Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Test neplánované syntézy DNA (UDS) umožňuje měřit reperační syntézu DNA po excizi a odstranění části DNA obsahující oblast poškození indukovaného chemickými, nebo fyzikálními faktory. Test je založen na inkorporaci značeného tymidínu (³H-TdR) do DNA savčích buněk, které nejsou v S fázi buněčného cyklu. Vzestup ³H-TdR je stanoven autoradiograficky, nebo kapalnou scintilační metodou (LSC) v exponovaných buňkách. Používají se primární buněčné kultury potkaních hepatocytů, které jsou exponovány testovanou látkou jak v přítomnosti tak i v nepřítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému. UDS může být také stanovena v systému in vivo.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Testované látky a sloučeniny použité jako kontrolní, nebo referenční se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Další ředění se provádí jenom kultivačním médiem. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk.

         Používají se pouze primokultury potkaních hepatocytů, lidských lymfocytů, nebo stabilizovaných buněčných linií (lidské diploidní fibroblasty).

         Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Počet kultur

            Pro každý experimentální bod je potřeba nejméně dvou buněčných kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo méně, je-li to vědecky zdůvodnitelné) pro LSC UDS.

         1. 1.2.2.2 Negativní a positivní kontroly

            V každém experimentu musí být současně zařazeny negativní a positivní kontroly v přítomnosti i v nepřítomnosti metabolického aktivačního systému.

            Jako positivní kontrolu lze pro potkaní hepatocyty použít 7,12-dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA), nebo 2-acetylaminofluoren (2-AAF). Jako positivní kontrolu pro stabilisované buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC bez metabolické aktivace lze použít 4-nitroquinolin-N-oxid (4-NQO). Jako positivní kontrolu při použití metabolického aktivačního systému lze použít N-dimethylnitrosamin.

         1. 1.2.2.3 Koncentrace testované látky

            Musí být použito několik koncentrací testované látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat toxický efekt.

            Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.

         1. 1.2.2.4 Buňky

            Pro udržování kultur musí být použito vhodné růstové médium, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost. Stabilizované buněčné linie musí být pravidelně kontrolovány na přítomnost Mycoplasmat.

         1. 1.2.2.5 Metabolická aktivace

            Pro primokultury hepatocytů se metabolický aktivační systém nepoužívá. Stabilizované buněčné linie a lymfocyty jsou exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

      1. 1.2.3 Vlastní experiment
         1. 1.2.3.1 Příprava kultur

            Stabilizovaná buněčná linie se připravuje ze zásobní kultury (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C.

            Krátkodobé kultury potkanních hepatocytů se připravují tak, že se umožní čerstvě isolovaným hepatocytům přichytit se ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.

            Kultury lidských lymfocytů jsou založeny pomocí vhodné metody.

         1. 1.2.3.2 Expozice kultur testované látce

            Primární hepatocyty potkana. Čerstvě isolované hepatocyty potkana jsou exponovány testované látce v médiu obsahujícím ³H-TdR po vhodnou dobu. Po ukončené expozici je médium odstraněno, buňky promyty, fixovány a sušeny. Sklíčka jsou ponořena do autoradiografické emulse (alternativně může být použit stripping film), exponována, vyvolána, obarvena a vyhodnocena.

            Stabilizované buněčné linie a lymfocyty

            Autoradiografické techniky: Buněčné kultury jsou exponovány testované látce po vhodnou dobu a pak jsou vystaveny působení ³H-TdR. Doba působení je závislá na druhu testované látky, aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení nejvyššího vrcholu UDS je třeba ³H-TdR přidat současně s testovanou látkou, nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy je ovlivněn možnou interakcí mezi testovanou látkou a ³H-TdR. K odlišení mezi UDS a semikonzervativní replikací DNA se užívá arginin deficientní médium, nízký obsah séra, nebo aplikace hydroxyurey do kultivačního média což způsobí inhibici semikonzervativní replikace DNA.

            Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí testované látce je třeba blokovat vstup buněk do S-fáze, jak bylo shora uvedeno. Buňky jsou pak exponovány testované látce jak bylo popsáno pro autoradiografii. Na konci kultivace je DNA extrahována z buněk a stanoven celkový obsah DNA a určen rozsah inkorporace ³H-TdR.

            Jestliže jsou použity ve shora uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.

      1. 1.2.4 Analýza
         1. 1.2.4.1 Vyhodnocení autoradiografie

            Při vyhodnocování UDS v buněčné kultuře se jádra v S-fázi nehodnotí. Hodnotí se nejméně 50 buněk v každém experimentálním bodě. Preparáty je třeba zakódovat před vyhodnocováním. V každém preparátu se hodnotí několik náhodně vybraných polí. Množství inkorporovaného ³H-TdR v cytoplasmě se určí v zóně o velikostí tří jader v cytoplasmě každé hodnocené buňky.

         1. 1.2.4.2 Vyhodnocení LSC

            Pro stanovení LSC UDS se použije přiměřený počet kultur pro každou koncentraci testované látky a pro kontroly.

            Výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.

1. 2. ÚDAJE

   Údaje musí být uvedeny v tabulkách.

   1. 2.1 Vyhodnocení autoradiografie

      Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn nalezených mimo buněčné jádro se zaznamenávají odděleně.

      Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn v jádře je hodnocen pomocí průměru, mediánu a modu.

   1. 2.2 Vyhodnocení LSC

      Inkorporace ³H-TdR se zaznamenává jako dpm/μg DNA. Průměrná hodnota dpm/μpg DNA spolu se směrodatnou odchylkou se používají k vyjádření distribuce inkorporace.

      Údaje se vyhodnocují vhodnými statistickými metodami.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - použitých buňkách, jejich hustotě a číslu pasáže v době ovlivnění kultury, počtu buněčných kultur,
      2. - metodách použitých k udržování kultury, médiu, teplotě, koncentraci CO₂,
      3. - testované látce, rozpouštědle, koncentracích a zdůvodnění jejich výběru v experimentu,
      4. - metabolickém aktivačním systému,
      5. - pokusném schématu,
      6. - positivních a negativních kontrolách,
      7. - použitých autoradiografických metodách,
      8. - způsobech blokování vstupu buněk do S-fáze,
      9. - postupech použitých k extrakci DNA, a k vyhodnocení celkového obsahu DNA při metodě LSC,
      10. - vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
      11. - statistickém vyhodnocení,
      12. - diskusi výsledků,
      13. - interpretaci výsledků.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      SCE je krátkodobý test pro detekci recipročních výměn DNA mezi dvěma sesterskými chromatidami chromozómu. SCE representují výměny identických sekvencí DNA mezi replikačními produkty v identických (homologních) lokusech. SCE pravděpodobně vyžaduje zlom a opětovné spojení, ale je zatím málo znalostí o molekulárním základě tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje diferenční značení sesterských chromatid. Toho se dosahuje inkorporací bromodeoxyuridinu (BrdU) do chromozomální DNA na dobu dvou buněčných cyklů.

      Savčí buňky in vitro jsou exponovány testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému, je-li to potřebné. Kultivují se po dobu dvou replikačních cyklů v médiu obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se buňky ovlivní inhibitorem dělícího vřeténka (např. kolchicín) k akumulaci buněk v c-metafázi mitózy. Po ukončení kultivace jsou buňky zpracovány a připraveny preparáty pro analýzu chromozómů.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Používají se primokultury, (lidské lymfocyty) nebo stabilizované buněčné linie (ovariální buňky čínského křečka). Buněčné linie musí být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty,

         Používají se vhodná kultivační média a kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost),

         Testovaná látka se rozpouští, nebo suspenduje v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Výsledná koncentrace rozpouštědla nesmí významně ovlivnit životnost buněk, rychlost růstu nebo frekvenci SCE,

         Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti vhodného exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Počet kultur

            Pro každý experimentální bod se použijí nejméně dvě kultury.

         1. 1.2.2.2 Negativní a pozitivní kontroly

            V každém experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s látkami s přímým mutagenním účinkem a látky vyžadující metabolickou aktivaci. Dále musí být použita negativní kontrola s použitým rozpouštědlem.

            Jako positivní kontrolu lze použít:

            1. - přímo působící mutageny: etylmetansulfonát
            2. - nepřímo působící mutageny: cyklofosfamid

            Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.

         1. 1.2.2.3 Koncentrace

            Testují se nejméně tři dávky. Nejvyšší koncentrace testované látky musí mít signifikantní toxický účinek, ale zároveň musí umožnit adekvátní replikaci buněk. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.

      1. 1.2.3 Popis postupu
         1. 1.2.3.1 Příprava kultur

            Stabilizovaná buněčná linie se připravuje se zásobní kultury (trypsinací, nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C. Pro monovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby na konci kultivace nevytvářely více než z 50 % konfluentní vrstvu. Lze také použít suspensních kultur. Lidské lymfocytární kultury se připraví z heparinizované krve běžnými postupy a inkubují při 37 °C.

         1. 1.2.3.2 Uxpozice kultur

            Buňky jsou exponovány testované látce v exponenciální fázi růstu po vhodnou dobu. Ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, ale expozice může být prodloužena až na dva buněčné cykly, je-li to třeba. Buňky, které nemají dostatečnou vlastní metabolickou aktivitu, musí být exponovány testovanou látkou v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je testovaná látka z média odstraněna, buňky vymyty a dále kultivovány v růstovém médiu s BrdU dva replikační cykly. Alternativně mohou být buňky exponovány současně s testovanou látkou a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.

            Lidské lymfocytární kultury jsou exponovány testovanou látkou dokud jsou v semisynchronizovaných podmínkách.

            Buňky jsou analyzovány v druhém mitotickém dělení po expozici testované látce, která proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s BrdU je třeba udržovat v temnu, nebo ve světle zastíněné žárovky, aby se zabránilo fotolýze DNA ve které je inkorporovaný BrdU.

         1. 1.2.3.3 Zpracování buněk

            Jednu až čtyři hodniny před ukončením kultivace se do kultur přidá inhibitor dělícího vřeténka (např. kolchicín). Každá kultura se zpracovává samostatně.

         1. 1.2.3.4 Příprava preparátů a barvení

            Preparáty se připraví standardní cytogenetickou technikou. Barvení preparátů ke znázornění SCE může být provedeno několika technikami (např. fluorescenční plus Giemsa).

         1. 1.2.3.5 Analýza

            Počet analyzovaných buněk je závislý na spontánní frekvenci SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na každou kulturu. Preparáty musí být zakódovány před analýzou. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U stabilizovaných linií pouze metafáze, které se liší o ±2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se budou analyzovat SCE v oblasti centromery. Výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.

1. 2. ÚDAJE

   Údaje se zpracovávají tabulkovou formou. Zaznamenává se počet SCE v každé metafázi a počet SCE/chromozóm zvlášť pro každou metafázi v exponovaných i kontrolních skupinách.

   Údaje se hodnotí vhodnými statistickými metodami.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury,
      2. - kultivačních podmínkách: složení média, teplotě, koncentraci CO₂, koncentraci testované látky, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce expozice, inhibitoru mitozy a jeho koncentraci i jeho délce působení, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách,
      3. - počtu kultur pro každý experimentální bod,
      4. - způsobu přípravy mikroskopických preparátů
      5. - počtu analyzovaných metafází (odděleně pro každou kulturu)
      6. - průměrném počtu SCE/buňku a SCE/chromozóm (odděleně pro každou kulturu
      7. - kritériích hodnocení SCE
      8. - zdůvodnění výběru koncentrací
      9. - vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
      10. - statistickém vyhodnocení,
      11. - diskusi výsledků,
      12. - interpretaci výsledků.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Test na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) na Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, jak genových, tak i malých delecí, v zárodečných buňkách hmyzu. Je to test na forward mutace vhodný pro skríning mutací v přibližně 800 lokusech chromozómu X. Tyto representují asi 80 % všech lokusů X-chromozómu. X-chromozóm representuje přibližně 1/5 celého haploidního genómu.

      Mutace v X-chromozómu se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se normálně rodí heterozygotní samici. SRLS test je výhodný vzhledem k zvláštnímu vzhledu a uspořádání chromozómů.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava
         1. 1.2.1.1 Zdroje

            Používají se samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodné dobře popsané linie samic s vícenásobnou inversí X-chromozómu.

         1. 1.2.1.2 Testované látky

            Testované látky se rozpouštějí ve vodě. Látky ve vodě nerozpustné se rozpouštějí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle (např. směs etanolu a Tweenu-60, nebo 80), před aplikací se dále ředí vodou, nebo fyziologickým roztokem. Doporučuje se nepoužívat dimetylsulfoxid (DMSO) jako vehikulum.

         1. 1.2.1.3 Počet zvířat

            Test má předem určenou citlivost. Spontánní frekvence mutací v kontrolní skupině významně ovlivňuje nutný počet ovlivněných chromozómů, které je třeba analyzovat.

         1. 1.2.1.4 Způsob aplikace

            Expozice testované látce se uskutečňuje per os, injekčně, nebo expozicí plynům nebo parám. Zkrmování testované látky se provádí v cukerném roztoku. Je-li to nutné, testovaná látka se rozpustí v 0,7 % roztoku NaCl a injikuje se do hrudní nebo břišní dutiny.

         1. 1.2.1.5 Negativní a positivní kontroly

            V každém pokusu se zařazují negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly. Jestliže má laboratoř k dispozici vhodné historické kontrolní údaje, není třeba zařazovat do experimentu souběžné kontroly.

         1. 1.2.1.6 Dávkování

            Používají se tři dávky testované látky. Pro předběžný orientační odhad se používá jedna dávka rovnající se maximální tolerované koncentraci, nebo vyvolávající známky toxicity. Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce.

      1. 1.2.2 Popis postupu

         Samci divokého typu (ve stáří 3-5 dnů) jsou ovlivněni testovanou látkou a individuálně kříženi s virginními samicemi z linie Muller-5 nebo z jiné vhodné markerové linie (vícenásobná inverse X-chromozómu). Samice jsou vyměněny za čerstvé virginní samice každé dva až tři dny aby byl pokryt celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic je sledován letální efekt korespondující s účinkem testované látky v době expozice na zralé spermie, na spermatidy ve středním, nebo pozdním stádiu, časné spermatidy, spermatocyty a spermatogonie.

         Heterozygotní F₁ samice narozené z tohoto křížení jsou dále kříženy individuálně (t.j. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V F₂ generaci je v každé kultuře zaznamenávána absence samců divokého typu. Jestliže v kultuře vznikají F₁ samice nesoucí letální mutaci v rodičovském X-chromozómu ( nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromozómem), dcery těchto samic se stejným genotypem jsou dále testovány aby se zjistilo, zda letalita se opakuje v dalších generacích.

1. 2. ÚDAJE

   Získané údaje se zpracují do formy tabulky. Uvádí se počet hodnocených X-chromozómů, počet afertilních samců a počet chromozómů s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období křížení a pro každého testovaného samce. Zaznamenává se počet clusterů různých velikostí pro každého samce. Výsledky se mají potvrdit v nezávislém experimentu.

   Údaje se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Nahromadění recesivních letálních mutací vzniklých v jednom samci má být vzato v úvahu a zhodnoceno vhodným statistickým způsobem.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - použitých liniích, nebo kmenech Drosophily, věku, počtu ovlivněných samců, počtu sterilních samců, počtu vzniklých F₂ kultur, počtu F₂ kultur bez potomků, počtu chromozómů nesoucích letální mutaci pro každé stádium zárodečných buněk,
      2. - kritériích pro velikost ovlivněných skupin,
      3. - podmínkách testu: detailní popis ovlivňování a schéma odběru vzorků, výše dávek, údaje o toxicitě, negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly,
      4. - kritériích počítání letálních mutací,
      5. - vztahu expozice/účinek, je-li to možné,
      6. - hodnocení údajů,
      7. - diskusi výsledků,
      8. - interpretaci výsledků.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Savčí buňky lze použít pro detekci fenotypických změn in vitro indukovaných chemickými látkami spojených s maligní transformací in vivo. Nejčastěji se používají buňky C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischerových potkanů a test se opírá o změny buněčné morfologie, tvorbu ložisek, nebo změny v uchycení v semisolidním agaru. Méně se používají systémy detekující ostatní fyziologické či morfologické změny v buňkách po expozici karcinogenním látkám. Žádný výsledek in vitro testu není důkazem karcinogenity. Některé systémy jsou schopné detekce promotorů. Cytotoxicita může být zjištěna hodnocením účinku testované látky na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency), nebo ovlivněním rychlosti růstu kultury. Při hodnocení cytotoxicity se vychází ze skutečnosti, že expozice testované látce byla toxikologicky relevantní, ale přesto ji nelze použít k určení frekvence transformace ve všech experimentech, protože u některých mohlo dojít k prodloužení inkubace, nebo k replatingu.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava
         1. 1.2.1.1 Buňky

            Existuje řada buněčných linií a primokultur použitelných k testu transformace. Experimentátor musí zajistit, že buňky použité v testu transformace vykazují příslušné fenotypické změny po expozici známým karcinogenem a že test používaný laboratoří je ověřen a že je dokumentována jeho oprávněnost a spolehlivost.

         1. 1.2.1.2 Médium

            Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro použitý test transformace.

         1. 1.2.1.3 Testované látky

            Testované látky se rozpouštějí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle před ovlivněním buněk. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí ovlivnit životnost buněk, růstovou rychlost nebo výskyt transformace.

         1. 1.2.1.4 Metabolická aktivace

            Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a bez přítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Alternativně mohou být použity buňky s vlastní metabolickou aktivitou, jestliže její vlastnosti jsou vhodné pro testované látky.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Negativní a positivní kontroly

            Do každého experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s použitím látek přímo působících, i vyžadujících metabolickou aktivaci. Musí být zařazeny také negativní kontroly (s rozpouštědlem).

            Příklady látek pro positivní kontroly:

            1. - přímo působící látky: etylmetansulfonát, β-propiolakton,
            2. - látky vyžadující metabolickou aktivaci: 2-acetylaminofluoren, 4-dimetylaminoazobenzen, 7,12-dimetylbenzantracen.

            Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.

         1. 1.2.2.2 Koncentrace

            Testují se nejméně tři dávky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace způsobují nízkou úroveň přežívání buněk, v nejnižší koncentraci je přežívání buněk přibližně stejné jako v negativní kontrole. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.

      1. 1.2.3 Popis postupu

         Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu závislou na použitém testovacím systému. Ta může zahrnovat i opakovanou expozici testované látce spojenou s výměnou média (ev. výměnou čerstvé metabolické aktivační směsi) jestliže se jedná o prolongovanou expozici. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je z buněk propláchnutím odstraněna testovaná látka a kultivace probíhá dále za vhodných podmínek pro transformaci. Pak je zaznamenáván výskyt transformace. Všechny výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.

1. 2. ÚDAJE

   Údaje musí být presentovány v tabulkové formě. Je vhodné vyjadřovat přežívání buněk jako procento kontrolní úrovně a frekvenci transformací jako počet transformací na počet přežívajících buněk. Data je třeba zpracovat vhodnými statistickými metodami.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury, počtu kultur,
      2. - kultivačních podmínkách: koncentraci testované látky, době inkubace, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce a frekvenci expozice, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách, hustotě buněk během expozice, specifikaci sledovaného fenotypu, použití selektivního systému (je-li to vhodné), zdůvodnění výběru koncentrací,
      3. - metodách vyčíslení živých a transformovaných buněk,
      4. - statistickém vyhodnocení,
      5. - diskusi výsledků,
      6. - interpretaci výsledků.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Dominantní letalita způsobuje embryonální, nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárodečné tkáně exponovaného zvířecího druhu. Obecně se přijímá, že dominantní letální mutace jsou způsobeny poškozením chromozómů (strukturální a numerické abnormality). Smrt embrya exponované samice může být také výsledkem toxického účinku.

      Samci jsou exponováni testované látce a pářeni s neovlivněnými, intaktními samicemi. Vzestup mrtvých implantací na samičku v exponované skupině nad počet mrtvých imlantací v kontrolní skupině vyjadřuje postimplantační ztráty. Preimplantační ztráty se hodnotí na základě počtu žlutých tělísek, nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině. Celková dominantní letalita je součet pre- a postimplantačních ztrát. Výpočet celkové dominantní letality je založen na srovnání živých implantací na samici v exponované skupině k živým implantacím na samici v kontrolní skupině. Snížení počtu implantací v některém intervalu může být způsobeno zánikem buněk (t.j. spermatocytů a/nebo spermatogonií).

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Testovanou látku rozpustit, nebo suspendovat ve fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě se ředí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle. Použité rozpouštědlo nesmí reagovat s testovanou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Před aplikací je třeba připravovat čerstvě naředěnou testovanou látku.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Způsob aplikace

            Testovaná látka se obvykle podává pouze jednou. Na základě toxikologických informací je možné podávat látku opakovaně. Obvyklý způsob aplikace je orální sondou nebo intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné způsoby aplikace.

         1. 1.2.2.2 Experimentální zvířata

            Pro test se doporučují použít potkani, nebo myši. Zdravá, pohlavně dospělá zvířata jsou náhodně rozdělena na exponované a kontrolní skupiny.

         1. 1.2.2.3 Počet a pohlaví

            Je třeba použít dostatečný počet exponovaných samců s ohledem na spontánní variabilitu hodnocené biologické charkteristiky. Počet se řídí předem zjištěnou detekční citlivostí a silou statistického testu. V typickém případě se na příklad volí takový počet samců, aby se dosáhlo 30 - 50 březích samic na připouštěcí interval.

         1. 1.2.2.4 Negativní a positivní kontroly

            Positivní a negativní (s rozpouštědlem) kontroly musí být zařazeny do každého experimentu. Jestliže však má laboratoř k dispozici přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávných experimentů, mohou být použity. Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných, nízkých dávkách aby byla prokázána citlivost testu (např. MMS, intraperitoneálně, 10 mg.kg^-1).

         1. 1.2.2.5 Dávkování

            Nejčastěji se používají tři dávkové hladiny. Nejvyšší dávka má vyvolávat známky toxicity, nebo snížené fertility u exponovaných zvířat. V některých případech je postačující jedna vysoká dávka.

         1. 1.2.2.6 Limitní test

            Netoxické látky se podávají v jedné dávce 5 g.kg^-1, nebo v dávce 1 g.kg^-1.den^-1 při opakované aplikaci.

      1. 1.2.3 Popis postupu

         Existuje několik postupů. Nejčastěji se používá jednorázová aplikace. Může však být použito jiné schéma.

         Jeden samec je opakovaně křížen s jednou, nebo dvěmi neovlivněnými, intaktními samičkami ve vhodných intervalech po aplikaci látky. Samičky musí být u samců nejméně po dobu trvání jednoho cyklu říje, nebo pokud se neprokáží spermie ve vagině, či vaginální zátka.

         Počet páření po expozici je dán schématem expozice a musí zahrnovat všechna stádia zárodečných buněk sledovaných po expozici.

         Samice jsou utraceny cervikální dislokací ve druhé polovině březosti a obsah dělohy je vyšetřen k určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaječníky musí být vyšetřeny k určení počtu žlutých tělísek.

1. 2. ÚDAJE

   Údaje o počtu samců, počtu březích samic, a počtu nezabřezlých samic jsou uváděny v tabulkách. Výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice jsou uváděny samostatně. Každá samice musí mít záznam o týdnu páření, o dávce podané samci, o počtu živých a mrtvých implantacích.

   Zhodnocení celkového dominantního letálního efektu je založeno na srovnání počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací v kontrolní skupině. Poměr mrtvých ku živým implantacím v exponované skupině ke stejnému poměru v kontrolní skupině po analýze vypovídá o postimplantačních ztrátách.

   V tabulce musí být jasně odlišeny časná a pozdní letalita. Musí být zaznamenány i preimplantační ztráty. Ty mohou být vypočítány jako rozdíl mezi počtem corpora lutea a počtem implantací, nebo jako snížení průměrného počtu implantací na dělohu ve srovnání s kontrolou.

   Údaje jsou vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - druhu, kmeni, věku a váze zvířat, počet zvířat od každého pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
      2. - testované látce, rozpouštědlu, dávkových hladinách a důvodech jejich výběru, negativních a positivních kontrolách, údajích o toxicitě,
      3. - způsobu podání a schematu expozice,
      4. - schéma páření,
      5. - metodách k průkazu páření,
      6. - doba usmrcení,
      7. - kriteria pro počítání dominantních letálních efektů,
      8. - vztah dávka/odpověď,
      9. - statistické hodnocení,
      10. - diskuse výsledků,
      11. - interpretace výsledků.

1. 1. METODA

   Metoda je replikací OECD TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).

   1. 1.1 ÚVOD

      Účelem testu je in vivo identifikovat látky způsobující strukturální chromozómové aberace v savčích spermatogoniích (1) (2) (3) (4) (5). Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Tato metoda není určena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou u člověka příčinou řady genetických chorob.

      Tímto testem se analyzují chromozómové aberace v spermatogoniích a proto se předpokládá, že dokáže predikovat indukci dědičných mutací v zárodečných buňkách.

      K testu se obvykle používají hlodavci. Tímto cytogenetickým testem in vivo se zjišťují chromozómové aberace v mitózách spermatogonií.Tato metoda nepoužívá jiné cílové buňky.

      Aby se ve spermatogoniích zjistily aberace chromatidového typu, je třeba analyzovat první mitózu po působení testované látky, dříve než se poškození ztratí v následujícím buněčném dělení. Další informace z ovlivněných spermatogonií lze získat analýzou meiotických chromozómů, kde se zjišťují aberace chromozómového typu v diakinéze I, když se ovlivněné buňky mění ve spermatocyty.

      Tento test in vivo je určen ke zjišťování, zda jsou mutageny aktivní v somatických buňkách také aktivní v buňkách zárodečných. Mimoto má test význam také pro hodnocení rizika mutagenity tím, že umožňuje posuzovat faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a reparačních procesů DNA.

      V testes je přítomna řada generací spermatogonií se širokým spektrem citlivosti vůči chemickým látkám. Zjištěné aberace tedy představují souhrn reakcí ovlivněných populací spermatogonií, kde převládají diferencované spermatogonie. Podle jejich polohy ve varleti pak různé generace spermatogonií mohou, ale nemusejí být exponovány krevním oběhem kvůli anatomické a fyziologické bariéře Sertoliho buněk a hemato-testikulární bariéře.

      Existují-li doklady toho, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není tato látka pro test vhodná.

   1. 1.2 DEFINICE

      Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.

      Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)

      Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.

      Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.

      Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.

      Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).

      Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty, a výměny.

   1. 1.3 PRINCIP METODY

      Zvířata se vhodným způsobem exponují testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Ze zárodečných buněk se pak připraví preparáty a po obarvení se v metafázích analyzují chromozómové aberace.

   1. 1.4 POPIS METODY
      1. 1.4.1 Příprava
         1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu

            Běžně se používají samci čínských křečků a myší, lze ovšem použít samce jakéhokoliv jiného vhodného savčího druhu. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

         1. 1.4.1.2 Podmínky chovu

            Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.

            Vlhkost by měla být 50 – 60 %.

         1. 1.4.1.3 Příprava zvířat

            Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

         1. 1.4.1.4 Příprava dávek

            Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

      1. 1.4.2 Podmínky testu
         1. 1.4.2.1 Rozpouštědlo / vehikulum

            Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

         1. 1.4.2.2 Kontroly

            Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

            Pozitivní kontroly by měly ve spermatogoniích vykazovat chromozómové aberace in vivo při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň.

            Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu.

            ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

            Látka	CAS	EINECS
            cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
            cyklohexylamin	108-91-8	203-629-0
            mitomycin C	50-07-7	200-008-6
            akrylamid monomer	79-06-1	201-173-7
            triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

            Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s aberacemi a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky

   1. 1.5 POSTUP
      1. 1.5.1 Počet a pohlaví zvířat

         V každé zkušební a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných samců.

      1. 1.5.2 Dávkovací schéma

         Testovaná látka se podává nejlépe jednorázově nebo ve dvou dávkách. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace rozdělit, tj. na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.

         V případě skupiny s nejvyšší dávkou se vzorky po expozici látce odebírají dvakrát. Jelikož testovaná látka může ovlivňovat kinetiku buněčného dělení, provádí se jeden dřívější a jeden pozdější odběr zhruba 24 a 48 hodin po expozici. U ostatních dávek (tj. mimo dávku nejvyšší) se odběr vzorků provádí po 24 hodinách nebo po 1,5-násobku délky buněčného cyklu po expozici, ledaže je znám vhodnější časový interval pro detekci účinku (6).

         Kromě toho mohou být použity jiné časové intervaly odběru vzorků. Např. jedná-li se o látku zpomalující pohyb chromozómů během mitósy, nebo látku s účinky nezávislými na S-fázi cyklu, jsou vhodnější dřívější doba odběru vzorku (1).

         Zda je vhodné nechat látku působit opakovaně, se posuzuje případ od případu. Pokud se provádí aplikace látky opakovaně, usmrcují se zvířata po 24 hodinách (1,5-násobku buněčného cyklu) od poslední aplikace. Odběry lze provádět i v dalších intervalech, považuje-li se to za účelné.

         Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3-5 hodin, u čínských křečků zhruba 4–5 hodin.

      1. 1.5.3 Dávkování

         Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii (7). Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější čas odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální.

         Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity ve spermatogoniích (např. pokles poměru mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi; tento pokles nemá být vyšší než 50 %).

      1. 1.5.4 Limitní test

         Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Podle očekávané humánní expozice se může použít v limitním testu vyšší dávky.

      1. 1.5.5 Aplikace látky

         Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

      1. 1.5.6 Příprava chromozómů

         Okamžitě po usmrcení zvířete se připraví z jednoho nebo z obou varlat připraví buněčná suspenze, na kterou se působí hypotonickým roztokem a fixuje se. Buněčná suspenze se nakape na podložní sklo a obarví.

      1. 1.5.7 Analýza

         U každého jedince se analyzuje minimálně 100 dobře rozprostřených metafází (tj. minimálně 500 metafází v jedné skupině). Tento počet se dá snížit, je-li počet pozorovaných aberací vysoký. Všechny mikroskopické preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven číslu 2n ± 2.

1. 2. ÚDAJE
   1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

      Údaje z jednotlivých zvířat se prezentují v tabelární formě. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého jedince se vyhodnocuje počet buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi a počet aberací na jednu buňku. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť, uvádějí se, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.

      Je-li analyzována mitóza i meióza, stanoví se u všech pokusných zvířat i zvířat z negativní kontroly jakožto míra cytotoxicity poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi, a to tak, že se z každého jedince použije 100 dělících se buněk. Je-li analyzována pouze mitóza, stanoví se mitotický index u minimálně 1000 buněk z každého jedince.

   1. 2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině ovlivněné jednorázovou dávkou a s jedním časovým intervalem odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody (8); statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.

      Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

      Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů.

      Pozitivní výsledky testu ukazují, že testovaná látka vyvolává v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.

      Je třeba diskutovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

   ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU

   Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:

   Rozpouštědlo / vehikulum:

   1. – zdůvodnění volby vehikula,
   2. – rozpustnost a stabilita testované látky rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.

   Pokusná zvířata:

   1. – použitý živočišný druh/kmen,
   2. – počet a věk zvířat,
   3. – původ, chovné podmínky, strava apod.,
   4. – hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.

   Podmínky pokusu:

   1. – údaje ze studie pro určení rozpětí toxicity, byla-li provedena,
   2. – zdůvodnění volby velikosti dávek,
   3. – zdůvodnění způsobu aplikace látky,
   4. – podrobnosti o přípravě testované látky,
   5. – podrobnosti o podávání testované látky,
   6. – zdůvodnění doby usmrcení zvířat,
   7. – případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti/den),
   8. – podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
   9. – podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
   10. – metody zjišťování toxicity,
   11. – látka blokující metafázi, její koncentrace a délka působení,
   12. – metody přípravy mikroskopických preparátů
   13. – kritéria pro hodnocení aberací,
   14. – počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,
   15. – kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.

   Výsledky:

   1. – známky toxicity,
   2. – mitotický index,
   3. – poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi,
   4. – typ a počet aberací pro každého jedince zvlášť,
   5. – celkový počet aberací v dané skupině,
   6. – počet buněk s aberacemi na jednu skupinu,
   7. – vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
   8. – statistické analýzy, byly-li provedeny,
   9. – údaje ze souběžných negativních kontrol,
   10. – historické údaje z negativních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
   11. – údaje ze souběžných pozitivních kontrol,
   12. – případně pozorované změny ploidie.

   Diskuse výsledků.

   Závěry.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Je to in vivo test na myších, u kterých jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u embryí jsou melanoblasty a cílovými geny ty, které kontrolují pigmentaci srsti. Embrya jsou heterozygoti pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace, nebo ztráty dominantních allel v genech melanoblastů jsou vyjádřeny recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrny (spots) pozměněné barvy srsti narozených myší. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, je zaznamenán a jejich frekvence je srovnávána s frekvencí u potomků z kontrol. Myší spot test detekuje především somatické mutace v embryonálních buňkách.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Testované látky jsou rozpuštěny, nebo suspendovány v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Použitá rozpouštědla nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxický efekt. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky.

         1. 1.2.1.1 Experimentální zvířata

            Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c ^ch p/c ^ch p; brown, b/b; dilute, shon ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) jsou kříženy buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ /ln fz; pearl pe/pe) nebo s kmenem C57 BL (nonagouti, a/a).

            Mohou být použita i jiná křížení, za předpokladu že budou vznikat nonagouti potomci. Např. křížení mezi kmenem NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).

         1. 1.2.1.2 Počet a pohlaví zvířat

            Použije se dostatečný počet zabřezlých samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou dávku. Vhodná velikost vzorku je závislá na počtu skvrn pozorovaných u ovlivněných myší a u kontrolních myší. Negativní výsledky jsou akceptovány pouze v případě, že bylo hodnoceno nejméně 300 potomků samic ovlivněných nejvyšší dávkou.

         1. 1.2.1.3 Negativní a positivní kontroly

            Musí být použity kontroly ovlivněné pouze rozpouštědlem (negativní kontroly. Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní hodnoty z téže laboratoře za předpokladu, že jsou homogenní. Nedávné údaje z positivních kontrol získané v téže laboratoři při expozici látce se známým mutagenním účinkem mohou být v tomto testu použity, jestliže u testované látky nebyla mutagenita detekována.

         1. 1.2.1.4 Způsob aplikace

            Obvykle se používá orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Je-li to vhodné, je možné použít inhalační, nebo jiný způsob aplikace.

         1. 1.2.1.5 Dávkování

            Používají se nejméně dvě dávky z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo zmenšení velikosti vrhu.

      1. 1.2.2 Popis postupu

         Zvířata jsou obyčejně ovlivněna testovanou látkou pouze jednou 8., 9., nebo 10. den březosti, přičemž za 1.den březosti se považuje den zjištění vaginální zátky. Tyto dny odpovídají 7.25, 8.25 a 9.25 dnů po koncepci. Opakované ovlivnění látkou lze provést během těchto dnů.

         Analýza

         U mláďat je počítán a zaznamenáván počet skvrn mezi třetím a čtvrtým týdnem po porodu. Rozlišují se tři třídy skvrn:

         (a) bílé skvrny v rozsahu 5 mm ve střední ventrální linii o kterých se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);

         (b) žluté skvrny typu agouti, se vyskytují v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, a předpokládá se, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS);

         (c) zbarvené a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti jako výsledek somatických mutací (RS).

         Všechny tři skupiny jsou zaznamenávány, ale pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením mezi MDS a RS je možné vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.

         Zaznamenávají se nápadné, velké morfologické malformace potomků.

1. 2. ÚDAJE

   Získaná data jsou uváděna jako celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat majících jednu, nebo více skvrn vyvolaných somatickými mutacemi. Údaje získané z kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Údaje jsou také uváděny jako získané hodnoty na vrh.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - kmeni použitém při křížení,
      2. - počtu zabřezlých samic v experimentální a v kontrolní skupině,
      3. - průměrné velikosti vrhu v experimentální a v kontrolní skupině při porodu a při odstavení,
      4. - dávkových úrovních testované látky,
      5. - použitém rozpouštědle,
      6. - ve kterém dni březosti byla testovaná látka aplikována,
      7. - o způsobu podání testované látky,
      8. - celkovém počtu sledovaných potomků, a jejich počet s WMVS, MDS a RS v experimentální a kontrolní skupině,
      9. - hrubých morfologických malformacích,
      10. - vztahu dávka/odpověď u RS, je-li to možné,
      11. - statistickém hodnocení,
      12. - diskusi výsledků,
      13. - interpretaci výsledků.

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip metody

      Test na přenosné translokace u myší detekuje strukturální a numerické chromozómové změny v savčích zárodečných buňkách zachycené v první generaci potomků. Indukované změny jsou reciproké translokace a u samičích potomků ještě ztráty X-chromozómu. Nositelé translokací a XO-samice vykazují sníženou fertilitu, která se využívá pro výběr F₁ potomstva pro cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je způsobena některými typy translokací (X-autosom a c-t typ). Translokace jsou analyzovány mikroskopicky v meiotických buňkách samců ze spermatocytů ve stadiu diakinézy-metafáze I, nebo F1 samců či samčích potomků F₁ samic. Samice XO jsou cytogeneticky identifikovány přítomností pouze 39 chromozómů v mitózách z kostní dřeně.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.

         1. 1.2.1.1 Způsob aplikace

            Aplikuje se obvykle orálně sondou, nebo intraperitoneální injekcí. Mohou být použity i jiné vhodné způsoby aplikace.

         1. 1.2.1.2 Experimentální zvířata

            Pro snadnější křížení a cytologickou verifikaci se pokusy provádí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen. Průměrná velikost vrhu by měla být větší než osm a měla by být relativně konstantní. Používají se zdravá, pohlavně dospělá zvířata.

         1. 1.2.1.3 Počet zvířat

            Počet zvířat nutně závisí na frekvenci spontánních translokací a na minimálním počtu indukovaných translokací vyžadovaném pro positivní kontrolu.

            Test se obvykle provádí analýzou samců F₁ potomků. Nejméně 500 samců v F₁ generaci je testováno v každé exponované skupině. Jestliže budou analyzovány také samice F₁ generace potomků, pak se vyžaduje 300 samců a 300 samic.

         1. 1.2.1.4 Negativní a positivní kontroly

            Mohou se použít adekvátní výsledky kontrol získané z předchozích pokusů. Jestliže jsou dostupné přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávného pokusu z téže laboratoře, mohou být použity.

         1. 1.2.1.5 Dávkování

            Používá se jedna dávka, obyčejně nejvyšší dávka vyvolávající minimální toxický efekt ale bez vlivu na reprodukční chování nebo přežívání. Pro stanovení vztahu dávka/odpověď je třeba dvou dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná dávka.

      1. 1.2.2 Popis postupu
         1. 1.2.2.1 Expozice a oplodnění

            Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.

            Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.

         1. 1.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů

            Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility F₁ potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců F₁ generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.

            (a) Test fertility

            Snížená fertilita zvířat v F₁ generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.

            Velikost vrhu: F₁ samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18.dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví F₂ potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány F₁ samice, F₂ potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice-nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0-samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1:1 na 1:2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální F₁ zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první F₂ vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy. F₁ zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří F₂ vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.

            Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikostí vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní F₁ samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. -16.den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.

            (b) Cytogenetická analýza

            Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - matafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni F₁ samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u F₁ samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.

1. 2. ÚDAJE

   Získané údaje jsou presentovány tabulkovou formou.

   Pro každý interval připouštění je zaznamenána průměrná velikost vrhu a poměr pohlaví (sex ratio).

   Pro odhad ferility F₁ zvířat se uvádí průměrná velikost vrhu kontroly a individuální velikosti vrhů F₁ nosičů translokací. Pro analýzu obsahů dělohy se uvádí průměrný počet živých a mrtvých zárodků v kontrole a individuální počty živých a mrtvých zárodků pro každé připouštění F₁ nosičů translokací.

   Při cytogenetické analýze diakinéze-metafáze I se uvádí počet typů multivalentních figur a celkový počet buněk pro každého nosiče translokací.

   Pro F₁ sterilní jedince se zaznamenává počet a doba připuštění. Dále se uvádí váha testes a podrobnosti o cytogenetické analýze.

   U X0 samic se uvádí průměrná velikost vrhu, sex ratio F₂ potomků a výsledky cytogenetické analýzy.

   V případě, že pomocí testů fertility byly předběžně vybráni možní nositelé F₁ translokací, je třeba v tabulkách uvést informaci o skutečném počtu potvrzených translokačních heterozygotů.

   Musí být uvedeny údaje o negativních a positivních kontrolách.

1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:

      1. - kmenu myší, stáří a váze exponovaných zvířat,
      2. - počtu rodičovských zvířat pro každé pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
      3. - experimentálních podmínkách, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla a schéma připouštění
      4. - počtu a pohlaví mláďat na samici, počet a pohlaví potomků chovaných pro analýzu translokací,
      5. - době a kritériích analýzy translokací,
      6. - počet a detailní popis nosičů translokací, včetně údajů o březosti a obsahu dělohy,
      7. - popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, pokud možno s obrázky,
      8. - statistické hodnocení,
      9. - diskuse výsledků,
      10. - interpretace výsledků.

(90denní opakované podávání per os, studie na hlodavcích)

1. 1. METODA
   1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.

         Testovanou látku lze podávat v potravě, sondou, v kapslích nebo v pitné vodě. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná dřívější data, je možno je využít.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata