Vyhláška Ministerstva zemědělství, kterou se stanoví požadavky na odběr vzorků a principy metod laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsob uchovávání vzorků

Příloha č. 1

Pomůcky a zařízení pro odběr vzorků krmiv, doplňkových látek a premixů

1. 1. K odběru dílčích vzorků se používají
   1. a) vertikální dvouplášťové vzorkovače, dělené nebo nedělené, s účinnou výškou odpovídající výšce vzorkované partie,
   2. b) jednoplášťové vzorkovače pro horizontální odběr vzorků,
   3. c) lopatky vhodných rozměrů s rovným dnem a okraji zdviženými do pravého úhlu,
   4. d) vzorkovací krabice vhodných rozměrů,
   5. e) mechanická zařízení, která jsou uváděna do pohybu obsluhou nebo se pohybují samostatně,
   6. f) násoska nebo čerpadlo s uzávěrem pro kontinuální odběr vzorku u tekutých nebo polotekutých krmiv.

1. 2. K odběru vzorků statkových objemných krmiv lze použít i jiné pomůcky a zařízení než jsou uvedeny v bodě 1.
2. 3. K redukci souhrnných a konečných vzorků lze použít děliče vzorků.
3. 4. Vzorky se odebírají a sestavují tak, aby nedošlo oproti vzorkované partii k nežádoucím změnám a aby nebyly znečištěny jinými materiály. Použité pomůcky a pracovní plochy, kde se vzorky zpracovávají, jakož i obaly musí být čisté a suché.

Příloha č. 2

Minimální počty dílčích vzorků*)

1. Materiály se rozumí krmiva, doplňkové látky a premixy.

Příloha č. 3

Minimální hmotnost souhrnného vzorku*)

Příloha č. 4

Minimální počet souhrnných vzorků pro stanovení nežádoucích a zakázaných látek a produktů

Příloha č. 5

Minimální hmotnost konečného vzorku*)

Příloha č. 6

Postup odběru vzorků krmiv, doplňkových látek a premixů

1. 1. Dílčí vzorky s výjimkou dílčích vzorků pro stanovení přítomnosti a obsahu nežádoucích látek, zakázaných látek a produktů, jakož i dílčích vzorků pro stanovení homogenity a posouzení pracovní přesnosti míchacích zařízení se odebírají nahodile tak, aby zahrnovaly celou vzorkovanou partii. Hmotnost nebo objem jednotlivých odebraných dílčích vzorků je přibližně stejný. Při odběru dílčích vzorků se dále dodržuje:
   1. a) U krmiv v obalech nad 100 kg se každý obal hypoteticky rozdělí na přibližně stejné díly v takovém počtu, kolik dílčích vzorků je stanoveno odebrat podle přílohy č. 2 ve sloupci 2. Obdobně se postupuje při odběru vzorků v případě, že je partie vzorkovaná z toku krmiva dynamickým způsobem nebo u volně ložených krmiv.
   2. b) U krmiv, doplňkových látek a premixů v obalech se odebírá z každého obalu určeného pro vzorkování nejméně jeden dílčí vzorek; obsah obalu se odděleně vyprázdní a poté se odebere dílčí vzorek.
   3. c) U tekutých nebo polotekutých krmiv se odebírají dílčí vzorky po rovnoměrném promíchání obsahu obalů určených k odběru dílčích vzorků. Z každého obalu se odebírá nejméně jeden dílčí vzorek. Obdobně se postupuje při odběru dílčích vzorků v případě, že partie je vzorkovaná z toku krmiva dynamickým způsobem.
   4. d) U tekutých nebo polotekutých krmiv, která nelze rovnoměrně promíchat, se odebírají dílčí vzorky z různých hloubek obalů. Ustanovení se nevztahuje na odběr tekutých a polotekutých krmiv v případě odběru vzorků z toku krmiva dynamickým způsobem, při němž se zpravidla u těchto krmiv neodebírají dílčí vzorky v počáteční fázi toku krmiva. V těchto případech však objem souhrnného vzorku musí být nejméně 10 litrů.
   5. e) U krmiv v blocích nebo u lizů se odebírá jeden díl z každého bloku nebo lizu určeného pro odběr vzorku.
   6. f) U pastevních porostů se za dílčí vzorek považuje jedna plná hrst porostu.

1. 2. Partie krmiv, doplňkových látek a premixů, u kterých má být stanovena přítomnost nebo obsah nežádoucích a zakázaných látek a produktů, se rozděluje do přibližně stejných dílů, odpovídajících předpokládanému počtu souhrnných vzorků podle přílohy č. 3 ve sloupci 2. Celkový počet dílčích vzorků stanovený podle přílohy č. 2 ve sloupci 2 se rovnoměrně rozděluje na všechny díly vzorkované partie. Dílčí vzorky z jednotlivých dílů nelze smíchávat.
2. 3. Dílčí vzorky z každého jednotlivého dílu vzorkované partie odebrané podle bodu 2 se skládají do souhrnného vzorku, který se samostatně upraví, a podle plánu vzorkování míst odběru dílčích vzorků se označí příslušným číslem dílu partie, ze které vznikly.
3. 4. Souhrnné vzorky se upravují promícháním, až jsou rovnoměrné. Pokud se v souhrnném vzorku vyskytují hrudky, odděleně se rozdrtí a následně promíchají se zbývající částí souhrnného vzorku. Hmotnost nebo objem souhrnného vzorku se zmenšuje mechanickým děličem nebo čtvrcením až na hmotnost dva kilogramy nebo na objem dva litry.
4. 5. Dílčí vzorky pro posouzení homogenity partie se odebírají z nahodile vybraných obalů nebo u volně ložených krmiv z nahodile vybraných míst, které jsou rovnoměrně rozloženy po celé vzorkované partii. Počet odebíraných dílčích vzorků z partie je uveden v příloze č. 14.
5. 6. Dílčí vzorky pro posouzení pracovní přesnosti míchacího zařízení se odebírají tak, aby jejich odběr byl rovnoměrně rozmístěn po celé ploše prostoru míchacího zařízení nebo při vzorkování mimo míchací prostor byl rovnoměrně rozložen podle počtu vzorkovaných obalů nebo vzorkované hmotnosti.
6. 7. Metody odběru vzorků k provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a určování dioxinům podobných PCB v některých krmivech jsou uvedeny v příloze č. 18 části 1.

Příloha č. 7

Úprava konečných vzorků krmiv, doplňkových látek a premixů k laboratornímu zkoušení

1. 1. Obecné postupy úpravy vzorků
   1. 1.1. Krmiva, doplňkové látky a premixy se upravují podle požadavku na jejich zkoušení. Úprava vzorků se volí podle jejich konzistence, struktury, vlhkosti a obsahu tuku.
   2. 1.2. Konečný vzorek se důkladně promíchá na suché, hladké a čisté podložce. Pak se kvartací po rozprostření do nízké vrstvy a postupném odstraňování dvou protilehlých částí děleného vzorku nebo pomocí mechanického děliče rozdělí na dva stejné díly. Podle hmotnosti konečného vzorku se dělení na dva stejné díly opakuje tak dlouho, až jeden díl odpovídá hmotnosti, nezbytné pro zkušební vzorek. K dělení konečného vzorku je možno použít i rotační dělič. Hmotnost zkušebního vzorku musí reprezentovat minimálně 100 g sušiny konečného vzorku. Jestliže hmotnost konečného vzorku nepřesahuje 500 g sušiny vzorku, považuje se celý konečný vzorek za část, ze které bude připraven zkušební vzorek a nemusí být jeho hmotnost redukována. U konečného vzorku, který nelze dokonale promíchat bez předchozí úpravy velikosti částic, je nutné nejdříve celý vzorek vhodně upravit tak, aby byl velikostí částic stejnorodý. Úpravy se mohou týkat předsušení, odtučnění, rozřezání apod. Toto ustanovení se nevztahuje na konečné vzorky pro posouzení obsahu nežádoucích látek, homogenity a pracovní přesnosti míchacího zařízení.
   3. 1.3. Konečný vzorek mimo části, která byla vyčleněna jako zkušební vzorek, se uloží do vhodné, čisté, suché, vzduchotěsně uzavíratelné nádobky. Ponechá se bez úpravy a slouží pro smyslové nebo fyzikální zkoušky, případně pro mikroskopické vyšetření apod.
   4. 1.4. Zkušební vzorek se upravuje mletím tak, aby navážky požadované pro jednotlivé zkoušky byly homogenní a representovaly konečný vzorek. Zkušební vzorek po úpravě musí obsahovat částice, které propadnou drátěným sítem o velikosti strany oka 1 mm, není-li stanoveno jinak.
   5. 1.5. Stanovuje-li se obsah původní vlhkosti konečného vzorku, je nutné ihned po otevření obalu vzorku oddělit část pro toto stanovení, nebyla-li již oddělena při vzorkování, a provést potřebnou úpravu.
   6. 1.6. Konečné vzorky pro posouzení obsahu nežádoucích látek se předem smyslově posoudí, provedou se případné fyzikální a speciální zkoušky a konečný vzorek se jako celek upravuje tak, aby částice propadly drátěným sítem o velikosti strany oka 1 mm, a poté se dokonale promíchá tak, aby navážky požadované pro jednotlivé zkoušky byly homogenní a reprezentovaly konečný vzorek. Z takto upraveného vzorku se připravují navážky pro jednotlivé zkoušky.
   7. 1.7. Konečné vzorky pro posouzení homogenity a pro posouzení pracovní přesnosti míchacího zařízení se nejprve jako celek upravují tak, aby částice propadly drátěným sítem o velikosti strany oka 1 mm, a poté se dokonale promíchají tak, aby navážky pro jednotlivé zkoušky byly homogenní a reprezentovaly konečný vzorek. Z takto upravených vzorků se připravují navážky pro jednotlivé zkoušky.

1. 2. Úprava konečného vzorku předsoušením

   Jestliže příprava vzorku nemůže být provedena bez významných změn obsahu vlhkosti vzorku, musí být provedeno stanovení obsahu vlhkosti před přípravou vzorku a po ní podle následující metody zkoušení.

   1. Pracovní postup:

      Konečný vzorek se odsype na čistou vysoušecí misku a rozprostře se rovnoměrně po celé ploše tak, aby výška vrstvy byla maximálně 20 mm. Z konečného vzorku se odebírá takové množství, aby se předsoušením získalo asi 200 g předsušeného vzorku. Misky se vzorkem se suší při teplotě (55 ± 5) °C, až do získání pevné drtitelné konzistence, přičemž se periodicky vzorek promíchává. Po předsušení se vzorek ponechá na misce vychladnout a asi 12 hodin kondicionovat do rovnovážné laboratorní vlhkosti. Během sušení i kondicionace nesmí dojít ke ztrátám rozprášením nebo k nežádoucímu znečištění vzorku. Z takto upraveného konečného vzorku se upraví zkušební vzorek podle odstavce 1.4. této přílohy.

1. 3. Speciální postupy úpravy vzorků
   1. 3.1. Úprava konečného vzorku odtučněním

      Účel, rozsah a princip

      U suchých vzorků s relativně vysokým obsahem tuku je nutné před vlastní přípravou provést jejich odtučnění částečnou extrakcí. Podstatou tohoto způsobu úpravy je částečné odtučnění vzorku za účelem snížení obsahu tuku. Větší podíl tuku se odextrahuje diethyletherem, petroletherem nebo hexanem a rozbor vzorku se provede v částečně odtučněném vzorku. Obsahy složek, zjištěné rozborem částečně odtučněného vzorku, se přepočtou na obsahy v konečném neodtučněném vzorku. K odtučnění vzorku se používá extrakční zařízení v bezpečnostním provedení (Soxhlet apod.).

   1. 3.2. Úprava konečného vzorku předsoušením s nasávací hmotou

      Účel, rozsah a princip

      Postup se používá u vzorků řídké konzistence, u kterých vysoký obsah tuku neumožňuje přímé předsoušení. Vzorek se upraví vhodným nasávacím materiálem (např. pilinami z tvrdého dřeva, nejlépe bukového), předem zanalyzovanými na obsahy všech složek, které mají být stanoveny. Podstatou tohoto způsoby úpravy je nasátí tukové složky krmiva do nasávacího materiálu, který tuk neobsahuje a tím snížení poměrného zastoupení tuku ve vzorku. Obsahy složek, stanovených ve směsi vzorku a nasávací hmoty se přepočítávají na obsahy v konečném vzorku.

   1. 3.3.Úprava konečného vzorku mixováním

      Účel, rozsah a princip

      Pokud se krmivo zkouší v původním stavu bez předsoušení a má tekutou pastovitou strukturu, provede se úprava vzorku mixováním. Mixuje se tak dlouho, až nejsou patrny zjevné rozdíly ve velikosti částic nebo v různorodosti materiálu.

   1. 3.4. Úprava konečného vzorku drcením

      Účel, rozsah a princip

      Pokud krmivo vykazuje hrudkovitou strukturu nebo je ve formě granulí nebo výlisků, které zabraňují předsoušení nebo mletí, provede se úprava drcením.

   1. 3.5. Úprava konečného vzorku s obsahem močoviny

      Účel, rozsah a princip

      Pokud krmivo obsahuje více než 5 g močoviny v 1 kg, upravuje se celý nezmenšený konečný vzorek mletím podle postupu, uvedeném v odstavci 1.4. této přílohy. Zkušební vzorek se získá po promíchání a následné kvartaci vzorku upraveného mletím.

   1. 3.6. Úprava konečného vzorku živočišného nebo rostlinného tuku a oleje

      Účel, rozsah a princip

      Zkušební vzorek se získá ze zhomogenizovaného konečného vzorku. Jestliže to postup zkoušky vyžaduje, izolují nerozpustné částice filtrací a voda se odstraní sušením bezvodým síranem sodným. Metoda není vhodná pro emulgované tuky.

   1. 3.7. Postupy přípravy vzorků a požadavky na analytické metody používané k provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů v některých krmivech jsou uvedeny v příloze č. 18 části 2

Příloha č. 8

Uchovávání vzorků krmiv, doplňkových látek a premixů

1. 1. Uskladnění konečných a zkušebních vzorků se zajišťuje tak, aby nedocházelo ke změnám sledovaných znaků, kromě znaků, u kterých nelze změně zabránit, jako je číslo kyselosti tuku, přítomnost škůdců, mikrobiální hodnoty, obsahy specificky účinných látek podléhajících rozkladu, pach apod.

   Konzervační prostředky nebo přípravky proti škůdcům mohou být použity, pokud neovlivní sledované jakostní znaky.

1. 1.1. Vzorky, které jsou určeny pro laboratorní zkoušení obsahu vitaminů nebo na světlo citlivých substancí, musí být uchovány v obalech, které zabrání přístupu světla.
2. 1.2. Teplota skladovacího prostoru by neměla přestoupit 25 °C a relativní vlhkost vzduchu by neměla být vyšší než 60 %.
3. 1.3. Vzorky živočišných a rostlinných tuků a olejů se uchovávají v inertním a vzduchotěsném obalu v chladničce, při teplotě max. 10 °C a chráněny před světlem. Přednostně se uchovává ta část konečného vzorku, která nebyla podrobena zkouškám, ovlivňujícím její složení. Za výše uvedených podmínek se vzorky uchovávají 6 měsíců ode dne doručení vzorku do laboratoře. Po této době se považují za vzorky podléhající zkáze.

Příloha č. 9

Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

1. 1. Vlhkost, těkavé látky
   1. 1.1. Stanovení obsahu vlhkosti

      Účel, rozsah a princip

      Metoda umožňuje stanovení obsahu vlhkosti v krmivech.

      Metoda není vhodná pro stanovení obsahu vlhkosti v mléčných produktech pro přímé zkrmování, pro minerální látky a směsi, které jsou tvořeny převážně minerálními látkami, pro živočišné a rostlinné tuky a oleje nebo pro analýzy olejnatých semen a plodů.

      Vzorky se suší za předepsaných podmínek, které závisí na původu krmiva. Obsah vlhkosti se stanoví vážkově jako úbytek hmotnosti. U pevných krmiv s vysokým obsahem vlhkosti je nutné provést předsoušení.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 0,2 %.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 1.2. Stanovení obsahu vlhkosti v olejích a tucích

      Účel, rozsah a princip

      Metoda umožňuje stanovení obsahu vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

      Vzorek je sušen do konstantní hmotnosti při 103 °C. Úbytek hmotnosti je zjištěn vážením.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 0,05 %.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

1. 2. Dusíkaté sloučeniny
   1. 2.1. Stanovení obsahu dusíkatých látek

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu dusíkatých látek v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla.

      Vzorek se mineralizuje horkou kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje odměrným roztokem hydroxidu sodného.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dusíkatých látek:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 20 %	0,2 %
      od 20 do 40 %	1 % relat.
      nad 40 %	0,4 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena

   1. 2.2. Stanovení obsahu bílkovin

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu bílkovin v krmivech a je použitelný pro všechna krmiva organického původu.

      Obsah bílkovin se stanoví metodou podle Barnsteina po jejich oddělení od dusíkatých látek nebílkovinného původu vysrážením mědnatou solí.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.3. Stanovení obsahu aminokyselin

      Účel, rozsah a princip

      Tato metoda slouží ke stanovení obsahu volných (syntetických a přirozených) a veškerých (vázaných peptidickou vazbou a volných) aminokyselin v krmivech za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je vhodná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.

      Tato metoda nerozlišuje mezi solemi aminokyselin a nemůže také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není vhodná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.

      Volné aminokyseliny

      Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekulární látky se srážejí kyselinou sulfosalicylovou a odstraňují se filtrací. Zfiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.

      Veškeré aminokyseliny

      Zvolený postup závisí na stanovovaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin se musí před hydrolýzou oxidovat na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 se mohou stanovovat buď v oxidovaném nebo v neoxidovaném vzorku.

      Oxidace se provádí při 0 °C směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží disiřičitanem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (c = 6 mol/l) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).

      Opakovatelnost

      Hodnoty opakovatelnosti pro různé aminokyseliny a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.

      Reprodukovatelnost

      Hodnoty reprodukovatelnosti pro různé aminokyseliny a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.

   1. 2.4. Stanovení obsahu močoviny

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu močoviny v krmivech s aditivním obsahem této látky.

      Obsah močoviny se stanoví, po vyčeření vodního výluhu vzorku Carresovými činidly, reakcí s p-dimethylaminobenzaldehydem spektrofotometricky při vlnové délce 420 nm.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.5. Stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek

      Účel, rozsah a princip

      1. A. Mikrodifúze

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek vyjádřených jako amoniak v krmivech.

         Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a zfiltruje se. Těkavé dusíkaté báze se po přidání roztoku uhličitanu draselného vytěsní a mikrodifuzí se zachycují v roztoku kyseliny borité a titrují se kyselinou sírovou.

      1. B. Destilace

         Účel, rozsah a princip

         Metoda umožňuje stanovení obsahu těkavých dusíkatých látek, vyjádřených jako amoniak, v rybí moučce, která neobsahuje prakticky žádnou močovinu. Metoda je použitelná pouze u obsahů nižších než 0,25 % amoniaku.

         Vzorek se extrahuje vodou, roztok se vyčeří a zfiltruje se. Těkavé dusíkaté báze se vytěsní za varu po přidání oxidu hořečnatého a zachycují se v předepsaném množství kyseliny sírové. Přebytek kyseliny sírové se titruje roztokem hydroxidu sodného.

      Opakovatelnost

      Mikrodifúze

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu těkavých dusíkatých látek:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 1,0 %	10,0% relat.
      nad 1,0 %	0,1 %

      Destilace

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit pro všechny obsahy těkavých dusíkatých látek 10,0 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.6. Stanovení aktivity ureázy v sóji a jejích produktech

      Účel, rozsah a princip

      Postup specifikuje podmínky pro stanovení aktivity ureázy v sóji a jejích produktech pro ověření, zda tyto produkty byly tepelně upravovány po dostatečně dlouhou dobu. Aktivita ureázy se stanoví určením množství amoniakálního dusíku, uvolněného z roztoku močoviny jedním gramem zkoušeného vzorku za jednu minutu při teplotě 30 °C.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.7. Ureázový test

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení aktivity ureázy v soji a jejích produktech.

      Aktivita ureázy se stanoví titračně alkalimetricky určením množství amoniaku, uvolněného z roztoku močoviny ureázou ze zkoušeného vzorku za 1 hodinu.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.8. Stanovení obsahu biuretu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu biuretu v močovině.

      Metoda je založena na tvorbě barevného komplexu biuretu se síranem měďnatým a měření absorbance vybarveného roztoku při vlnové délce 540 nm.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 0,03 %.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.9. Stanovení obsahu hydroxyanalogu methioninu

      Účel, rozsah a princip

      Obsah hydroxyanalogu methioninu se stanoví po extrakci vzorku směsí voda-acetonitril a následné hydrolýze metodou HPLC na reverzní fázi s použitím UV detekce.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.10. Stanovení obsahu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda je použitelná pro stanovení podílu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu a kyseliny chlorovodíkové za definovaných podmínek.

      Vzorek krmiva v roztoku zředěné kyseliny chlorovodíkové a pepsinu se zahřívá po dobu 48 hodin na teplotu 40 °C. Suspense se zfiltruje a ve filtrátu se stanoví obsah dusíkatých látek metodou 2.1.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dusíkatých látek rozpustných působením pepsinu:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 20 %	0,4 %
      od 20 do 40 %	2 % relat.
      nad 40 %	0,8 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.11. Stanovení aktivity pepsinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení aktivity pepsinu, který se používá k určení obsahu dusíkatých látek rozpustných působením roztoku pepsinu v kyselině chlorovodíkové.

      Na hemoglobin se působí roztokem zředěné kyseliny chlorovodíkové a pepsinu za definovaných podmínek. Nezhydrolyzovaný podíl dusíkatých látek se vysráží kyselinou trichloroctovou. K filtrátu se přidá hydroxid sodný a Folin-Ciocalteuovou činidlo. Zabarvení roztoku se proměří při 750 nm a odpovídající množství tyrosinu se odečte z kalibrační křivky.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.12. Stanovení obsahu methioninu v premixech

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu methioninu v premixech.

      Obsah methioninu se stanoví po extrakci vzorku fosfátovým pufrem a následné reakci s jodem za vzniku komplexu methionin - jod při pH 6,5. Komplex se reverzibilně rozkládá při pH 1 zpět na jod a methionin. Uvolněný jod se stanoví titračně jodometricky.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 2.13. Stanovení obsahu tryptofanu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Metoda nerozlišuje mezi D- a L-formou.

      Pro stanovení obsahu celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek hydroxidem barnatým při 110 °C po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidá interní standard.

      Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek za přítomnosti vnitřního standardu.

      Tryptofan v hydrolyzátu nebo extraktu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat. z vyššího výsledku.

      Reprodukovatelnost

      Hodnoty reprodukovatelnosti pro a různá krmiva jsou součástí úplného znění metody.

1. 3. Tuk
   1. 3.1. Stanovení obsahu oleje a tuku

      Účel, rozsah a princip

      Touto metodou se stanoví obsah tuku v krmivech. Metoda se nevztahuje na analýzu olejnatých semen a plodin.

      1. Podle druhu a složení krmiva se pro analýzu použije jeden ze dvou následujících postupů:
         1. Postup A – přímo extrahovatelné tuky

            Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu, s výjimkou těch, které jsou uvedeny v postupu B.

         1. Postup B – celkový obsah tuku

            Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Používá se pro všechny materiály, z nichž není možno tuk úplně extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepky, kvasnice, bramborové proteiny a výrobky, které byly podrobeny zpracování, jako vytlačování, vločkování a zahřívání).

      1. 1.1. Interpretace výsledků

         Ve všech případech, kdy se dosáhlo vyššího výsledku postupem B, než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu podle postupu B.

         1. Postup A

            Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje a zbytek se vysuší a zváží.

         1. Postup B

            Vzorek se zahřívá s kyselinou chlorovodíkovou. Směs se ochladí a zfiltruje. Promytý a usušený zbytek se pak zpracuje podle postupu A.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu tuku:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 5 %	0,2 %
      od 5 do 10 %	4 % relat. z vyššího výsledku
      nad 10 %	0,4 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 3.2. Stanovení čísla kyselosti tuku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení čísla kyselosti tuku v krmivech.

      Číslo kyselosti tuku se stanoví titračně alkalimetricky, po rozpuštění tuku vyextrahovaného z krmiva směsí extrakčního činidla a ethanolu. Způsob extrakce tuku závisí na druhu zkoušeného krmiva.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku pro hodnoty větší než 4 mg KOH/g (resp. 0,07 mmol/g) nesmí překročit 5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí při hodnotě nad 4 mg KOH/g tuku překročit hodnotu 15 % relat.

   1. 3.3. Stanovení obsahu nerozpustných nečistot v tucích a olejích

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu nerozpustných nečistot v živočišných a rostlinných tucích nebo olejích.

      Obsah nerozpustných nečistot se stanoví rozpuštěním vzorku v přebytku n - hexanu nebo petroletheru nebo diethyletheru, filtrací získaného roztoku a zvážením vysušeného filtru s nerozpustnými nečistotami.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu nerozpustných nečistot:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 0,3 %	0,02 %
      nad 0,3 %	0,05 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 3.4. Stanovení obsahu nezmýdelnitelných látek v tucích a olejích

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení nezmýdelnitelného podílu v živočišných a rostlinných tucích a olejích. Metoda není použitelný pro vosky a dává přibližné výsledky u určitých tuků s vyšším obsahem nezmýdelnitelného podílu, např. u tuků pocházejících z mořských živočichů.

      Tuk nebo olej se zmýdelní varem s ethanolickým roztokem hydroxidu draselného pod zpětným chladičem. Nezmýdelnitelný podíl se vyextrahuje z roztoku mýdla diethyletherem a po oddestilování rozpouštědla a vysušení se zváží.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu nezmýdelnitelných látek:

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         do 5 %	0,05 %
         od 5 do 10 %	0,1 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 3.5. Stanovení peroxidového čísla

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení peroxidového čísla v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

      Peroxidové číslo se určí reakcí chloroformového extraktu vzorku s jodidem draselným v roztoku kyseliny octové a chloroformu a následnou titrací uvolněného jodu odměrným roztokem thiosíranu sodného.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při hodnotě peroxidového čísla:

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         méně než 0,5 mmol/kg	0,1 mmol/kg
         od 0,5 do 3 mmol/kg	0,2 mmol/kg
         od 3 do 6 mmol/kg	0,5 mmol/kg
         větší než 6 mmol/kg	1,0 mmol/kg

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 3.6. Stanovení obsahu lecitinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda je určen ke stanovení obsahu lecitinu v technických a potravinářských produktech.

      Stanoví se obsah látek rozpustných v acetonu, obsah látek nerozpustných v benzenu nebo toluenu a obsah vody s těkavými látkami a jejich součet se odečte od 100.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 1 %.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 3.7 Stanovení obsahu mastných kyselin

      Účel, rozsah a princip

      Metoda určuje podmínky pro stanovení obsahu jednotlivých mastných kyselin v krmivech.

      Mastné kyseliny se stanovují ve formě svých methylesterů metodou plynové chromatografie.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 13 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit hodnotu 31 % relat.“

1. 4. Polysacharidy
   1. 4.1. Stanovení obsahu vlákniny

      Účel, rozsah a princip

      Metoda umožňuje stanovit v krmivech organické látky, které neobsahují tuk a jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a louhu a jsou nazývány vláknina.

      Vzorek se, pokud je to nutné, odtuční a potom se na něj působí postupně vroucím roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek je oddělen filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyt, vysušen, zvážen a spálen při teplotě 475 – 500 °C. Úbytek váhy po spálení odpovídá obsahu vlákniny ve zkoušeném vzorku.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit pro obsah vlákniny:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 10 %	0,3 %
      nad 10 %	3 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

1. 5. Bezdusíkaté látky výtažkové
   1. 5.1. Stanovení obsahu škrobu

      Účel, rozsah a princip

      Tato metoda dává možnost stanovit hladiny škrobu a vysokomolekulárních degradačních produktů škrobu v krmivech za účelem kontroly obsahu metabolizovatelné energie podle přílohy č. 28 vyhlášky č. 451/2000 Sb., ve znění vyhlášky č. 184/2004 Sb. a kontrolu požadavků podle přílohy č. 11 téže vyhlášky.

      Metoda zahrnuje dvě stanovení. Nejprve je vzorek podroben působení horké zředěné kyseliny chlorovodíkové. Po vyčeření a filtraci je optická rotace roztoku měřena polarimetricky.

      Potom je vzorek extrahován 40 % ethanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčeření a filtraci je optická rotace roztoku měřena polarimetricky.

      Rozdíl mezi těmito dvěma měřeními násobený známým faktorem udává obsah škrobu ve vzorku.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit pro obsahy škrobu:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 40 %	0,4 %
      nad 40 %	1 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.
   1. 5.2. Stanovení obsahu cukrů

      Účel, rozsah a princip

      Tato metoda umožňuje stanovit množství redukujících cukrů a celkové cukry po inverzi vyjádřené jako glukosa nebo určené jako sacharosa použitím faktoru 0,95. Je použitelná pro krmné směsi. Pro ostatní krmiva jsou používány speciální metody. Je-li to nutné, může být zjištěn obsah laktosy zvlášť a potom zahrnut do celkového výsledku.

      Cukry jsou extrahovány zředěným ethanolem. Roztok je vyčiřen Carrezovými činidly I a II. Odstraní se ethanol a množství cukru před a po inversi se určí Luff-Schoorlovou metodou.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 5.3. Stanovení obsahu laktosy

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu laktosy v krmivech. Metoda je použitelný pro krmiva obsahující více než 0, 5 % laktosy.

      Cukry se vyextrahují ze vzorku vodou, extrakt se vystaví fermentačnímu účinku kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které ponechají laktosu v nezměněném stavu. Po vyčeření Carresovými činidly se laktosa stanoví titračně jodometricky podle Luff-Schoorla.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 5.4. Stanovení obsahu bezdusíkatých látek výtažkových výpočtem

      Účel, rozsah a princip

      Metoda uvádí způsob výpočtu obsahu bezdusíkatých látek výtažkových z výsledků stanovení základních složek krmiv, a to vlhkosti, dusíkatých látek (N x 6,25), tuku, popele a vlákniny, případně močoviny a amoniaku.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

1. 6. Popel
   1. 6.1. Stanovení obsahu popele

      Účel, rozsah a princip

      Tato metoda dává možnost stanovit obsah popela v krmivech.

      Vzorek je zpopelněn při 550 °C a zbytek je zvážen.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 6.2. Stanovení obsahu popele nerozpustného v kyselině chlorovodíkové

      Účel, rozsah a princip

      Metoda umožňuje stanovení obsahu minerálních látek, nerozpustných v kyselině chlorovodíkové v krmivech. Podle původu vzorku mohou být použity dvě různé metody.

      Metoda A: použitelná pro organická krmiva a pro většinu krmných směsí. Vzorek se zpopelní, popel se povaří s kyselinou chlorovodíkovou a nerozpuštěný zbytek se zfiltruje a zváží.

      Metoda B: použitelná pro minerální suroviny nebo minerální doplňková krmiva a krmné směsi s obsahem látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové, stanovených metodou A, vyšší než 1 %.

      Vzorek se rozpouští v kyselině chlorovodíkové. Roztok se zfiltruje, zbytek na filtru se zpopelní a dále se postupuje podle metody A.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

1. 7. Makroprvky
   1. 7.1. Stanovení obsahu fosforu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu fosforu v krmivech.

      Je zvláště vhodná pro analýzu látek s nízkým obsahem fosforu. V určitých případech (produktech bohatých na fosfor) je vhodné použít vážkovou metodu.

      Vzorek je mineralizován a převeden do kyselého roztoku, buď suchým spalováním (v případě organických krmiv), nebo kyselou digescí (v případě minerálních sloučenin a kapalných krmiv). Roztok je podroben působení molybdátovanadátového činidla. Absorbance takto vzniklého žlutého roztoku je měřena spektrofotometricky při 430 nm.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními spektrofotometrickými stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu fosforu:

      Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

      do 5 %	3 % relat.
      nad 5 %	0,15 %

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 7.2. Stanovení obsahu hořčíku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu hořčíku v krmivech. Metoda je vhodná zejména pro obsahy do 5 %.

      Vzorek po zpopelnění je rozpuštěn v kyselině chlorovodíkové. Jestliže nejsou přítomny organické látky, je vzorek rozpuštěn přímo v kyselině chlorovodíkové. Roztok je naředěn a obsah hořčíku je stanoven atomovou absorpční spektrofotometrií při 285,2 nm pomocí standardních roztoků.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 7.3. Stanovení obsahu draslíku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu draslíku v krmivech.

      Vzorek je zpopelněn, popel rozpuštěn v kyselině chlorovodíkové. Obsah draslíku v roztoku je stanoven plamenovou fotometrií v přítomnosti chloridu cesného a dusičnanu hlinitého. Přídavek těchto látek z velké části odstraňuje interferenci rušivých prvků.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 7.4. Stanovení obsahu sodíku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu sodíku v krmivech.

      Vzorek je zpopelněn, popel rozpuštěn v kyselině chlorovodíkové. Obsah sodíku v roztoku je stanoven plamenovou fotometrií v přítomnosti chloridu cesného a dusičnanu hlinitého. Přídavek těchto látek z velké části odstraňuje interferenci rušivých prvků.

      Opakovatelnost

      Nestanovena

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena

   1. 7.5. Stanovení obsahu ve vodě rozpustných chloridů

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení ve vodě rozpustných chloridů (vyjádřených jako chlorid sodný) v krmivech. Je vhodná pro všechna krmiva.

      Chloridy jsou rozpuštěny ve vodě. Jestliže produkt obsahuje organické látky, je vyčeřen. Roztok je slabě okyselen kyselinou dusičnou a chloridy jsou vysráženy jako chlorid stříbrný přídavkem roztoku dusičnanu stříbrného. Přebytek dusičnanu stříbrného je titrován roztokem thiokyanatanu amonného podle Volharda.

      Opakovatelnost

      Nestanovena

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena

   1. 7.6. Stanovení obsahu celkových uhličitanů

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu uhličitanů (vyjádřeno jako uhličitan vápenatý) ve většině krmiv.

      Obsah celkových uhličitanů se stanoví po rozkladu vzorku kyselinou chlorovodíkovou a vzniklý oxid uhličitý se změří v kalibrované trubici a jeho objem se porovná s objemem plynu uvolněného za stejných podmínek ze známého množství uhličitanu vápenatého.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 7.7. Stanovení celkového obsahu síry

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu síry v krmivech. Je vhodný pro všechny obsahy síry v krmivech.

      Obsah síry se stanoví v chloridovém výluhu po zpopelnění vzorku vážkově jako síran barnatý.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

   1. 7.8. Stanovení obsahu vápníku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda umožňuje stanovení obsahu vápníku v krmivech.

      Vzorek se zpopelní, popel se rozpustí v kyselině chlorovodíkové a vápník se vysráží jako šťavelan vápenatý. Sraženina se rozpustí v kyselině sírové a uvolněná kyselina šťavelová se titruje manganistanem draselným.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

1. 8. Mikroprvky
   1. 8.1. Stanovení obsahů železa, mědi, manganu a zinku

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu železa, mědi, manganu a zinku.

      Vzorek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové, nebo se jinak odstraní organická matrice. Železo, měď, mangan a zinek se po vhodném naředění stanoví atomovou absorpční spektrofotometrií.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu mědi, železa, manganu a zinku:

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         do 50 mg/kg	5 mg/kg
         od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
         od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
         nad 200 mg/kg	5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti pro stanovení železa je 20 mg/kg, pro stanovení mědi je 10 mg/kg, pro stanovení manganu je 20 mg/kg, pro stanovení zinku je 20 mg/kg.

   1. 9. Kyselost
      1. 9.1. Stanovení volné, vázané a celkové kyselosti vodního výluhu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení volné, vázané i celkové kyselosti vodního výluhu. Je použitelný pro všechna krmiva.

         Volná kyselost vodního výluhu se stanoví přímo alkalimetrickou titrací vodního výluhu vzorku do hodnoty pH = 8,5 nebo na indikátor fenolftalein.

         Vázaná kyselost vodního výluhu se stanoví po uvolnění vazeb vnitřní neutralizace formaldehydem alkalimetrickou titrací do hodnoty pH = 8,5 nebo na indikátor fenolftalein.

         Celková kyselost vodního výluhu se určí součtem výsledků volné a vázané kyselosti vodního výluhu.

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 9.2. Stanovení kyselosti vodního výluhu v mléčných krmných směsích

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení kyselosti vodního výluhu v mléčných krmných směsích. Je použitelný pro všechny druhy mléčných krmných směsí a všechny obsahy kyselosti.

         Kyselost vodního výluhu se stanoví ve vodním výluhu vzorku přímo alkalimetrickou titrací na indikátor fenolftalein pomocí určení bodu ekvivalence srovnávacím roztokem kobaltnaté soli.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

   1. 10. Nežádoucí látky
      1. 10.1. Stanovení obsahu kyanovodíku

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu kyanovodíku volného i vázaného v glukosinolátech v krmivech, zejména v lněném semeni, maniokové mouce a v některých druzích bobů.

         Vzorek se rozmíchá ve vodě, kyanovodík se uvolní enzymaticky a vodní parou se předestiluje do okyseleného roztoku dusičnanu stříbrného. Kyanid stříbrný se oddělí filtrací a zbylý dusičnan stříbrný se stanoví titračně thiokyanatanem amonným.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.2. Stanovení obsahu glukosinolátů v řepce

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení nejdůležitějších glukosinolátů v řepce a jejích produktech.

         Glukosinoláty se extrahují horkým methanolem a po přečistění a enzymatické desulfataci na ionexové pryskyřici se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elučním gradientem a UV detekcí.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.3. Stanovení obsahu 5-vinyl-2-thiooxazolidonu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vinylthiooxazolidonu (VOT) v krmivech a je použitelný pro obsahy od 200 mg/kg.

         Ze vzorku krmiva je enzymaticky uvolněn 2-hydroxy-3-butenyl-isothiokyanát, ze kterého vzniká VOT a jeho obsah se stanoví metodou plynové chromatografie (GC) nebo vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu vinylthiooxazolidonu.

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         do 1000 mg/kg	24 mg/kg
         od 1 000 do 1 500 mg/kg	36 mg/kg
         nad 1 500 mg/kg	45 mg/kg

         Reprodukovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí pro všechny obsahy 5-vinyl-2-thiooxazolidonu překročit 20 % relat.

      1. 10.4. Stanovení obsahu kyseliny erukové

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení kyseliny erukové ve všech druzích rostlinných tuků a olejů různého stupně čištění. Obsah kyseliny erukové (kyselin cis, trans-11 dokosenové a cis, trans 13-dokosenové) je vyjádřen jako hmotnostní podíl mastných kyselin C 22: 1 z celého spektra mastných kyselin ve vzorku.

         Obsah kyseliny erukové se stanoví po esterifikaci mastných kyselin metodou plynové chromatografie.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.5. Stanovení obsahu olova a kadmia

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu olova a kadmia v krmivech. Metoda není vhodná pro premixy.

         Obsah olova a kadmia se stanoví po mineralizaci vzorku metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými metodou AAS na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu olova.

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         od 1 do 3 mg/kg	25 % relat.
         od 3 do 10 mg/kg	0,75 mg/kg
         nad 10 mg/kg	7,5 % relat.

         Reprodukovatelnost

         1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými metodou AAS ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu olova:

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         od 1 do 3 mg/kg	50 % relat.
         od 3 do 5 mg/kg	1,5 mg/kg
         od 5 do 10 mg/kg	30 % relat.
         od 10 do 20 mg/kg	3 mg/kg
         od 20 do 40 mg/kg	15 % relat.
         od 40 do 60 mg/kg	6 mg/kg
         nad 60 mg/kg	10 % relat.

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými metodou AAS na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu kadmia.

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         od 0,1 do 0,5 mg/kg	30 % relat.
         od 0,5 do 1 mg/kg	0,15 mg/kg
         nad 1 mg/kg	15 % relat.

         Reprodukovatelnost

         1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými metodou AAS ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu kadmia:

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         od 0,1 do 0,2 mg/kg	50 % relat.
         od 0,2 do 0,4 mg/kg	0,1 mg/kg
         od 0,4 do 1 mg/kg	25 % relat.
         od 1 do 2,5 mg/kg	0,25 mg/kg
         nad 2,5 mg /kg	10 % relat.

      1. 10.6. Stanovení obsahu ricinových slupek

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu ricinových slupek v krmivech a zejména v olejnatých semenech.

         Ricinové slupky se uvolní vyvařením zkušebního vzorku v kyselém a alkalickém prostředí a jejich obsah se stanoví vážkově.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.7. Stanovení obsahu reziduí organochlorových pesticidů

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu DDT, DDE, DDD, HCB, alfa, beta, gamma, delta izomerů HCH, aldrinu, dieldrinu, endrinu, isodrinu, heptachloru, endosulfanu a chlordanu v krmivech.

         Residua organochlorových pesticidů se extrahují z krmiv vhodným rozpouštědlem a přečistěný extrakt se analyzuje metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.8. Stanovení obsahu indikačních kongenerů polychlorovaných bifenylů (PCB)

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu sedmi indikačních kongenerů PCB (PCB 28, 52, 101, 118, 138, 153,180) v krmivech.

         Residua indikačních kongenerů PCB se extrahují z krmiv vhodným rozpouštědlem a přečištěný extrakt se analyzuje metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.9. Stanovení obsahu toxaphenu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu persistentních kongenerů toxaphenu (P 26, 50, 62) v krmivech.

         Rezidua toxaphenu se extrahují z krmiv nepolárním rozpouštědlem, vícestupnovým čistěním na sloupci vhodných sorbentů se odstraní nečistoty a přebytek ostatních chlorovaných látek a obsah persisteních kongenerů toxaphenu se stanoví metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.10. Stanovení obsahu rtuti

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení rtuti v krmivech.

         Rtuť v krmivech se stanoví metodou studených par na rtuťovém analyzátoru TMA (AMA).

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit pro všechny obsahy rtuti 10,9 % relat.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.11. Stanovení obsahu aflatoxinu B₁

         Účel, rozsah a princip

         Pro stanovení aflatoxinu B1 jsou popsány Metoda A a Metoda B:

         Metoda A

         Metoda dává možnost stanovit obsah aflatoxinu B1 v surovinách a v jednosložkových krmivech. Metoda nemůže být použita za přítomnosti slupek citrusu. Mez stanovitelnosti je 0,01 mg/kg. Za přítomnosti interferujících látek je nutné opakovat analýzu Metodou B (vysokoúčinná kapalinová chromatografie).

         Vzorek se extrahuje chloroformem. Extrakt se zfiltruje a alikvotní díl se přečistí na chromatografické koloně se silikagelem. Eluát se odpaří a zbytek se rozpustí v definovaném objemu chloroformu nebo ve směsi benzenu a acetonitrilu. Alikvotní podíl roztoku se analyzuje metodou tenkovrstvé chromatografie. Množství aflatoxinu B1 se určí po ozáření UV lampou, buď vizuálně, nebo fluorometricky porovnáním se známým množstvím aflatoxinu B1. Totožnost aflatoxinu B1 extrahovaného z krmiva musí být potvrzena určeným postupem

         Opakovatelnost

         1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu aflatoxinu B1

            Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

            od 10 do 20 μg/kg	25 % relat. z nejvyššího výsledku
            od 20 do 50 μg/kg	5 μg/kg
            nad 50 μg/kg	10 % relat. z nejvyššího výsledku

         Reprodukovatelnost

         1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu aflatoxinu

            Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

            od 10 do 20 μg/kg	50 % relat.
            od 20 do 50 μg/kg	10 μg/kg
            nad 50 μg/kg	20 % relat.

         Mez stanovitelnosti

         Mez stanovitelnosti je 10 μg/kg.

         Metoda B

         Metoda se používá pro stanovení aflatoxinu B1 v živočišných krmivech včetně krmiv obsahujících citrusovou slupku. Mez stanovitelnosti je 0,001 mg/kg.

         Vzorek se extrahuje chloroformem. Extrakt se zfiltruje a alikvotní podíl se přečistí na florisilové kolonce a potom na kolonce C₁₈. Konečná separace a stanovení se provede vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C₁₈, následné postkolonové derivatizaci vodným roztokem jodu a fluorescenční detekci.

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 11 % relat.

         Reprodukovatelnost

         1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu aflatoxinu B1:

            Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

            do 10 μg/kg	50 % relat.
            od 20 μg/kg do 50 μg/kg	10 μg/kg
            nad 50 μg/kg	20 % relat.

         Mez stanovitelnosti

         Mez stanovitelnosti je 1 μg/kg.

      1. 10.12. Stanovení obsahu arsenu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení arsenu v krmivech.

         Ve vzorku se po rozkladu kyselinou dusičnou v uzavřeném systému stanoví obsah arsenu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS) s hydridovou technikou.

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu arsenu nad 1 mg/kg hodnotu 6 % relativních.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.13. Stanovení obsahu gossypolu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu volného a celkového gossypolu a chemicky příbuzných látek v koncentraci nad 20 mg/kg v bavlníku a krmných směsích, které bavlník obsahují.

         Gossypol se extrahuje buď za přítomnosti 3-amino-1-propanolu (při stanovení volného gossypolu) nebo dimethylformamidu (při stanovení celkového gossypolu). Gossypol je reakcí s anilinem převeden na gossypol-dianilid a absorbance roztoku je měřena při 440 nm.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

      1. 10.14. Stanovení obsahu theobrominu

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro stanovení theobrominu v krmivech.

         Obsah theobrominu se stanoví po extrakci vzorku směsným rozpouštědlem chloroformamoniak metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi.

         Opakovatelnost

         Nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

         Mez stanovitelnosti

         Nestanovena.

   1. 11. Zkoušení siláží
      1. 11.1. Zkoušení jakosti siláží

         Účel, rozsah a princip

         Metoda specifikuje podmínky pro zkoušení jakosti konzervace silážovaných krmiv. Uvedené postupy zkoušení jsou použitelné pro všechny druhy silážovaných krmiv.

         Ze vzorku siláže se připraví vodní výluh. Ve výluhu se určí hodnota pH elektrometricky, obsah amoniaku se stanoví difusní Conwayovou metodou, obsah alkoholu se stanoví metodou plynové chromatografie a obsah silážních kyselin metodou kapilární izotachoforézy.

         Stanovení stlačitelnosti u řízkových siláží se provádí z upraveného vzorku.

         Opakovatelnost

         Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit u stanovení

         Příloha č. 9 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení krmiv

         pH	0,05
         formolové titrace	0,1 g/kg
         obsahu amoniaku jako NH3	0,1 g/kg
         obsahu silážních kyselin	1,0 g/kg

         U stanovení obsahu alkoholu a stlačitelnosti siláží opakovatelnost nestanovena.

         Reprodukovatelnost

         Nestanovena.

Příloha č. 10

Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů

Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

1. 1. Stimulátory růstu
   1. 1.1. Stanovení obsahu avilamycinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu avilamycinu v krmivech a premixech.

      Obsah avilamycinu se stanoví po extrakci ze zkušebního vzorku chloroformem a přečištění extraktu na pevné fázi Silica, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C18 s gradientovou elucí a UV detekcí při λ = 295 nm.).

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Nestanovena.

   1. 1.2. Stanovení obsahu olachindoxu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu olachindoxu v krmivech. Obsah olachindoxu se stanoví po extrakci směsí methanol - voda vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV-detekcí.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu olachindoxu 10 až 20 mg/kg 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

      Reprodukovatelnost

      Je uvedena u metody.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

   1. 1.3. Stanovení obsahu monensinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.

      Obsah monensinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Monensin se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu monensinu:

         Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

         do 25 mg/kg	20 % relat.
         od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
         od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
         od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
         nad 200 mg/kg	5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu monensinu:

         Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

         do 25 mg/kg	40 % relat.
         od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
         od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
         od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
         nad 200 mg/kg	10 % relat.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 0,2 mg/kg.

   1. 1.4. Stanovení obsahu salinomycinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu salinomycinu v krmivech a premixech.

      Obsah salinomycinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Salinomycin se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu salinomycinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 25 mg/kg	20 % relat.
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
      od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
      nad 200 mg/kg	5 % relat

      Reprodukovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu salinomycinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 25 mg/kg	40 % relat.
      od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
      od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
      od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
      nad 200 mg/kg	10 % relat.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.

   1. 1.5. Stanovení obsahu tylosinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení tylosinu v krmivech, koncentrátech a premixech od obsahu 2 mg/kg.

      Vzorek se podrobí působení fosfátového pufru pH 8 zahřátého na 80 °C, potom se extrahuje methanolem. Po odstředění se extrakt naředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví změřením difúze tylosinu na agaru s Kocuria rhizophila (CCM 552). V přítomnosti mikroorganizmu se difúze projevuje tvorbou inhibičních zón. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

   1. 1.6. Stanovení obsahu zinkbacitracinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení zinkbacitracinu v krmivech a premixech.

      Vzorek se extrahuje při pH 2 směsí methanol-voda-kyselina chlorovodíková a roztokem síranu sodného. Přidání síranu sodného slouží k vysrážení rozpustných solí mědi, které mohou při stanovení rušit. Extrakt se upraví na pH 6,5, zakoncentruje se (je-li to nezbytné) a naředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze zinkbacitracinu v agaru, do něhož byl naočkován mikroorganismus Micrococcus luteus (CCM 732). Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu zinkbacitracinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      od 5 do 10 mg/kg	2 mg/kg
      od 10 mg/kg do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 mg/kg do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

   1. 1.7. Stanovení obsahu flavofosfolipolu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení flavofosfolipolu v krmivech, koncentrátech a premixech.

      Vzorek se extrahuje zředěným methanolem za varu pod zpětným chladičem. Po odstředění se extrakt přečistí (pokud je to třeba) na ionexu a naředí. Antibiotická aktivita vzorku se stanoví měřením difúze flavofosfolipolu do agarové půdy, zaočkované mikroorganismem Staphylococcus aureus (CCM 2022). Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu flavofosfolipolu překročit

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      od 1 do 2 mg/kg	0,5 mg/kg
      od 2 do 10 mg/kg	25 % relat. z vyššího výsledku
      od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

   1. 1.8. Stanovení obsahu avoparcinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení avoparcinu v krmivech a premixech.

      Přítomnost polyetherických antibiotik může na stanovení působit rušivě.

      Vzorek se extrahuje směsí aceton-voda-kyselina chlorovodíková. Antibiotická aktivita extraktu se stanoví měřením difúze avoparcinu v živném agaru zaočkovaném mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se dokáže vznikem inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu avoparcinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 10 mg/kg	2 mg/kg
      od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

   1. 1.9. Stanovení obsahu monensinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.

      Vzorek se extrahuje 90 % methanolem. Extrakt se podrobí vhodnému postupu podle obsahu monensinátu sodného ve vzorku. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze monensinátu sodného v agarové živné půdě zaočkované mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se projeví vznikem inhibičních zón testovacího organismu. Průměr těchto inhibičních zón je v rozsahu použitých koncentrací považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika. Citlivost Metodau je snížena přítomností sodných iontů.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu monensinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 10 mg/kg.

   1. 1.10. Stanovení obsahu spiramycinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu spiramycinu v krmivech a premixech.

      Vzorek se extrahuje směsným roztokem methanol-fosfátouhličitanovým tlumivým roztokem pH 8,0. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a naředí. Antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze spiramycinu v agarové půdě zaočkované mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón mikroorganismu. Průměr zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu spiramycinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 10 mg/kg	2 mg/kg
      od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

   1. 1.11. Stanovení obsahu virginiamycinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu virginiamycinu v krmivech a premixech.

      Vzorek je extrahován methanolickým roztokem Tween 80. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a potom vhodně naředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze virginiamycinu v agaru, do něhož byl naočkován mikroorganismus Kocuria rhizophila (CCM 552). Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu virginiamycinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 10 mg/kg	2 mg/kg
      od 10 do 25 mg/kg	20 % relat. z vyššího výsledku
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      nad 50 mg/kg	10 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti 2 mg/kg.

1. 2. Antikokcidika
   1. 2.1. Stanovení obsahu amprolia

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu amprolia v krmivech a premixech. Mez detekce je 1 mg/kg.

      Vzorek se extrahuje směsí methanol - voda. Po zředění extraktu mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s výměnou kationtů a s UV detekcí.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu amprolia:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      od 25 do 500 mg/kg	15 % relat. z vyššího výsledku
      od 500 do 1000 mg/kg	75 mg/kg
      nad 1 000 mg/kg	7,5 % relat. z vyššího výsledku

      Reprodukovatelnost

      Je uvedena u metody.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 25 mg/kg.

   1. 2.2. Stanovení obsahu maduramicinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu maduramicinu v premixech.

      Obsah maduramicinu se stanoví po extrakci vzorku extrakční směsí, následném přečištění na pevné fázi a postkolonové derivatizaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím UV detekce při vlnové délce 598 nm

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu maduramicinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 5 mg/kg	10 % relat.
      od 800 do 1200 mg/kg	5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu maduramicinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 10 mg/kg	30 % relat.
      od 10 do 30 mg/kg	3 mg/kg.
      nad 30 mg/kg	10 % relat.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 0,9 mg/kg.

   1. 2.3. Stanovení obsahu methylbenzochátu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu methylbenzochátu v krmivech a premixech.

      Obsah methylbenzochátu se stanoví po extrakci vzorku methanolovým roztokem methansulfonové kyseliny, po přečištění extrakcí dichlormethanem je izolován na chromatografickém ionexovém sloupci a znovu extrahován dichlormethanem, nakonec stanoven vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu methylbenzochátu od 4,0 do 20 mg/kg hodnotu 10 % relat. z vyššího výsledku.

      Reprodukovatelnost

      Je uvedena u metody.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

   1. 2.4. Stanovení obsahu narasinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu narasinu v krmivech a premixech.

      Obsah narasinu se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Narasin se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 °C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.

      Opakovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu narasinu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 25 mg/kg	20 % relat.
      od 25 do 50 mg/kg	5 mg/kg
      od 50 do 100 mg/kg	10 % relat.
      od 100 do 200 mg/kg	10 mg/kg
      nad 200 mg/kg	5 % relat.

      Reprodukovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu narasinu

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 25 mg/kg	40 % relat.
      od 25 do 50 mg/kg	10 mg/kg
      od 50 do 100 mg/kg	20 % relat.
      od 100 do 200 mg/kg	20 mg/kg
      nad 200 mg/kg	10 % relat.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.

   1. 2.5. Stanovení obsahu nikarbazinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení nikarbazinu v krmivech a premixech.

      Nikarbazin se stanoví po extrakci ze vzorku extrakčním roztokem acetonitril – voda naředěním mobilní fází vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s isokratickou elucí na koloně C18 s UV detekcí při vlnové délce 351 nm.

      Opakovatelnost

      Nestanovena.

      Reprodukovatelnost

      Nestanovena.

      Mez stanovitelnosti

      Nestanovena.

   1. 2.6. Stanovení obsahu robenidinu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení robenidinu v krmivech.

      Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi pomocí UV detektoru.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu robenidinu nad 15 mg/kg překročit 10 % relat. vyššího výsledku.

      Reprodukovatelnost

      Je uvedena u metody

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

   1. 2.7. Stanovení obsahu meticlorpindolu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu meticlorpindolu v krmivech a premixech.

      Obsah meticlorpindolu se stanoví po extrakci vzorku směsným rozpouštědlem methanolamoniak a po jeho převedení do mobilní fáze vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí při 265 nm.

      Opakovatelnost

      Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu.

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      do 100 mg/kg	5 % relat.
      od 100 do 200 mg/kg	5 mg/kg

      Reprodukovatelnost

      1. Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu:

      Příloha č. 10 Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy

      od 50 do 200 mg/kg

      15 % relat.

      Mez stanovitelnosti

      Mez stanovitelnosti je 3,6 mg/kg.

   1. 2.8. Stanovení obsahu salinomycinu

      Metoda stanovení obsahu salinomycinu je uveden v příloze č. 10, část 1.

   1. 2.9. Stanovení obsahu monensinu

      Metoda stanovení obsahu monensinu je uveden v příloze č. 10, část 1.

   1. 2.10. Stanovení obsahu halofuginonu

      Účel, rozsah a princip

      Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu halofuginonu v krmivech a premixech.