Platné znění

Vyhláška, kterou se mění vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 8. 10. 2005

účinné od 8. 10. 2005389

účinné od 8. 10. 2005VYHLÁŠKA

účinné od 8. 10. 2005ze dne 15. září 2005,

účinné od 8. 10. 2005kterou se mění vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 8. 10. 2005Ministerstvo životního prostředí stanoví podle § 8 odst. 5 písm. c) zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů:

účinné od 8. 10. 2005

Čl. I

Odkaz účinné od 8. 10. 2005Čl. I

účinné od 8. 10. 2005Vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí, se mění takto:

  1. účinné od 8. 10. 20051. V § 2 odst. 1 se slova „části I. přílohy č. 2“ nahrazují slovy „příloze č. 2“.
  2. účinné od 8. 10. 20052. V § 2 se na konci odstavce 1 tečka nahrazuje čárkou a doplňují se písmena v) až y), která znějí:
    účinné od 8. 10. 2005
    1. účinné od 8. 10. 2005„v) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci dusíku,
    2. účinné od 8. 10. 2005w) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku,
    3. účinné od 8. 10. 2005x) aerobní a anaerobní transformace v půdě,
    4. účinné od 8. 10. 2005y) aerobní a anaerobní transformace v systémech voda-sediment.“.
  1. účinné od 8. 10. 20053. V § 2 se odstavec 2 zrušuje a zároveň se zrušuje označení odstavce 1.
  2. účinné od 8. 10. 20054. V příloze č. 2 části I se doplňují body XXI až XXIV, které znějí:
    účinné od 8. 10. 2005
    1. účinné od 8. 10. 2005„XXI. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI DUSÍKU

      účinné od 8. 10. 2005(metoda C.21 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

      1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1. METODA

        účinné od 8. 10. 2005Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 216 (2000).

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.1 ÚVOD

          účinné od 8. 10. 2005Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování dlouhodobých účinků chemických látek po jednorázové expozici na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku. Je založena na podkladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 7). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci dusíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci dusíku, tak zkouška na transformaci uhlíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku.

          účinné od 8. 10. 2005Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve formě složitých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důležitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy přispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé porušení těchto biochemických procesů by mohlo porušit koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných půd. Ačkoliv se populace mikroorganismů odpovědných za tyto procesy u jednotlivých půd liší, jedná se v podstatě o totéž schéma transformace.

          účinné od 8. 10. 2005Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace dusíku v aerobních povrchových půdách. Tato metoda rovněž umožňuje odhadnout účinky látek na transformaci uhlíku půdní mikroflórou. K tvorbě dusičnanů dochází po rozpadu vazeb uhlík-dusík. Pokud je tedy u zkušebních a kontrolních půd zjištěna stejná rychlost tvorby dusičnanů, je vysoce pravděpodobné, že hlavní schéma odbourávání uhlíku je neporušené a funkční. Substrát zvolený pro zkoušku (prášková vojtěšková moučka) má příznivý poměr uhlíku a dusíku (obvykle od 12/1 do 16/1). Je tedy snížen nedostatek uhlíku v průběhu zkoušky, a dojde-li k poškození populace mikroorganismů chemickou látkou, může k jejich obnově dojít opět do 100 dnů.

          účinné od 8. 10. 2005Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Použití zkoušky však není omezeno pouze na agrochemikálie. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se tedy stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci dusíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECx, kde x je procentuální účinek.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.2 DEFINICE

          účinné od 8. 10. 2005Transformace dusíku: je konečný rozklad dusíkaté organické látky mikroorganismy cestou amonifikace a nitrifikace na příslušný konečný anorganický produkt – dusičnan.

          účinné od 8. 10. 2005ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace dusíku na dusičnan.

          účinné od 8. 10. 2005EC50 (Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace dusíku na dusičnan.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

          účinné od 8. 10. 2005Žádné.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 8. 10. 2005Do proseté půdy se vpraví prášková rostlinná moučka a na půdu se poté aplikuje zkoušená látka, nebo se půda ponechá nedotčená (jako kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentrací na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy vyluhují vhodným rozpouštědlem a stanoví se obsah dusičnanů. Rychlost tvorby dusičnanů v exponovaných vzorcích se porovnává s rychlostí v kontrolních vzorcích a vypočte se procentuální odchylka hodnot experimentálních vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou 25 % nebo větší, v měření se pokračuje až do 100 dnů. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a množství vzniklých dusičnanů v experimentálních a kontrolních vzorcích se měří po 28denní inkubaci. Výsledky zkoušek s více koncentracemi se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty ECx (tj. EC50, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

          účinné od 8. 10. 2005Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota ±25 %) mezi koncentracemi dusičnanů v kontrolní a exponovaných vzorcích, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než ±15 %.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6 POPIS METODY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.1 Zkušební zařízení

            účinné od 8. 10. 2005Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, která by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace celého množství půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.

            účinné od 8. 10. 2005Použije se standardní laboratorní vybavení, které zahrnuje

            1. účinné od 8. 10. 2005— třepačku: mechanickou třepačku nebo rovnocenné vybavení;
            2. účinné od 8. 10. 2005— odstředivku (3 000 g) nebo filtrační zařízení (za použití filtračního papíru bez dusičnanů);
            3. účinné od 8. 10. 2005— měřicí zařízení pro stanovení dusičnanů s vhodnou citlivostí a reprodukovatelností.
          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.2 Výběr a počet půd

            účinné od 8. 10. 2005Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:

            1. účinné od 8. 10. 2005— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;
            2. účinné od 8. 10. 2005— pH: 5,5 – 7,5;
            3. účinné od 8. 10. 2005— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;
            4. účinné od 8. 10. 2005— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 8, 9) a její uhlík by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.

            účinné od 8. 10. 2005Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností však může být použití další půdy nezbytné, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd
            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.3.1 Odběr

              účinné od 8. 10. 2005K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi těmito informacemi musí být přesná poloha, vegetace, údaje o ošetřování přípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odběr půdy by mělo být zvoleno místo, které umožňuje dlouhodobé používání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kromě kukuřice) nebo hustě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorků by neměla být minimálně jeden rok před odběrem ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovněž by neměla být alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je přípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by neměly být odebírány dříve než po třech měsících po aplikaci. Neměly by být používány půdy s hnojivy, o nichž je známo, že mají biocidní účinky (např. kyanamid vápenatý).

              účinné od 8. 10. 2005Vzorky by neměly být odebírány při dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delších než 30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichž po delší dobu (alespoň po jedno vegetační období) nebyla prováděna orba, může maximální hloubka odběru nepatrně překračovat 20 cm (např. až 25 cm).

              účinné od 8. 10. 2005Vzorky půd by měly být přepravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, že se původní vlastnosti půdy významně nezmění.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.3.2 Skladování

              účinné od 8. 10. 2005Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 ± 2) °C maximálně po dobu tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při -18 °C až -22 °C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku
            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.4.1 Předběžná inkubace

              účinné od 8. 10. 2005Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky

              účinné od 8. 10. 2005Z půdy se ručně odstraní velké kusy (např. kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, aniž je půda nadměrně vysoušena, prosejí částice o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maximální vodní kapacity.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.4.3 Obohacení organickým substrátem

              účinné od 8. 10. 2005Půda by měla být obohacena vhodným organickým substrátem, např. zelenou travní moučkou s vojtěškou (hlavní složka: Medicago sativa) s poměrem C/N od 12/1 do 16/1. Doporučená dávka vojtěškové moučky je 5 g vojtěšky na kilogram půdy (vztaženo na sušinu).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

            účinné od 8. 10. 2005Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosiče. Nosičem může být voda (u látek rozpustných ve vodě) nebo inertní tuhá látka, např. jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1 – 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče než voda (např. organická rozpouštědla jako aceton, chloroform) by neměly být používány, neboť mohou zničit mikroflóru. Použije-li se jako nosič písek, může být obalen zkoušenou látkou rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouštědle. V takovém případě se rozpouštědlo před smísením s půdou odstraní odpařením. Pro optimální distribuci zkoušené látky v půdě se doporučuje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.

            účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba pokud možno zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.6.6 Zkušební koncentrace

            účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které se v reálných podmínkách dostane do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi maximální předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky. U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty ECx.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.1 Podmínky expozice
            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.1.1 Expozice a kontrola

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se půda rozdělí na tři díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosičem obsahujícím látku a třetí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporučuje se, aby byla zkouška provedena s minimálně třemi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se půda rozdělí na šest dílů o stejné hmotnosti. Pět vzorků se smísí s nosičem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se smísí pouze s nosičem bez chemické látky. Doporučuje se použít tři duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je třeba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky v exponovaných vzorcích půdy. Při míšení by nemělo docházet k hutnění nebo shlukování půdy.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd

              účinné od 8. 10. 2005Inkubaci vzorků půd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejně velkých dílčích vzorků jak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se však zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, připraví se velká množství exponované a neexponované půdy a během zkoušky se podle potřeby odebírají dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství připravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, počtu duplikátních vzorků použitých pro analýzu a na předpokládaném počtu intervalů, v nichž se odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se před odběrem dílčích vzorků důkladně promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorků půd, rozdělí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na požadovaný počet dílčích vzorků a ty se použijí podle potřeby. U experimentů, kdy lze předpokládat více než dva intervaly odběru, by měl být připraven dostatečný počet dílčích vzorků s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odběru. Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by měly být použity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U těkavých látek se zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání

              účinné od 8. 10. 2005Zkouška se provádí v temnu při pokojové teplotě (20 ± 2) °C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 60 % (±5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potřeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.

              účinné od 8. 10. 2005Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají rychlosti tvorby dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích a vypočítají se hodnoty ECx.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd
            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se obsah dusičnanů ve vzorcích analyzuje v 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14-denních intervalech po 28. dni.

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah dusičnanů se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. v 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení ECx chemické látky. Podle potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít ve zprávě jako výchozí koncentraci dusičnanů v půdě.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXI.1.7.2.2 Analýza vzorků půd

              účinné od 8. 10. 2005Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví obsah dusičnanů. Dusičnany se extrahují ze vzorků třepáním s vhodným extrakčním roztokem, např. s 0,1M roztokem chloridu draselného. Doporučuje se použít 5 ml roztoku KCl na gram sušiny půdy. Při optimální extrakci by měly být nádoby s půdou a extrakčním roztokem naplněny nejvýše z jedné poloviny. Směsi se extrahují třepáním při 150 ot./min. po dobu 60 minut. Směsi se odstředí nebo zfiltrují a kapalná fáze se analyzuje na dusičnany. Kapalný extrakt zbavený pevných částic lze před analýzou skladovat při (-20 ±5) °C po dobu šesti měsíců.

      1. účinné od 8. 10. 2005XXI.2. DATA
        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

          účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství vytvořených dusičnanů v každém duplikátním vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Rychlost přeměny dusíku se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem na 5 % hladině významnosti). Množství vzniklých dusičnanů se vyjádří v mg dusičnanů na kg sušiny půdy za den. Rychlost tvorby dusičnanů se pro každou expozici porovná s rychlostí získanou pro kontrolní vzorky a vypočte se odchylka od kontrolních vzorků v procentech.

          účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství dusičnanů v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot ECx se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Množství dusičnanů (tj. množství dusičnanů v mg na kg sušiny půdy) zjištěná v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou do grafu proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 10 až 12) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty ECx.

          účinné od 8. 10. 2005Zkoušené látky s vysokým obsahem dusičnanů mohou přispívat k množství dusičnanu vytvořeného při zkoušce. Pokud se zkouší vysoké koncentrace těchto látek (např. chemikálie, u nichž se očekává opakované použití), musí být součástí zkoušky vhodné kontrolní vzorky (tj. půda a zkoušená látka bez rostlinné moučky). Data z těchto kontrol musí být zohledněna při výpočtech ECx.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXI.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

          účinné od 8. 10. 2005Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při jakémkoli odběru po 28 dnech rozdíl rychlosti tvorby dusičnanů při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti tvorby v kontrolách roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci dusíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10.

      1. účinné od 8. 10. 2005XXI.3. ZPRÁVY

        účinné od 8. 10. 2005Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

        účinné od 8. 10. 2005Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:

        1. účinné od 8. 10. 2005— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);
        2. účinné od 8. 10. 2005— informace a historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);
        3. účinné od 8. 10. 2005— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);
        4. účinné od 8. 10. 2005— hloubka odběru vzorků (cm);
        5. účinné od 8. 10. 2005— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);
        6. účinné od 8. 10. 2005— pH (ve vodě);
        7. účinné od 8. 10. 2005— obsah organického uhlíku (v % sušiny);
        8. účinné od 8. 10. 2005— obsah dusíku (v % sušiny);
        9. účinné od 8. 10. 2005— výchozí koncentrace dusičnanů (mg dusičnanů na kg sušiny);
        10. účinné od 8. 10. 2005— kapacita iontové výměny (mmol/kg);
        11. účinné od 8. 10. 2005— mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;
        12. účinné od 8. 10. 2005— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;
        13. účinné od 8. 10. 2005— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;
        14. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.

        účinné od 8. 10. 2005Zkoušená látka:

        1. účinné od 8. 10. 2005— fyzikální povaha a případně fyzikálně-chemické vlastnosti;
        2. účinné od 8. 10. 2005— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.

        účinné od 8. 10. 2005Substrát:

        1. účinné od 8. 10. 2005— zdroj substrátu;
        2. účinné od 8. 10. 2005— složení (tj. vojtěšková moučka, zelená travní moučka s vojtěškou);
        3. účinné od 8. 10. 2005— obsah uhlíku, dusíku (v % sušiny);
        4. účinné od 8. 10. 2005— velikost síta (mm).

        účinné od 8. 10. 2005Zkušební podmínky:

        1. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;
        2. účinné od 8. 10. 2005— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;
        3. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;
        4. účinné od 8. 10. 2005— inkubační teplota;
        5. účinné od 8. 10. 2005— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;
        6. účinné od 8. 10. 2005— použitá metoda inkubace půdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);
        7. účinné od 8. 10. 2005— počet duplikátních vzorků;
        8. účinné od 8. 10. 2005— doby odběru vzorků;
        9. účinné od 8. 10. 2005— metoda použitá pro extrakci dusičnanů z půdy.

        účinné od 8. 10. 2005Výsledky:

        1. účinné od 8. 10. 2005— postup analýzy a zařízení použité pro stanovení dusičnanů;
        2. účinné od 8. 10. 2005— jednotlivé naměřené hodnoty obsahu dusičnanů a jejich průměrné hodnoty v tabulkové formě;
        3. účinné od 8. 10. 2005— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;
        4. účinné od 8. 10. 2005— podle potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;
        5. účinné od 8. 10. 2005— procentuální odchylka v rychlosti tvorby dusičnanů pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx (tj. EC25 nebo EC10) s intervaly spolehlivost a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;
        6. účinné od 8. 10. 2005— statistické zpracování výsledků;
        7. účinné od 8. 10. 2005— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.
      1. účinné od 8. 10. 2005XXI.4. LITERATURA

        účinné od 8. 10. 2005(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.

        účinné od 8. 10. 2005(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).

        účinné od 8. 10. 2005(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28. září, 1987.

        účinné od 8. 10. 2005(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, (vyd. M. R. Lynch), Pub. SETAC-Europe, Brussels.

        účinné od 8. 10. 2005(5) ISO 14238 (1997). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4.

        účinné od 8. 10. 2005(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna 1995.

        účinné od 8. 10. 2005(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

        účinné od 8. 10. 2005(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.

        účinné od 8. 10. 2005(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.

        účinné od 8. 10. 2005(10) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.

        účinné od 8. 10. 2005(11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3. vyd., Cambridge, London, New York.

        účinné od 8. 10. 2005(12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

    1. účinné od 8. 10. 2005XXII. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI UHLÍKU

      účinné od 8. 10. 2005(metoda C.22 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

      1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1. METODA

        účinné od 8. 10. 2005Tato metoda odpovídá metodě OECD TG 217 (2000).

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.1 ÚVOD

          účinné od 8. 10. 2005Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování možných dlouhodobých účinků jednorázové expozice přípravkům na ochranu rostlin a popřípadě jiným chemický látkám na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku. Je založena na pokladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 6). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci uhlíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci uhlíku, tak zkouška na transformaci dusíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku.

          účinné od 8. 10. 2005Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve formě složitých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důležitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy přispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé porušení těchto biochemických procesů by mohlo porušit koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných půd. Ačkoliv se populace mikroorganismů odpovědných za tyto procesy u jednotlivých půd liší, jedná se v podstatě o totéž schéma transformace.

          účinné od 8. 10. 2005Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace uhlíku v aerobních povrchových půdách. Zkouška je citlivá na změny ve velikosti a aktivitě mikrobiální populace, která je odpovědná za transformaci uhlíku, neboť tyto populace budou vystaveny jak chemickému stresu, tak nedostatku uhlíku. Použijí se písčité půdy s nízkým obsahem organického materiálu. Tyto půdy se exponují zkoušené látce a inkubují se za podmínek, které umožňují rychlý mikrobiální metabolismus. Za těchto podmínek se zdroje snadno dostupného uhlíku rychle vyčerpají. To způsobí nedostatek uhlíku, který vede k nejen k odumření mikrobiálních buněk, ale také indukuje klidové stadium a/nebo tvorbu sporů. Pokud se zkouška provádí déle než 28 dnů, lze souhrn těchto reakcí měřit v kontrolních vzorcích (neexponovaná půda) jako postupnou ztrátu metabolicky aktivní mikrobiální biomasy (viz literatura 7). Pokud je biomasa v půdě s nedostatkem uhlíku za podmínek zkoušky ovlivněna přítomností chemické látky, pravděpodobně se nevrátí do téhož stavu jako kontrolní vzorek. Porušení stavu způsobené zkoušenou látkou kdykoliv během zkoušky tedy často přetrvává až do konce zkoušky.

          účinné od 8. 10. 2005Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Zkouška však není omezena na chemické látky, jejichž koncentraci v životním prostředí lze předpovědět. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se proto stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci uhlíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECx, kde x je procentuální účinek.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.2 DEFINICE

          účinné od 8. 10. 2005Transformace uhlíku: je rozklad organického materiálu působením mikroorganismů, jehož výsledkem je anorganický konečný produkt oxid uhličitý.

          účinné od 8. 10. 2005ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.

          účinné od 8. 10. 2005EC50 (Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

          účinné od 8. 10. 2005Žádné.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 8. 10. 2005Prosetá půda se buď exponuje zkušební látce, nebo se ponechá neexponovaná (kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentraci na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy smísí s glukosou a po následujících 12 h se měří respirační rychlost vyvolaná glukosou. Respirační rychlost se vyjádří jako uvolněný oxid uhličitý (v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu) nebo jako spotřebovaný kyslík (v mg kyslíku na kg půdy za hodinu). Průměrná respirační rychlost u exponovaných vzorků půd se porovná s rychlostí u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou rovné 25 % nebo větší, v měření se pokračuje ve 14-denních intervalech nejdéle do 100 dnů. Při zkoušení jiných chemických látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a respirační rychlost vyvolaná glukosou (tj. průměrné množství uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku) se změří po 28 dnech. Výsledky zkoušek s řadou koncentrací se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty ECx (tj. EC50, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

          účinné od 8. 10. 2005Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota ±25 %) mezi uvolněným oxidem uhličitým nebo spotřebovaným kyslíkem u kontrolních a exponovaných vzorků, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než ±15 %.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6 POPIS METODY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.1 Zkušební zařízení

            účinné od 8. 10. 2005Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, který by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.

            účinné od 8. 10. 2005Pro stanovení respirace vyvolané glukosou jsou nezbytné inkubační systémy a přístroje pro měření uvolňovaného oxidu uhličitého nebo spotřeby kyslíku. Příklady takových systémů lze nalézt v literatuře 8 až 11.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.2 Výběr a počet půd

            účinné od 8. 10. 2005Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:

            1. účinné od 8. 10. 2005— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;
            2. účinné od 8. 10. 2005— pH: 5,5 – 7,5;
            3. účinné od 8. 10. 2005— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;
            4. účinné od 8. 10. 2005— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 12 a 13) a její obsah uhlíku by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.

            účinné od 8. 10. 2005Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností může být nezbytné nasazení další půdy, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd
            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.3.1 Odběr

              účinné od 8. 10. 2005K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi těmito informacemi musí být přesná poloha, vegetace, údaje o ošetřování přípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odběr půdy by mělo být zvoleno místo, které umožňuje dlouhodobé používání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kromě kukuřice) nebo hustě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorků by neměla být minimálně jeden rok před odběrem ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovněž by neměla být alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je přípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by neměly být odebírány dříve než po třech měsících po aplikaci. Neměly by být používány půdy s hnojivy, o nichž je známo, že mají biocidní účinky (např. kyanamid vápenatý).

              účinné od 8. 10. 2005Vzorky by neměly být odebírány při dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delších než 30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichž po delší dobu (alespoň po jedno vegetační období) nebyla prováděna orba, může maximální hloubka odběru mírně překračovat 20 cm (např. až 25 cm). Vzorky půd by měly být přepravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, že se původní vlastnosti půdy významně nezmění.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.3.2 Skladování

              účinné od 8. 10. 2005Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 ± 2) °C po dobu maximálně tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při -18 °C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku
            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.4.1 Předběžná inkubace

              účinné od 8. 10. 2005Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2 a 1.7.1.3), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).

            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky

              účinné od 8. 10. 2005Z půdy se ručně odstraní velké kusy (např. kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, aniž je půda nadměrně vysoušena, prosejí částice o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maximální vodní kapacity.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

            účinné od 8. 10. 2005Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosiče. Nosičem může být voda (u látek rozpustných ve vodě) nebo inertní tuhá látka, např. jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1 – 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče než voda (např. organická rozpouštědla jako aceton, chloroform) by neměly být používány, neboť mohou zničit mikroflóru. Použije-li se jako nosič písek, může být obalen zkoušenou látkou rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouštědle. V takovém případě se rozpouštědlo před smísením s půdou odstraní odpařením. Pro optimální distribuci zkoušené látky v půdě se doporučuje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.

            účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.6.6 Zkušební koncentrace

            účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení přípravků na ochranu rostlin nebo jiných chemických látek, u nichž lze předpovědět koncentraci v životním prostředí, se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které v reálných podmínkách pronikne do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky.

            účinné od 8. 10. 2005U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty ECx.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.1 Podmínky expozice
            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.1.1 Expozice a kontrola

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se půda rozdělí na tři díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosičem obsahujícím látku a třetí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporučuje se, aby byla zkouška provedena s minimálně třemi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se půda rozdělí na šest dílů o stejné hmotnosti. Pět vzorků se smísí s nosičem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se smísí pouze s nosičem bez chemické látky. Doporučuje se použít tři duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je třeba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky v exponovaných vzorcích půdy. Při míšení by nemělo docházet k hutnění nebo shlukování půdy.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd

              účinné od 8. 10. 2005Inkubaci vzorků půd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejně velkých dílčích vzorků jak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se však zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, připraví se velká množství exponované a neexponované půdy a během zkoušky se podle potřeby odebírají dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství připravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, počtu duplikátních vzorků použitých pro analýzu a na předpokládaném počtu intervalů, v nichž se odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se před odběrem dílčích vzorků důkladně promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorků půd, rozdělí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na požadovaný počet dílčích vzorků a ty se použijí podle potřeby. U experimentů, kdy lze předpokládat více než dva intervaly odběru, by měl být připraven dostatečný počet dílčích vzorků s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odběru. Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by měly být použity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U těkavých látek se zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání

              účinné od 8. 10. 2005Zkouška se provádí v temnu při pokojové teplotě (20 ± 2) °C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 60 % (±5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potřeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.

              účinné od 8. 10. 2005Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných chemických látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků a vypočítají se hodnoty ECx.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd
            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se rychlost respirace vyvolané glukosou ve vzorcích analyzuje 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14denních intervalech po 28. dni.

              účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah respirace vyvolané glukosou se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení ECx chemické látky. V případě potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít k odhadu výchozího množství metabolicky aktivní mikrobiální biomasy v půdě.

            1. účinné od 8. 10. 2005XXII.1.7.2.2 Měření rychlostí respirace vyvolané glukosou

              účinné od 8. 10. 2005Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví rychlost respirace vyvolané glukosou. Vzorky půd se smísí s dostatečným množstvím glukosy, aby se ihned vyvolala maximální respirační odezva. Množství glukosy potřebné pro vyvolání maximální respirační odezvy u dané půdy lze stanovit v orientační zkoušce se sérií koncentrací glukosy (viz literatura 14). U písčitých půd s obsahem organického uhlíku od 0,5 do 1,5 % obvykle stačí 2 000 mg až 4 000 mg glukosy na kg sušiny. Glukosu lze rozmělnit na prášek s čistým křemenným pískem (10 g písku na kg sušiny) a homogenně smísit s půdou.

              účinné od 8. 10. 2005Vzorky půdy obohacené glukosou se inkubují ve vhodné aparatuře, která umožňuje měřit respirační rychlosti při (20 ± 2) °C buď kontinuálně, nebo každou hodinu, nebo každé dvě hodiny (viz oddíl 1.6.1). Měření uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku se provádí nepřetržitě po dobu 12 h a měření se zahájí co nejdříve, tj. do 1 až 2 h po přidání glukosy. Změří se celkové množství uvolněného oxidu uhličitého nebo celkové množství spotřebovaného kyslíku za 12 h a stanoví se průměrná respirační rychlost.

      1. účinné od 8. 10. 2005XXII.2. DATA
        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

          účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u každého duplikátního vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Výsledky se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem při 5% hladině významnosti). Rychlosti respirace vyvolané glukosou se vyjádří v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo v mg kyslíku na kg sušiny za hodinu. Průměrná rychlost uvolňování oxidu uhličitého nebo průměrná rychlost spotřeby kyslíku u každé expozice se porovná s odpovídajícími hodnotami u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků.

          účinné od 8. 10. 2005Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot ECx se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Rychlosti respirace vyvolané glukosou (tj. mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo mg kyslíku na kg sušiny za hodinu) zjištěné v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 15 až 17) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty ECx.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXII.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

          účinné od 8. 10. 2005Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při kterémkoli odběru po 28 dnech rozdíl respiračních rychlostí při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti u kontroly roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci uhlíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10.

      1. účinné od 8. 10. 2005XXII.3. ZPRÁVY

        účinné od 8. 10. 2005PROTOKOL O ZKOUŠCE

        účinné od 8. 10. 2005Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

        účinné od 8. 10. 2005Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:

        1. účinné od 8. 10. 2005— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);
        2. účinné od 8. 10. 2005— informace o historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);
        3. účinné od 8. 10. 2005— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);
        4. účinné od 8. 10. 2005— hloubka odběru vzorků (cm);
        5. účinné od 8. 10. 2005— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);
        6. účinné od 8. 10. 2005— pH (ve vodě);
        7. účinné od 8. 10. 2005— obsah organického uhlíku (v % sušiny hmotnosti);
        8. účinné od 8. 10. 2005— obsah dusíku (v % sušiny);
        9. účinné od 8. 10. 2005— kapacita iontové výměny (mmol/kg);
        10. účinné od 8. 10. 2005— výchozí mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;
        11. účinné od 8. 10. 2005— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;
        12. účinné od 8. 10. 2005— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;
        13. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.

        účinné od 8. 10. 2005Zkoušená látka:

        1. účinné od 8. 10. 2005— fyzikální povaha a případně její fyzikálně-chemické vlastnosti;
        2. účinné od 8. 10. 2005— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.

        účinné od 8. 10. 2005Zkušební podmínky:

        1. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;
        2. účinné od 8. 10. 2005— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;
        3. účinné od 8. 10. 2005— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;
        4. účinné od 8. 10. 2005— inkubační teplota;
        5. účinné od 8. 10. 2005— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;
        6. účinné od 8. 10. 2005— použitá metoda inkubace (tj. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);
        7. účinné od 8. 10. 2005— počet duplikátních vzorků;
        8. účinné od 8. 10. 2005— doby odběru vzorků.

        účinné od 8. 10. 2005Výsledky:

        1. účinné od 8. 10. 2005— metoda a zařízení použité pro měření respiračních rychlostí;
        2. účinné od 8. 10. 2005— data včetně jednotlivých hodnot a průměrných hodnot množství oxidu uhličitého nebo kyslíku zpracovaná v tabulkové formě;
        3. účinné od 8. 10. 2005— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;
        4. účinné od 8. 10. 2005— v případě potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;
        5. účinné od 8. 10. 2005— procentuální odchylka v rychlostech respirace vyvolané glukosou pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx (tj. EC25 nebo EC10) s intervaly spolehlivosti a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;
        6. účinné od 8. 10. 2005— případné statistické vyhodnocení výsledků;
        7. účinné od 8. 10. 2005— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.
      1. účinné od 8. 10. 2005XXII.4 LITERATURA

        účinné od 8. 10. 2005(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.

        účinné od 8. 10. 2005(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).

        účinné od 8. 10. 2005(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

        účinné od 8. 10. 2005(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, vyd. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.

        účinné od 8. 10. 2005(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna, 1995.

        účinné od 8. 10. 2005(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

        účinné od 8. 10. 2005(7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Chap. 3: 45 – 60.

        účinné od 8. 10. 2005(8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration. In: Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties. Agronomy Monograph N° 9. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller a D. R. Keeney. 41: 831 – 871.

        účinné od 8. 10. 2005(9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.

        účinné od 8. 10. 2005(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

        účinné od 8. 10. 2005(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E. A., Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77 – 81.

        účinné od 8. 10. 2005(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.

        účinné od 8. 10. 2005(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.

        účinné od 8. 10. 2005(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113 – 120.

        účinné od 8. 10. 2005(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.

        účinné od 8. 10. 2005(16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3. vyd., Cambridge, London, New York.

        účinné od 8. 10. 2005(17) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

    1. účinné od 8. 10. 2005XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ

      účinné od 8. 10. 2005(metoda C.23 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)

      1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1. METODA

        účinné od 8. 10. 2005Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 307 (2002).

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.1 ÚVOD

          účinné od 8. 10. 2005Postup popsaný v této zkušební metodě je vyvinut pro účely hodnocení aerobní a anaerobní transformace chemické látky v půdě. Je založen na doporučeních a směrnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 9). Účelem experimentů je stanovit i) rychlost transformace zkoušené látky a ii) povahu a rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů, kterým mohou být rostliny a půdní organismy vystaveny. Tyto studie jsou požadovány u chemických látek, které se aplikují přímo do půdy nebo pravděpodobně mohou proniknout do půdního ekosystému. Výsledky těchto laboratorních studií mohou být také použity pro vypracování postupů odběru vzorků a analýzy u podobných polních studií.

          účinné od 8. 10. 2005Pro vyhodnocení způsobu transformace obvykle postačují aerobní a anaerobní studie s jedním druhem půdy (viz literatura 8, 10 a 11). Rychlosti transformace se stanoví alespoň pro tři další půdy (viz literatura 8 a 10).

          účinné od 8. 10. 2005Druhy zkušebních půd by měly být reprezentativní pro environmentální podmínky, v nichž dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Například chemické látky, k jejichž uvolnění může dojít v subtropickém až tropickém klimatu, by měly být zkoušeny s ferrasoly nebo nitosoly (systém FAO). Tato metoda se rovněž týká půd rýžových polí.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.2 DEFINICE

          účinné od 8. 10. 2005Zkoušená látka: jakákoli látka, ať již výchozí látka, nebo příslušné transformační produkty.

          účinné od 8. 10. 2005Transformační produkty: všechny látky vznikající při biotických a abiotických transformačních reakcích zkoušené látky, včetně CO2 a látek, které jsou přítomny ve vázaných reziduích.

          účinné od 8. 10. 2005Vázaná rezidua: sloučeniny v půdě, rostlině nebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve formě výchozí látky nebo (jejího metabolitu (jejích metabolitů) nebo transformačních produktů. Metoda extrakce nesmí podstatně měnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a náročnými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např. kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněž záchyty. Tvorba vázaných reziduí obecně podstatně snižuje biologickou přístupnost a dostupnost (viz literatura 12) [upraveno podle IUPAC 1984 (viz literatura 13)].

          účinné od 8. 10. 2005Aerobní transformace: reakce, ke kterým dochází za přítomnosti kyslíku (viz literatura 14).

          účinné od 8. 10. 2005Anaerobní transformace: reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 14).

          účinné od 8. 10. 2005Půda: směs minerálních a organických chemických složek oživená malými organismy (většinou mikroorganismy), přičemž organické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Lze pracovat s dvěma formami půdy:

          1. účinné od 8. 10. 2005a) s neporušenou půdou, jak v průběhu času vznikla, s charakteristickými vrstvami různých druhů půdy;
          2. účinné od 8. 10. 2005b) s porušenou půdou, která se obvykle vyskytuje na obdělávaných polích v případě, že se vzorky odebírají vyrýváním a používají se v této zkušební metodě (viz literatura 14).

          účinné od 8. 10. 2005Mineralizace: úplný rozklad organické sloučeniny na CO2, H2O za aerobních podmínek a na CH4, CO2 a H2O za anaerobních podmínek. V souvislosti s touto metodou, při níž se používají sloučeniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, při němž se radioisotopy uhlíku oxidují za tvorby odpovídajícího množství 14CO2 (viz literatura 14).

          účinné od 8. 10. 2005Poločas: t0,5, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkoušené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezávisí na počáteční koncentraci.

          účinné od 8. 10. 2005DT50 (doba odbourání 50): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 50 %; liší se od poločasu t0,5, pokud transformace neprobíhá podle kinetiky prvního řádu.

          účinné od 8. 10. 2005DT75 (doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 75 %.

          účinné od 8. 10. 2005DT90 (doba odbourání 90): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 90 %.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

          účinné od 8. 10. 2005Referenční látky se použijí pro charakterizaci a/nebo identifikaci transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.4 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

          účinné od 8. 10. 2005Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (neznačené nebo značené radioaktivními isotopy), pro něž je k dispozici analytická metoda s dostatečnou správností a citlivostí. Je použitelná pro mírně těkavé a netěkavé sloučeniny rozpustné i nerozpustné ve vodě. Zkouška by neměla být použita u látek, které z půdy silně těkají (např. fumiganty, organická rozpouštědla), a nelze je tedy v půdě udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

          účinné od 8. 10. 2005Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky neznačené radioisotopy, tak značené látky. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporučuje se značení isotopem 14C, avšak užitečné mohou být i jiné isotopy, např. 13C, 15N, 3H, 32P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnější část (nejstabilnější části) molekuly. Pokud například zkoušená látka obsahuje jeden aromatický kruh, je třeba, aby byl tento kruh označen. Pokud zkoušená látka obsahuje dva nebo více kruhů, může být nezbytné provést samostatné studie s cílem podchytit zbytky každého z kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů.). Čistota látky by měla být alespoň 95 %.

          účinné od 8. 10. 2005Před provedením zkoušky na aerobní a anaerobní transformaci v půdě by měly být k dispozici alespoň tyto informace o látce:

          1. účinné od 8. 10. 2005a) rozpustnost ve vodě (metoda A.6)
          2. účinné od 8. 10. 2005b) rozpustnost v organických rozpouštědlech;
          3. účinné od 8. 10. 2005c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;
          4. účinné od 8. 10. 2005d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);
          5. účinné od 8. 10. 2005e) chemická stabilita v temnu (hydrolýza) (metoda C.7);
          6. účinné od 8. 10. 2005f) pKa, pokud u molekuly nastává protonace nebo deprotonace [směrnice OECD 112] (viz literatura 16).

          účinné od 8. 10. 2005Mezi další užitečné informace patří údaje o toxicitě zkoušené látky pro půdní mikroorganismy [zkušební metody C.21 a C.22] (viz literatura 16).

          účinné od 8. 10. 2005K dispozici by měly být analytické metody (včetně extrakčních a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky a jejích transformačních produktů.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.6 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 8. 10. 2005Vzorky půdy se exponují zkušební látce a inkubují se v temnu v biometrických baňkách nebo v průtokových systémech za řízených laboratorních podmínek (při konstantní teplotě a vlhkosti půdy). Ve vhodných intervalech se vzorky půd extrahují a analyzuje se obsah výchozí látky a transformačních produktů. Vhodným absorpčním zařízením se k analýze shromáždí také těkavé produkty. Prostřednictvím materiálu značeného isotopem 14C lze po zachycení uvolněného 14CO2 měřit různé rychlosti mineralizace zkoušené látky a dále lze stanovit látkovou bilanci včetně tvorby vázaných reziduí v půdě.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.7 KRITÉRIA JAKOSTI
          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.7.1 Výtěžnost

            účinné od 8. 10. 2005Extrakce a analýza provedená alespoň u dvou duplikátních vzorků půdy ihned po přidání zkoušené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnoměrnosti aplikace zkoušené látky. Výtěžnosti pozdějších stupňů experimentu se zjistí z příslušných látkových bilancí. Výtěžnosti by se měly nacházet v rozmezí 90% až 110 % u značených chemických látek (viz literatura 8) a v rozmezí 70 % až 110 % u neznačených chemických látek (viz literatura 3).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.7.2 Opakovatelnost a citlivost analytické metody

            účinné od 8. 10. 2005Opakovatelnost analytické metody (kromě účinnosti první extrakce) pro kvantitativní stanovení zkoušené látky a transformačních produktů lze ověřit provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů půdy, která byla dostatečně dlouho inkubována, aby došlo k vytvoření transformačních produktů.

            účinné od 8. 10. 2005Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkoušenou látku a pro transformační produkty by měla být alespoň 0,01 mg na kg půdy (pro zkoušenou látku) nebo 1 % aplikované dávky, podle toho, která z hodnot je nižší. Rovněž by měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ).

          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.7.3 Správnost dat o transformaci

            účinné od 8. 10. 2005Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase poskytuje vhodné informace o spolehlivosti transformační křivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poločasy (v případě zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT50, popřípadě hodnot DT75 a DT90.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8 POPIS METODY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8.1 Vybavení a chemická činidla

            účinné od 8. 10. 2005Inkubačními systémy jsou statické uzavřené systémy nebo vhodné průtokové systémy (viz literatura 7 a 17). Příklady vhodných průtokových inkubačních aparatur a biometrických baněk jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Oba typy inkubačních systémů mají své výhody a svá omezení (viz literatura 7 a 17).

            účinné od 8. 10. 2005Pro zkoušku je nezbytné standardní laboratorní vybavení, zejména:

            1. účinné od 8. 10. 2005— analytické přístroje, jako jsou GLC, HPLC, TLC, včetně vhodných detekčních systémů pro analýzu značených nebo neznačených látek nebo pro inverzní isotopovou zřeďovací metodu;
            2. účinné od 8. 10. 2005— přístroje pro identifikaci látek (např. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR atd.);
            3. účinné od 8. 10. 2005— kapalinový scintilační spektrometr;
            4. účinné od 8. 10. 2005— okysličovací zařízení pro spalování radioaktivního materiálu;
            5. účinné od 8. 10. 2005— odstředivka;
            6. účinné od 8. 10. 2005— extrakční aparatura (např. centrifugační zkumavky pro studenou extrakci a Soxhletův přístroj pro kontinuální extrakci s refluxem);
            7. účinné od 8. 10. 2005— zařízení pro zkoncentrování roztoků a extraktů (např. rotační odparka);
            8. účinné od 8. 10. 2005— vodní lázeň;
            9. účinné od 8. 10. 2005— mechanické míchací zařízení (např. hnětací zařízení, rotační mixér).

            účinné od 8. 10. 2005Použijí se např. tato chemická činidla:

            1. účinné od 8. 10. 2005— NaOH p.a, 2 M, nebo jiná vhodná zásada (např. KOH, ethanolamin);
            2. účinné od 8. 10. 2005— H2SO4 p.a., 0,05 M;
            3. účinné od 8. 10. 2005— ethylenglykol p.a.;
            4. účinné od 8. 10. 2005— tuhý absorpční materiál, např. natronové vápno, a polyurethanové zátky;
            5. účinné od 8. 10. 2005— organická rozpouštědla čistoty p.a., např. aceton, methanol atd.;
            6. účinné od 8. 10. 2005— kapalný scintilátor.
          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8.2 Aplikace zkoušené látky

            účinné od 8. 10. 2005Za účelem aplikace zkoušené látky do půdy a jejího rozptýlení lze zkoušenou látku rozpustit ve vodě (v deionizované nebo destilované vodě) nebo lze v případě potřeby použít co nejmenší množství acetonu nebo jiných organických rozpouštědel (viz literatura 6), ve kterých je zkoušená látka dostatečně rozpustná a stabilní. Zvolené množství rozpouštědla však nesmí mít významný vliv na mikrobiální aktivitu půdy (viz oddíly 1.5 a 1.9.2 až 1.9.3). Rozpouštědla, která působí jako inhibitory mikrobiální aktivity, např. chloroform, dichloromethan a jiná halogenovaná rozpouštědla, nesmějí být použita.

            účinné od 8. 10. 2005Látku lze do půdy přidat také např. ve směsi s křemenným pískem (viz literatura 6) nebo ve formě malých dílčích vzorků zkušební půdy, které byly předem vysušeny na vzduchu a sterilizovány. Pokud se látka přidává pomocí rozpouštědla, mělo by být rozpouštědlo odpařeno ještě před tím, než jsou k původním nesterilním vzorkům půdy přidány obohacené dílčí vzorky.

            účinné od 8. 10. 2005U běžně používaných chemických látek, jež se dostávají do půdy prostřednictvím zemědělské aplikace kalů z čistíren odpadních vod, se zkoušená látka nejprve přidá do kalu, který se poté vpraví do vzorku půdy (viz oddíly 1.9.2 a 1.9.3).

            účinné od 8. 10. 2005Nedoporučuje se používat rutinně přípravky v komerční úpravě. Například u špatně rozpustných látek však může být použití přípravku v komerční úpravě vhodnou alternativou.

          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8.3 Půdy
            1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8.3.1 Výběr půd

              účinné od 8. 10. 2005Pro stanovení způsobu transformace lze použít reprezentativní půdy; doporučují se písčitohlinitá, prachovitohlinitá, hlinitá nebo hlinitopísčitá půda [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)] o hodnotě pH 5,5 až 8,0 a obsahu organického uhlíku 0,5 – 2,5 %, přičemž mikrobiální biomasa by měla tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku (viz literatura 10).

              účinné od 8. 10. 2005Pro studie transformačních rychlostí se použijí alespoň tři další půdy reprezentující rozsah relevantních půd. Půdy by se měly lišit, pokud jde o obsah organického uhlíku, pH, obsah jílu a mikrobiální biomasy (viz literatura 10).

              účinné od 8. 10. 2005U všech půd by měly být charakterizovány alespoň jejich: struktura (% písku, % prachu, % jílu) [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)], pH, kationtová výměnná kapacita, organický uhlík, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa (pouze pro aerobní studie). Schopnost půdy zadržet vodu lze měřit jako polní kapacitu, jako retenční vodní kapacitu nebo jako vodní sací tlak (pF). Vysvětlení je uvedeno v dodatku 1. V protokolu o zkoušce by mělo být uvedeno, zda byly schopnost půdy zadržet vodu a sypná hustota stanoveny u neporušených polních vzorků, nebo porušených (zpracovaných) vzorků. Pro interpretaci výsledků mohou být užitečné další informace o vlastnostech půdy. Pro stanovení charakteristik půdy lze použít metody doporučené v literatuře (viz literatura 19 až 23). Mikrobiální biomasa se stanoví metodou respirace indukované substrátem (SIR) (viz literatura 25 a 26) nebo alternativními metodami (viz literatura 20).

            1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.8.3.2 Odběr, příprava a skladování půd

              účinné od 8. 10. 2005K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Těmito informacemi jsou přesná poloha, vegetační kryt, údaje o ošetřování chemickými látkami, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo jiná kontaminace. Pokud byla půda v předchozích čtyřech letech ošetřena zkoušenou látkou nebo látkami s analogickou strukturou, neměla by být použita pro transformační studie (viz literatura 10 a 15).

              účinné od 8. 10. 2005Půda by měla být čerstvě odebraná z terénu (z A horizontu nebo z horní 20cm vrstvy) a měla by být tak vlhká, aby bylo možné snadné prosévání. Kromě půd z rýžových polí by půdy neměly být odebírány v průběhu dlouhých období (více než 30 dnů) sucha, mrazů nebo zavodnění nebo krátce po těchto obdobích (viz literatura 14). Vzorky se přepravují způsobem, který minimalizuje změny obsahu vody v půdě, a uchovávají se v temnu za co největšího přístupu vzduchu. Pro tento účel je obecně vhodný volně uzavřený polyethylenový sáček.

              účinné od 8. 10. 2005Půda se zpracuje co nejdříve po odběru. Před proséváním na sítu o velikosti 2 mm, při němž se odstraní malé kameny, drobní živočichové a zbytky rostlin, se z půdy odstraní vegetace, větší živočichové a kameny. Před proséváním by nemělo dojít k nadměrnému vysušení a rozdrcení půdy (viz literatura 15).

              účinné od 8. 10. 2005Pokud je v zimě obtížné odebrat vzorky v terénu (zmrzlá půda, sněhová pokrývka), mohou být odebrány z půdy skladované ve skleníku pod vegetačním pokryvem (např. zatravněné půdy nebo půdy s travní směsí s jetelem). V každém případě se upřednostňují studie s čerstvě odebranými půdami; pokud má být odebraná a zpracovaná půda před zahájením studie skladována, musí být skladována za odpovídajících podmínek a pouze po omezenou dobu (při (4 ± 2) °C po dobu maximálně tří měsíců), aby byla zachována mikrobiální aktivita. Z výsledků nedávných výzkumů vyplývá, že půdy z mírného pásma lze skladovat při -20 °C déle než tři měsíce (viz literatura 28 a 29), aniž dojde k významné ztrátě mikrobiální aktivity.

              účinné od 8. 10. 2005Podrobné pokyny pro odběr, zpracování a skladování půd pro biotransformační experimenty lze nalézt v literatuře (viz literatura 8, 10, 15, 26 a 27).

              účinné od 8. 10. 2005Před tím, než se zpracovaná půda použije ve zkoušce, provede se její předběžná inkubace, aby se umožnilo klíčení a odstranila se semena a aby se po změnách podmínek, ke kterým došlo od odběru nebo skladování po nastolení inkubačních podmínek, znovu ustavila rovnováha mikrobiálního metabolismu. Obecně postačuje předběžné inkubační období v délce od 2 do 28 dnů při podmínkách teploty a vlhkosti blížících se podmínkám zkoušky (viz literatura 15). Skladování a předběžná inkubace by dohromady neměly trvat déle než tři měsíce.

        1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
          1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.9.1 Zkušební podmínky
            1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.9.1.1 Zkušební teplota

              účinné od 8. 10. 2005V průběhu celé zkoušky by měly být půdy inkubovány v temnu při stálé teplotě, která je reprezentativní pro klimatické podmínky, ve kterých dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Pro zkoušky všech látek, které se dostávají do půdy v mírném klimatickém pásu, se doporučuje teplota (20 ± 2) °C. Teplota musí být monitorována.

              účinné od 8. 10. 2005V případě chemických látek aplikovaných nebo uvolňovaných v chladném klimatickém pásu (např. v severských zemích, během podzimu/zimy) se inkubují další vzorky půdy, avšak při nižší teplotě (např. při (10 ± 2) °C).

            1. účinné od 8. 10. 2005XXIII.1.9.1.2 Vlhkost