Platné znění

Vyhláška, kterou se mění vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

zrušený předpis

Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí 103 až 104 buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na každé destičce se použije standardní suspenze 105 až 106 buněk na 1 ml v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.

Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A.

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).

Validované jsou dva protokoly ELISA.

  1. a) Nepřímý test ELISA (Robinson Smith et al., 1995)
    1. 1) Použije se 100-200 μl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4 minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech redukovat vznik nespecifických výsledků).
    2. 2) Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.
    3. 3) Nakape se 100 μl do každé jamky mikrotitrační destičky (např. Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C nebo 14 –18 h při teplotě 4 °C.
    4. 4) Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween (dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5 minut.
    5. 5) Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je titr).
    6. 6) Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
    7. 7) Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4.).
    8. 8) Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
    9. 9) Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).
    10. 10) Přidá se 100 μl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových intervalech.
  1. b) DAS-ELISA
    1. 1) Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky. Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 ° C po dobu 16 hodin.
    2. 2) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).Přidá se 190 μl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.
    3. 3) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
    4. 4) Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R. solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového albuminu (BSA), přidá se 190 μl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny při teplotě 37 °C.
    5. 5) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
    6. 6) Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.
    7. 7) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
    8. 8) Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém pufru (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky a inkubuje se v temnu při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných intervalech 90 minut.

Interpretace výsledků testu ELISA

Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH) z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových extraktů.

Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních vzorcích.

Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.

  1. 6.1.9. Biotest
  2. Poznámka.:

    Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci 103 až 104 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).

    3. Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách. Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v glycerolu v teplotě - 68 až - 86 °C.

    Následující protokol vychází z Janseho (1988):

    1. 6.1.9.1. Použije se 10 testovacích rostlin citlivé odrůdy rajčete (např. kultivaru Moneymaker nebo kultivaru s rovnocennou citlivostí podle testovací laboratoře) ve fázi třech pravých listů u každého vzorku. Podrobnosti pěstování viz. v dodatku 8. Nebo se použije lilek (např. kultivar Black Beauty nebo kultivary s rovnocennou citlivostí), ale jen rostliny ve fázi 2. až 3. listů až do plného rozvinu třetího pravého listu. Příznaky u lilku jsou méně výrazné a vyvíjejí se pomaleji. Pokud možno, doporučujeme proto použít sazenice rajčat.
    2. 6.1.9.2. Rozdělí se 100 μl extraktu ze vzorku mezi testovací rostliny.
      1. 1. Inokulace injekční stříkačkou

        Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací rostliny.

      1. 2. Inokulace zářezem

        Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5-10 μl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.

        Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky resuspendované pelety.

        Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

    1. 6.1.9.3. Stejnou technikou se nainokulujte 5 sazenic vodní suspenzí 105 až 106 buněk na 1 ml, připravenou ze 48 hodinové kultury virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum jako pozitivní kontrolní vzorek, a peletovým pufrem (dodatek 4) jako negativní kontrolní vzorek. Oddělí se pozitivní a negativní kontrolní rostliny od ostatních rostlin, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci.
    2. 6.1.9.4. Testovací rostliny se nechají růst v karanténním zařízení 4 týdny při teplotě 25 -30 °C a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zavlažováním, aby se zabránilo jak přemokření, tak vadnutí z důvodu nedostatku vody. Aby se zabránilo kontaminaci, musí být drženy pozitivní a negativní kontrolní rostliny ve zcela oddělených místech skleníku nebo vegetační komory nebo jinak přísně izolovány. Musejí-li být rostliny z různých vzorků po dobu inkubace drženy blízko sebe, oddělí se vhodnými zástěnami. Při hnojení, zalévání, prohlížení a všech ostatních činnostech se věnuje zvláštní pozornost tomu, aby nedošlo k vzájemné kontaminaci. Nutné je udržovat skleník nebo vegetační prostor bez hmyzích škůdců, protože by mohli přenést bakterie mezi vzorky.

      Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.

    1. 6.1.9.5. Z infikovaných rostlin se provede izolace (odst. 2.3) a identifikují se podezřelé čisté kultury (bod 6.2.).
    2. 6.1.9.6. Jestliže během 3 týdnů nejsou pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR/izolace na složeném vzorku ze segmentů stonků dlouhých 1 cm z každé testovací rostliny, odebraných nad místem inokulace. Je-li test pozitivní, provedou se zřeďovací roztěry (bod 4.1).
    3. 6.1.9.7. Identifikují se všechny čisté kultury s podezřením na R. solanacearum (bod 6.2.).

      Interpretace výsledků biotestu

      Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny nevykazují žádné příznaky.

      Biotest je negativní, jestliže rostliny nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin.

      Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R. solanacearum.

  1. 6.2. Identifikační testy

    Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R. solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

    Zahrnou se případně známé referenční kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).

    1. 6.2.1. Výživové a enzymatické identifikační testy

      Určují se následující fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

      TextOčekávaný výsledek
      Produkce fluorescenčního pigmentu-
      Inkluze PHB+
      Oxidačně fermentační testO+/F-
      Katalázová aktivita+
      Oxidázový test podle Kovacse+
      Redukce dusičnanů+
      Využití citrátů+
      Růst při 40°C-
      Růst v 1% NaCl+
      Růst v 2% NaCl-
      Arginin-dihydrolázová aktivita-
      Ztekucení želatiny-
      Hydrolýza škrobu-
      Hydrolýza eskulinu-
      Produkce levanu-

      Média a metody viz. Lelliot &Stead (1987).

    1. 6.2.2. Test IF
      1. 6.2.2.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml v pufru IF (dodatek 4).
      2. 6.2.2.2. Připraví se řada dvojnásobných zředění vhodného antiséra.
      3. 6.2.2.3. Použije se IF metoda (6.1.5.).
      4. 6.2.2.4. Test IF je pozitivní, jestliže titr IF kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.
    1. 6.2.3. Test ELISA
    2. Poznámka:

      Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této metody jiný sérologický test.

      1. 6.2.3.1. Připraví se suspenze přibližně 108 buněk na 1 ml v 1X PBS (dodatek 4).
      2. 6.2.3.2. Provede se test ELISA se specifickou monoklonální protilátkou k R. solanacearum.
      3. 6.2.3.3. Test ELISA je pozitivní, jestliže hodnota jeho výsledku získaná z této kultury je nejméně poloviční v porovnání s hodnotou z pozitivní kontroly.
    1. 6.2.4. Testy PCR
      1. 6.2.4.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml sterilní vody (UPW = ultra pure water).
      2. 6.2.4.2. Ohřeje se 100 μl buněčné suspense v uzavřených zkumavkách v ohřívacím bloku nebo vařící vodní lázni při 100 °C 4 minuty. Vzorky mohou být uchovány při teplotě - 16 až - 24 °C do dalšího použití.
      3. 6.2.4.3. Použijí se příslušné postupy PCR k amplifikaci amplikonů specifických pro R. solanacearum (např. Seal et al. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).
      4. 6.2.4.4. Identifikace organismu R. solanacearum je pozitivní, jestliže amplikony PCR mají stejnou velikost a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentů jako pozitivní kontrolní kmen.
    1. 6.2.5. Test FISH
      1. 6.2.5.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml v UPW.
      2. 6.2.5.2. Použije se metoda FISH (6.1.7) s nejméně 2 oligosondami specifickými pro R. solanacearum (dodatek 7).
      3. 6.2.5.3. Test FISH je pozitivní, jestliže se u kultury a pozitivní kontroly dosáhne stejných reakcí.
    1. 6.2.6. Analýza mastných kyselin (FAP)
      1. 6.2.6.1. Pěstuje se kultura na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) 48 hodin při teplotě 28 °C.
      2. 6.2.6.2. Použijte se metoda FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).
      3. 6.2.6.3. Test FAP je pozitivní, jestliže je profil podezřelé kultury stejný jako profil pozitivní kontroly. Výskyt charakteristických mastných kyselin: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absence 16:0 3 OH poukazuje na Ralstonia sp.
    1. 6.2.7. Metody charakteristiky kmenů

      Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod.

      U každého provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz. dodatek 3).

      1. 6.2.7.1. Stanovení biovaru

        R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku 2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 μl na 1 jamku), zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená pozitivní výsledek testu.

        Obrázek

        Dodatečné testy pro rozlišení dílčích fenotypů biovaru 2

        Obrázek
      1. 6.2.7.2. Genomická variabilita

        Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout několikerými technikami, mezi něž patří:

        1. 1. Analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů RFLP (Cook et al., 1989).
        2. 2. Repetitivní sekvenční PCR s využitím primerů REP, BOX a ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).
        3. 3. Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van der Wolf et al., 1998).
      1. 6.2.7.3. Metody PCR

        Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

  1. 6.3. Konfirmační test (test patogenity)

    Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být proveden test patogenity.

    1. 1) Připraví se inokulum o hustotě přibližně 106 buněk na 1 ml ze 24 až 48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).
    2. 2) Inokuluje se 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3 pravých listů (viz odst. 6.1.9).
    3. 3) Sazenice se nechají inkubovat až 2 týdny při teplotě 25-28 °C a vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení zamokření nebo vyprahlosti půdy. U čistých kultur by typické vadnutí mělo nastat během 14 dnů. Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.
    4. 4) Hledají se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.
    5. 5) Provede se izolace z rostlin vykazujících příznaky odebráním segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace. Segment se rozmělní a suspenduje v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru (dodatek 4). Izolace ze suspense se provede zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2). Po inkubaci 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C se vyhodnotí výskyt typických kolonií pro R. solanacearum.

Dodatek 1

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů
Laboratoř (1)MístoZemě
Agentur für Gesundheit und ErnährungssicherheitVídeň a LinecRakousko
Departement GewasbeschermingMerelbekeBelgie
PlantedirektoratetLyngbyDánsko
Central Science LaboratoryYorkAnglie
Scottish Agricultural Science AgencyEdinburghSkotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de BactériologieAngersFrancie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de TerreLe RheuFrancie
Biologische BundesanstaltKleinmachnowNěmecko
Pflanzenschutzamt HannoverHannoverNěmecko
State LaboratoryDublinIrsko
Dipartimento di Scienze e Tecnologie AgroambientaliBoloňItálie
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi FitosanitariVeronaItálie
Nederlandse Algemene KeuringsdienstEmmeloordNizozemsko
Plantenziektenkundige DienstWageningenNizozemsko
Direcção-General de Protecção das CulturasLisabonPortugalsko
Centro de Diagnóstico de AldearrubiaSalamancaŠpanělsko
Instituto Valenciano de Investigaciones AgrariasValencieŠpanělsko
Swedish University of Agricultural SciencesUppsalaŠvédsko
(1) Kontakty: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2

Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum

  1. a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci
    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Živný agar (NA)
    Živný agar (Difco)23,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
    Kvasnicový extrakt (Difco)5,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)5,0 g
    D(+) Glukóza (monohydrát)10,0 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Sacharózopeptonový agar (SPA)
    Sacharóza20,0 g
    Bacto-Peptone (Difco)5,0 g
    K2 HPO40,5 g
    MgSO4.7H2O0,25 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l
    pH 7,2–7,4

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Kelmanovo tetrazoliové médium
    kasein hydrolyzát (Difco)1,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)10,0 g
    Dextróza5,0 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.

  1. b) Validované selektivní živné půdy

    Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Základní živná půda
    Casamino kyseliny (Difco)1,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)10,0 g
    Glycerol5,0 ml
    Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Krystalová violeť (Sigma)5 mg/l
    Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004)600 000 U (přibližně 100 mg)/l
    Bacitracin (Sigma B-0125)1 250 U (přibližně 25 mg)/l
    Chloramfenikol (Sigma C-3175)5 mg/l
    Penicilín-G (Sigma P-3032)825 U (přibližně 0,5 mg)/l
    2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma)50 mg/l
  2. Poznámky:
    1. 1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R. solanacearum.
    2. 2. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1-2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.
    3. 3. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.

    3. Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.

    Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.

    Nutno zabránit přílišnému vysušení média.

    Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.

  1. c) Validované obohacené živné půdy

Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.

Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
Sacharóza10 g
Proteázový pepton5g
K2 HPO40,5 g
MgSO40,25 g
NaNO30,25 g
Destilovaná voda1,00 l

Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.

Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.

Dodatek 3

  1. A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál
    1. a) Izolované bakteriální kultury

      Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:

      1. 1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.
      2. 2. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.
      3. 3. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.

      Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum
      Kód NCPPBSMT
      #      		Jiné kódyZemě původuBiovar
      NCPPB 41536CFBP 4582, Pr 3020, EURS11Egypt2
      NCPPB 415410CFBP 4585, 550, EURS21Turecko2
      NCPPB 385712CFBP 4587, Pr 1140, EURS26Anglie2
      NCPPB 158423CFBP 4598, EURS49Kypr2
      NCPPB 250524CFBP 4599, EURS50Švédsko2
      NCPPB 415526CFBP 4601, 502, EURS55Belgie2
      NCPPB 4156 (*)71(*)PD 2762, CFBP 3857Nizozemsko2
      NCPPB 415766LNPV 15.59Francie2
      NCPPB 415839CFBP 4608, Port 448, EURS80Portugalsko2
      NCPPB 416069IVIA-1632-2Španělsko2
      NCPPB 416176B3BNěmecko2
      NCPPB 32541CFBP 2047, KEL60-1, R842USA1
      NCPPB 396742CFBP 4610, R285, GONg7Kostarika1
      NCPPB 402843CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205Kolumbie2
      NCPPB 398544CFBP 4612, R578, CIP312Peru2T
      NCPPB 398945CFBP 4613, R568, CIP226Brazílie2T
      NCPPB 399646CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225Peru3
      NCPPB 399747CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131Austrálie3
      NCPPB 402948CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861Srí Lanka4
      NCPPB 400549CFBP 4616, R470Filipíny4
      NCPPB 401150CFBP 4617, R288, HEmps2Čína5
      (*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).
    2. Poznámka:

      Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.

      3. Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů
      Kód NCPPBSMT
      #      		Jiné kódyIdentifikace
      NCPPB 416251CFBP 1954Bacillus polymyxa(1)
      NCPPB 416352CFBP 1538Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1)
      NCPPB 4164-CFBP 2227Burkholderia cepacia (2)
      NCPPB 4165-CFBP 2459Ralstonia pickettii(2)
      NCPPB 416658CFBP 3567, CSL Pr1150Ralstonia pickettii(1)
      NCPPB 416760CFBP 4618, PD 2778Ralstonia sp. (1)
      NCPPB 112753CFBP 3575Burkholderia andropogonis (1)
      NCPPB 35354CFBP 3572Burkholderia caryophylli(1)
      NCPPB 94555CFBP 3569Burkholderia cepacia (1)
      NCPPB 370856CFBP 3574Burkholderia glumae (1)
      NCPPB 359057CFBP 3573Burkholderia plantarii (1)
      NCPPB 372659CFBP 3568Banana Blood Disease Bacterium (1)(2)(3)
      NCPPB 416861CFBP 4619, IPO S339Enterobacter sp. (1)
      NCPPB 416962IPO 1695Enterobacter sp. (1)
      NCPPB 417063CFBP 4621, IPO S306Ochrobactrum anthropi(1)(2)
      NCPPB 417164CFBP 4622, IPO 1693Curtobacterium sp.(1)(2)
      NCPPB 417265IPO 1696aPseudomonas sp.(1)
      NCPPB 4173-PD 2318Aureobacterium sp. (2)
      NCPPB 417481IVIA 1844.06Flavobacterium sp. (1)(2)
      (1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem.
      (2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6).
      (3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.
    1. b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál

      Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.

      Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.

      Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 103 až 104 a 104 až 106 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.

      Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 106 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.

  1. B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH

    Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 108 buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.

    Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.

    Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

    Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 μl resuspendované pelety.

    Přenese se 100 μl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..

    Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.

    Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.

    Připraví se alikvotní části z 100 μl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.

    Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.

    Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

    Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

    Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 106 a 104 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Dodatek 4

Pufry pro testovací postupy

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

  1. 1. Pufry pro extrakci
    1. 1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

      Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Na2 HPO4 (bezvodý)4,26 g
      KH2PO42,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

      Užitečné mohou být následující složky:

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      ÚčelMnožství (na litr)
      Lubrolové vločkyProtisrážlivý prostředek (*)0,5 g
      DC silikonový odpěňovačOdpěňovací činidlo (*)1,0 ml
      TetrasodiumpyrofosfátAntioxidační činidlo1,0 g
      Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40)Vázání inhibitorů PCR50 g
      (*) pro použití při extrakci homogenizací
    1. 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

      Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Na2HPO4.12H2O2,7 g
      NaH2PO4. 2H2O0,4 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

  1. 2. Pufry pro IF test

    Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

    Tento pufr se používá k ředění protilátek.

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
    Na2HPO4.12H2O2,7 g
    NaH2PO4.2H2O0,4 g
    NaCl8,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

    IF-pufr-Tween

    Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.

    Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

    Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

    Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
    Na2HPO4 .12H2O3,2 g
    NaH2PO4 . 2H2O0.15 g
    Glycerol50 ml
    Destilovaná voda100 ml

    Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield® (Vector Laboratories) nebo Citifluor® (Leica).

  1. 3. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA
    1. 3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Na2CO36,36 g
      NaH CO311,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

      Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).

    1. 3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      NaCl80,0 g
      KH2PO42,0 g
      Na2HPO4.12H2O29,0 g
      KCl2,0 g
      Destilovaná voda1,00 l
    1. 3.3. PBS-Tween
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS100 ml
      10 % Tween 205 ml
      Destilovaná voda895 ml
    1. 3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS10,0 ml
      Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)2,0 g
      10 % Tween 200,5 ml
      Sušené mléko0,5 g
      Destilovaná vodadoplnit do 100 ml
    1. 3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Diethanolamin97 ml
      Destilovaná voda800 ml

      Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.

      Doplní se do 1 l destilovanou vodou.

      Přidá se 0,2 g MgCl2.

      Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.

  1. 4. Pufry pro účely testu DASI ELISA
    1. 4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Na2CO31,59 g
      NaH CO32,93 g
      Destilovaná voda1 000 ml

      Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.

    1. 4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      NaCl80,0 g
      Na2HPO4.12H2O27 g
      NaH2PO4.2H2O4g
      Destilovaná voda1 000 ml
    1. 4.3. PBS-Tween
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS50 ml
      10 % Tween 205 ml
      Destilovaná voda950 ml
    1. 4.4 Substrátový pufr, pH 9,8
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy
      Diethanolamin100 ml
      Destilovaná voda900 ml

      Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.

Dodatek 5

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

  1. 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).
  2. 2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

    C = c x S/s,

    kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a

    s = plocha pole objektivu.

    kde i = koeficient pole (v rozmezí 8-24 podle typu okuláru),

    K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),

    G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).

  1. 3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).

    N =C x 1 000/y x F,

    kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

    F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Dodatek 6

Validované protokoly a činidla pro PCR

  • Poznámka:

    Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103 až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).

    1. 1. Protokol PCR Seal et al. (1993)
      1. 1.1. Oligonukleotidové primery
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Přímý primer OLI-1:5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
        Reverzní primer Y-2:5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp

      1. 1.2. Reakční směs PCR
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW17,65 μl
        10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)2,5 μl1x (1,5 mM MgCl2)
        Směs dNTP (20mM)0,25 μl0,2 mM
        Primer OLI-1 (20 μM)1,25 μl1μM
        Primer Y-2 (20 μM)1,25 μl1μM
        Taq polymerasa (5U/μl) (1)0,1 μl0,5 U
        Množství vzorku2,0 μl
        Celkové množství25 μl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
      1. 1.3. Reakční podmínky PCR

        Provede se následující cyklický proces:

        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        1 cyklus:i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
        35 cyklů:ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
        iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
        iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
        1 cyklus:v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
        vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:

        Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

      1. 1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.

    1. 2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)
      1. 2.1. Oligonukleotidové primery
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'
        Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.

      1. 2.2. Reakční směs PCR
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW16,025 μl
        10x pufr PCR (1)2,5 μl1x (1,5 mM MgCl2)
        BSA (frakce V) (10 %)0,25 μl0,1 %
        Směs dNTP (20mM)0,125 μl0,1 mM
        Primer Ps-1 (10 μM)0,5 μl0,2 μM
        Primer Ps-2 (10 μM)0,5 μl0,2 μM
        Taq polymerasa (5U/μl) (1)0,1 μl0,5 U
        Množství vzorku5,0 μl
        Celkové množství25,0 μl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        Poznámka:
        Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.
      1. 2.3 Reakční podmínky PCR

        Provede se následující cyklický proces:

        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        1 cyklusi) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
        iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
        1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
        vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:

        Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

      1. 2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.

    1. 3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)
      1. 3.1. Oligonukleotidové primery
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Přímý primer RS-1-F:5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
        Reverzní primer RS-1-R:5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
        Přímý primer NS-5-F:5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
        Reverzní primerNS-6-R:5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).

        Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).

      1. 3.2. Reakční směs PCR
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW12,625 μl
        10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)2,5 μl1x (1,5 mM MgCl2)
        BSA (frakce V) (10 %)0,25 μl0,1 %
        Směs dNTP (20mM)0,125 μl0,1 mM
        Primer RS-1-F (10 μM)2,0 μl0,8 μM
        Primer RS-1-R (10 μM)2,0 μl0,8 μM
        Primer NS-S-F (10 μM)(2)0,15 μl0,06 μM
        Primer NS-6-R (10 μM)(2)0,15 μl0,06 μM
        Taq polymeráza (5U/μl)(1)0,2 μl1,0 U
        Množství vzorku5,0 μl
        Celkové množství25,0 μl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)).
        Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.
      1. 3.3. Reakční podmínky PCR

        Provede se následující cyklický proces:

        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        1 cyklus:i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
        iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
        1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
        vi) nechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:

        Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

      1. 3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.

    1. 4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)
      1. 4.1. Oligonukleotidové primery
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Přímý primer Rs-1-F:5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
        Reverzní primer Rs-1-R:5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
        Reverzní primer Rs-3-R:5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:

        s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

        s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

      1. 4.2. Reakční směs PCR
        1. a) Protokol PCR specifický pro biovar ½
          Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
          ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
          Sterilní UPW12,925 μl
          10x pufr PCR(1)2,5 μl1x (1,5 mM MgCl2)
          BSA (frakce V) (10 %)0,25 μl0,1 %
          Směs dNTP (20mM)0,125 μl0,1 mM
          Primer Rs-1-F (10 μM)2,0 μl0,8 μM
          Primer Rs-1-R (10 μM)2,0 μl0,8 μM
          Taq polymeráza (5U/μl)(1)0,2 μl1,0 U
          Množství vzorku5,0 μl
          Celkové množství25,0 μl
          (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        1. b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5
          Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
          ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
          Sterilní UPW14,925 μl
          10x pufr PCR (1)2,5 μl1x (1,5 mM MgCl2)
          BSA (frakce V) (10 %)0,25 μl0,1 %
          Směs dNTP (20mM)0,125 μl0,1 mM
          Primer Rs-1-F (10 μM)1,0 μl0,4 μM
          Primer Rs-3-R (10 μM)1,0 μl0,4 μM
          Taq polymeráza (5U/μl) (1)0,2 μl1,0 U
          Množství vzorku5,0 μl
          Celkové množství25,0 μl
          (1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
      1. 4.3. Reakční podmínky PCR

        Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        1 cyklus:i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
        iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
        iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
        1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
        vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:

        Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

      1. 4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

        Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.

    1. 5. Příprava nanášecího pufru
      1. 5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Bromfenolová modř5g
        Destilovaná (redestilovaná) voda50 ml
      1. 5.2. Nanášecí pufr
        Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
        Glycerol (86 %)3,5 ml
        Bromfenolová modř (5,1)300 μl
        Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát)6,2 ml
    1. 6. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR
      TRIS48,4 g
      Ledová kyselina octová11,42 ml
      EDTA (sodná sůl)3,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Před použitím se zředí na 1X.

      Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

    Dodatek 7

    Validovaná činidla pro FISH test

    1. 1. Oligosondy
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test
      Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3:5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
      Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC:5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
    1. 2. Fixační roztok

      [UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

      1. i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
      2. ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]
      3. iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 μm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
    1. 3. 3x Hybmix
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test
      NaCl2,7 M
      Tris-HCl60 mM (pH 7,4)
      EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)15 mM

      Zředí se až 1x, podle potřeby.

    1. 4. Hybridizační roztok
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test
      1x Hybmix
      Sodium dodecyl sulfát (SDS)0,01 %
      Formamid30 %
      Sonda EUB 3385 ng/μl
      Sonda OLI-1 nebo OLI25 ng/μl

      Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 μl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

      Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
      Počet sklíček146810
      Sterilní ultra čistá voda23,192,4138,6184,8231,0
      3 x Hybmix30,0120,0180,0240,0300,0
      1 % SDS0,93,65,47,29,0
      Formamid27,0108,0162,0216,0270,0
      Sonda EUB 338 (100 ng/μl)4,518,027,036,045,0
      Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/μl)4,518,027,036,045,0
      Celkové množství90,0360,0540,0720,0900,0
    2. Poznámka:

      Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

    1. 5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0
      Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
      Na2HPO48,52 g
      KH2PO45,44 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Dodatek 8

    Pěstování lilku a rajčete

    Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do pasterizovaného pěstebního substrátu.

    Rostliny lilku a rajčete by se měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi Dodatek 8 Pěstování lilku a rajčete
    Délka dne:14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
    Teplota:den:21 až 24 °C,
    noc:14 až 18 °C.
    Dodatek 1 Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů Dodatek 2 Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Dodatek 3 Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Dodatek 4 Pufry pro testovací postupy Dodatek 5 Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Dodatek 6 Validované protokoly a činidla pro PCR Dodatek 7 Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi Dodatek 8 Pěstování lilku a rajčete
    Vhodná odrůda lilku vejcoplodého:„Black Beauty“
    Vhodná odrůda rajčete:„Moneymaker“

    Dodavatelé: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

    LITERATURA

    1. 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.
    2. 2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.
    3. 3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;373-380.
    4. 4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.
    5. 5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.
    6. 6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.
    7. 7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.
    8. 8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.
    9. 9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.
    10. 10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.
    11. 11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.
    12. 12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
    13. 13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.
    14. 14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
    15. 15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
    16. 16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
    17. 17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
    18. 18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.
    19. 19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
    20. 20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
    21. 21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
    22. 22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
    23. 23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
    24. 24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.
    25. 25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.
    26. 26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.
    27. 27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.
    28. 28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.
    29. 29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.
    30. 30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.“.
    1. 11. V příloze č. 2 části A se v nadpise a v první větě slova „odst. 12“ nahrazují slovy „odst. 11“.
    2. 12. V příloze č. 2 části A písm. a) poznámka pod čarou č. 1 zní:
    3. „1) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.
    1. 13. V příloze č. 2 části A písm. a) se za první odrážku vkládá nová odrážka, která zní:
      1. „– celková plocha pěstování sadbových a ostatních brambor v hektarech,“.
    1. 14. V příloze č. 2 části A písm. a) čtvrté odrážce se slova „a hmotnost (v tunách)“ zrušují.
    2. 15. V příloze č. 2 části A písm. c) třetí odrážce se slova „– pro hnědou hnilobu“ zrušují.
    3. 16. V příloze č. 2 část B zní:
      „ B. Uchování testovaných vzorků a partií a dokladování testování
      1. Vznikne-li podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby na základě pozitivního výsledku testování provedeného postupy podle přílohy č. 1, musí být až do potvrzení nebo vyvrácení tohoto výsledku dalším postupem podle přílohy č. 1 uchovány a vhodným způsobem konzervovány:
      - celá partie rostlin, z níž byl odebrán vzorek, nebo část této partie v původním obalu s etiketou, je-li to možné,
      - všechny hlízy a pokud možno i rostliny odebraného vzorku,
      - jakýkoliv zbývající extrakt a dodatečně připravený materiál pro screeningový(é) test(y), např. sklíčka pro imunofluorescenční test, a
      - všechny příslušné podklady.
      Uchování hlíz umožní případné testování odrůdové pravosti anebo použít jinou metodu testování.
      2. V případě potvrzení výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby musí být minimálně po dobu jednoho měsíce od úředního oznámení výsledku testu způsobem stanoveným v § 5 odst. 3 uchovány a vhodným způsobem konzervovány:
      - materiál specifikovaný v bodě 1,
      - vzorek infikovaných rostlin lilku vejcoplodého nebo rajčete naočkovaných extraktem z hlíz nebo rostlin (v případě hnědé hniloby, kde je to vhodné), a
      - izolovaná kultura původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby.“.
    1. 17. V příloze č. 3 bodu 1 pátá odrážka zní:
      1. „– na němž byla k závlaze nebo postřiku použita povrchová voda ze zdroje, u něhož bylo potvrzeno, že je zamořen původcem hnědé hniloby nebo který je ze zamoření původcem hnědé hniloby podezřelý,“.
    1. 18. V příloze č. 3 bodu 2 první odrážce se slovo „označené“ nahrazuje slovem „označeném“.
    2. 19. V příloze č. 3 bodu 2 páté a šesté odrážce se slovo „objekty“ nahrazuje slovem „předměty“.
    3. 20. V příloze č. 3 bodu 2 šesté odrážce se slova „bodě 3 přílohy č. 4“ nahrazují slovy „příloze č. 6,“.
    4. 21. V příloze č. 3 bodu 2 sedmá odrážka zní:
      1. „– hostitelské rostliny, které mají na základě testování podle § 6 stejný klonový původ jako hostitelské rostliny označené za zamořené podle § 5 odst. 1 písm. a), a u kterých rostlinolékařská správa na základě odborného šetření podle § 76 odst. 2 zákona označí vzhledem ke klonové souvislosti zamoření za pravděpodobné, a to včetně rostlin testovaných s negativním výsledkem; v případě pochybností o identitě zamořených a klonově příbuzných hostitelských rostlin rostlinolékařská správa určí testování odrůdové pravosti,“.
    1. 22. V příloze č. 3 bodu 2 desáté odrážce se za slovo „rostliny“ vkládají slova „původce hnědé hniloby“.
    2. 23. V příloze č. 3 bodu 3 čtvrté odrážce se slovo „zaplaveno“ nahrazuje slovem „zaplaveny“.
    3. 24. V příloze č. 3 bodu 3 páté odrážce se slova „každá jednotlivá“ nahrazují slovy „každou jednotlivou“ a na konci odrážky se tečka nahrazuje čárkou.
    4. 25. V příloze č. 3 bodu 3 se za pátou odrážku doplňuje nová odrážka, která zní:
      1. „– vodní objekty, které jsou spojeny s povrchovou vodou označenou podle § 5 odst. 2 písm. b) za zamořenou původcem hnědé hniloby, s přihlédnutím ke směru toku a množství průtoku této vody a k planě rostoucím hostitelským rostlinám původce hnědé hniloby z čeledi lilkovitých.“.
    1. 26. V příloze č. 3 bod 4 zní:
      „4. Náležitosti oznámení potvrzeného výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle § 5 odst. 3.
      4.1. Bezprostředně po potvrzení přítomnosti původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby laboratorními testy za použití metod stanovených v příloze č. 1 se oznámí Komisi a členským státům alespoň:
      - u bramboru název odrůdy příslušné partie, druh dodávky (konzumní, sadba atd.), u sadby kategorie rozmnožovacího materiálu,
      - u rajčete název odrůdy příslušné partie a případně kategorie rozmnožovacího materiálu.
      Aniž jsou dotčeny požadavky na oznámení podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby podle § 4 odst. 4, pokud je potvrzen výskyt v partii bramboru nebo rajčete původem z jiného členského státu(jiných členských států) nebo hrozí riziko zamoření bramboru nebo rajčete v jiném členském státu(jiných členských státech), musí být neprodleně oznámeny dotčenému státu(dotčeným státům) informace nezbytné ke splnění opatření dle § 5 odst. 4, zejména:
      - název odrůdy příslušné partie bramboru nebo rajčete,
      - název a adresa odesílatele a příjemce partie,
      - datum doručení a množství doručené partie,
      - identifikace příslušného rostlinolékařského osvědčení podle § 21 odst. 1 písm. d) zákona, popřípadě kopie nebo číslo rostlinolékařského pasu, nebo registrační číslo pěstitele nebo obchodníka a kopie dodacího listu.
      4.2. Po ukončení všech šetření se oznámí:
      - datum potvrzení zamoření,
      - stručný popis šetření provedeného k zjištění zdroje a možného rozšíření zamoření, včetně rozsahu provedeného odběru vzorků,
      - informace o zjištěném nebo předpokládaném zdroji(zdrojích) zamoření,
      - podrobnosti o rozsahu zamoření, včetně počtu míst produkce a počtu partií s uvedením odrůdy a u sadbových brambor kategorie rozmnožovacího materiálu,
      - podrobnosti o vymezeném karanténním území a bezpečnostní zóně, včetně počtu míst produkce, která nebyla označena jako zamořená, ale nacházejí se v karanténním území nebo v bezpečnostní zóně,
      - v případě původce hnědé hniloby podrobnosti o určení vodního zdroje, včetně názvu a umístění vodního objektu a rozsahu označení oblasti se zákazem zavlažování;
      - pro každou zásilku nebo partii rostlin rajčete označenou za zamořenou, příslušné rostlinolékařské osvědčení podle § 21 odst. 1 písm. d) zákona a číslo rostlinolékařského pasu;
      - další informace související s potvrzeným(i) zdrojem(zdroji) zamoření, které si Komise případně vyžádá.“.
    1. 27. V příloze č. 4 bodu 1 písm. a) se slova „pro hlízy napadené původcem hnědé hniloby“ zrušují a za slovo „nebo“ se vkládají slova „v případě hlíz napadených původcem hnědé hniloby“.
    2. 28. V příloze č. 4 bodu 1 písm. c) se za slova „funguje systém“ vkládají slova „očisty a“ a za slovo „zneškodňování“ slova „nebo likvidaci“.
    3. 29. V příloze č. 4 bodu 1 písm. e) se slova „a při kterém“ nahrazují slovy „, pokud bylo prokázáno, že“ a na konci se tečka nahrazuje čárkou.
    4. 30. V příloze č. 4 bodu 1 se na konci tečka nahrazuje čárkou a doplňuje se písmeno f), které včetně poznámky pod čarou č. 1 zní:
      1. „f) spálení s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu1).
    5. 1) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.“.

      6. Dosavadní poznámka pod čarou č. 1 se označuje jako poznámka pod čarou č. 3.

    1. 31. V příloze č. 4 bodu 1 text za písmenem f) zní:

      „Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.

      1. Opatření pod písmenem a) je možné použít k naložení s partií označenou jako zamořená jen v případě, kdy nebylo možné zcela využít postup v písmenech b) až e). Opatření nařízená v souladu s písmeny d) a e) sděluje rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským státům. Pokud má být opatření pod písmeny a) až e) provedeno na území jiného členského státu, povinnná osoba o tom informuje rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci rostlinolékařské péče příslušného členského státu.“.
    1. 32. V příloze č. 4 bodu 2 písm. a) se za slovy „konzumní brambory“ vkládají slova „, v místě s vhodným zařízením na likvidaci odpadu dle požadavků stanovených v příloze č. 5“.
    2. 33. V příloze č. 4 bodu 2 písmeno e) včetně poznámky pod čarou č. 2 zní:
      1. e) v případě původce kroužkovitosti a rozmnožovacího materiálu bramboru výsadba hlíz v karanténním území vymezeném podle § 5 odst. 1 písm. c) za podmínek, že:
        1. - hlízy byly v tomto karanténním území vypěstovány a bylo prokázáno, že nedošlo k jejich bezprostřednímu kontaktu s hlízami partie označené za zamořenou,
        2. - se karanténní území nenachází v uzavřené pěstební oblasti pro výrobu rozmnožovacího materiálu bramboru podle zvláštního zákona2),
        3. - porost bude rostlinolékařskou správou kontrolován a testován dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti,
        4. - hlízy sklizené z příslušného porostu budou použity pouze způsobem podle písmene b) popř. d), pokud nepůjde o hlízy z partie označené za zamořenou,
      2. 2) § 7 odst. 4 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.

      Dosavadní písmeno e) se označuje jako písmeno f).

      Dosavadní poznámka pod čarou č. 2 se označuje jako poznámka pod čarou č. 5.

    1. 34. V příloze č. 4 bodu 2 text za písmenem f) zní: „Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.

      Opatření nařízená v souladu s písmeny d), e) a f) sděluje rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským státům. Pokud má být opatření pod písmeny a) až d) provedeno na území jiného členského státu, povinná osoba o tom v předstihu informuje rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci rostlinolékařské péče příslušného členského státu tak, aby bylo možno zajistit úřední kontrolu nad plněním nařízeného opatření.“.

    1. 35. V příloze č. 4 bodu 4.1.1. písmena a) až c) včetně poznámek pod čarou č. 3 a 4 znějí:
      „a) nesmí po dobu tří vegetačních období následujících po roce potvrzení výskytu původce kroužkovitosti pěstovat brambor včetně osiva, a musí systematicky vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce kroužkovitosti (§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona)
      nebo
      musí tento pozemek po čtyři vegetační období udržovat jako černý úhor nebo jej po prvním roce černého úhoru na dobu tří vegetačních období zatravnit nebo osít jetelem, jetelotrávou, vojtěškou či vojtěškotrávou a porost na něm udržovat sekáním jako co nejnižší strniště, či intenzivně spásat, a musí na něm vyhledávat a odstraňovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce kroužkovitosti (§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona);
      b) smí pěstovat brambor v prvém roce, který následuje po splnění ustanovení uvedených pod písm. a), ale jen s podmínkou, že
      - během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru a ostatních planě rostoucích hostitelských rostlin původce kroužkovitosti,
      - k výsadbě bude použit rozmnožovací materiál3) nebo farmářská sadba4) vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním, a
      - sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování (§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona);
      c) po splnění ostatních mimořádných rostlinolékařských opatření nařízených v karanténním území podle bodu 4 smí v dalším sklizňovém období následujícím po příslušném rotačním cyklu, který musí činit nejméně 2 roky, pěstovat brambory na sadbu nebo na konzum s podmínkou, že rostlinolékařská správa provede vymezovací průzkum výskytu původce kroužkovitosti podle § 3 odst. 3, k výsadbě bude použit rozmnožovací materiál3) nebo farmářská sadba4) vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním, a sklizené hlízy budou testovány dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti.
    2. 3) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.
    3. 4) § 19a zákona č. 408/2000 Sb., o ochraně práv k odrůdám rostlin a o změně zákona č. 92/1996 Sb., o odrůdách, osivu a sadbě pěstovaných rostlin, ve znění pozdějších předpisů, (zákon o ochraně práv k odrůdám), ve znění pozdějších předpisů.“.
    1. 36. V příloze č. 4 bodu 4.1.4. se na konci před středník vkládají slova „a sklizené brambory musí být testovány postupem podle přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. d) zákona]“.
    2. 37. V příloze č. 4 bodu 4.1.5. se slovo „manipulace“ nahrazuje slovem „manipulaci“, slovo „materiálu1)“ slovem „materiálu3)“ a za slova „materiálu3) bramboru“ se vkládají slova „a farmářské sadby4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle prílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním“.
    3. 38. V příloze č. 4 bodu 4.1.6. druhá odrážka zní: „– provádět očistu strojů, dopravních prostředků, skladovacích prostor, třídicích linek, obalů, palet a jiných předmětů po každém použití při výrobě hlíz bramboru po dobu stanovenou rostlinolékařskou správou [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona]; očista strojů se provádí po ukončení jejich práce na jednom pozemku s alespoň jedním porostem bramboru, očista skladovacích prostorů, obalů, palet, třídiček, dopravních prostředků a jiných předmětů vždy po vyskladnění jedné partie nebo ukončení práce s jednou partií;“.
    4. 39. V příloze č. 4 bodu 4.1.7. se slovo „materiál1)“ nahrazuje slovem „materiál3)“ a za slovo „materiál3)“ se vkládají slova „nebo farmářská sadba4) vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním,“.
    5. 40. V příloze č. 4 bodu 4.2. písm. a) se za slovo „brambor,“ vkládají slova „včetně osiva,“ a slovo „dezinfekce“ se nahrazuje slovem „dezinfekci“.
    6. 41. V příloze č. 4 bodu 4.5. písmeno b) zní:
      1. „b) musí zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování rozmnožovacího materiálu bramboru3) a farmářské sadby4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním od ostatních rostlin bramboru [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];“.
    1. 42. V příloze č. 4 bodu 4.5. písm. c) se slovo „materiál1)“ nahrazuje slovem „materiál3)“ a za slovo „materiál3)“ se vkládají slova „nebo farmářskou sadbu4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním“.
    2. 43. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písm. a) se za slova „hnědé hniloby“ vkládají slova „včetně osiva bramboru a rajčete,“ a slova „její přenos“ se nahrazují slovy „jeho přenos“.
    3. 44. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písmena c) a d) znějí: „c) smí v případě režimu podle písmene a) pěstovat brambor nebo rajče v prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení uvedených pod písmenem a), ale jen s podmínkou, že
      1. - během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a
      2. - v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací materiál3), a
      3. - sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování,
      4. - v případě bramboru a rajčete budou sklizené bramborové hlízy či rostliny rajčete testovány postupem podle přílohy č. 1;
        1. následně smí pěstovat brambor nebo rajče až po uplynutí vhodné rotace plodin stanovené rostlinolékařskou správou a v případě pěstování brambor musí k výsadbě použit rozmnožovací materiál3), a sklizeň musí být určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování, pro případné pěstování sadbových brambor musí být předem proveden vymezovací průzkum výskytu původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 3 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];
      1. d) smí v případě režimu podle písmene b) pěstovat brambor nebo rajče v prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení uvedených pod písmenem b), ale jen s podmínkou, že
        1. - během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin původce hnědé hniloby, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a
        2. - v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací materiál3), a
        3. - brambory mohou být pěstovány pro sadbové nebo konzumní účely nebo k průmyslovému zpracování, a v případě bramboru a rajčete budou sklizené bramborové hlízy, případně rostliny rajčete, testovány postupem podle přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];“.
    1. 45. V příloze č. 4 bodu 5.2.1. písm. e) se slova „a po uplynutí odpovídajícího rotačního cyklu“ zrušují, slovo „materiál2)“ se nahrazuje slovem „materiál3)“ a slovo „zákona2)“ slovem „zákona5)“; poznámka pod čarou č. 5 zní:
    2. „5) § 6 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.
    1. 46. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písm. a) se za slova „hostitelské rostliny původce hnědé hniloby“ vkládají slova „, včetně osiva bramboru a rajčete,“, na konci písm. a) se vkládá čárka a slovo „nebo“ a vkládají se dvě nové odrážky, které včetně poznámky pod čarou č. 6 znějí:
      1. „– smí pěstovat brambor za podmínky, že k výsadbě bude použit pouze rozmnožovací materiál3), který byl úředně uznán podle zvláštního zákona5), a produkce bude určena výlučně pro konzumní účely nebo k průmyslovému zpracování [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona],
      2. – smí pěstovat rajče pouze z osiva, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu6), a to pouze pro produkci plodů [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];
    2. 6) Příloha č. 4 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.“.
    1. 47. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písmeno b) zní:
      1. „b) smí po dobu dvou let následujících po roce provedení opatření podle písmene a)
        1. – k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál3) nebo farmářskou sadbu4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním,
        2. – k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.
    1. 48. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. písmeno c) zní:
      1. „c) musí ihned po označení místa produkce za zamořené a následně až do doby prvého přípustného pěstování bramboru nebo rajčete každoročně provádět očistu a dezinfekci všech strojů a skladovacích zařízení používaných při pěstování bramboru nebo rajčete způsobem uvedeným v příloze č. 6 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.
    1. 49. V příloze č. 4 bodu 5.2.2. se doplňuje písmeno e), které zní:
      1. „e) musí po dobu tří úplných vegetačních období od potvrzení výskytu původce hnědé hniloby vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce hnědé hniloby [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].“.
    1. 50. V příloze č. 4 bodu 5.7. písm. a) se slova „jiných hostitelských rostlin“ nahrazují slovy „jiné hostitelské rostliny“ a za slova „hnědé hniloby včetně“ se vkládají slova „, osiva bramboru a“.
    2. 51. V příloze č. 4 bodu 5.7. písm. b) se slovo „materiálu“ nahrazuje slovy „materiálu3) úředně uznaného podle zvláštního zákona5) nebo“.
    3. 52. V příloze č. 4 bodu 5.7. se za písmeno b) vkládá nové písmeno c), které zní:
      1. „c) musí k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];“.

      Dosavadní písmeno c) se označuje jako písmeno d).

    1. 53. V příloze č. 4 bodu 5.10. písmena b) až d) znějí:
      1. „b) zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování rozmnožovacího materiálu3) bramboru a farmářské sadby4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním od ostatních rostlin bramboru [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];
      2. c) k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál3) nebo farmářskou sadbu4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem negativním [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];
      3. d) k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům podle zvláštního právního předpisu6), nebo rostliny rajčete vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].“.
    1. 54. V příloze č. 4 bodu 5.11. písmena a) a b) znějí:
      1. „a) provádí každoročně průzkum výskytu původce hnědé hniloby, a to vzorkováním povrchové vody a případných hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých u dotyčných zdrojů vody způsobem stanoveným rostlinolékařskou správou a následným testováním podle příslušných metod stanovených v příloze č. 1;
      2. b) provádí kontrolu zavlažovacích a postřikových systémů a popřípadě stanoví takové podmínky umělého zavlažování hostitelských rostlin původce hnědé hniloby, aby se zabránilo jeho šíření, včetně zákazu používání vody označené za zamořenou k zavlažování a postřiku hostitelských rostlin původce hnědé hniloby. Tento zákaz může být odvolán v případě, kdy je na základě výsledků prováděného průzkumu prokázáno, že povrchová voda již není zamořena, nebo že jsou používány k zavlažování a postřiku technologie schválené rostlinolékařskou správou, které vylučují výskyt původce hnědé hniloby a jeho šíření;“.
    1. 55. V příloze č. 5 bod 1. včetně poznámky pod čarou č. 2 zní:
      1. „1. Pevný odpad ze zpracování hlíz brambor a rostlin rajčete
        1. Vyhozené hlízy bramboru, bramborové slupky nebo plody rajčete a jiný pevný odpad vzniklý při zpracování hlíz bramboru (např. zemina, kamení apod.) a rostlin rajčete musí být:
        2. a) odvezeny do řízené skládky odpadů a okamžitě převrstveny vhodným materiálem (zemina, suť apod.). Odpad musí být přivezen přímo na skládku a musí být zabalen tak, aby bylo během transportu vyloučeno nebezpečí vypadnutí odpadu z dopravního prostředku.
        3. Mohou být přitom využity jen takové skládky, u nichž je vyloučeno nebezpečí úniku původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby do prostředí, např. prosáknutím do zemědělsky využívané orné půdy nebo, v případě hlíz napadených původcem hnědé hniloby, do povrchových vod využívaných k zavlažování zemědělské půdy, nebo
        4. b) spáleny s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu2), nebo
        5. c) zneškodněny jiným opatřením, které bylo předem písemně schváleno rostlinolékařskou správou a pokud bylo prokázáno, že nehrozí rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti ani hnědé hniloby. Tato opatření sděluje rostlinolékařská správa Komisi a ostatním členským státům.
    2. 2) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.“.
    1. 56. V příloze č. 5 bodu 2. první odrážka zní:
      1. — před vypuštěním zahřát po dobu minimálně 30 minut při teplotě minimálně 60 °C uvnitř objemu,“.