Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

Je to in vivo test na myších, u kterých jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u embryí jsou melanoblasty a cílovými geny ty, které kontrolují pigmentaci srsti. Embrya jsou heterozygoti pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace, nebo ztráty dominantních allel v genech melanoblastů jsou vyjádřeny recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrny (spots) pozměněné barvy srsti narozených myší. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, je zaznamenán a jejich frekvence je srovnávána s frekvencí u potomků z kontrol. Myší spot test detekuje především somatické mutace v embryonálních buňkách.

  1. 1.2 Popis metody
    1. 1.2.1 Příprava

      Testované látky jsou rozpuštěny, nebo suspendovány v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Použitá rozpouštědla nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxický efekt. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky.

      1. 1.2.1.1 Experimentální zvířata

        Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c ch p/cch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) jsou kříženy buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) nebo s kmenem C57 BL (nonagouti, a/a).

        Mohou být použita i jiná křížení, za předpokladu že budou vznikat nonagouti potomci. Např. křížení mezi kmenem NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

      1. 1.2.1.2 Počet a pohlaví zvířat

        Použije se dostatečný počet zabřezlých samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou dávku. Vhodná velikost vzorku je závislá na počtu skvrn pozorovaných u ovlivněných myší a u kontrolních myší. Negativní výsledky jsou akceptovány pouze v případě, že bylo hodnoceno nejméně 300 potomků samic ovlivněných nejvyšší dávkou.

      1. 1.2.1.3 Negativní a pozitivní kontroly

        Musí být použity kontroly ovlivněné pouze rozpouštědlem (negativní kontroly). Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní hodnoty z téže laboratoře za předpokladu, že jsou homogenní. Nedávné údaje z pozitivních kontrol získané v téže laboratoři při expozici látce se známým mutagenním účinkem mohou být v tomto testu použity, jestliže u testované látky nebyla mutagenita detekována.

      1. 1.2.1.4 Způsob aplikace

        Obvykle se používá orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Je-li to vhodné, je možné použít inhalační, nebo jiný způsob aplikace.

      1. 1.2.1.5 Dávkování

        Používají se nejméně dvě dávky z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo zmenšení velikosti vrhu. U netoxických látek se použije maximální dosažitelná koncentrace.

    1. 1.2.2 Popis postupu

      Zvířata jsou obyčejně ovlivněna testovanou látkou pouze jednou 8., 9., nebo 10. den březosti, přičemž za 1.den březosti se považuje den zjištění vaginální zátky. Tyto dny odpovídají 7.25, 8.25 a 9.25 dnů po koncepci. Opakované ovlivnění látkou lze provést během těchto dnů.

      Analýza

      1. U mláďat je počítán a zaznamenáván počet skvrn mezi třetím a čtvrtým týdnem po porodu. Rozlišují se tři třídy skvrn:

        (a) bílé skvrny v rozsahu 5 mm ve střední ventrální linii o kterých se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);

        (b) žluté skvrny typu agouti, se vyskytují v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, a předpokládá se, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS);

        (c) zbarvené a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti jako výsledek somatických mutací (RS).

      Všechny tři skupiny jsou zaznamenávány, ale pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením mezi MDS a RS je možné vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.

      Zaznamenávají se nápadné, velké morfologické malformace potomků.

  1. 2 ÚDAJE

    Získaná data jsou uváděna jako celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat majících jednu, nebo více skvrn vyvolaných somatickými mutacemi. Údaje získané z kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Údaje jsou také uváděny jako získané hodnoty na vrh.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
      1. - kmeni použitém při křížení,
      2. - počtu zabřezlých samic v experimentální a v kontrolní skupině,
      3. - průměrné velikosti vrhu v experimentální a v kontrolní skupině při porodu a při odstavení,
      4. - dávkových úrovních testované látky,
      5. - použitém rozpouštědle,
      6. - ve kterém dni březosti byla testovaná látka aplikována,
      7. - o způsobu podání testované látky,
      8. - celkovém počtu sledovaných potomků, a jejich počet s WMVS, MDS a RS v experimentální a kontrolní skupině,
      9. - hrubých morfologických malformacích,
      10. - vztahu dávka/odpověď u RS, je-li to možné,
      11. - statistickém hodnocení.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.25 PŘENOSNÉ TRANSLOKACE U MYŠÍ

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip metody

      Test na přenosné translokace u myší detekuje strukturální a numerické chromozómové změny v savčích zárodečných buňkách zachycené v první generaci potomků. Indukované změny jsou reciproké translokace a u samičích potomků ještě ztráty X-chromozómu. Nositelé translokací a XO-samice vykazují sníženou fertilitu, která se využívá pro výběr F1 potomstva pro cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je způsobena některými typy translokací (X-autosom a c-t typ). Translokace jsou analyzovány mikroskopicky v meiotických buňkách samců ze spermatocytů ve stadiu diakinézy-metafáze I, nebo F1 samců či samčích potomků F1 samic. Samice XO jsou cytogeneticky identifikovány přítomností pouze 39 chromozómů v mitózách z kostní dřeně.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.

        1. 1.2.1.1 Způsob aplikace

          Aplikuje se obvykle orálně sondou, nebo intraperitoneální injekcí. Mohou být použity i jiné vhodné způsoby aplikace.

        1. 1.2.1.2 Experimentální zvířata

          Pro snadnější křížení a cytologickou verifikaci se pokusy provádí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen. Průměrná velikost vrhu by měla být větší než osm a měla by být relativně konstantní. Používají se zdravá, pohlavně dospělá zvířata.

          Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        1. 1.2.1.3 Počet zvířat

          Počet zvířat nutně závisí na frekvenci spontánních translokací a na minimálním počtu indukovaných translokací vyžadovaném pro positivní kontrolu.

          Test se obvykle provádí analýzou samců F1 potomků. Nejméně 500 samců v F1 generaci je testováno v každé exponované skupině. Jestliže budou analyzovány také samice F1 generace potomků, pak se vyžaduje 300 samců a 300 samic.

        1. 1.2.1.4 Negativní a pozitivní kontroly

          Mohou se použít adekvátní výsledky kontrol získané z předchozích pokusů. Jestliže jsou dostupné přijatelné výsledky pozitivních kontrol z nedávného pokusu z téže laboratoře, mohou být použity.

        1. 1.2.1.5 Dávkování

          Používá se jedna dávka, obyčejně nejvyšší dávka vyvolávající minimální toxický efekt ale bez vlivu na reprodukční chování nebo přežívání. Pro stanovení vztahu dávka/odpověď je třeba dvou dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná dávka.

      1. 1.2.2 Popis postupu
        1. 1.2.2.1 Expozice a oplodnění

          Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.

          Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.

        1. 1.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů

          Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility F1 potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců F1 generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.

          (a) Test fertility

          Snížená fertilita zvířat v F1 generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.

          Velikost vrhu: F1 samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18.dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví F2 potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány F1 samice, F2 potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice-nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0-samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1:1 na 1:2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální F1 zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první F2 vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy.

          F1 zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří F2 vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.

          Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikosti vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní F1 samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. -16. den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.

          (b) Cytogenetická analýza

          Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - metafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni F1 samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u F1 samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomnost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.

  1. 2 ÚDAJE

    Získané údaje se zapisují do tabulky.

    Pro každý interval připouštění je zaznamenána průměrná velikost vrhu a poměr pohlaví (sex ratio) při narození a při odstavení.

    Pro odhad fertility F1 zvířat se uvádí průměrná velikost vrhu kontroly a individuální velikosti vrhů F1 nosičů translokací. Pro analýzu obsahů dělohy se uvádí průměrný počet živých a mrtvých zárodků v kontrole a individuální počty živých a mrtvých zárodků pro každé připouštění F1 nosičů translokací.

    Při cytogenetické analýze diakinéze-metafáze I se uvádí počet typů multivalentních figur a celkový počet buněk pro každého nosiče translokací.

    Pro F1 sterilní jedince se zaznamenává počet a doba připuštění. Dále se uvádí váha testes a podrobnosti o cytogenetické analýze.

    U X0 samic se uvádí průměrná velikost vrhu, sex ratio F2 potomků a výsledky cytogenetické analýzy.

    V případě, že pomocí testů fertility byly předběžně vybráni možní nositelé F1 translokací, je třeba v tabulkách uvést informaci o skutečném počtu potvrzených translokačních heterozygotů.

    Musí být uvedeny údaje o negativních a pozitivních kontrolách.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. - kmenu myší, stáří a váze exponovaných zvířat,
      2. - počtu rodičovských zvířat pro každé pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
      3. - experimentálních podmínkách, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla a schéma připouštění,
      4. - počtu a pohlaví mláďat na samici, počet a pohlaví potomků chovaných pro analýzu translokací,
      5. - době a kritériích analýzy translokací,
      6. - počet a detailní popis nosičů translokací, včetně údajů o březosti a obsahu dělohy,
      7. - popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, včetně obrázků,
      8. - statistické hodnocení.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.26 TEST SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY (90ti-denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7)
    1. 1.1 Úvod

      Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací po získaní prvních informací o toxicitě z testů akutní toxicity nebo toxicity při 28denní opakované aplikaci. Tato 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo nastat vlivem opakované expozice látce v průběhu delšího období, zahrnujícího vývoj po odstavení a růst až do dospělosti. Studie má poskytnout informace o významných toxických účincích, určit cílové orgány a možnou kumulaci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovni dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.

      Metoda klade dále důraz na neurologické příznaky a naznačuje možné imunologické účinky a účinky na reprodukci. Důraz se klade též na pečlivé klinické pozorování zvířat, s cílem získat co nejvíce informací. Tato studie by měla umožnit identifikaci chemických látek, které by mohly vyvolat neurotoxické či imunologické účinky nebo mít nepříznivý vliv na reprodukční orgány, které by vyžadovaly další hlubší zkoumání.

    1. 1.2 Definice

      Dávka: je podané množství testované látky. Dávka se vyjadřuje buď jako hmotnost (v g, mg), nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti testovaného zvířete (např. mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (ppm) nebo v pitné vodě.

      Dávkování: je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání.

      NOAEL (no observed adverse effect level): je zkratka pro hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku a odpovídá nejvyšší dávce nebo expozici, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáváním látky.

    1. 1.3 Princip metody

      Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během podávání se zvířata pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu nebo jsou utracena, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

    1. 1.4 Popis metody
      1. 1.4.1 Příprava zvířat

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní a do jednotlivých experimentálních skupin.

      1. 1.4.2 Příprava dávek

        Testovanou látku lze podávat sondou, v potravě nebo v pitné vodě. Způsob orálního podávání závisí na účelu studie a na fyzikálních a chemických vlastnostech testované látky.

        Pokud je to nezbytné, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku, potom roztoku nebo emulze nebo suspenze v oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiném vehikulu. Pro nevodná vehikula je třeba znát jejich toxikologickou charakteristiku. Je třeba stanovit stabilitu testované látky v podmínkách aplikace.

      1. 1.4.3 Experimentální podmínky
        1. 1.4.3.1 Pokusná zvířata

          V pokusech se upřednostňují potkani, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myši. Použijí se mladá zdravá zvířata z běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nulipary a nesmí být březí. Aplikace by měla začít co nejdříve po odstavení a dříve než zvířata dosáhnou stáří devíti týdnů. Na začátku studie má být variační rozpětí hmotnosti zvířat minimální; pro každé pohlaví zvlášť by nemělo překročit ± 20 % střední hodnoty. Je-li studie předběžnou studií pro dlouhodobou studii chronické toxicity, měla by se v obou studiích používat zvířata stejného kmene a stejného původu.

        1. 1.4.3.2 Počet a pohlaví

          Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Pokud se zvířata budou usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem pokusu. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 10 (5 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.

        1. 1.4.3.3 Úrovně dávek

          Neprovádí-li se limitní test (viz 1.4.3.4), použijí se nejméně tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6-10násobek).

          Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se zachází se zvířaty v kontrolní skupině stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelně skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.

          Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicitu; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.

        1. 1.4.3.4 Limitní test

          Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.

    1. 1.5 Postup
      1. 1.5.1 Aplikace

        Testovaná látka se zvířatům aplikuje 7 dní v týdnu po dobu 90 dnů. Jiný režim aplikace, např. 5 dní v týdnu, musí být zdůvodněn. Aplikuje-li se testovaná látka sondou nebo kanylou měla by být aplikace jen v jediné dávce. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na tělesné hmotnosti zvířete. Objem by neměl překročit 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze podat až 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých nebo leptavých látek, jejichž účinky se zhoršují s koncentrací, je třeba rozdíly podávaných objemů minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl ve všech hladinách dávek podáván týž objem.

        U látek podávaných potravou nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství podávané látky neovlivnilo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu; je třeba dávkování upravovat tak, aby bylo konstantní vzhledem k změnám tělesné hmotnosti zvířete. Je-li 90denní studie předběžnou studií k dlouhodobé studii chronické toxicity, má být v obou studiích použita stejná dieta.

      1. 1.5.2 Pozorování

        Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají po vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo toxické účinky přetrvávají.

        Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.

        Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému (včetně doby nástupu, stupně a trvání), standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a držení těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku).7)

        Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie, nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

        Ke konci pokusu, ale ne dříve než v 11. týdnu, se otestují reakce na senzorické podněty7) (např. sluchové, zrakové a proprioceptivní),7) změří se síla úchopu7) a celková motorická aktivita.7) Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Lze však použít i alternativní postupy.

        Pozorování funkčních poruch lze případně vynechat, jsou-li k dispozici data o funkčních pozorováních z jiných studií a pokud denní klinická pozorování neodhalila žádné funkční poruchy.

        Výjimečně lze pozorování funkčních poruch vynechat i u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu vadily.

        1. 1.5.2.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody

          Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.

        1. 1.5.2.2 Hematologie a klinická biochemie

          Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.

          Z odběrů krve na konci testování a během studie se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve a stanoví se protrombinový čas.

          Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně - zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti těsně před nebo při usmrcení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Podobně jako u hematologických vyšetření lze odebírat vzorky pro biochemickou analýzu i během studie. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata přes noc nalačno.9) Vyšetření plazmy a séra zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, dusíku močoviny, kreatininu, celkových proteinů a albuminu, nejméně dva enzymy indikující o hepatocelulární účinky (například alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gamaglutamyltranspeptidáza a sorbitoldehydrogenáza). Zahrnout lze také stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v určitých případech poskytnout užitečné informace.

          Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev/krvinky.

          Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru. Další vyšetření se provádí u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce, např. stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů nalačno, specifických hormonů, methemoglobinu a cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

          Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.

          Pokud nejsou k dispozici historické údaje o výchozích hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba zvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie; obecně se nedoporučuje, aby se tato data získávala v rámci studie před aplikací.7)

        1. 1.5.2.3 Pitva

          U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, děloha, vaječníky, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena uhynulá nebo byla usmrcena v průběhu testu) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.

          Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, slinivka, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a následným ponořením), aorta, gonády, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, žlučník (myš), lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně), kůže a oči (byly-li při oftalmologických vyšetřeních pozorovány změny). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.

        1. 1.5.2.4 Histopatologická vyšetření

          U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

          Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

          U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky u ostatních exponovaných zvířat.

  1. 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
    1. 2.1 Údaje

      K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Veškeré údaje se sumarizují do tabulky, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat na začátku testu, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úhynu jednotlivých zvířat nebo humánního utracení; počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

      Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o pokusu obsahuje následující informace:
      1. Testovaná látka:
        1. - fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
        2. - identifikační údaje
        3. - vehikulum (je-li použito): zdůvodnění volby vehikula, není-li to voda.
      1. Pokusná zvířata:
        1. - použitý druh a kmen,
        2. - počet, stáří a pohlaví zvířat,
        3. - původ, podmínky chovu, potrava atd.,
        4. - hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu.
      1. Podmínky testu:
        1. - zdůvodnění výběru hladin dávek,
        2. - podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě potravy, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku,
        3. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
        4. - přepočet z koncentrace látky v potravě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg.kg-1 tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v potravě nebo vodě),
        5. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody.
      1. Výsledky
        1. - tělesná hmotnost a její změny,
        2. - spotřeba potravy a případně vody,
        3. - údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávek, včetně popisu příznaků toxicity,
        4. - povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda byly vratné nebo nevratné,
        5. - výsledky oftalmologického vyšetření,
        6. - posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity (pokud byly získány),
        7. - výsledky hematologického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
        8. - výsledky biochemické analýzy s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
        9. - tělesná hmotnost na konci studie a hmotnosti orgánů a poměry hmotnosti orgánů k tělesné hmotnosti,
        10. - pitevní nálezy,
        11. - podrobný popis všech histopatologických nálezů,
        12. - údaje o absorpci, pokud byly získány,
        13. - statistické zpracování číselných výsledků, kde je to možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.27 TEST SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY

(90ti-denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7)
    1. 1.1 Úvod

      Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze provést stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací po získaní prvních informací o toxicitě z testů akutní toxicity nebo toxicity při 28denní opakované aplikaci. Tato 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo nastat vlivem opakované expozice látce v průběhu delšího období, zahrnujícího vývoj po odstavení a růst až do dospělosti. Studie má poskytnout informace o významných toxických účincích, určit cílové orgány a možnou kumulaci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovni dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.

      Tato metoda umožňuje zjistit nepříznivé účinky vyvolané chemickou látkou na nehlodavcích a používá se pouze tehdy, když:

      1. - účinky pozorované v jiných studiích naznačují potřebu objasnit či charakterizovat je na dalším druhu než na hlodavcích nebo když
      2. - toxikokinetické studie naznačují, že použití specifického druhu nehlodavce je nejvhodnější volbou laboratorního zvířete, nebo když
      3. - jiné konkrétní důvody zdůvodňují použití nehlodavce.

      Viz též Všeobecný úvod, Část B.

    1. 1.2 Definice

      Dávka: je podané množství testované látky. Dávka se vyjadřuje buď jako hmotnost (v g, mg), nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti testovaného zvířete (např. mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (ppm) nebo v pitné vodě.

      Dávkování: je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání.

      NOAEL (no observed adverse effect level): je zkratka pro hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku a odpovídá nejvyšší dávce nebo expozici, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáváním látky.

    1. 1.3 Princip metody

      Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během podávání se zvířata pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu nebo jsou utracena, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

    1. 1.4 Popis metody
      1. 1.4.1 Výběr zvířecích druhů

        Obvykle používaným druhem nehlodavce je pes; je třeba definovat plemeno - často se používá beagle. Lze použít i jiné druhy, např. prasata nebo miniprasata. Primáti se nedoporučují, použijí-li se, musí to být zdůvodněno. Používají se mladá, zdravá zvířata, v případě psů se má s podáváním začít ve věku 4-6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.

      1. 1.4.2 Příprava zvířat

        Používají se zdravá zvířata, která dosud nebyla vystavena žádným experimentálním zásahům a která jsou před testem chována v experimentálních podmínkách. Doba aklimatizace závisí na vybraném druhu a na původu zvířat. Doporučuje se nejméně pět dní pro psy či prasata z vlastního chovu a nejméně 2 týdny pro zvířata z externích chovných zařízení. Musí se popsat druh, kmen, původ, pohlaví, hmotnost a/nebo věk. Zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní a do jednotlivých experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby se vlivy jejich umístění minimalizovaly. Každému zvířeti se přiřadí jedinečné identifikační číslo.

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

      1. 1.4.3 Příprava dávek

        Testovanou látku lze podávat v potravě nebo v pitné vodě, sondou nebo v kapslích. Způsob orálního podávání závisí na účelu studie a na fyzikálních a chemických vlastnostech testované látky.

        Pokud je to nezbytné, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku, potom roztoku nebo emulze nebo suspenze v oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiném vehikulu. Pro nevodná vehikula je třeba znát jejich toxikologickou charakteristiku. Je třeba stanovit stabilitu testované látky v podmínkách aplikace.

    1. 1.5 Postup
      1. 1.5.1 Počet a pohlaví

        Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počítá-li se s usmrcováním v průběhu studie, měl by být tento počet zvýšen o počet zvířat, která mají být v průběhu studie usmrcena. Počet zvířat na konci studie musí být dostatečný, aby bylo možno provést smysluplné vyhodnocení toxických účinků. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 8 (4 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.

        1. 1.5.1.1 Úrovně dávek

          Neprovádí-li se limitní test (viz 1.5.3), použijí se nejméně 3 úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6-10násobek).

          Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelní skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.

          Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicita; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.

        1. 1.5.1.2 Limitní test

          Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.

      1. 1.5.2 Aplikace

        Testovaná látka se zvířatům aplikuje 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Jiný režim aplikace, např. 5 dnů v týdnu, musí být zdůvodněn. Aplikuje-li se testovaná látka sondou nebo kanylou měla by být aplikace jen v jediné dávce. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na tělesné hmotnosti zvířete. Zpravidla se udržuje co nejnižší objem. S výjimkou dráždivých nebo leptavých látek, jejichž účinky se zhoršují s koncentrací, je třeba rozdíly podávaných objemů minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl ve všech hladinách dávek podáván týž objem.

        U látek podávaných potravou nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství podávané látky neovlivnilo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou nebo v kapslích, mělo by se podávat každý den ve stejnou dobu; je třeba dávkování upravovat tak, aby bylo konstantní vzhledem k změnám tělesné hmotnosti zvířete. Je-li 90denní studie předběžnou studií k dlouhodobé studii chronické toxicity, má být v obou studiích použita stejná dieta.

      1. 1.5.3 Pozorování

        Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo zda toxické účinky přetrvávají.

        Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.

        Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Příznaky toxicity je třeba pečlivě zaznamenávat, včetně doby nástupu, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a držení těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a/nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování.

        Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

        1. 1.5.3.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody

          Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.

        1. 1.5.3.2 Hematologie a klinická biochemie

          Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.

          Z odběrů krve na počátku testování a pak v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a poté i na konci se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve, stanoví se protrombinový a trombinový čas.

          Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti na počátku studie a v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a na konci studie.

          Je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus cukrů,funkce jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním mechanizmu účinku látky. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Doporučuje se stanovení vápníku, fosforu, chloridů sodíku, draslíku, glykémie nalačno, alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferázy, ornitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkové bílkoviny v séru.

          Minimálně na počátku, v polovině a na konci studie provést vyšetření moči z časově definovaného sběru. Hodnotí se následující parametry: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky. V případě potřeby se mohou použít další analýzy pro studium širšího spektra účinků.

          Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání. Mezi další testy, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterázy. Je-li zapotřebí na základě pozorovaných účinků rozšířit zkoumání, lze přidat i další klinicko-biochemické testy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

          Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.

        1. 1.5.3.3 Pitva

          U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra s žlučníkem, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, vaječníky, děloha, štítná žláza (s příštítnými tělísky), brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena mrtvá nebo usmrcena průběžně) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.

          Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, oči, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Pleyerových plátů), játra, žlučník, slinivka břišní, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce, aorta, pohlavní žlázy, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně) a kůže. Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.

        1. 1.5.3.4 Histopatologická vyšetření

          U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

          Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

          U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

  1. 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
    1. 2.2 Údaje

      K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat na začátku testu, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úhynu nebo úhynu jednotlivých zvířat; počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

      Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol s následujícími údaji.

    1. Testovaná látka:
      1. - fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
      2. - identifikační údaje
      3. - vehikulum (je-li použito): zdůvodnění volby vehikula, není-li to voda.
    1. Pokusná zvířata:
      1. - použitý druh a kmen,
      2. - počet, stáří a pohlaví zvířat,
      3. - původ, podmínky chovu, potrava atd.,
      4. - hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu.
    1. Podmínky testu:
      1. - zdůvodnění výběru hladin dávek,
      2. - podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě potravy, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku,
      3. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
      4. - přepočet z koncentrace látky v potravě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg na kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v potravě nebo vodě),
      5. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody.
    1. Výsledky
      1. - tělesná hmotnost a její změny,
      2. - spotřeba potravy a případně vody,
      3. - údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávek, včetně popisu příznaků toxicity,
      4. - povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda jsou vratné nebo nevratné,
      5. - výsledky oftalmologického vyšetření,
      6. - výsledky hematologického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
      7. - výsledky biochemického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami
      8. - tělesná hmotnost na konci studie a hmotnosti orgánů a poměry hmotnosti orgánů k tělesné hmotnosti,
      9. - pitevní nálezy,
      10. - podrobný popis všech histopatologických nálezů,
      11. - statistické zpracování číselných výsledků, kde je to možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.28 SUBCHRONICKÁ TOXICITA DERMÁLNÍ (90ti-denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se aplikuje denně na kůži po 90 dnů v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.

        Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu.

        Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba zkoušenou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

          Je možno použít dospělé potkany, králíky nebo morčata, případně i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický dermální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.

        1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

          Pro každou úroveň dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) s 20 zvířaty (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90 dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

        1. 1.2.2.3 Dávkování

          Je třeba použít nejméně 3 hladiny dávek a 1 kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

          Nejvyšší hladina dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední hladina dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 hladiny dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední hladinou dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

          Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové hladiny může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.

        1. 1.2.2.4 Limitní test

          Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.

        1. 1.2.2.5 Doba pozorování

          Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

      1. 1.2.3 Popis postupu

        Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 28 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.

        Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla, u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.

        Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovací plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.

        Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky vodou nebo jiným způsobem vhodným k očištění pokožky.

        Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání.

        Pozorování v kleci zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako například v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata v agonii, zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

        1. U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

          (a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

          (b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.