Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb.

1. „

2.2.31. OBECNÝ PRINCIP Elektroforéza

Působením elektrického pole nabité částice rozpuštěné nebo dispergované v roztoku elektrolytu migrují ve směru elektrody opačné polarity. Při gelové elektroforéze je pohyb částic zpomalován interakcemi s okolní gelovou matricí, která působí jako molekulární síto. Protichůdné působení elektrické síly a molekulárního prosívání vede k různým migračním rychlostem podle velikosti, tvaru a náboje částic. Vzhledem k jejich odlišným fyzikálně-chemickým vlastnostem migrují různé makromolekuly směsi během elektroforézy různými rychlostmi, a tak se rozdělují do jednotlivých frakcí. Elektroforetické separace se mohou provádět v systémech bez podpůrných fází (např. separace ve volném roztoku při kapilární elektroforéze) a ve stabilizujících médiích, jako jsou tenkovrstvé desky, filmy nebo gely.

VOLNÁ ELEKTROFORÉZA NEBOLI ELEKTROFORÉZA S POHYBLIVÝM ROZHRANÍM

Tato metoda se používá hlavně ke stanovení elektroforetické pohyblivosti, přičemž experimentální charakteristiky jsou přímo měřitelné a reprodukovatelné. Využívá se hlavně pro látky s vysokými relativními molekulovými hmotnostmi a s nízkými difuzními koeficienty. Poloha rozhraní se na počátku stanoví fyzikálními metodami, jako je refraktometrie nebo konduktometrie. Po aplikaci elektrického pole se po přesně změřeném čase pozorují nová rozhraní a jejich vzájemná poloha. Je nutno volit takové pracovní podmínky, aby bylo možné určit tolik rozhraní, kolik je složek.

ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA V NOSIČI

Pro tuto metodu postačuje pouze malé množství vzorku.

1. Povaha nosiče, jako je papír, agarový gel, acetat celulosy, škrob, agarosa, methylakrylamid, směsný gel, zavádí řadu dalších faktorů ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost:
   1. a) následkem porozity nosiče je naměřená migrační vzdálenost menší než skutečná migrační dráha,
   2. b) některé nosiče nejsou elektroneutrální a mohou někdy vyvolat významný elektroendoosmotický tok,
   3. c) jakékoliv zahřívání v důsledku Jouleova efektu může způsobit odpařování kapaliny z nosiče, což v důsledku kapilarity způsobí pohyb roztoku od krajů do středu. Iontová síla má z tohoto důvodu tendenci postupně vzrůstat.

Rychlost migrace potom závisí na čtyřech hlavních faktorech, zejména na pohyblivosti nabité částice, elektroendoosmotickém toku, toku způsobeném odpařováním a intenzitě elektrického pole. Proto je nezbytné pracovat za zcela přesně definovaných experimentálních podmínek a používat, kdekoliv je to možné, referenčních látek.

1. Zařízení pro elektroforézu se skládá ze:
   1. - zdroje stejnosměrného elektrického proudu, jehož napětí může být regulováno a stabilizováno,
   2. - elektroforetické komory, obvykle pravoúhlé, vyrobené ze skla nebo pevného plastu se dvěma oddělenými prostory, anodickým a katodickým, obsahujícími roztok elektrolytu. V každém prostoru je ponořena elektroda, např. platinová nebo grafitová. Elektrody jsou propojeny vhodně izolovaným obvodem se zdrojem stejnosměrného proudu, jehož kladný pól se připojí k anodě a záporný pól ke katodě. Hladina kapaliny v obou prostorech se udržuje na stejné úrovni, aby se předešlo toku způsobenému sifonovým efektem.

Elektroforetická komora je uzavřena vzduchotěsným víkem, které udržuje během operace vlhkostí nasycenou atmosféru a snižuje odpařování rozpouštědla. Z bezpečnostních důvodů se používá zařízení k přerušení elektrického proudu při sejmutí víka. Překročí-li elektrický výkon 10 W, doporučuje se chlazení nosiče.

1. - zařízení na upevnění nosiče:

   Proužková elektroforéza. Proužek nosiče, předem navlhčený používaným roztokem elektrolytu a ponořený na obou koncích do elektrodových prostorů je vhodně napnutý a upevněný k podložce nosiče, který zabrání difúzi elektrolytu. Podložkou může být vodorovný rámeček, podstavec ve tvaru obráceného V nebo deska s vyčnívajícími hroty umístěnými ve vhodných vzdálenostech.

   Gelová elektroforéza. Zařízení se skládá ze skleněné desky (např. mikroskopické sklíčko), na jejíž celou plochu je nanesena pevně přilnavá vrstva gelu stejné tloušťky. Elektrické spojení mezi gelem a vodivým roztokem je zajištěno různými způsoby podle druhu použitého zařízení. Je třeba učinit předběžné opatření, aby se zabránilo kondenzaci vlhkosti nebo vysychání pevné vrstvy.

1. - měřícího nebo detekčního zařízení.

Pracovní postup. Roztok elektrolytu se nalije do elektrodových prostorů. Nosič nasycený elektrolytem se umístí do komory způsobem vhodným pro dané zařízení. Vyznačí se místo startu a nanese se vzorek. Na předepsanou dobu se zapojí elektrický proud. Po vypnutí zdroje se nosič vyjme z komory, vysuší se a separované látky se vizualizují.

ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU V TRUBIČKÁCH

Při tomto typu elektroforézy je stacionární fází gel, který je připraven ze směsi akrylamidu a N,N'-methylen-bisakrylamidu. Gely jsou připraveny do trubiček délky 7,5 cm a o vnitřním průměru 0,5 cm. Na každou trubičku se nanáší jeden roztok.

Zařízení. Skládá se ze dvou nad sebou umístěných nádobek na tlumivý roztok vyrobených z vhodného materiálu, jako je polymethylmetakrylat. Každá nádobka je vybavena platinovou elektrodou. Elektrody jsou připojeny ke zdroji umožňujícímu práci buď při konstantním proudu, nebo při konstantním napětí. Zařízení má na dně horní nádobky několik držáků stejně vzdálených od elektrody.

Postup stanovení. Před polymerací gelu by měly být roztoky odplyněny a gely použity bezprostředně po přípravě. Připraví se směs gelu podle předpisu a nalije se do vhodných skleněných trubiček s uzavřeným dnem do stejné výšky asi 1 cm od horního okraje. Je nutné zajistit, aby v trubičce nezůstaly bublinky vzduchu. Směs gelu se převrství vodou R, aby se zamezilo přístupu vzduchu a nechá se zpolymerovat. Tvorba gelu trvá obvykle asi 30 min a je ukončena, když se objeví ostré rozhraní mezi gelem a vrstvou vody. Vrstva vody se odstraní. Spodní nádobka se naplní předepsaným tlumivým roztokem a odstraní se uzávěry trubiček. Trubičky se upevní do držáků v horní nádobce tak, aby spodní část trubiček byla ponořena v tlumivém roztoku spodní nádobky. Trubičky se opatrně naplní předepsaným tlumivým roztokem. Připraví se zkoušený roztok a kontrolní roztok, oba obsahující vhodné značkovací barvivo, zahustí se např. tím, že se v nich rozpustí sacharosa R. Tyto roztoky se nanášejí na povrch gelu jednotlivých trubiček, přičemž pro každý roztok se použije jiná trubička. Do horní nádobky se nalije stejný tlumivý roztok. Elektrody se připojí ke zdroji elektrické energie a elekroforéza se nechá probíhat za předepsané teploty a při předepsaném konstantním napětí nebo předepsané intenzitě proudu. Zdroj energie se vypne v okamžiku, kdy značkovací barvivo doputuje téměř ke spodní nádobce. Trubičky se ze zařízení okamžitě vyjmou a gel se z nich uvolní. Poloha jednotlivých zón v elektroforeogramu se deteguje předepsaným způsobem.

SDS ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU

Rozsah použitelnosti. Gelová elektroforéza v polyakrylamidu se používá ke kvalitativní charakterizaci bílkovin v biologických přípravcích, ke kontrole čistoty a ke kvantitativnímu stanovení.

Účel. Analytická gelová elektroforéza je vhodná metoda, kterou se prokazuje totožnost a homogenita bílkovin ve farmaceutických přípravcích. Tato metoda se rutinně používá ke stanovení molekulových hmotností bílkovin a bílkovinných podjednotek a ke stanovení složení podjednotek purifikovaných bílkovin.

Náhradou za gely a zkoumadla popsaná v tomto textuje možno použít komerčně běžně dostupné gely a zkoumadla, za předpokladu, že poskytují odpovídající výsledky a že vyhovují validačním požadavkům uvedeným v odstavci Validace zkoušky.

CHARAKTERISTIKY POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ

Sítovací vlastnosti polyakrylamidových gelů jsou založeny na trojrozměrné síti vláken a pórů, kterou tvoří bifunkční bisakrylamidové zesíťování polyakrylamidových řetězců. Polymerace je katalyzována tvorbou volných radikálů z peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu.

Zvyšováním koncentrace akrylamidu v gelu se snižuje účinná velikost jeho pórů. Účinná velikost pórů gelu je pracovně definovaná jeho prosívacími vlastnostmi, tj. odporem, který klade pohybu makromolekul. Jsou dány limity koncentrací akrylamidu, které mohou být používány. Při vysokých koncentracích akrylamidu se gel láme mnohem snáze a je s ním obtížnější manipulace. Se snižující se velikostí pórů gelu se snižuje i migrační rychlost průchodu bílkovin gelem. Úpravou velikosti pórů gelu pomocí změny koncentrace akrylamidu může být rozlišovací schopnost metody optimalizována pro daný bílkovinný produkt. Proto je daný gel fyzikálně charakterizován pomocí odpovídajícího složení akrylamidu a bisakrylamidu.

Stav bílkoviny je vedle složení gelu důležitým faktorem elektroforetické pohyblivosti. U bílkovin závisí elektroforetická pohyblivost na hodnotě pK nabitých skupin a velikosti molekuly. Je ovlivňována typem, koncentrací a hodnotou pH tlumivého roztoku, teplotou a silou pole a také vlastnostmi materiálu nosiče.

ELEKTROFORÉZA ZA DENATURAČNÍCH PODMÍNEK V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU

Metoda citovaná jako příklad je omezena na analýzy monomerních polypeptidů s hmotnostním rozmezím od 14 000 do 100 000 daltonů. Hmotnostní rozmezí je možné rozšířit různými technikami (např. gradientové gely, zvláštní tlumivý systém), tyto techniky však nejsou předmětem této kapitoly.

Elektroforéza za denaturačních podmínek v polyakrylamidovém gelu s použitím dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE) je nejrozšířenější způsob elektroforézy ke stanovení farmaceutické kvality bílkovinných výrobků a bude předmětem vzorové metody. Typická analytická elektroforéza bílkovin se provádí v polyakrylamidových gelech za podmínek zajišťujících rozštěpení bílkovin na jejich jednotlivé polypeptidové podjednotky a současně minimalizujících jejich shlukování. Nejčastěji se používá silně aniontový detergent dodecylsíran sodný (SDS) v kombinaci se zahříváním, při kterém se bílkoviny štěpí před jejich aplikací na gel. Denaturované polypeptidy váží SDS, stávají se záporně nabitými a vykazují stálý poměr náboj/hmotnost, bez ohledu na druh bílkoviny. Protože množství navázaného SDS je téměř vždy úměrné molekulové hmotnosti polypeptidu a je nezávislé na jeho sekvenci, SDS-polypeptidové komplexy migrují polyakrylamidovým gelem s pohyblivostí závislou na velikosti polypeptidu.

U všech výsledných detergent-polypeptidových komplexů se předpokládá stejný funkční vztah mezi jejich elektroforetickou pohyblivostí a molekulovou hmotností. Migrace SDS komplexů směrem k anodě probíhá předvídatelným způsobem, přičemž nízkomolekulární komplexy se pohybují rychleji než vysokomolekulární. Molekulová hmotnost bílkovin se může tudíž určovat z jejich relativní pohyblivosti v kalibrované SDS-PAGE a výskyt jednoho pruhu v takovémto gelu je kritériem čistoty.

Modifikace polypeptidového skeletu, jako je N- nebo O-glykosylace, má však významný vliv na zdánlivou molekulovou hmotnost bílkoviny, protože SDS se neváže na sacharidovou složku způsobem podobným polypeptidu, a tak není udržován stálý poměr náboje ke hmotnosti. Zdánlivá molekulová hmotnost bílkovin po posttranslačních modifikacích tedy není skutečným odrazem hmotnosti polypeptidového řetězce.

Redukční podmínky

Polypeptidové podjednotky a trojrozměrná struktura je v bílkovinách často udržována přítomností disulfidických vazeb. Cílem SDS-PAGE analýzy za redukčních podmínek je porušení této struktury redukcí disulfidických vazeb. Úplná denaturace a štěpení bílkovin působením 2-merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu (DTT) vede k rozvinutí skeletu polypeptidu a jeho následné komplexaci s SDS. Za těchto podmínek může být molekulová hmotnost polypeptidových podjednotek počítána lineární regresí z molekulových hmotností přítomných vhodných standardů.

Neredukční podmínky

Pro některé analýzy není úplné štěpení bílkovin na peptidové podjednotky žádoucí. Nepůsobí-li se redukčními zkoumadly, jako je 2-merkaptoethanol nebo DTT, zůstávají disulfidické kovalentní vazby neporušeny a je zachována oligomerní forma bílkoviny. Oligomerní komplexy SDS-bílkovina se pohybují pomaleji než SDS-polypeptidové podjednotky. Kromě toho nemohou být neredukované bílkoviny kompletně nasyceny SDS, a tudíž nemohou vázat detergent v konstantním hmotnostním poměru. Tím je stanovení molekulové hmotnosti těchto molekul pomocí SDS-PAGE analýzy méně přesné než analýzy plně denaturovaných polypeptidů a je proto nezbytné, aby jak standardy tak neznámé bílkoviny byly pro platná srovnání v podobné konfiguraci. Nicméně zbarvení jediného pásu v takovém gelu je kritériem čistoty.

CHARAKTERISTIKY DISKONTINUÁLNÍHO TLUMIVÉHO SYSTÉMU GELOVÉ ELEKTROFORÉZY

Nejoblíbenější elektroforetickou metodou k charakterizaci komplexních směsí bílkovin je použití diskontinuálního tlumivého systému skládajícího se ze dvou stýkajících se, ale odlišných gelů: rozlišovacího neboli separačního gelu (dolního) a zaostřovacího (horního) gelu. Tyto dva gely jsou zhotoveny s odlišnou pórovistostí a obsahují roztoky o různém pH a iontové síle. Kromě toho v gelu a v elektrodových tlumivých roztocích se používají ionty s různou pohyblivostí. Diskontinuita tlumivých roztoků způsobuje zakoncentrování velkých objemů vzorků v zaostřovacím gelu a vede ke zlepšení rozlišení. Po zapnutí proudu se na zóně vzorku vytvoří spád napětí, jehož působením bílkoviny putují do zaostřovacího gelu. Glycinové ionty z elektrodového tlumivého roztoku následují bílkoviny do zaostřovacího gelu. Rychle se utvoří oblast pohybujícího se rozhraní s vysoce pohyblivými chloridovými ionty v čele a s relativně pomalými glycinovými ionty vzadu. Lokalizovaný vysokonapěťový gradient, tvořící se mezi zónami vedoucího a koncového iontu, způsobuje, že SDS-bílkovinné komplexy vytvářejí úzké zóny a migrují mezi zónami chloridů a glycinu.

V širokých limitech, bez ohledu na výšku zóny aplikovaného vzorku se všechny SDS-bílkoviny koncentrují do velmi úzké oblasti a vstupují do rozlišovacího gelu jako tenká, dobře definovaná zóna o vysoké hustotě bílkovin. Zaostřovací gel s velkými póry nezpomaluje migraci většiny bílkovin a slouží hlavně jako antikonvekční prostředí. Na rozhraní zaostřovacího a separačního gelu jsou bílkoviny silně zpomaleny vlivem omezené velikosti pórů separačního gelu. V rozlišovacím gelu jsou bílkoviny dále zpomalovány vlivem zesíťování matrice. Glycinové ionty předstihnou bílkoviny, které se pak pohybují v oblasti stálého pH tvořeného trometamolem a glycinem. Molekulární prosívání způsobuje, že se komplexy SDS-polypeptid oddělují na základě svých molekulových hmotností.

PŘÍPRAVA VERTIKÁLNÍCH SDS POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ S DISKONTINUÁLNÍMI TLUMIVÝMI ROZTOKY

Sestavení kazety pro odlévání gelu

Slabým detergentem se očistí a důkladně se opláchnou vodou dvě skleněné desky (např. o velikosti 10 cm × 8 cm), polytetrafluorethylenový hřeben, dva vymezovače a silikonová gumová hadice (např. o průměru 0,6 mm × 35 cm). Všechny části se osuší papírovým ubrouskem. Vymezovače a hadice se namažou nesilikonovým tukem. Vymezovače se aplikují podél každé ze dvou krátkých stran skleněné desky 2 mm od okrajů a 2 mm od dlouhé strany odpovídající spodní části gelu. Hadice se začne pokládat na skleněnou desku za použití jednoho vymezovače jako vodítka. Hadice se pečlivě svine na dně vymezovače a sleduje dlouhou stranu skleněné desky. Zatímco se přidržuje hadice jedním prstem podél dlouhé strany, hadice se opět stočí a položí se ke druhé krátké straně skleněné desky za použití druhého vymezovače jako vodítka. Druhá skleněná deska se umístí přesně nad první a forma se přitlačí rukou. Na každou ze dvou krátkých stran formy se umístí dvě svorky, na delší stranu gelové formy se pečlivě umístí čtyři svorky a takto se vytvoří dno gelové formy. Ověří se, že hadice prochází kolem okraje skleněných desek a nebyla vytlačena při umísťování svorek. Gelová forma je nyní připravena k nalití gelu.

Příprava gelu

V diskontinuálním tlumivém SDS polyalkrylamidovém gelu se doporučuje nejprve nalít separační gel, nechat jej zpolymerovat a poté nalít zaostřovací gel, neboť složení těchto dvou gelů se liší poměrem akrylamidbisakrylamidu, tlumivými roztoky a pH.

Příprava separačního (rozlišovacího) gelu

V kónické baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího požadovanou koncentraci akrylamidu pro separační gel za použití hodnot daných v tabulce 2.2.31-1. Složky se smísí v předepsaném pořadí. Pokud je třeba, roztok se před přidáním roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethyletnylendiaminu (TEMED) zfiltruje, je-li to nutné za použití vakua přes acetatcelulosovou membránu o velikosti pórů 0,45 μm; roztok se udržuje pod vakuem, filtrační jednotkou se krouží, až se v roztoku netvoří žádné bublinky. Přidá se vhodné množství roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu podle tabulky 2.2.31-1, krouživým pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery mezi dvěma skleněnými deskami formy. Nechá se dostačující prostor pro zaostřovací gel (délka zubů hřebenu plus 1 cm navíc). Za použití zúžené skleněné pipety se roztok opatrně převrství isobutanolem nasyceným vodou. Gel se ponechá ve vertikální poloze při teplotě místnosti zpolymerovat.

Příprava zaostřovacího gelu

Po úplné polymeraci (asi 30 min) se odlije isobutanol a horní část gelu se několikrát opláchne vodou, aby se odstranil zbytek isobutanolu a nezpolymerizovaný akrylamid. Z horní části gelu se odsaje co možná nejvíce kapaliny a poté se odstraní zbývající voda okrajem papírového ubrousku.

V kónické baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího požadovanou koncentraci akrylamidu za použití hodnot daných v tabulce 2.2.31-2. Složky se smísí v předepsaném pořadí. Je-li to vhodné, roztok se před přidáním roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu zfiltruje, je-li nutno za použití vakua přes acetatcelulosovou membránu o velikosti pórů 0,45 μm; roztok se udržuje pod vakuem, za občasného víření, kroužení filtrační jednotkou, až se v roztoku netvoří další bublinky. Přidá se vhodné množství roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu podle tabulky 2.2.31-2, krouživým pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery mezi dvěma skleněnými deskami formy přímo na povrch zpolymerovaného rozlišovacího gelu. Do zaostřovacího gelu se ihned vloží čistý polytetrafluorethylenový hřeben, přičemž se dbá na to, aby pod hřebenem nezůstaly vzduchové bublinky. Přidá se další roztok zaostřovacího gelu, aby se zcela zaplnily prostory hřebenu. Gel se nechá ve vertikální poloze při teplotě místnosti zpolymerovat.

1. Tab. 2.2.31-1 Příprava separačního gelu

1. Tab. 2.2.31-2 Příprava zaostřovacího gelu

Umístění gelu do elektroforetického zařízení a elektroforetická separace

Po úplné polymeraci (asi 30 min) se opatrně odstraní polytetrafluorethylenový hřeben. Jamky se ihned vypláchnou vodou nebo SDS-PAGE elektrodovým roztokem R, aby se odstranil nezpolymerovaný akrylamid. Je-li to nutné, napřímí se zuby zaostřovacího gelu pomocí tupé hypodermické jehly připevněné k injekční stříkačce. Na krátké straně se odstraní svorky, opatrně se vytáhnou hadice a svorky se opět nasadí. Na druhé krátké straně se postupuje podobně. Odstraní se hadice i ze spodní části gelu. Kazeta s gelem se umístí do elektroforetického zařízení. Vrchní i spodní nádobka se naplní elektroforetickými tlumivými roztoky. Odstraní se všechny bubliny, které se zachytily na dně gelu mezi skleněnými deskami, nejlépe zahnutou hypodermickou jehlou připevněnou k injekční stříkačce. Nikdy se neprovádí preelektroforéza, tj. připojení napětí před aplikací vzorku, protože tím dochází k porušení diskontinuity tlumivých systémů.

Před aplikací vzorku se štěrbina mezi skly pečlivě opláchne SDS-PAGE elektrodovým roztokem RS. Připraví se zkoušený a kontrolní roztok v doporučeném vzorkovém tlumivém roztoku a upraví se, jak je specifikováno v jednotlivém článku. Aplikuje se vhodný objem jednotlivých vzorků do jamek zaostřovacího gelu. Elektroforéza se spustí podle podmínek doporučených výrobcem zařízení. Výrobci SDS-PAGE zařízení mohou dodávat gely různých rozměrů o různé tloušťce. Čas, po který elektroforéza probíhá, a aplikovaný proud, resp. napětí pro optimální dělení se mohou lišit podle výrobce zařízení. Ověří se, že barevné čelo se pohybuje směrem k separačnímu gelu. Přiblíží-li se barvivo ke dnu gelu, elektroforéza se zastaví. Kazeta s gelem se vyjme ze zařízení a oddělí se skleněné desky. Odstraní se vymezovače a zaostřovací gel a ihned se pokračuje barvením.

DETEKCE BÍLKOVIN V GELECH

Coomassie barvení je nejrozšířenější metoda barvení bílkovin s detekční úrovní řádu od 1 μg do 10 μg bílkoviny na pás. Barvení stříbrem je nejcitlivější metoda barvení bílkovin v gelech a může být detegován pás obsahující 10 ng až 100 ng.

Všechny kroky při barvení gelu se provádějí při teplotě místnosti jemným třepáním (např. na orbitální třepačce) ve vhodné nádobě. Při barvení gelů musí být použity rukavice, aby nedošlo k obarvení otisků prstů.

Coomassie barvení

Gel se ponoří do velkého přebytku barvicího roztoku modři kyselé 83 RS a nechá se stát nejméně 1 h. Pak se barvicí roztok odstraní.

Gel se odbarví velkým přebytkem odbarvovacího roztoku RS, který se několikrát vymění, až jsou obarvené pruhy bílkovin jasně rozlišitelné na čistém pozadí. Čím důkladněji je gel odbarven, tím menší množství bílkoviny může být detegováno. Odbarvování může být urychleno přidáním několika gramů anexu nebo malé houby do odbarvovacího roztoku RS.

POZNÁMKA: Kyselé roztoky používané v tomto procesu nefixují bílkoviny v gelu. Úplně to může vést ke ztrátě některých nízkomolekulárních bílkovin během barvení a odbarvování tenkých gelů. Stálé fixace se dosáhne tak, že se gel nechá stát ve směsi objemových dílů kyseliny trichloroctové R, methanolu R a vody R (1 + 4 + 5) po dobu 1 h před ponořením do barvicího roztoku modři kyselé RS.

Barvení stříbrem

Gel se ponoří do velkého přebytku fixačního roztoku R a nechá se stát po dobu 1 h. Fixační roztok R se odstraní, přidá se čerstvý fixační roztok R a inkubuje se nejméně 1 h nebo, je-li to vhodné, přes noc.

Fixační roztok R se odstraní a gel se promývá velkým přebytkem vody R po dobu 1 h. Gel se poté nechá nasáknout 15 min v roztoku glutaraldehydu R 1 % (V/V) a dvakrát po dobu 15 min se promývá ve velkém přebytku vody R, pak se nechá 15 min nasáknout ve tmě čerstvým zkoumadlem dusičnanu stříbrného R. Nakonec se gel třikrát po dobu 5 min promyje ve velkém přebytku vody R a ponoří se asi na 1 min do vyvíjecího roztoku R, dokud nedojde k uspokojivému obarvení. Vyvíjení se zastaví inkubací v blokovacím roztoku R po dobu 15 min a gel se opláchne vodou R.

SUŠENÍ OBARVENÝCH SDS POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ

V závislosti na použité barvicí metodě se s gely zachází poněkud odlišným způsobem. Při Coomassie barvení se po odbarvovacích krocích ponechá gel stát v roztoku glycerolu R (100 g/l) nejméně 2 h (je možná inkubace přes noc). Pro barvení stříbrem se ke konečnému oplachování přidá jeden krok - ponechání gelu 5 min v roztoku glycerolu R (20 g/l).

Dvě fólie porézního celulosového filmu se ponoří do vody R a inkubují se 5 min až 10 min. Jedna z fólií se umístí na sušicím rámečku. Gel se opatrně uchopí a položí se na celulosový film. Odstraní se všechny zachycené vzduchové bubliny a nalije se několik mililitrů vody R okolo okrajů gelu. Druhá fólie se umístí na gel shora a opět se odstraní zachycené vzduchové bubliny. Dokončí se sestavení sušicího rámečku, který se umístí v sušárně nebo se ponechá při pokojové teplotě, dokud se neusuší.

STANOVENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI

Molekulové hmotnosti bílkovin se stanovují srovnáním jejich pohyblivostí s pohyblivostí několika standardů bílkovin o známých molekulových hmotnostech. Pro kalibrační gely jsou dostupné směsi bílkovin s přesně známými molekulovými hmotnostmi smíchané pro homogenní barvení. Lze je získat v různých rozmezích molekulových hmotností. Koncentrované zásobní roztoky bílkovin o známé molekulové hmotnosti jsou ředěny ve vhodném vzorkovém tlumivém roztoku a jsou aplikovány na stejný gel jako zkoumaný vzorek bílkoviny.

Okamžitě po ukončení elektromigrace se v gelu označí poloha značkovacího barviva bromfenolové modři, aby se identifikoval vedoucí okraj elektroforetického iontového čela. To může být provedeno tím, že se vystřihnou zářezy v koncích gelu nebo se vloží jehla s nasátým indickým inkoustem do gelu na čelo barviva. Po barvení se měří migrační vzdálenost každého bílkovinného pásu (standardů i neznámých bílkovin) od počátku separačního gelu. Migrační vzdálenost každé bílkoviny se dělí vzdáleností, kterou urazilo barvivo. Takto získané normalizované migrační vzdálenosti se nazývají relativní pohyblivosti bílkovin (relativní k čelu barviva) a jsou konvenčně označeny jako R_f. Sestrojí se křivka logaritmu relativních molekulových hmotností (M_r) standardů bílkovin jako funkce hodnot R_f. Graf je mírně sigmoidní. Neznámé molekulové hmotnosti mohou být určeny lineární regresní analýzou nebo interpolací z křivek log M_r proti R_f, pokud se hodnoty neznámých vzorků nacházejí v lineární části grafu.

VALIDACE ZKOUŠKY

Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardů molekulových hmotností jsou rozloženy podél 80 % délky gelu a zahrnují požadované separační rozmezí (např. rozmezí pokrývající produkt a jeho dimer nebo produkt a jeho nečistoty) separace získané pro významné bílkovinné pásy, vykazující lineární vztah mezi logaritmem molekulové hmotnosti a R_f. Další validační požadavky s ohledem na zkoušený roztok mohou být specifikovány v příslušném článku.

KVANTIFIKACE NEČISTOT

Tam, kde je limit nečistot v článku specifikován, měl by být ředěním zkoušeného roztoku připraven kontrolní roztok, odpovídající dané úrovni nečistot. Např. pokud je limit 5 %, připraví se kontrolní roztok ředěním zkoušeného roztoku v poměru 1 : 20. Žádná nečistota (žádný pás jiný než hlavní pás) na elektroforeogramu získaného se zkoušeným roztokem nesmí být intenzivnější než hlavní pás získaný s kontrolním roztokem.

Za validačních podmínek by měly být nečistoty kvantifikovány normalizací k hlavnímu pásu za pomoci integračního densitometru. V tomto případě musí být odezvy validovány na linearitu.

1. “

1. „

2.2.42 Hustota pevných látek

Hustota pevných látek odpovídá jejich průměrné hmotnosti vztažené na jednotku objemu a je obvykle vyjadřována v gramech na krychlový centimetr (g/cm³), ačkoliv mezinárodní jednotka je kilogram na krychlový metr (g/cm³ = 1000 kg/m³).

Na rozdíl od plynů a kapalin, jejichž hustota závisí jenom na teplotě a tlaku, hustota pevné částice závisí také na jejím molekulovém uspořádání, a proto se mění s krystalovou strukturou a stupněm krystalinity.

Je-li pevná částice amorfní nebo částečně amorfní, může její hustota záviset také na způsobu přípravy a zpracování.

Na rozdíl od kapalin mohou tedy být hustoty dvou chemicky ekvivalentních pevných látek různé, a tato různost odráží rozdíl ve struktuře pevného stavu. Hustota částic je důležitá fyzikální charakteristika pro farmaceutické použití.

Hustota pevné částice může dosahovat různých hodnot v závislosti na metodě použité k měření jejího objemu. Je užitečné rozlišovat tři úrovně vyjadřování hustoty:

1. - hustota krystalu, která zahrnuje pouze pevnou frakci materiálu; hustota krystalu je také nazývána pravá hustota,
2. - hustota částice, která zahrnuje také objem dutin uvnitř částice,
3. - celková hustota, která dále zahrnuje volný objem mezi částicemi, vytvořený ve vrstvě prášku; celková hustota se také nazývá zdánlivá hustota.

1. I. Hustota krystalu

   Hustota krystalu látky je průměrná hmotnost vztažená na jednotku objemu (hmotnost objemové jednotky), s výjimkou všech dutin, které nejsou základní částí molekulového uspořádání. Je to vnitřní vlastnost látky a měla by být proto nezávislá na metodě stanovení. Hustota krystalu může být zjištěna buď výpočtem, nebo jednoduchým měřením.

   1. A. Vypočítaná hustota krystalu se získá s použitím krystalografických dat (velikost a složení základní buňky) dokonalého krystalu, např. z rentgenových difrakčních dat, a molekulové hmotnosti látky.
   2. B. Změřená hustota krystalu je poměr hmotnosti a objemu po změření těchto hodnot u monokrystalu.

1. II. Hustota částice

   Hustota částice bere v úvahu jak hustotu krystalu, tak i porozitu uvnitř částice (uzavřené a/nebo otevřené póry). Hustota částice tedy závisí na hodnotě určeného objemu, tato hodnota však závisí na metodě měření. Hustota částice může být stanovena s použitím jedné ze dvou následujících metod:

   1. A. Hustota určená pyknometrem je stanovena měřením objemu, který zaujímá známá hmotnost prášku; tento objem je ekvivalentní objemu plynu, nahrazeného práškem v plynovém pyknometru (2.9.23). Při měření hustoty pyknometrem určený objem zahrnuje objem otevřených pórů; vylučuje však objem zavřených pórů nebo pórů nedosažitelných pro plyn. Z důvodů vysoké difuzní schopnosti helia, který je pro tyto účely přednostně volen, je většina otevřených pórů pro plyn dosažitelná. Hustota jemně rozemletého prášku určená pyknometrem se tedy obecně příliš neliší od hustoty krystalu.
   2. B. Hustota určená rtuťovým porozimetrem se také nazývá hustota granule. Objem určený touto metodou také nezahrnuje příspěvky od uzavřených pórů, u otevřených pórů zahrnuje objem jen od pórů větších, než je určitý limit velikosti. Tento limit velikosti pórů neboli minimální dostupný průměr pórů závisí na maximálním tlaku rtuti potřebném k proniknutí a použitém při měření; za normálních používaných tlaků rtuť neproniká do nejjemnějších pórů dosažitelných pro helium. Pro jeden vzorek mohou být získány různé hustoty granule, protože pro každý použitý tlak rtuti je určena hodnota, odpovídající limitní velikosti pórů při tomto tlaku.

1. III. Celková a setřesná hustota

   Celková hustota prášku zahrnuje příspěvek volného objemu mezi částicemi. Celková hustota tedy závisí na hustotě částic prášku a na prostorovém uspořádání částic ve vrstvě prášku.

   Celkovou hustotu je často velmi obtížné změřit, protože nejmenší porušení vrstvy může mít za následek získání jiné hodnoty. Při uvádění získané hodnoty je tedy nutno specifikovat, jak bylo stanovení provedeno.

   1. A. Celková hustota je stanovována měřením objemu prášku o známé hmotnosti, který byl prosát sítem do odměrného válce (2.9.15).
   2. B. Setřesná hustota je získána mechanickým sklepáváním odměrného válce obsahujícího práškový vzorek. Po zaznamenání původního objemu je válec mechanicky sklepáván, dokud jsou pozorovány další malé změny objemu (2.9.15).

2.2.43 Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie je metoda založená na přímém měření hodnoty poměru hmotnosti a nábojového čísla (m/z) (počtu kladných a záporných iontů v plynné fázi vzniklých po ionizaci analyzované látky). Tento poměr je vyjadřován v atomových hmotnostních jednotkách (1 a.h.j. je jedna dvanáctina atomové hmotnosti izotopu uhlíku ¹²C) nebo v daltonech (1 Da je hmotnost vodíkového atomu).

Ionty produkované v iontovém zdroji přístroje jsou akcelerovány, a pak separovány v analyzátoru a následně detegovány v detektoru. Veškeré tyto procesy probíhají v uzavřeném prostoru, ve kterém je systémem pump udržováno vakuum 10^-3 Pa až 10^-6 Pa.

Ve výsledném hmotnostním spektru je vynesen relativní nadbytek různých druhů přítomných iontů jako funkce poměru m/z. Signál příslušející určitému iontu je obvykle reprezentován několika píky odpovídajícími statistickému zastoupení jednotlivých izotopů ve struktuře iontu. Charakteristický soubor izotopických píků tvoří izotopický profil charakteristický pro danou strukturu. Pík reprezentující nejvíce zastoupený izotop daného atomu je nazýván monoizotopický pík.

Informace získané hmotnostní spektrometrií jsou kvalitativní (určení molekulové hmotnosti, informace o struktuře z pozorovaných fragmentových iontů) nebo kvantitativní (s použitím vnitřních nebo vnějších standardů) s dosahovanými detekčními limity řádu pikomolů až femtomolů.

Dávkování vzorku

Prvním krokem při analýze je nadávkování vzorku bez přílišného narušení vakua přístroje. Při obecné metodě tzv. přímého dávkování je roztok vzorku ve vhodném rozpouštědle s pomocí sondy přímého vstupu vnesen do prostoru iontového zdroje (v křemenném kelímku, na vlákně nebo na kovové destičce). Systém vakuových uzávěrů zajišťuje postupné snižování tlaku při zasouvání sondy, odpaření rozpouštědla mimo prostor iontového zdroje a vylučuje přímou expozici iontového zdroje atmosférickému tlaku.

Jiné způsoby dávkování umožňují s využitím vhodného zařízení vzájemně separovat komponenty vzorku před vstupem do hmotnostního spektrometru:

Plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC-MS) - při použití vhodných kapilárních nebo mikronáplňových kolon je možno konec kolony umístit přímo do prostoru iontového zdroje bez nutnosti použití separátoru nosného plynu.

Kapalinová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (LC-MS) - tato kombinace je obzvláště vhodná pro analýzu polárních, málo těkavých sloučenin a látek tepelně nestálých, které není možno analyzovat kombinací GC-MS. Spojení je komplikováno obtížemi při ionizaci z kapalné fáze. Mezi kapalinový chromatograf a hmotnostní spektrometr je nutno zařadit některé z dále uvedených rozhraní:

1. - rozhraní pro přímý vstup kapalin: mobilní fáze je rozprášena a rozpouštědlo je odpařeno před vstupem do iontového zdroje,
2. - rozhraní pro vstup desolvatovaného vzorku: zajišťuje rozprášení mobilní fáze do maximálního průtoku 0,6 ml/min a následné odsušení kapalné fáze v desolvatační komůrce. Vzorek v podobě neutrálních částic vstupuje do vlastního prostoru iontového zdroje. Tato technika je vhodná pro analýzu málo polárních látek s hmotností do 1000 Da,
3. - rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem: mobilní fáze se vzorkem, s maximální průtokovou rychlostí do 1 ml/min, je kontinuálně nanášena na smyčku z kovového pásku a přes systém vakuových uzávěrů unášena do prostoru iontového zdroje. Během pohybu dochází k odpaření rozpouštědla a vzorek je unášen do prostoru iontového zdroje, kde je ionizován. Tato metoda není vhodná pro analýzu vysoce polárních a tepelně nestálých látek.

Ostatní typy rozhraní (elektrosprej, termosprej, chemická ionizace za atmosférického tlaku) jsou ve své podstatě ionizačními technikami a jsou dále popsány v odstavci věnovaném způsobům ionizace.

Chromatografie s nadkritickou fází/hmotnostní spektrometrie (SFC-MS) - mobilní fáze je většinou tvořena oxidem uhličitým udržovaným při nadkritické teplotě a tlaku. Průchodem přes vyhřívaný restriktor, který je umístěn mezi kolonou a iontovým zdrojem dochází k jejímu převedení do plynné fáze.

Kapilární elektroforéza/hmotnostní spektrometrie (CE-MS) - nosný elektrolyt s komponentami vzorku je přes vhodné rozhraní veden do hmotnostního spektrometru. K zajištění účinného transportu analyzovaných látek i při extrémně malých průtocích nosného elektrolytu separační kapilárou (řádu několika mikrolitrů za minutu) je často využíván tok pomocné kapaliny přidávané za výstupem separační kolony. Využitelnost CE-MS je do značné míry limitována velmi malým množstvím dávkovaného vzorku a nutností použití těkavých nosných elektrolytů.

Způsoby ionizace

Ionizace nárazem elektronu (EI) - vzorek převedený do plynné fáze je ionizován proudem elektronů, jejichž kinetická energie (obvykle 70 eV) je vyšší než ionizační energie analyzovaných molekul. Ve spektru je možno kromě molekulárního iontu M⁺ pozorovat i ionty fragmentové, které jsou charakteristické pro strukturu pozorovaných molekul. Tato technika EI ionizace je hlavně limitována nutností převedení vzorku do plynné fáze a nehodí se pro látky polární, tepelně nestálé nebo vysokomolekulární. EI ionizace je vhodná pro spojení s plynovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií, v některých případech s kapalinovou chromatografií.

Chemická ionizace (CI) - tento způsob ionizace využívá pro přenos energie na ionizovanou molekulu vzorku tzv. reakčního plynu (methan, amoniak, oxid dusnatý a dusičitý nebo kyslík). Pro hmotností spektrum po chemické ionizaci je v závislosti na použitém reakčním plynu charakteristická přítomnost kvazimolekulárního iontu typu (M + H)⁺, (M - H)^-, nebo popřípadě aduktových iontů vznikajících mezi vzorkem a použitým plynem. Ve srovnání s EI ionizací je obecně produkováno méně fragmentových iontů. Pro ionizaci tepelně nestálých látek je využívána varianta desorpční chemické ionizace, kdy vzorek nanesený na žhavené kovové vlákno je velmi rychle odpařen vlivem Joule-Thomsonova jevu.

Ionizace nárazem urychlených neutrálních atomů a nebo iontů (FAB-fast atom borbardment, LSIMS-liquid secondary ion mass spectrometry) - vzorek rozpuštěný ve viskózní netěkavé matrici (např. glycerin) je nanesen na kovovou destičku a ionizován proudem urychlených neutrálních atomů (např. argonu, xenonu a nebo cesiových iontů). Při ionizaci vznikají ionty typu (M + H)⁺, (M - H)^-, nebo ionty aduktů s vlastním vzorkem nebo matricí. Tento způsob ionizace je vhodný pro polární a tepelně nestálé látky, umožňuje i ionizaci makromolekul do hmotnosti asi 10 kDa. Pokud jsou do mobilní fáze přidány 1 % až 2 % glycerolu, je tato technika ionizace kompatibilní s kapalinovou chromatografií. Průtok mobilní fáze musí být velmi nízký, řádově jednotek μl/min. Technika FAB ionizace rovněž umožňuje analýzu látek separovaných tenkovrstvou chromatografií přímo na separační destičce, která je po nanesení tenké vrstvy matrice vložena do iontového zdroje.

Ionizace a desorpce polem (FI, FD) - vzorek převedený do plynné fáze je ionizován elektrickým polem o vysoké intenzitě v blízkosti wolframové elektrody pokryté mikrojehličkami (emitoru) (ionizace polem) nebo je vzorek nanesen na emitor (desorpce polem). K ionizaci vzorku dochází po vložení napětí mezi emitor a protielektrodu (asi 10 kV) přímo z fáze pevné. Techniky FI a FD, produkující především molekulární a kvazimolekulární ionty typu M⁺ a (M + H)⁺, jsou využívány pro ionizaci málo polárních a tepelně nestálých látek.

Ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice (MALDI) - vzorek ve vhodné matrici je nanesen na kovovou destičku a ionizován zářením pulzního laseru (oblast vlnových délek od UV do IČ, délka trvání pulzu od pikosekund až k nanosekundám). Tento způsob ionizace hraje klíčovou roli při analýze makromolekulárních látek s hmotností až 100 kDa a je používán nejčastěji ve spojení s průletovými hmotnostními analyzátory (TOF).

Elektrosprej (ES) - ionizace probíhá za atmosférického tlaku. Vzorky v roztoku jsou přiváděny do iontového zdroje kovovou kapilárou na jejíž konec je vloženo napětí asi 5 kV. Kapalina je rozprášena vlivem nehomogenního elektrického pole, vytvořený sprej je rychle desolvatován protiproudem horkého inertního plynu. Látky disociované v roztoku přecházejí v iontové formě přímo do plynné fáze. V závislosti na povaze analyzovaných látek jsou produkovány jednou a nebo vícenásobně nabité ionty. Průtoková rychlost kapalné fáze přicházející do elektrospreje se pohybuje v rozmezí několika μl/min až 1 ml/min. Tato technika ionizace je vhodná pro analýzu polárních, vysokomolekulárních látek do molekulových hmotností až 1000 kDa. Může být spojena s kapalinovou chromatografií nebo kapilární elektroforézou.

Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI) - vzorek v kapalné fázi je rozprášen rychlým ohřevem a proudem inertního plynu. Ionizace probíhá za atmosférického tlaku působením dostatečně intenzivního elektrického pole v okolí elektrody udržované na potenciálu několika kV a vystavené proudu spreje. Produkované ionty jsou většinou jednou nabité, typu (M + H)⁺, (M - H)^- v závislosti na podmínkách ionizace. Průtoková rychlost kapalné fáze může dosahovat až 2 ml/min, proto je technika ionizace ideální pro spojení s kapalinovou chromatografií.

Termosprej (TS) - Vzorek v mobilní fázi obsahující vodu, organické rozpouštědlo a těkavý elektrolyt (nejčastěji octan amonný) je rozprášen průchodem kovovou kapilárou za kontrolované teploty, jejíž konec je zahříván na teplotu nad bodem varu kapalných složek roztoku. K vlastní ionizaci dochází při desolvataci vytvořeného spreje kombinovaným působením povrchového elektrostatického náboje a přítomného elektrolytu. Přijatelná průtoková rychlost kapalné fáze přicházející do termospreje se může pohybovat v rozmezí 1 ml/min až 2 ml/min. Ionty elektrolytu ionizují analyzované složky. V případě čistě organického rozpouštědla může být produkce iontů nahrazena nebo podpořena působením elektrického výboje asi 800 V. Tato technika ionizace je kompatibilní ve spojení s kapalinovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií.

Analyzátory

1. Rozdíly v účinnosti hmotnostních analyzátorů jsou v zásadě dány dvěma parametry:
   1. - rozsahem, ve kterém mohou být měřeny poměry m/z, tj. hmotnostním rozsahem,
   2. - rozlišovací schopností, definovanou pro separaci dvou iontů stejné intenzity, poskytující píky s 10% překrytím, s poměry m/z lišícími se o ΔM, např. rozlišovací schopnost (M/ΔM) je 1000 s 10% překrytím, umožní rozdělit poměry m/z na 1000 a 1001 s 10% odezvou nad základní linií. Ostatně, v řadě případů (např. v kvadrupolových analyzátorech, průletových analyzátorech a iontových pastí) je rozlišovací schopnost často definována podílem molekulové hmotnosti iontu pozorovaného píku a jeho šířky v polovině jeho výšky.

Magnetické a elektrostatické analyzátory - ionty produkované v iontovém zdroji jsou urychlovány napětím V a (v závislosti na konfiguraci přístroje) fokusovány na vstup magnetického analyzátoru (magnetická indukce B) nebo elektrostatického analyzátoru (elektrostatické pole E). V magnetickém poli ionty opisují dráhu o poloměru r danou Laplaceovou rovnicí:

Aby ionty rozdílné hmotnosti dopadly na fixní místo na detektoru, je nutno v průběhu měření periodicky měnit (skenovat) hodnoty B a nebo V. Obvyklé je skenování B při konstantní hodnotě V a nebo skenování V při konstantní hodnotě B. Za magnetickým analyzátorem je obvykle umístěn elektrostatický analyzátor (elektrický sektor), který disperguje svazek procházejících iontů podle kinetických energií a umožňuje tím podstatně zvýšit rozlišovací schopnost přístroje. Maximální rozlišení takto uspořádaného přístroje (tzv. dvousektorového) dosahuje hodnot 10 000 až 150 000 a v mnoha případech umožňuje stanovení hodnoty poměrů (m/z) s dostatečnou přesností určit elementární složení pozorovaných iontů. Maximální analyzovatelná hmotnost jednou nabitých iontů dosahuje hodnot v rozmezí 2 kDa až 15 kDa. Některé ionty se mohou spontánně (netastabilní přechody) nebo zprostředkovaně (kolizemi s molekulami plynné látky v tzv. kolizní cele (kolizně aktivovaná disociace - CAD) rozpadat v prostorech bez vlivu elektrického a magnetického pole mezi zdrojem iontů a detektorem. Pozorování těchto rozpadů je velmi užitečné pro určení struktury látky, stejně tak pro charakterizaci specifické složky ve směsi bez předchozího dělení. Studium tohoto typu rozpadu je často realizováno s pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie. Existuje několik technik v závislosti na místě rozpadu:

1. - mód dceřinných iontů (určení fragmentačních cest vybraného tzv. rodičovského iontu):
   1. B/E je konstantní, (MIKES - Mass-analysed Ion Kinetic spectroscopy),

1. - mód rodičovských iontů (určení všech iontů, které při svém rozpadu poskytnou ion o specifickém poměru m/z): B²/E je konstantní,
2. - mód neutrálních ztrát (detekce všech iontů odštěpujících stejný neutrální fragment):
   1. B/E(1–E/E₀)^1/2 je konstantní, v němž E₀ je základní napětí vkládané na elektrický sektor.

Kvadrupolové filtry - jsou tvořeny čtyřmi paralelními kovovými tyčemi kruhového nebo hyperbolického průřezu. Jsou uspořádány symetricky vzhledem k trajektorii procházejících iontů, tyče orientované proti sobě jsou elektricky propojené. Potenciály vkládané na oba protější páry jsou opačné a sestávají ze stejnosměrné a střídavé složky. Ionty různých hmotností produkované v iontovém zdroji jsou postupně propouštěny přes kvadrupol změnou velikosti vkládaných napětí (poměr stejnosměrné a střídavé složky zůstává konstantní). Běžný rozsah hmotností analyzovatelných iontů leží v rozsahu 1 až 2000 a.h.j., v závislosti na provedení může dosahovat maximální hodnoty až 4000 a.h.j. Kvadrupolový filtr dosahuje obecně nižší rozlišovací schopnosti než magnetický analyzátor, přesto však je možno získat monoizotopický profil jednou nabitých iontů v celém hmotnostním rozsahu. Kvadrupolové filtry je možno kombinovat a získat přístroje typu tandemových hmotnostních spektrometrů, kde jsou v sérii zařazeny tři kvadrupoly Q₁, Q₂ a Q₃ (Q₂ slouží jako kolizní cela a není pravým analyzátorem, nejčastěji používaným kolizním plynem je argon).

1. Nejběžnější způsoby skenování trojitého kvadrupolového přístroje jsou:
   1. - mód dceřinných iontů: Q₁ propouští vybraný rodičovský ion, který fragmentuje v kolizní cele Q₂. Produkty rozpadu (dceřinné ionty) jsou analyzovány v Q₃.
   2. - mód rodičovských iontů: Q₃ propouští pouze ion o vybraném m/z, neboť Q₁ skenuje daný hmotnostní rozsah. Pouze ionty rozpadající se na vybraný fragment jsou detegovány.
   3. - mód neutrálních ztrát: Q₁ a Q₃ jsou skenovány přes určitý hmotnostní rozsah s posunem odpovídajícím hmotnostní diferenci při odštěpení vybraného neutrálního fragmentu charakteristického pro produkt nebo pro určitou třídu látek.

Hmotnostní spektra je možno získat i s pomocí přístrojů kombinujících kvadrupolové filtry s magnetickými analyzátory nebo elektrostatickými sektory. Tyto přístroje označujeme jako hybridní hmotnostní spektrometry.

Iontová past - je funkční obdobou kvadrupolových filtrů s vytvářeným uzavřeným elektrostatickým polem. Iontová past umožňuje získat trojrozměrná spektra iontových produktů přes několik generací dceřinných iontů (MSⁿ).

Ion-cyklotronová rezonance (ICR) - ionty vystavené homogennímu magnetickému poli o dostatečně velké intenzitě, se pohybují po uzavřených kruhových drahách. Jejich úhlovým rychlostem je možno s využitím algoritmu Fourierovy transformace přiřadit příslušné hodnoty m/z. Tento jev se nazývá ioncyklotronová rezonance. Analyzátory tohoto druhu tvořené supravodivými magnety dosahují extrémně vysoké rozlišovací schopnosti (do 1 000 000 a výše) a umožňují provádět experimenty (MSⁿ). Zásadním požadavkem funkce ICR analyzátorů je velmi nízké vakuum řádu 10^-7 Pa.

Průletové analyzátory (TOF) - ionty produkované v iontovém zdroji jsou akcelerovány napětím V v rozsahu 10 kV až 20 kV. Pak procházejí analyzátorem tvořeným tzv. letovou trubicí o délce 25 cm až 150 cm bez vlivu elektrického a magnetického pole. Doba průletu t iontu letovou trubicí k detektoru je přímo úměrná odmocnině z poměru m/z. Teoreticky je hmotnostní rozsah TOF analyzátoru neomezený, praktické limitace jsou dány typem použitého iontového zdroje (metodou ionizace nebo desorpce). TOF analyzátory jsou využívány zejména při analýze makromolekulárních látek do hmotnosti až několika set kDa. Hmotnostní spektrometry využívající TOF analyzátory jsou velmi citlivé (pro analýzu jsou postačující množství řádově jednotek pikomolů). Přesnost měření a dosažitelné rozlišení je možno výrazně zvýšit použitím elektrostatického zrcadla (reflektronu).

Sběr dat

V zásadě existují tři způsoby získávání dat.

Mód kompletního spektra - je zaznamenáván veškerý signál získaný ve zvoleném rozsahu hodnot m/z. Hmotnostní spektrum zobrazuje relativní intenzity různých druhů iontů jako funkci m/z. Získané výsledky jsou v zásadě kvalitativní. Pro rychlou identifikaci struktury reprezentované získaným hmotnostním spektrem je možno využít počítačového porovnání s referenčními knihovnami spekter.

Fragmentometrický mód [monitorování vybraného iontu - SIM (single-ion monitoring), monitorování více vybraných iontů - MIM (multiple-ion monitoring)] - je zpracován pouze signál příslušející iontu o vybraném m/z, popřípadě několika vybraným iontům charakteristickým pro zkoušenou látku. S využitím tohoto způsobu sběru dat, využívaného často pro účely kvantitativní analýzy, je možno podstatně snížit detekční limit metody. Kvantitativní nebo semikvantitativní stanovení je možno provádět s použitím interních a externích standardů (např. deuterovaných standardů). Tento typ měření není možno provádět s TOF analyzátory.

Fragmentometrický MS-MS mód (multiple reaction monitoring-MRM) - je možno specificky sledovat unimolekulární nebo bimolekulární rozpad iontů vybraného prekurzorového iontu charakteristického pro analyzovanou látku. Díky vysoké selektivitě, specifičnosti a citlivosti je tento mód mimořádně vhodný pro kvantitativní studie s použitím vhodných vnitřních standardů (např. deuterovaných standardů). Tento druh analýz je možno provádět pouze na tandemových hmotnostních spektrometrech, přístrojích s iontovou pastí nebo ICR analyzátorem.

Kalibrace

Kalibrace umožňuje přiřadit detegovanému signálu správnou hodnotu m/z. Obecně se kalibrace provádí s pomocí vhodné porovnávací látky. Je možno provádět kalibraci externí (odděleně od vlastního měření) nebo interní (kdy je porovnávací látka přidána přímo do analyzovaného vzorku. Počet iontů nebo bodů nutných pro spolehlivou kalibraci závisí na druhu použitého analyzátoru a na požadované přesnosti měření. Např. v případě magnetických analyzátorů, kdy hodnota m/z závisí exponenciálně na magnetické indukci, je nutno kalibrovat na maximální počet bodů.

Detekce signálu a zpracování výsledků

Ionty separované v analyzátoru, fokusované na detektor typu fotonásobiče a nebo elektronásobiče, poskytují elektrický signál úměrný jejich dopadajícímu počtu. Signál je dále zesílen, digitalizován a zpracován v počítači. S pomocí vhodného programového vybavení jsou kromě sběru dat zajištěny další nezbytné funkce, jako je kalibrace, rekonstrukce spekter, automatická kvantifikace, archivování a strojové vyhodnocení spekter. Počítač kontroluje i důležité parametry související s chodem a nastavením hmotnostního spektrometru.

2.2.44 Celkový obsah organického uhlíku ve vodě pro farmaceutické použití ¹⁾

Stanovení celkového obsahu organického uhlíku je nepřímým měřítkem organických sloučenin obsažených ve vodě pro farmaceutické použití. Stanovení celkového obsahu organického uhlíku může být použito také pro kontrolu provádění různých operací při přípravě léčivých přípravků.

Pro stanovení celkového obsahu organického uhlíku je dostupná řada vhodných metod. Tato obecná stať nepředpisuje danou metodu, která má být použita, ale popisuje postupy používané pro kvalifikaci zvolené metody a interpretaci výsledků u limitních zkoušek. Porovnávací roztok je analyzován ve vhodných intervalech v závislosti na četnosti měření; pro přípravu tohoto roztoku je použita látka, u níž se předpokládá, že je snadno oxidovatelná (např. sacharosa) při koncentraci nastavené tak, aby odezva přístroje odpovídala limitu celkového obsahu organického uhlíku, který má být měřen. Pro stanovení způsobilosti systému je analyzován roztok látky, u níž se předpokládá, že je obtížně oxidovatelná (např. 1,4-benzochinon).

Společné pro různé typy přístrojů, které jsou používány pro měření celkového obsahu organického uhlíku ve vodě pro farmaceutické použití, je to, že se v nich dosahuje úplné oxidace organických molekul ve vzorku vody za vzniku oxidu uhličitého, jehož množství je následně změřeno a výsledek je použit pro výpočet koncentrace uhlíku ve vodě.

Použitý přístroj musí rozlišit organický uhlík a anorganický uhlík později přítomný jako uhličitan. Tohoto rozlišení může být dosaženo buď změřením anorganického uhlíku a odečtením od celkového uhlíku, nebo odstraněním anorganického uhlíku ze vzorku před oxidací. Při odstraňování anorganického uhlíku mohou být strženy i organické molekuly, ale takovýto organický uhlík je ve vodě pro farmaceutické použití přítomen v zanedbatelném množství.

Přístroj. Použije se kalibrovaný přístroj instalovaný buď v přímém spojení, nebo odděleně. Ověří se způsobilost systému ve vhodných intervalech, jak je popsáno dále. Přístroj musí mít mez detekce udávanou výrobcem nejméně 0,05 mg uhlíku v litru.

COU voda (voda pro stanovení celkového obsahu organického uhlíku). Použije se vysoce čištěná voda splňující následující požadavky:

1. - vodivost: nejvýše 1,0 μS.cm^-1 při 25 °C,
2. - celkový organický uhlík: nejvýše 0,1 mg/l.

Podle typu použitých přístrojů, obsah těžkých kovů a mědi může být kritický. Je proto třeba dodržovat pokyny výrobce přístroje.

Příprava skleněného nádobí. Použije se skleněné nádobí, z něhož byly velice pečlivě odstraněny organické látky. Pro konečné opláchnutí se použije COU voda.

Porovnávací roztok. Sacharosa R se suší 3 h při 105 °C a pak se rozpustí v COU vodě tak, aby získaný roztok obsahoval 1,19 mg sacharosy v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

Zkoušený roztok. Voda, která má být zkoušena, se při řádném dodržování opatření zabraňujících znečištění shromáždí ve vzduchotěsně nádobě, přičemž zbývající prázdný prostor v nádobě musí být co nejmenší. Zkouška se provede co nejdříve, aby se snížilo znečištění vody z nádoby a z uzávěru na minimum.

Roztok pro způsobilost systému. 1,4-benzochinon R se rozpustí v COU vodě tak, aby získaný roztok obsahoval 0,75 mg 1,4-benzochinonu v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

COU voda pro kontrolu. Použije se COU voda získaná současně s vodou použitou pro přípravu porovnávacího roztoku a roztoku pro způsobilost systému.

Kontrolní roztoky. Kromě COU vody pro kontrolu, se připraví vhodné kontrolní roztoky pro nulování přístroje nebo další roztoky potřebné pro stanovení základní linie nebo pro nastavení kalibrace podle pokynů výrobce; provede se slepá zkouška pro nastavení nulové polohy přístroje.

Způsobilost systému. Provede se měření s následujícími roztoky a zaznamenají se odezvy. Vypočítá se účinnost odezvy v procentech za použití výrazu:

2. v němž značí:
   1. r_w - COU voda,
   2. r_s - porovnávací roztok,
   3. r_ss - roztok pro způsobilost systému.

Systém je způsobilý, jestliže účinnost odezvy je 85 % až 115 % teoretické odezvy.

Pracovní postup. Provede se měření se zkoušeným roztokem a zaznamená se odezva (r_u). Zkoušený roztok vyhovuje zkoušce, jestliže r_u není větší než r_s - r_w.

Tato metoda může být použita také u přímo spojeného přístrojového systému, který byl patřičně kalibrován a u něhož byla ověřena způsobilost systému. Umístění přístroje musí být zvoleno tak, aby bylo zajištěno, že odezvy jsou charakteristické pro použitou vodu.

1. “

1. „

2.4.22 Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií

Cizí oleje se stanoví jako methylestery mastných kyselin přítomných ve zkoušených olejích. Pokud není v příslušném článku uvedeno jinak, použije se metoda A.

Metoda A

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- nebo cyklopropenylovými skupinami nebo oleje s velkým podílem mastných kyselin s kratším řetězcem než 8 uhlíkových atomů nebo pro oleje s vyšším číslem kyselosti než 2,0.

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Je-li v článku předepsáno, zkoušený olej se před methylací suší. Naváží se 1,0 g zkoušeného oleje do 25ml zabroušené baňky s kulatým dnem opatřené zpětným chladičem a upravené k zavádění plynu. Přidá se 10 ml methanolu bezvodého R, 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného R (60 g/l) v methanolu R a za míchání se pod zpětným chladičem zahřívá k varu za současného probublávání dusíkem R rychlostí asi 50 ml/min. Když je roztok čirý (asi po 10 min), pokračuje se v zahřívání ještě 5 min. Baňka se ochladí pod tekoucí vodou a obsah se převede do dělicí nálevky. Vnitřek baňky se opláchne 5 ml heptanu R, který se přidá do dělicí nálevky a protřepe se. Přidá se 10 ml roztoku chloridu sodného R (200 g/l) a intenzivně se protřepe. Po rozdělení se organická vrstva převede do nádobky, vysuší se síranem sodným bezvodým R, nechá se stát a zfiltruje se.

Porovnávací roztok (a). Podle jedné z tabulek 2.4.22 se připraví 0,50 g směsi kalibračních látek tak, jak je předepsáno v příslušném článku (nezmiňuje-li se článek o určitém roztoku, použije se složení popsané v tab. 2.4.22-1). Rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí heptanem R na 10,0 ml.

1. Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
   1. - skleněné kolony nebo nerezové ocelové kolony délky 2 m až 3 m a vnitřního průměru 2 mm až 4 mm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii R (125 μm až 200 μm) impregnovanou 5 % až 15 % makrogolsukcinatu R nebo makrogoladipatu R,
   2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 25 ml/min,
   3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 180 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 200 °C. Pokud je to nutné nebo předepsané, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 5 °C/min ze 120 °C na 200 °C.

1. Chromatografický postup může být alternativně proveden za použití:
   1. - skleněné nebo křemenné kapilární kolony (je dávána přednost koloně se stěnami pokrytými kapalnou fází) délky 10 m až 30 m a vnitřního průměru 0,2 mm až 0,8 mm, jejíž vnitřní povrch je pokryt vrstvou poly[(kyanpropyl)(methyl)][(fenyl)(methyl)]siloxanu R nebo makrogolu 20 000 R (tloušťky 0,1 μm až 0,5 μm) nebo jinou vhodnou stacionární fází,
   2. - helia pro chromatografii R nebo vodíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1,3 ml/min (pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm),
   3. - plamenoionizačního detektoru,
   4. - dělicího poměru 1 : 100 nebo menšího, podle vnitřního průměru použité kolony (1 : 50 pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm).

Teplota kolony se udržuje na 160 °C až 200 °C podle délky a typu použité kolony (pro kolonu délky 30 m pokrytou makrogolem 20 000 R, 200 °C), teplota nástřikového prostoru a detektoru se udržuje na 250 °C. Je-li nutno nebo předepsáno, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 3 °C/min ze 170 °C na 230 °C (pro kolonu s makrogolem 20 000 R).

Nastříkne se 0,5 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače.

Určí se retenční časy jednotlivých mastných kyselin. Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b) a zkontroluje se poměr signálu k šumu pro pík odpovídající methylmyristatu.

Nastříkne se 0,5 μl až 1,0 μl zkoušeného roztoku. Zaznamenávají se chromatogramy podobu odpovídající 2,5násobku retenčního času methyloleatu. Chromatogramy se vyhodnotí, jak je uvedeno níže.

Použije-li se kalibrační směs 1 nebo 3, zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater (n) (2.2.28), počítáno pro pík odpovídající methylstearatu, nejméně 2000 pro náplňové kolony a nejméně 30 000 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (R_s) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloleatu a methylstearatu nejméně 1,25 pro náplňové a nejméně 1,8 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylmyristatu nejméně 5.

Použije-li se kalibrační směs 2, zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater (n) (2.2.28), počítáno pro pík odpovídající methyldekanoatu, nejméně 1500 pro náplňové kolony a nejméně 15 000 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (R_s) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloktanoatu a methyldekanoatu nejméně 2 pro náplňové a nejméně 4 pro kapilární kolony; na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylhexanoatu nejméně 5.

Vyhodnocení chromatogramu

Je třeba se vyvarovat pracovních podmínek, které umožňují vznik maskovaných píků (přítomnost složek s malými rozdíly v retenčních časech, jako u kyseliny linolenové a kyseliny arachidové).

Kvalitativní analýza. Sestrojí se kalibrační křivky za použití chromatogramu získaného s kalibračními roztoky a informací v tabulce 2.4.22-1:

1. a) za izotermických podmínek vynesením logaritmů redukovaných retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastné kyseliny; identifikují se píky pomocí takto získané přímky a „ekvivalentní délky řetězce“ pro různé píky. Kalibrační křivka nasycených kyselin je přímka. Logaritmy redukovaných retenčních časů nenasycených kyselin jsou umístěny na této přímce v bodech odpovídajících necelým číslům, která se nazývají „ekvivalentní délky řetězce“,
2. b) za podmínek lineárního teplotního programu vynesením retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastných kyselin; určení totožnosti se provede pomocí kalibrační křivky.

Kvantitativní analýza. Používá se obvyklý postup (metoda normalizace), při kterém součet ploch všech píků na chromatogramu, kromě píku rozpouštědla, je brán jako 100 %. Doporučuje se použití elektronického integrátoru. Obsah složky se vypočítá jako procentuální podíl plochy odpovídajícího píku z celkového součtu ploch všech píků. Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,05 % celkové plochy.

V některých případech, např. v přítomnosti mastných kyselin s 12 nebo méně uhlíkovými atomy, mohou být v jednotlivém článku předepsány korekční faktory převodu ploch píků na procenta.

Metoda B

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami nebo oleje s číslem kyselosti vyšším než 2,0.

Zkoušený roztok. Naváží se 0,100 g zkoušeného oleje do 10ml centrifugační zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Rozpustí se v 1 ml heptanu R a 1 ml dimethylkarbonatu R a opatrně se míchá za mírného zahřívání (50 °C až 60 °C). Ještě za tepla se přidá 1 ml roztoku sodíku R (12 g/l) v methanolu bezvodém R, který se připraví opatrně a intenzivně se míchá asi 5 min. Přidají se 3 ml vody destilované R a intenzivně se míchá asi 30 s. Zkumavka se odstřeďuje 15 min při 1500 g_n. Nastříkne se 1 μl organické fáze.

Porovnávací roztoky a vyhodnocení chromatogramu. Pokud není v článku uvedeno jinak, použije se postup uvedený v metodě A.

1. Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
   1. - křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm se stěnou pokrytou vrstvou makrogolu 20 000 R (tloušťka filmu 0,25 μm),
   2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 0,9 ml/min,
   3. - plamenoionizačního detektoru,
   4. - injektorové smyčky (1/100),
   5. s následujícím teplotním programem:

      2.4.22 Metoda A Vyhodnocení chromatogramu Metoda B

      	Čas (min)	Teplota (°C)	Rychlost (°C/min)	Poznámky
      kolona	0 - 15	100	-	izotermicky
      	15 - 36	100 → 225	10	lineární gradient
      	36 - 61	225	-	izotermicky
      nástřikový prostor		250
      detektor		250

Metoda C

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroperoxy-, aldehyd-, keton-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami a konjugovanými polynenasycenými nebo acetylenovými skupinami, protože dochází k částečnému nebo celkovému rozpadu těchto skupin.

Zkoušený roztok. V 25ml kuželové baňce se rozpustí 0,10 g zkoušeného oleje ve 2 ml roztoku hydroxidu draselného R (20 g/l) v methanolu R a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Zpětným chladičem se přidají 2,0 ml fluoridu boritého v methanolu RS, vaří se 30 min a pak se přidají 4 ml heptanu R a vaří se 5 min. Baňka se ochladí, přidá se 10,0 ml nasyceného roztoku chloridu sodného R, míchá se asi 15 s a přidá se takové množství nasyceného roztoku chloridu sodného R, aby vrchní vrstva vystoupila k hrdlu baňky. Z vrchní vrstvy se odeberou 2 ml a promyjí se třikrát 2 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

Porovnávací roztoky a vyhodnocení chromatogramů. Pokud není v článku uvedeno jinak, použije se postup uvedený v metodě A.

Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky*

Tab. 2.4.22-2 Kalibrační látky*

Tab. 2.4.22-3 Kalibrační látky*

1. “