Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

  1. - údaje ze souběžných a historických negativních kontrol,
  2. - údaje ze souběžných pozitivních kontrol.

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. 1.1 Úvod

      Při bakteriálním testu reverzních mutací se používají k detekci genových mutací kmeny Salmonella typh imurium (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině histidin) a kmeny Escherichia coli (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině tryptofan). Pomocí uvedených systémů lze detekovat genové mutace vzniklé mechanismem substituce, adice nebo delece jednoho nebo několika nukleotidů v chromozómu indikátorových bakteriálních kmenů.5) Princip bakteriálního testu reverzních mutací spočívá v tom, že se zjišťují mutace, které zpětně vracejí mutace přítomné v testovacím kmenu do původního stavu a obnovuje se funkční schopnost bakterie syntetizovat určitou základní aminokyselinu. Takto změněná bakteriální buňka je detekována na základě své schopnosti růst za nepřítomnosti aminokyseliny, kterou vyžaduje mateřský zkušební kmen.

      Genové mutace jsou u člověka příčinou řady genetických nemocí a existují přesvědčivé doklady toho, že genové mutace v onkogenech a tumorově supresorových genech somatických buněk hrají u člověka a pokusných zvířat roli při vzniku nádorů. Bakteriální test na reverzní mutace je rychlý, levný a relativně jednoduchý. Řada testovacích kmenů se vyznačuje charakteristikami, díky nimž jsou citlivější pro detekci mutací, včetně citlivých sekvencí DNA v místech reverze, zvýšené propustnosti buněk pro velké molekuly a eliminace systémů reparace DNA či posílení takových procesů reparace DNA, jež jsou náchylné k chybám. Specifita testovacích kmenů umožňuje získat některé užitečné informace o typech mutací, jež jsou vyvolány genotoxickými látkami. Pro bakteriální testy reverzních mutací je k dispozici velmi rozsáhlá databáze výsledků pro širokou škálu struktur a byly vypracovány osvědčené metody pro testování chemikálií o různých fyzikálně-chemických vlastnostech, včetně chemikálií těkavých.

    1. 1.2 Definice

      Test reverzních mutací s použitím kmenů Salmonella typhi murium nebo Escherichia coli slouží ke zjištění mutací v kmeni závislém na určité aminokyselině (histidinu resp. tryptofanu), jež vedou ke vzniku kmene, který je na dodávce aminokyseliny zvenku nezávislý.

      Mutageny vyvolávající substituci páru bází jsou látky způsobující změnu bází v DNA. Při reverzním testu může k takové změně dojít na místě původní mutace nebo na jiném místě bakteriálního genomu.

      Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace) jsou látky, jež způsobují přidání nebo odebrání jednoho nebo více párů bází v DNA, čímž se mění čtecí rámec v RNA.

    1. 1.3 Výchozí úvahy

      V bakteriálním testu se využívají prokaryotické buňky, které se od savčích buněk liší v příjmu látek metabolismu, chromozomální struktuře a procesech opravy DNA.

      Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Systémy metabolické aktivace in vitro ovšem nedokáží dokonale imitovat savčí podmínky in vivo, takže test neposkytuje přímé informace o mutagenní a karcinogenní potenci dané látky v organismech savců.

      Bakteriální test reverzních mutací se běžně používá jako prvotní screening genotoxické aktivity a zvláště aktivity vyvolávající genové mutace. Pomocí rozsáhlé databáze se prokázalo, že mnohé chemikálie, které jsou v tomto testu pozitivní, vykazují také v jiných testech mutagenní aktivitu. Existují ovšem i příklady mutagenních látek, jež se tímto testem neodhalí; důvodem tohoto nedostatku může být specifická povaha vyhodnocovaných veličin, rozdíly v metabolické aktivaci nebo rozdíly v biologické dostupnosti. Na druhé straně faktory, jež citlivost bakteriálního testu reverzní mutace zvyšují, mohou vést k tomu, že se mutagenní aktivita testované látky přecení.

      Bakteriální test reverzních mutací může být nevhodný pro určité třídy chemických látek, jakými jsou například některé silně baktericidní sloučeniny (kupříkladu určitá antibiotika) a látky, o nichž se předpokládá nebo ví, že specificky narušují replikační systém savčích buněk (například některé inhibitory topoizomerázy nebo některá analoga nukleozidů); v takovém případě mohou být vhodnější testy na mutace u savců.

      Mnohé sloučeniny, jež jsou při tomto testu pozitivní, jsou skutečně karcinogenní pro savce, ovšem korelace není absolutní; závisí na chemické třídě, a existují karcinogeny, které tímto testem odhaleny nejsou, protože působí jiným, negenotoxickým mechanismem nebo mechanismem, který v bakteriálních buňkách neprobíhá.

    1. 1.4 Princip metody

      Suspenze bakteriálních buněk se vystaví působení testované látky za přítomnosti a za nepřítomnosti exogenního systému metabolické aktivace. Při klasické miskové metodě “plate incorporation“ se suspenze smísí s vrchním agarem a vylije na misky s minimální živnou půdou. Při preinkubační metodě se pokusná směs inkubuje a smísí s vrchním agarem a až potom se očkuje na minimální živnou půdu. Při obou metodách se dva až tři dny po inkubaci revertantní kolonie spočítají a výsledek se porovná s počtem spontánně revertujících kolonií na kontrolních miskách s rozpouštědlem.

      Je popsáno několik postupů pro provedení testu. Z nich nejběžnější jsou klasická misková metoda [“plate incorporation“],5) preinkubační metoda,5) fluktuační metoda5) a suspenzní metoda.5) Jsou také popsány jejich modifikace pro testování plynů nebo par.5)

      Postupy popsané v rámci metody se týkají hlavně metody plate incorporation a metody preinkubační. Obě tyto metody jsou přijatelné pro experimenty jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Některé látky se detekují účinněji preinkubační metodou; jedná se o chemické třídy, kam spadají alifatické nitrosaminy s krátkým řetězcem, dvojmocné kovy, aldehydy, azobarviva a diazosloučeniny, pyrrolizidinové alkaloidy, alylové sloučeniny a nitrosloučeniny.5) Také bylo zjištěno, že existují určité třídy mutagenů, které se pomocí uvedených standardních procedur vždy neodhalí. Na ty je třeba pohlížet jako na “speciální případy“, k jejichž detekci je třeba použít jiných metod. Byly identifikovány následující “speciální případy“ (spolu s příklady postupů, které se dají pro jejich detekci použít): azobarviva a diazosloučeniny,5) plyny a těkavé chemikálie5) a glykosidy.5) Odchylky od standardního postupu je třeba vědecky zdůvodnit.

    1. 1.5 Popis metody
      1. 1.5.1 Příprava
        1. 1.5.1.1 Bakterie

          Čerstvé bakteriální kultury se vypěstují do pozdního exponenciálního nebo počátečního stacionárního stadia růstu (zhruba 109 buněk/ml). Kultury v pozdním stacionárním stadiu se nepoužívají. Důležité je, aby kultury použité pro experiment obsahovaly vysoký titr životaschopných bakterií. Titr se dá prokázat buď z historických údajů růstových křivek, nebo v jednotlivých testech stanovením počtu životaschopných buněk očkováním na miskách.

          Doporučená inkubační teplota činí 37°C.

          1. Použije se minimálně pět bakteriálních kmenů, které budou zahrnovat čtyři kmeny S. typhi murium (TA1535; TA1537 nebo TA97a nebo TA97; TA98; a TA100); u nichž byla prokázána spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků mezi různými laboratořemi. Tyto čtyři kmeny S. typhi murium mají na primárním reverzním místě páry bází GC a je známo, že nemusejí detekovat určité oxidační mutageny, látky vyvolávající křížové vazby a hydraziny. Tyto látky se dají detekovat pomocí kmenů E. coli WP2 nebo S. typhi murium TA102,5) které mají na primárním reverzním místě pár bází AT. Proto je doporučená kombinace kmenů tato:
            1. - S. typhi murium TA1535,
            2. - S. typhi murium TA1537 nebo TA97 nebo TA97a,
            3. - S. typhi murium TA98,
            4. - S. typhi murium TA100 a
            5. - E. coli WP2 uvrA nebo E. coli WP2 uvrA (pKM101) nebo S. typhi murium TA102.

          K detekci mutagenů vytvářejících křížové vazby může být nejvhodnější použít TA102 nebo přidat DNA reparačně proficientní kmen E. coli (např. E. coli WP2 nebo E. coli WP2 (pKM101)).

          Je třeba použít zavedených postupů přípravy zásobní kultury, ověření markeru a uchovávání. Pro každý zmrazený preparát zásobní kultury je třeba prokázat závislost na aminokyselině nutné pro růst (histidin v případě kmenů S. typhi murium, tryptofan v případě kmenů E. coli). Podobně je třeba zkontrolovat i další fenotypické charakteristiky, a to: přítomnost či nepřítomnost R-faktor plazmidů tam, kde to přichází v úvahu (např. rezistence vůči ampicilinu u kmenů TA98, TA100 a TA97a nebo TA97, WP2 uvrA (pKM101) a rezistence vůči ampicilinu + tetracyklinu u kmene TA 102); přítomnost charakteristických mutací (tj. rfa mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti vůči krystalové violeti a uvrA mutace u E. coli nebo uvrB mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti na ultrafialové záření).5) Použité kmeny mají mít počet spontánně revertujících kolonií ve frekvenčním rozmezí očekávaném podle historických kontrolních dat dané laboratoře a pokud možno i v rozmezí uvedeném v literatuře.

        1. 1.5.1.2 Médium

          Použije se vhodný minimální agar (např. s Vogelovým-Bonnerovým minimálním médiem E a glukózou) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umožňující několik dělení buněk.5)

        1. 1.5.1.3 Metabolická aktivace

          Bakterie se působení testované látky vystaví jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti vhodného systému metabolické aktivace. Nejčastěji se používá kofaktorem suplementovaná post-mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců po indukci enzymů látkami jako je Aroclor 12545) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu.5) Post-mitochondriální frakce se obvykle používá v koncentracích mezi 5 a 30 % v/v ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému mohou záviset na třídě testované chemikálie. V některých případech může být vhodné použít post-mitochondriální frakci v několika koncentracích. U azobarviv a diazosloučenin může být vhodnější použít redukční systém metabolické aktivace.5)

        1. 1.5.1.4 Testovaná látka / příprava

          Pevné látky se před působením na bakterie rozpustí nebo se připraví jejich suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné látky se mohou do pokusného systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stabilitě prokazují, že jejich delší skladování je přijatelné.

      1. 1.5.2 Podmínky testu
        1. 1.5.2.1 Pokusné kmeny (viz 1.5.1.1)
        2. 1.5.2.2 Koncentrace

          Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.

          Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.

          Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.

          Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půl-logaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

        1. 1.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

          Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.

          U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.

          1. Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            9,10-dimethylantracen781-43-1212-308-4
            7,12-dimethylbenz[a] antracen57-97-6200-359-5
            benz[a]pyren50-32-8200-028-5
            2-aminoantracen613-13-8210-330-9
            cyklofosfamid
            monohydrát cyklofosfamidu            		50-18-0
            6055-19-2            		200-015-4
          1. Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            Kongo červeň573-58-0209-358-4

          2-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.

          1. Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            azid sodný26628-22-8247-852-1TA 1535 a TA 100
            2-nitrofluoren607-57-8210-138-5TA 98
            9-aminoakridin90-45-9201-995-6TA 1537, TA 97 a TA 97a
            ICR 19117070-45-0241-129-4TA 1537, TA 97 a TA 97a
            kumen-hydroperoxid80-15-9201-254-7TA 102
            mitomycin C50-07-7200-008-6WP2 uvrA a TA 102
            N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin70-25-7200-730-1WP2, WP2uvrA a
            WP2uvrA(pKM101)
            4-nitrochinolin-1-oxid56-57-5200-281-1WP2, WP2uvrA a
            WP2uvrA(pKM101)
            urylfuramid (AF2)3688-53-7kmeny obsahující plazmidy

          K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.

          Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.

      1. 1.5.3 Postup

        Při klasické miskové metodě5) bez metabolické aktivace se obvykle smísí 0,05 nebo 0,1 ml testovaného roztoku, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující zhruba 108 životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru a 2,0 ml vrchního agaru. V testech s metabolickou aktivací se obvykle mísí 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství post-mitochondriální frakce (v rozmezí 5 – 30 % v/v v metabolické aktivační směsi) s 2,0 ml vrchního agaru společně s bakteriemi a testovanou látkou /testovaným roztokem. Obsah každé zkumavky se promísí a nalije na povrch misky s minimálním agarem. Vrchní agar se nechá před inkubací ztuhnout.

        Při preinkubační metodě5) se testovaná látka / testovaný roztok nechá preinkubovat s pokusným kmenem (obsahujícím zhruba 108 životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) obvykle po dobu 20 min nebo déle při 30 – 37 °C; potom se smísí s vrchním agarem a nalije na misku s minimálním agarem. Obvykle se mísí 0,05 nebo 0,1 ml testované látky / testovaného roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky se během preinkubace provzdušňují třepáním.

        Pro adekvátní odhad variací se pro každou dávku očkují tři misky. Duplicitní očkování je přijatelné, je-li vědecky zdůvodněno. Dojde-li náhodně ke ztrátě misky, nemusí to test nutně znehodnotit.

        Plynné nebo těkavé látky se testují za použití vhodných postupů, například v zatavených nádobách.5)

      1. 1.5.4 Inkubace

        Všechny misky v rámci daného testu se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 48 – 72 hodin, načež se spočítají revertantní kolonie na každé misce.

  1. 2 ÚDAJE
    1. 2.1 Zpracování výsledků

      Údaje se prezentují jako počet revertantních kolonií na jednu misku. Rovněž se uvede počet revertantních kolonií jak z negativní kontroly (rozpouštědlo, popřípadě kontrola bez působení, byla-li použita), tak z kontroly pozitivní. Pro testovanou látku i pro pozitivní a negativní kontrolu (resp. bez působení rozpouštědlo) se uvedou počty pro jednotlivé misky a průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku včetně směrodatné odchylky.

      Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musejí potvrdit případ od případu. Pokud se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba to zdůvodnit. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci studijních parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. Ke studijním parametrům, které se dají modifikovat, patří rozdíly mezi koncentracemi, metoda působení („plate incorporation“ nebo preinkubace v tekutém prostředí) a podmínky metabolické aktivace.

    1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků

      Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například dávkově závislý nárůst ve sledovaném rozmezí a/nebo reprodukovatelný nárůst počtu revertantních kolonií na jednu misku při jedné nebo více koncentracích u minimálně jednoho kmene s metabolickým aktivačním systémem nebo bez něj.5) Jako první se uvažuje biologická relevance výsledků. Jako pomůcku při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody,5) statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní reakci.

      Testovaná látka, jejíž výsledky výše uvedená kritéria nesplňují, se v tomto testu považuje za nemutagenní.

      Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

      Pozitivní výsledky bakteriálního testu na reverzní mutace ukazují, že látka vyvolává genové mutace typu substitucí bází nebo posunových mutací v genomu Salmonella typhi murium resp. Escherichia coli. Negativní výsledky ukazují, že za daných zkušebních podmínek není testovaná látka ve zkušebním druhu mutagenní.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. Rozpouštědlo/vehikulum:
        1. - zdůvodnění volby rozpouštědla,
        2. - rozpustnost a stabilita testované látky v tomto rozpouštědle, pokud je známa.
      1. Kmeny:
        1. - použité kmeny,
        2. - počet buněk v kultuře,
        3. - charakteristika kmene.
      1. Podmínkytestu:
        1. - množství testované látky na jednu misku (v mg nebo μl) se zdůvodněním volby dávky a počtu misek pro jednu koncentraci,
        2. - použitá média,
        3. - typ a složení sytému metabolické aktivace (včetně kritérií akceptovatelnosti),
        4. - postupy působení (zpracování).
      1. Výsledky:
        1. - známky toxicity,
        2. - známky srážení,
        3. - počty na jednotlivých miskách,
        4. - průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku a směrodatná odchylka,
        5. - vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
        6. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
        7. - údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
        8. - údaje z historických negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.15 GENOVÉ MUTACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip metody

      Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být užity pro určení produkce genových mutací indukovaných chemickými látkami bez a s metabolickou aktivací.

      Jsou využívány forward mutační systémy u haploidních kmenů, jako je míra vzniku mutací z červených, adenin vyžadujících mutant (ade-1, ade-2) na dvojité, adenin vyžadující bílé mutanty a selektivní systémy jako je indukce resistence ke kanavaninu a cykloheximidu.

      Nejlépe ověřený reversní mutační systém zahrnuje využití haploidního kmene XV 185-14C s okrovými (ochre) nonsense mutacemi ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Mutace jsou vratné působením mutagenů typu záměny bazí, které indukují mutace ve specifickém místě, nebo okrové supresorové mutace. XV185-14C nese rovněž his 1-7 marker, missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.

      U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D7, který je homozygotní pro ilv 1-92.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.

        Metabolická aktivace

        Buňky mají být exponovány testovaným látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

        Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Testovací kmeny

          Haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D7 jsou nejužívanější pro studie genových mutací. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.

        1. 1.2.2.2 Média

          Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk.

        1. 1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

          Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

        1. 1.2.2.4 Koncentrace

          Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

        1. 1.2.2.5 Kultivační podmínky

          Misky jsou inkubovány po sedm dní při 28 až 30 °C ve tmě.

        1. 1.2.2.6 Frekvence spontánních mutací

          Frekvence spontánních mutací u subkultur má být v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

        1. 1.2.2.7 Počet replikací

          Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu s prototrofními buňkami a u životnosti buněk. U experimentů užívajících markery jako hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí musí být počet misek zvýšen, aby byly získány statisticky relevantní údaje.

      1. 1.2.3 Popis postupu

        Ovlivnění kmenů S. cerevisiae je obvykle prováděno ve zkumavce v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách: 1-5 x 107 buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 37°C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné. Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí genových mutací.

        Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.

  1. 2. ÚDAJE

    Údaje mají být uspořádány do tabulky a mají zahrnovat počet kolonií, počet mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací. Všechny výsledky mají být potvrzeny nezávislým experimentem. Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
      1. - použitých kmenech,
      2. - podmínkách testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
      3. - podmínkách vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
      4. - počtu kolonií, počtu mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací, vztahu dávky a účinku, statistické hodnocení údajů pokud je to možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.16 MITOTICKÁ REKOMBINACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip metody

      Mitotická rekombinace u Saccharomycs cerevisiae může být detekována mezi geny (obecněji mezi genem a jeho centromerou) a uvnitř genů. První případ je nazýván mitotické překřížení a vytváří reciproční produkty, kdežto druhý případ je většinou nereciproční a je nazýván genová konverze. Překřížení je obecně testováno na základě tvorby recesivních homozygotních kolonií nebo sektorů vzniklých u heterozygotních kmenů, genová konverse je testována na základě tvorby prototrofních revertant vzniklých u auxotrofního heteroalelického kmene, který nese dvě různé defektní alely téhož genu. Nejčastěji užívané kmeny pro detekci mitotické genové konverse jsou D4 (heteroalelický v ade 2 a trp 5), D7 (heteroalelický v trp 5), BZ34 (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotické překřížení produkující červené a růžové sektory může být testováno u D5 nebo D7 (který rovněž měří mitotickou genovou konverzi a reverzní mutace v ilv 1-92). Oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely ade 2.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.

        Metabolická aktivace

        Buňky mají být vystaveny působení testovaných látek jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného exogenního metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Testovací kmeny

          Nejužívanější jsou diploidní kmeny D4, D5, D7 a JD1. Užití jiných kmenů může být rovněž vhodné.

        1. 1.2.2.2 Média

          Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení přežívajících buněk a frekvenci mitotické rekombinace.

        1. 1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

          Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

        1. 1.2.2.4 Koncentrace

          Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. Musí být brán ohled na cytotoxicitu a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

          Buňky mohou být vystaveny působení testované látky buď ve stacionární fázi, nebo během růstu po dobu až 18 h. Kultury dlouhodobě ovlivňované mají být mikroskopicky kontrolovány pro tvorbu spor, jejichž přítomnost test znehodnocuje.

        1. 1.2.2.5 Podmínky inkubace

          Misky jsou inkubovány ve tmě po čtyři až sedm dní při 28-30°C. Misky použité pro průkaz červených a růžových sektorů tvořených mitotickým překřížením mají být umístěny v chladničce (cca 4 °C) po další 1 - 2 dny před počítáním, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.

        1. 1.2.2.6 Spontánní frekvence mitotické rekombinace

          Používají se subkultury s frekvencí spontánních mutací v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

        1. 1.2.2.7 Počet replikací

          Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu prototrofních buněk tvořených mitotickou genovou konversí a pro určení životnosti buněk. V případě testování recesivní homozygosity tvořené mitotickým překřížením má být počet misek zvýšen, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.

        1. 1.2.2.8 Postup

          Ovlivnění S. cerevisiae probíhá obvykle jako zkumavkový test v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách. 1-5 x 107 buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 37°C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné.

          Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí mitotické rekombinace.

          Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se zaznamenávají do tabulky, která zahrnuje počet kolonií, počet rekombinací, přežívajících buněk a frekvenci rekombinací.

    Výsledky mají být potvrzeny v nezávislém experimentu.

    Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
      1. - použité kmeny,
      2. - podmínky testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
      3. - podmínky vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
      4. - počet kolonií, počet rekombinant, přežívajících buněk a frekvence rekombinací, vztah dávky a účinku, pokud je to možné, statistické hodnocení dat.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.17 MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. 1.1 Úvod

      Test genových mutací in vitro se dá používat ke zjišťování genových mutací vyvolaných chemickými látkami. Mezi vhodné buněčné linie patří myší lymfomové buňky L5178Y, linie CHO, CHO-AS52 a V79 buněk čínského křečka a lidské lymfoblastoidní buňky TK6 (1). U těchto buněčných linií se nejčastěji jako konečný genetický efekt zjišťují mutace v thymidinkináze (TK) a hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáze (HPRT) a v transgenní xanthin-guanin fosforibosyltransferáze (XPRT). Testy mutací v TK, HPRT a XPRT se zjišťují různá spektra genetických změn. Autosomální lokalizace TK a XPRT může umožnit detekci i takové genetické změny (např. velké delece), které se na lokusu HPRT chromozomů X nezjistí.5)

      K testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro se dají použít kultury stabilizovaných buněčných linií nebo buněčných kmenů. Při volbě buněk se berou v úvahu růstové schopnosti dané kultury a stabilita frekvence spontánních mutací.

      Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Takový systém metabolické aktivace nedokáže imitovat savčí podmínky in vivo dokonale. Je třeba vzniku takových podmínek, za kterých by výsledky neodrážely vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledkům, jež nejsou důsledkem vlastní mutagenity může dojít v důsledku změny pH, osmolality či vysoké cytotoxicity.5)

      Tento test se používá ke screeningu možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada sloučenin, které jsou v tomto testu pozitivní, jsou savčími karcinogeny, neexistuje však dokonalá korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu chemické látky a existuje stále více dokladů toho, že existují karcinogeny, které se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí nějakým jiným, negenotoxickým mechanismem či mechanismem, který v bakteriálních buňkách nepůsobí.5)

    1. 1.2 Definice

      Forward mutace: genová mutace výchozího typu mutantní formy, jež vede ke změně nebo ztrátě enzymatické aktivity kódovaného proteinu.

      Mutageny vyvolávající substituci páru bází: látky způsobující substituci jednoho nebo několika páru bází v DNA.

      Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace): látky, jež způsobují přidání nebo ztrátu jednoho nebo více párů bází v DNA.

      Doba fenotypické exprese: období, během kterého jsou z nově zmutovaných buněk odstraňovány nezměněné genové produkty.

      Frekvence mutací: počet pozorovaných mutovaných buněk dělený počtem živých buněk.

      Relativní celkový růst: nárůst počtu buněk v čase v porovnání s kontrolní populací buněk; vypočítává se jako součin poměrného suspenzního růstu (v porovnání s negativní kontrolou) a poměrné klonovací účinnosti cloning efficiency (v porovnání s negativní kontrolou).

      Relativní suspenzní růst: poměrný nárůst počtu buněk během období exprese v porovnání s negativní kontrolou.

      Životnost (viabilita): klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk v době inokulace na miskách v selekčních podmínkách po období exprese.

      Přežití: klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk inokulovaných na miskách na konci působení látky; vyjadřuje se obvykle v porovnání s přežitím kontrolní buněčné populace.

    1. 1.3 Princip metody

      Buňky, deficientní na thymidinkinázu (TK) v důsledku mutace TK+/-→ TK-/-, jsou rezistentní vůči cytotoxickému působení pyrimidinového analogu trifluorthymidinu (TFT). Buňky produkující thymidinkinázu jsou vůči TFT citlivé, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Za přítomnosti TFT proto mohou proliferovat mutované buňky, zatímco normální buňky, obsahující thymidinkinázu, proliferovat nemohou. Podobně jsou buňky s deficientní HPRT nebo XPRT selekčně rezistentní vůči 6-thioguaninu (TG) nebo 8-azaguaninu (AG). Pokud je analog báze nebo sloučenina příbuzná se selekčním činidlem analyzována v některém testu na genové mutace v savčích buňkách, je třeba vlastnosti testované látky bedlivě zvážit. Například je třeba prozkoumat každé podezření na selekční toxicitu testované látky vůči buňkám s mutacemi i bez nich. Testují-li se tedy chemikálie strukturně příbuzné se selekčním činidlem, je třeba potvrdit, že je selekční systém/činidlo vhodné.5)

      Buňky v suspenzi nebo jednovrstevné kultuře se po vhodnou dobu vystaví působení testované látky s metabolickou aktivací i bez ní a kultivují se ke stanovení cytotoxicity a k detekci fenotypické exprese před výběrem mutantů.5) Cytotoxicita se stanoví obvykle hodnocením relativní klonovací účinnosti (přežití) (cloning efficiency) nebo relativního celkového nárůstu kultur po působení látky. Kultury se ponechají v růstovém médiu po dostatečnou dobu, charakteristickou pro daný lokus a typ buňky, aby mohlo dojít k co nejoptimálnější fenotypické expresi indukovaných mutací. Frekvence mutantů se stanoví inokulací známého počtu buněk v médiu obsahujícím selekční činidlo pro detekci mutovaných buněk a v médiu bez tohoto činidla, ke stanovení klonovací účinnosti (cloning efficiency), (životnosti). Po vhodné inkubační době se kolonie spočítají. Mutační frekvence se odvodí z počtu kolonií mutovaných buněk v selekčním médiu a z počtu kolonií v neselekčním médiu.

    1. 1.4 Popis metody
    2. 1.5 Příprava
      1. 1.5.1.1 Buňky

        Dá se použít celá řada buněčných typů, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 a TK6. U buněčných typů používaných v tomto testu musí být prokázaná citlivost vůči chemickým mutagenům, vysoká klonovací účinnost (cloning efficiency) a stabilní frekvence spontánních mutací. U buněk se kontroluje, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty; infikované buňky se použít nesmějí.

        Test je třeba naplánovat tak, aby měl zvolenou citlivost a efektivnost (power). Počet buněk, počet kultur a koncentrace testované látky musí těmto definovaným parametrům vyhovovat.5) Minimální počet vitálních buněk, které přežijí expozici a použijí se v jednotlivých stadiích testu, je dán frekvencí spontánních mutací. Obecným vodítkem je, že počet buněk má být minimálně desetinásobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací. Doporučuje se však použít alespoň 106 buněk. Měly by být k dispozici adekvátní historické údaje, kterými by se prokázala bezproblémové zvládnutí testu.

      1. 1.5.1.2 Média a kultivační podmínky

        Je třeba použít vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentraci CO2, teplotu a vlhkost). Média se pro test volí podle selekčního systému a typu buňky. Zvláště důležité je, aby podmínky kultivace zajišťovaly optimální růst buněk během expresní periody a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.

      1. 1.5.1.3 Příprava kultur

        Buňky se namnoží ze zásobních kultur, inokulují do kultivačního média a inkubují při teplotě 37°C. Před provedením testu, je třeba kultury zbavit dříve vzniklých mutovaných buněk.

      1. 1.5.1.4 Metabolická aktivace

        Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254,5) nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu.5)

        Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná chemikálie. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.

        Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).

      1. 1.5.1.5 Příprava testované látky

        Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

      1. 1.5.2 Podmínky testu
        1. 1.5.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

          U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9.

          Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

        1. 1.5.2.2 Koncentrace

          Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.

          Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.

          Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10–20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 0,01 M.

          U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

        1. 1.5.2.3 Kontroly
          1. V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ B.15 GENOVÉ MUTACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE Metabolická aktivace B.16 MITOTICKÁ REKOMBINACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE Metabolická aktivace B.17 MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO
            Metabolická aktivaceLokusLátkaCASEINECS
            NeHPRTethyl methansulfonát62-50-0200-536-7
            ethyl nitrosomočovina759-73-9212-072-2
            TK (malé a velké kolonie)methyl methansulfonát66-27-3200-625-0
            XPRTethyl methansulfonát62-50-0200-536-7
            ethyl nitrosomočovina759-73-9212-072-2
            AnoHPRT3-methylcholantren56-49-5200-276-4
            N-nitrosodimethylamin62-75-9200-549-8
            7,12-dimethylbenzantracen57-97-6200-359-5
            TK (malé a velké kolonie)Cyklofosfamid
            monohydrát cyklofosfamidu            		50-18-0
            6055-19-2            		200-015-4
            benzo[a]pyren50-32-8200-028-5
            3-methylcholantren56-49-5200-276-5
            XPRTN-nitrosodimethylamin (pro vysoké koncentrace S-9)62-75-9200-549-8
            benzo[a]pyren50-32-8200-028-5

          Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historické údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

          Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.

      1. 1.5.3 Postup
        1. 1.5.3.1 Expozice testovanou látkou

          Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3–6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.

          Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.

          V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.5)

        1. 1.5.3.2 Hodnocení přežívání, viability a mutační frekvence

          Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.

          Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 – 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.

          Pokud je látka v testu L5178Y TK+/- pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s TK6TK+/-.

  1. 2 ÚDAJE
    1. 2.1 Zpracování výsledků