH ZÁRODEČNÝCH BUNĚK IN VIVO
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Tento cytogenetický test in vivo detekuje strukturální chromozómové aberace ve spermatogoniích. Je založen na analýze mitóz spermatogonií z hlediska chromatidových a chromozómových typů aberací.
    V metodě se používají preparáty z testes savců, kteří byli exponování testované látce vhodným způsobem a usmrceni v různých intervalech. Zvířata jsou před usmrcením ovlivněna inhibitorem dělícího vřeténka, jako je kolchicín, k nahromadění buněk ve stádiu metafáze (C - metafáze). Jsou zhotoveny mikroskopické preparáty, usušeny na vzduchu, obarveny a analyzovány v mikroskopu.
    Analýza spermatocytů v diakinézi (metafáze I) pro hodnocení mnohočetných translokací po ovlivnění kmenových buněk spermatogonií může poskytnout další užitečné informace.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.
      1. 1.2.1.1 Způsob aplikace
        Testované látky se většinou podávají pouze jednou. Opakovaná aplikace může být použita na základě toxikologických informací. Opakovaná aplikace však může být použita jen v případě, že testovaná látka nevyvolává větší cytotoxický efekt v diferencujících se spermatogoniích.
        Obvyklý způsob podání je orální aplikace sondou a intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i ostatní způsoby aplikace.
      1. 1.2.1.2 Experimentální zvířata
        Nejčastěji se používají myši a čínský křeček. Mohou však být použity i jiné savčí druhy.
        Pohlavně dospělí samci jsou náhodným výběrem rozděleni do exponovaných a kontrolních skupin.
      1. 1.2.1.3 Počet zvířat
        Pro exponované i kontrolní skupiny se použije nejméně po pěti samcích.
      1. 1.2.1.4 Negativní a positivní kontroly
        V každém experimentu musí být použity současně positivní i negativní (s rozpouštědlem) kontroly.
        Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných nízkých dávkách (např. mitomycin C, intraperitoneálně, 0.3 mg.kg^-1) k průkazu citlivosti testu.
      1. 1.2.1.5 Dávkování
        Používá se jedna dávka testované látky. Tato dávka má být maximální tolerovanou dávkou, nebo dávkou vyvolávající známky toxicity. Je-li třeba učit závislost dávka/odpověď, pak je třeba použít nejméně tří dávek (např. k potvrzení slabě positivní odpovědi). Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce jak pro jednorázovou, tak i pro opakovanou aplikaci.
    1. 1.2.2 Popis postupu
      Zvířata jsou většinou ovlivněna testovanou látkou pouze jednou. Ve skupinách exponovaných nejvyšší dávce se po expozici odebírají vzorky nejméně ve třech intervalech. Základní interval je 24 h. Jestliže kinetika buněčného cyklu může být ovlivněna testovanou látkou, používají se jeden dřívější a jeden pozdější odběrový interval stejnoměrně rozdělené v rozmezí od 6 do 48 h. Při použití dalších dávkových hladin je třeba vzorky odebrat v nejcitlivějším intervalu, pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.
      Alternativně může být použita opakovaná aplikace a zvířata jsou pak usmrcena 24 h po poslední aplikaci. Mohou být použity další odběrové časy v rozmezí od 6 do 24 h.
      1. 1.2.2.1 Příprava preparátů z testes
        Před analýzou mitóz spermatogonií je zvířatům infikován intraperitoneálně ve vhodné dávce inhibitor mitózy, např. kolchicín. Ve vhodném intervalu jsou potom zvířata usmrcena. U myší se tento interval pohybuje mezi třemi až pěti hodinami, u čínského křečka více než pět hodin.
        Používá se metoda sušených preparátů (air-drying). Různé druhy zvířat vyžadují modifikaci standardního postupu. Získaná buněčná suspenze je hypotonizována a fixována. Buňky jsou rozprostřeny na sklíčko a obarveny. Preparáty jsou před analýzou zakódovány.
      1. 1.2.2.2 Analýza
        Na strukturální chromozómové aberace je analyzováno nejméně 100 dobře rozprostřených metafází s plným počtem centromer. Ke zhodnocení možného cytotoxického efektu se počítá poměr mitóz spermatogonií k prvním a druhým meiotickým metafázím z celého vzorku 100 dělících se buněk na zvíře.
1. 2. ÚDAJE
  Získané údaje jsou presentovány tabulkovou formou. Pro každé exponované a kontrolní zvíře se všechny typy aberací uvádějí samostatně. Uvádí se celkový počet analyzovaných buněk a celkový počet aberantních buněk na každou skupinu. Pro každý parametr se uvádí průměr a směrodatná odchylka. Je-li to stanoveno, uvádí se v tabulce pro každou exponovanou a kontrolní skupinu průměr poměru mitóz spermatogonií k prvním a druhým meiotickým metafázím.
  Všechny údaje jsou zhodnoceny vhodnou statistickou metodou.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - druhu a kmeni samců, věku a váze samců,
    2. - počtu zvířat v každé exponované a kontrolní skupině,
    3. - podmínkách experimentu, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla, inhibitor dělícího vřeténka,
    4. - počtu analyzovaných buněk pro každé zvíře v každé skupině,
    5. - typu a počtu aberací u každého exponovaného a kontrolního zvířete
    6. - statistickém hodnocení
    7. - diskusi výsledků,
    8. - interpretaci výsledků.

B.24 SPOT TEST U MYŠÍ
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Je to in vivo test na myších, u kterých jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u embryí jsou melanoblasty a cílovými geny ty, které kontrolují pigmentaci srsti. Embrya jsou heterozygoti pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace, nebo ztráty dominantních allel v genech melanoblastů jsou vyjádřeny recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrny (spots) pozměněné barvy srsti narozených myší. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, je zaznamenán a jejich frekvence je srovnávána s frekvencí u potomků z kontrol. Myší spot test detekuje především somatické mutace v embryonálních buňkách.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Testované látky jsou rozpuštěny, nebo suspendovány v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Použitá rozpouštědla nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxický efekt. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky.
      1. 1.2.1.1 Experimentální zvířata
        Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c ^ch p/c ^ch p; brown, b/b; dilute, shon ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) jsou kříženy buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ /ln fz; pearl pe/pe) nebo s kmenem C57 BL (nonagouti, a/a).
        Mohou být použita i jiná křížení, za předpokladu že budou vznikat nonagouti potomci. Např. křížení mezi kmenem NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).
      1. 1.2.1.2 Počet a pohlaví zvířat
        Použije se dostatečný počet zabřezlých samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou dávku. Vhodná velikost vzorku je závislá na počtu skvrn pozorovaných u ovlivněných myší a u kontrolních myší. Negativní výsledky jsou akceptovány pouze v případě, že bylo hodnoceno nejméně 300 potomků samic ovlivněných nejvyšší dávkou.
      1. 1.2.1.3 Negativní a positivní kontroly
        Musí být použity kontroly ovlivněné pouze rozpouštědlem (negativní kontroly. Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní hodnoty z téže laboratoře za předpokladu, že jsou homogenní. Nedávné údaje z positivních kontrol získané v téže laboratoři při expozici látce se známým mutagenním účinkem mohou být v tomto testu použity, jestliže u testované látky nebyla mutagenita detekována.
      1. 1.2.1.4 Způsob aplikace
        Obvykle se používá orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Je-li to vhodné, je možné použít inhalační, nebo jiný způsob aplikace.
      1. 1.2.1.5 Dávkování
        Používají se nejméně dvě dávky z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo zmenšení velikosti vrhu.
    1. 1.2.2 Popis postupu
      Zvířata jsou obyčejně ovlivněna testovanou látkou pouze jednou 8., 9., nebo 10. den březosti, přičemž za 1.den březosti se považuje den zjištění vaginální zátky. Tyto dny odpovídají 7.25, 8.25 a 9.25 dnů po koncepci. Opakované ovlivnění látkou lze provést během těchto dnů.
      Analýza
      U mláďat je počítán a zaznamenáván počet skvrn mezi třetím a čtvrtým týdnem po porodu. Rozlišují se tři třídy skvrn:
      (a) bílé skvrny v rozsahu 5 mm ve střední ventrální linii o kterých se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);
      (b) žluté skvrny typu agouti, se vyskytují v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, a předpokládá se, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS);
      (c) zbarvené a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti jako výsledek somatických mutací (RS).
      Všechny tři skupiny jsou zaznamenávány, ale pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením mezi MDS a RS je možné vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.
      Zaznamenávají se nápadné, velké morfologické malformace potomků.
1. 2. ÚDAJE
  Získaná data jsou uváděna jako celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat majících jednu, nebo více skvrn vyvolaných somatickými mutacemi. Údaje získané z kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Údaje jsou také uváděny jako získané hodnoty na vrh.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - kmeni použitém při křížení,
    2. - počtu zabřezlých samic v experimentální a v kontrolní skupině,
    3. - průměrné velikosti vrhu v experimentální a v kontrolní skupině při porodu a při odstavení,
    4. - dávkových úrovních testované látky,
    5. - použitém rozpouštědle,
    6. - ve kterém dni březosti byla testovaná látka aplikována,
    7. - o způsobu podání testované látky,
    8. - celkovém počtu sledovaných potomků, a jejich počet s WMVS, MDS a RS v experimentální a kontrolní skupině,
    9. - hrubých morfologických malformacích,
    10. - vztahu dávka/odpověď u RS, je-li to možné,
    11. - statistickém hodnocení,
    12. - diskusi výsledků,
    13. - interpretaci výsledků.

B.25 PŘENOSNÉ TRANSLOKACE U MYŠÍ
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip metody
    Test na přenosné translokace u myší detekuje strukturální a numerické chromozómové změny v savčích zárodečných buňkách zachycené v první generaci potomků. Indukované změny jsou reciproké translokace a u samičích potomků ještě ztráty X-chromozómu. Nositelé translokací a XO-samice vykazují sníženou fertilitu, která se využívá pro výběr F₁ potomstva pro cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je způsobena některými typy translokací (X-autosom a c-t typ). Translokace jsou analyzovány mikroskopicky v meiotických buňkách samců ze spermatocytů ve stadiu diakinézy-metafáze I, nebo F1 samců či samčích potomků F₁ samic. Samice XO jsou cytogeneticky identifikovány přítomností pouze 39 chromozómů v mitózách z kostní dřeně.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.
      1. 1.2.1.1 Způsob aplikace
        Aplikuje se obvykle orálně sondou, nebo intraperitoneální injekcí. Mohou být použity i jiné vhodné způsoby aplikace.
      1. 1.2.1.2 Experimentální zvířata
        Pro snadnější křížení a cytologickou verifikaci se pokusy provádí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen. Průměrná velikost vrhu by měla být větší než osm a měla by být relativně konstantní. Používají se zdravá, pohlavně dospělá zvířata.
      1. 1.2.1.3 Počet zvířat
        Počet zvířat nutně závisí na frekvenci spontánních translokací a na minimálním počtu indukovaných translokací vyžadovaném pro positivní kontrolu.
        Test se obvykle provádí analýzou samců F₁ potomků. Nejméně 500 samců v F₁ generaci je testováno v každé exponované skupině. Jestliže budou analyzovány také samice F₁ generace potomků, pak se vyžaduje 300 samců a 300 samic.
      1. 1.2.1.4 Negativní a positivní kontroly
        Mohou se použít adekvátní výsledky kontrol získané z předchozích pokusů. Jestliže jsou dostupné přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávného pokusu z téže laboratoře, mohou být použity.
      1. 1.2.1.5 Dávkování
        Používá se jedna dávka, obyčejně nejvyšší dávka vyvolávající minimální toxický efekt ale bez vlivu na reprodukční chování nebo přežívání. Pro stanovení vztahu dávka/odpověď je třeba dvou dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná dávka.
    1. 1.2.2 Popis postupu
      1. 1.2.2.1 Expozice a oplodnění
        Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.
        Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.
      1. 1.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů
        Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility F₁ potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců F₁ generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.
        (a) Test fertility
        Snížená fertilita zvířat v F₁ generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.
        Velikost vrhu: F₁ samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18.dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví F₂ potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány F₁ samice, F₂ potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice-nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0-samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1:1 na 1:2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální F₁ zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první F₂ vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy. F₁ zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří F₂ vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.
        Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikostí vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní F₁ samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. -16.den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.
        (b) Cytogenetická analýza
        Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - matafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni F₁ samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u F₁ samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.
1. 2. ÚDAJE
  Získané údaje jsou presentovány tabulkovou formou.
  Pro každý interval připouštění je zaznamenána průměrná velikost vrhu a poměr pohlaví (sex ratio).
  Pro odhad ferility F₁ zvířat se uvádí průměrná velikost vrhu kontroly a individuální velikosti vrhů F₁ nosičů translokací. Pro analýzu obsahů dělohy se uvádí průměrný počet živých a mrtvých zárodků v kontrole a individuální počty živých a mrtvých zárodků pro každé připouštění F₁ nosičů translokací.
  Při cytogenetické analýze diakinéze-metafáze I se uvádí počet typů multivalentních figur a celkový počet buněk pro každého nosiče translokací.
  Pro F₁ sterilní jedince se zaznamenává počet a doba připuštění. Dále se uvádí váha testes a podrobnosti o cytogenetické analýze.
  U X0 samic se uvádí průměrná velikost vrhu, sex ratio F₂ potomků a výsledky cytogenetické analýzy.
  V případě, že pomocí testů fertility byly předběžně vybráni možní nositelé F₁ translokací, je třeba v tabulkách uvést informaci o skutečném počtu potvrzených translokačních heterozygotů.
  Musí být uvedeny údaje o negativních a positivních kontrolách.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. - kmenu myší, stáří a váze exponovaných zvířat,
    2. - počtu rodičovských zvířat pro každé pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
    3. - experimentálních podmínkách, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla a schéma připouštění
    4. - počtu a pohlaví mláďat na samici, počet a pohlaví potomků chovaných pro analýzu translokací,
    5. - době a kritériích analýzy translokací,
    6. - počet a detailní popis nosičů translokací, včetně údajů o březosti a obsahu dělohy,
    7. - popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, pokud možno s obrázky,
    8. - statistické hodnocení,
    9. - diskuse výsledků,
    10. - interpretace výsledků.

B.26 SUBCHRONICKÁ TOXICITA ORÁLNÍ
(90denní opakované podávání per os, studie na hlodavcích)
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip testovací metody
    Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.
      Testovanou látku lze podávat v potravě, sondou, v kapslích nebo v pitné vodě. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná dřívější data, je možno je využít.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata
        Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. V ideálním případě by na počátku podávání látky měli být potkani mladší než 6 týdnů, v žádném případě starší než 8 týdnů. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.
      1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví
        Pro každou hladinu dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
      1. 1.2.2.3 Dávkování
        Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen malý počet. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky.
        Ve skupině s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
        Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg^-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování v pravidelných intervalech (týdenních nebo čtrnáctidenních) přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
      1. 1.2.2.4 Limitní test
        Provede-li se 90-denní test níže popsanou metodou a nevyvolá-li aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den (nebo dávky vyšší - odpovídající možné expozici člověka, je-li tato známa) žádné toxické účinky, je možno od dalšího testování upustit. Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
      1. 1.2.2.5 Doba pozorování
        Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky, jejich dobu objevení, stupeň a trvání. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      V ideálním případě se zvířatům podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 90dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků.
      Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Příjem potravy (a příjem vody při podávání testované látky v pitné vodě) a hmotnost zvířat se zaznamenávají týdně.
      Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.
      Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:
      (a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      (b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      (c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno ( trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninaminotransferasa (dříve pyruvát-transaminasa) a aspartátaminotransferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát-transaminasa), ornithin dekarboxylása, gamaglutamyltranspeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
      (d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před podáváním.
      1. 1.2.3.1 Pitva
        U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza/ příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice a plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní, a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují v případě, pokud lze na jejich postižení usuzovat z příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. 1.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        (a) Úplné histopatologické vyšetření orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny.
        (b) Je třeba vyšetřit všechna makroskopická postižení.
        (c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v jiných dávkových skupinách.
        (d) Plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se mají histopatologicky vyšetřovat k zjištění příznaků infekce, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Je třeba také uvážit histopatologické vyšetření jater a ledvin u těchto skupin. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou dávkou.
        (e) Používá-li se satelitní skupiny, musí se provést histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením a procentuelně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
    2. - experimentální podmínky, - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    3. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
    4. - úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    5. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
    6. - popis toxických nebo jiných účinků,
    7. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    8. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    9. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    10. - biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
    11. - pitevní nálezy,
    12. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
    13. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    14. - diskuse výsledků,
    15. - interpretace výsledků.

B.27 SUBCHRONICKÁ TOXICITA ORÁLNÍ
(90denní opakované podávání per os, studie na nehlodavcích)
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip testovací metody
    Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat (nehlodavcům), a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Testovanou látku lze podávat v potravě nebo může být vhodnější podávání v kapslích. Mohou být použity také jiné způsoby orální aplikace. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata
        Obvykle se jako živočišný druh - nehlodavec používá pes: dává se přednost definovanému plemeni. Je možno používat i jiných druhů nehlodavců. Je třeba pracovat na mladých zdravých zvířatech; v případě psů se má s podáváním začít ve věku od 3 do 6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.
      1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví
        Pro každou úroveň dávek použít nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počet zvířat na konci pokusu musí být takový, aby umožnil vyhodnocení toxických účinků.
      1. 1.2.2.3 Dávkování
        Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední úroveň dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky.
        Ve skupině s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by k uhynutí rovněž nemělo docházet.
        Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
        Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg^-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Podává-li se látka přímo, například v kapslích, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování v týdenních intervalech přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
        Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejná dieta.
      1. 1.2.2.4 Limitní test
        Provede-li se 90denní test níže popsanou metodou a nevyvolá-li aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den (nebo dávky vyšší - odpovídající možné expozici člověka, je-li tato známa) žádné toxické účinky, je možno od dalšího testování upustit. Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
      1. 1.2.2.5 Doba pozorování
        Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky, jejich dobu objevení, stupeň a trvání. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      V ideálním případě se zvířatům podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 90dnů. Podává-li se látka jiným způsobem než v potravě, považuje se za přijatelné podávat látku 5 dní v týdnu.
      Pozorování zahrnuje (ale není na ně omezeno) změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování.
      Příjem potravy (a příjem vody při podávání testované látky v pitné vodě) a hmotnost zvířat se zaznamenávají týdně.
      Nejméně jednou denně je třeba provádět pečlivá klinická vyšetření s vhodnými opatřeními k minimalizaci ztrát zvířat pro studii. Po skončení studie se pitvají všechna zvířata, která přežila. Umírající zvířata je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      U všech zvířat včetně kontrolních se obvykle provedou následující vyšetření:
      (a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      (b) Na začátku testu, a potom buď v měsíčních intervalech nebo uprostřed a dále na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      (c) Na začátku testu, a potom buď v měsíčních intervalech nebo uprostřed a dále na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno (přičemž trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninamino transferasa (dříve pyruvát transaminasa séra) a aspartátamino transferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát transaminasa), ornithin dekarboxylása, gama-glutamyl transpeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků. Před odběrem vzorků krve by nehlodavci měli hladovět (ne více než 24 hodin).
      (d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      1. 1.2.3.1 Pitva
        U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník, jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), a (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. 1.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        Úplné histopatologické vyšetření orgánů a v tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny. Histopatologické vyšetření zvířat z dalších dávkových skupin se provede na orgánech, u kterých byla nalezena poškození u skupiny s nejvyšší dávkou, nebo když je to indikováno na základě klinických pozorováni.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením, typy poškození a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. - živočišný druh, plemeno nebo kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
    2. - experimentální podmínky,
    3. - úroveň dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    4. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
    5. - úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    6. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj, o přežití zvířat do konce sledování,
    7. - popis toxických nebo jiných účinků, ( zejména klinické nálezy),
    8. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    9. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    10. - oftalmologické nálezy,
    11. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    12. - biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
    13. - pitevní nálezy,
    14. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
    15. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    16. - diskuse výsledků,
    17. - interpretace výsledků.

B.28 SUBCHRONICKÁ TOXICITA DERMÁLNÍ
(90denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip testovací metody
    Testovaná látka se aplikuje denně na kůži po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.
      Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu.
      Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba zkoušenou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata
        Je možno použít dospělé potkany, králíky nebo morčata, případně i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty. Provádí-li se subchronický dermální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.
      1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví
        Pro každou úroveň dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
      1. 1.2.2.3 Dávkování
        Je třeba použít nejméně tři hladiny dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.
        Nejvyšší hladina dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední hladina dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 hladiny dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední hladinou dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
        Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové hladiny může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.
      1. 1.2.2.4 Limitní test
        Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.
      1. 1.2.2.5 Doba pozorování
        Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 28 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.
      Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla, u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.
      Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovací plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.
      Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným způsobem vhodným k očištění pokožky.
      Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání.
      Pozorování v kleci zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:
      (a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      (b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      (c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno (přičemž trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu), alaninamino transferasa (dříve glutamát- pyruvát transaminasa) a aspartátamino transferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát transaminasa), ornithin dekarboxylása, gama-glutamyl transpeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
      (d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem aplikace.
      1. 1.2.3.1 Pitva
        U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, přídatné pohlavní orgány, žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), (hrudní kost s kostní dření), (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní), a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. 1.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        (a) Úplné histopatologické vyšetření normální a exponované kůže, orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny.
        (b) Je třeba vyšetřit všechna makroskopická postižení.
        (c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.
        (d) Používá-li se potkanů, plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se mají histopatologicky vyšetřovat k zjištění příznaků infekce, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou dávkou.
        (e) Používá-li se satelitní skupiny, musí se provést histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.
1. 2. ÚDAJE
  Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi a procentuálně počet zvířat
  s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu
    Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, krmení,
    2. - podmínky pokusu,
    3. - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    4. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
    5. - hladina bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    6. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj, o přežití zvířat do konce sledování,
    7. - popis toxických nebo jiných účinků,
    8. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    9. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    10. - oftalmologické nálezy,
    11. - hematologická vyšetření a jejich výsledky
    12. - biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
    13. - pitevní nálezy,
    14. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
    15. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    16. - diskuse výsledků,
    17. - interpretace výsledků.

B.29 SUBCHRONICKÁ TOXICITA - INHALAČNÍ
(90denní opakovaná inhalační expozice, studie na hlodavcích)
1. 1. METODA
  1. 1.1 Princip testovací metody
    Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 90 dnů. Použije-li se pro dosažení potřebné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava
      Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
    1. 1.2.2 Experimentální podmínky
      1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata
        Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický inhalační test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný druh a kmen.
      1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví
        Pro každou úroveň koncentrace je třeba použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat další skupinu (satelitní skupinu) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší koncentraci a během následujících 28 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
      1. 1.2.2.3 Expoziční koncentrace
        Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina (případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se použije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky). S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen
        v malém počtu. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
      1. 1.2.2.4 Trvání expozice
        Zvířata se exponují po dobu 6 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. V případě specifických požadavků je možné použít i jiných dob expozice.
      1. 1.2.2.5 Expoziční zařízení
        Pro expozici zvířat se používá dynamické inhalační zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby co nejvíce bránil shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry
        v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.
      1. 1.2.2.6 Doba pozorování
        Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozic i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. 1.2.3 Popis postupu
      Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 90 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Během expozice se nepodává potrava ani voda.

Následující stránka