Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

zrušený předpis

  1. Ve1,Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
  2. W1, W2 jsou šířky základen píků,
  3. M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

  1. IX.1.6.8 Rozpouštědla

    Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

  1. IX.1.6.9 Kontrola teploty

    Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

  1. IX.1.6.10 Detektor

    Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

  1. IX.2 DATA A ZPRÁVY
    1. IX.2.1 Data

      Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

      Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.

      Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

      Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Číselně střední a hmotnostně střední molekulová hmotnost se obecně stanoví elektronickým zpracováním dat založeným na vzorcích v bodě 1.2. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

      Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

    1. IX.2.2 Protokol o zkoušce

      Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

      1. IX.2.2.1 Zkušební látka
        1. — dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
        2. — popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
      1. IX.2.2.2 Vybavení
        1. — zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
        2. — čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
        3. — separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
        4. — počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
        5. — informace o symetrii píků,
        6. — teplota kolony, způsob kontroly teploty,
        7. — detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
        8. — průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),
        9. — systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
      1. IX.2.2.3 Kalibrace systému
        1. — podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
        2. — informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
        3. — informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
        4. — všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
        5. — název vzorku,
        6. — výrobce vzorku,
        7. — charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
        8. — vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
        9. — hodnota Mp použitá po kalibraci,
        10. — eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
        11. — hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,
        12. — chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.
      1. IX.2.2.4 Hodnocení
        1. — hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
        2. — informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
        3. — informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
        4. — popis metody hlazení, bylo-li použito,
        5. — příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
        6. — popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
        7. — vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
        8. — pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
        9. — podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
        10. — podrobnosti o rozsahu chyb,
        11. — jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
  1. IX.3 LITERATURA

    (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

    (2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

    (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

    (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

PŘÍLOHA

Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů

  1. Gelová permeační chromatografie (GPC) je přednostní metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulačním kritériím na Mn (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:
    1. 1. Použití koligativních vlastností
      1. 1.1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu/bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1), (2).

        Použitelnost: Mn < 20 000.

      1. 1.2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1), (2).

        Použitelnost: Mn < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

      1. 1.3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a ustavit rovnováhu. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1), (3), (4).

        Použitelnost: Mn od 20 000 do 200 000.

      1. 1.4 Osmometrie - tlak páry: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1), (5), (6).

        Použitelnost: Mn < 20 000.

    1. 2. Analýza koncových skupin

      Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací/derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7), (8), (9).

      Použitelnost: Mn až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).

LITERATURA

(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.

(2) Glover C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recomended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons.

(7) Schröder, E., Müller, G., Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

  1. X. METODA PRO STANOVENÍ OBSAHU MOLEKUL O NÍZKÉ HMOTNOSTI V POLYMERECH – metoda A.19 podle přílohy směrnice 98/73/ES
    1. X.1 METODA

      Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.

      1. X.1.1 Úvod

        Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

        Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

      1. X.1.2 Definice a jednotky

        Nízká molekulová hmotnost je účelově definována jako molekulová hmotnost pod 1 000 daltonů.

        1. Číselně střední molekulová hmotnost Mn a hmotnostně střední molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí následujících rovnic:
          Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů LITERATURA
          1. kde
            1. Hi je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem Vi,
            2. Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi, a
            3. n je počet dat.

        Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

      1. X.1.3 Referenční látky

        Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

        Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

      1. X.1.4 Princip zkušební metody

        Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

        Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

        V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

        Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

      1. X.1.5 Kritéria kvality

        Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1). Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

        Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů LITERATURA
        Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20
        2 000 = MP = 106 Mw/Mn < 1,05
        Mp > 106 Mw/Mn < 1,20

        (Mp je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

      1. X.1.6 Popis zkušební metody
        1. X.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

          Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

          Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30×7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

        1. X.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

          Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

          Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

        1. X.1.6.3 Korekce na obsah nečistot a přísad

          Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.

          V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedena za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.

        1. X.1.6.4 Přístroje a pomůcky
          1. Aparatura pro GPC sestává z následujících součástí:
            1. — zásobník rozpouštědla,
            2. — odplynovací zařízení (podle potřeby),
            3. — čerpadlo,
            4. — tlumič rázů (podle potřeby),
            5. — vstřikovací systém,
            6. — chromatografické kolony,
            7. — detektor,
            8. — průtokoměr (podle potřeby),
            9. — zapisovač,
            10. — nádoba na odpad.

          Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

        1. X.1.6.5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

          Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

        1. X.1.6.6 Kolona

          Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

        1. X.1.6.7 Teoretická patra

          Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

          1. kde
            1. N je počet teoretických pater,
            2. Ve je eluční objem v maximu píku,
            3. W šířka základny píku,
            4. W½ šířka píku v polovině výšky.
        1. X.1.6.8 Separační účinnost
          1. Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:

            1. kde
              1. Ve,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,
              2. Ve,(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.

          Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

          1. kde
            1. Ve1, Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
            2. W1, W2 jsou šířky základen píků,
            3. M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).
            4. Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).
        1. X.1.6.9 Rozpouštědla

          Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

        1. X.1.6.10 Kontrola teploty

          Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

        1. X.1.6.11 Detektor

          Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

    1. X.2 DATA A ZPRÁVY
      1. X.2.1 Data

        Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

        Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také data ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.

        Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

        Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování dat. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

        Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce a pokud by to nebylo zohledněno, vedlo by to k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.

        Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

      1. X.2.2 Protokol o zkoušce

        Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

        1. X.2.2.1 Zkušební látka
          1. — dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
          2. — popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
        1. X.2.2.2 Vybavení
          1. — zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
          2. — čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
          3. — separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
          4. — počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
          5. — informace o symetrii píků,
          6. — teplota kolony, způsob kontroly teploty,
          7. — detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
          8. — průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),
          9. — systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
        1. X.2.2.3 Kalibrace systému
          1. — podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
          2. — informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
          3. — informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
          4. — všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
          5. — název vzorku,
          6. — výrobce vzorku,
          7. — charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
          8. — vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
          9. — hodnota Mp použitá po kalibraci,
          10. — eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
          11. — hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,
          12. — chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.
        1. X.2.2.4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru
          1. — popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,
          2. — informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v procentech celkového vzorku (m/m),
          3. — informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v procentech celkového vzorku (m/m).
        1. X.2.2.5 Hodnocení
          1. — hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
          2. — informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
          3. — informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
          4. — popis metody hlazení, bylo-li použito,
          5. — příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
          6. — popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
          7. — vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
          8. — pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
          9. — podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
          10. — podrobnosti o rozsahu chyb,
          11. — jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
    1. X.3 LITERATURA

      (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

      (2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

      (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

      (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

    PŘÍLOHA

    Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru

    Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, vede to ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtrování vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnou ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardním materiálem o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se provede kalibrace refraktometru. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit polymethylmethakrylát (pMMA).

    1. Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard pMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledná data se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

      1. kde
        1. K je konstanta refraktometru (μVs/ml),
        2. R je odečet pro standard pMMA (μVs),
        3. C je koncentrace standardu pMMA (mg/ml),
        4. V je nastříknutý objem (ml) a
        5. dn/dc je přírůstek indexu lomu pro pMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg).
    1. Pro standard pMMA jsou typická následující data:
      1. R = 2 937 891
      2. C = 1,07 mg/ml
      3. V = 0,1 ml
      4. dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg.

    Výsledná hodnota K, 3,05×1011 se =poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstřiknutého polymeru.

  1. XI. METODA PRO STANOVENÍ CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ / EXTRAKCI VE VODĚ – metoda A.20 podle přílohy směrnice 98/73/ES
    1. XI.1. METODA

      Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).

      1. XI.1.1 Úvod

        V případě určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předběžná úprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních podmínek reagují s vodou.

        Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění.

      1. XI.1.2 Referenční látky

        Nejsou.

      1. XI.1.3 Princip zkušební metody

        Chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A.6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedeno dále.

      1. XI.1.4 Kritéria kvality

        Nejsou.

      1. XI.1.5 Popis zkušební metody
        1. XI.1.5.1 Zařízení
          1. Pro provedení metody je nezbytné následující zařízení:
            1. — drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti,
            2. — třepačka s možností kontroly teploty,
            3. — membránový filtrační systém,
            4. — vhodné analytické vybavení,
            5. — normalizovaná síta.
        1. XI.1.5.2 Příprava vzorku

          Reprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Gumovité materiály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1).

          Nelze-li požadované velikosti částic dosáhnout, mělo by se postupovat tak, aby byla velikost částic zmenšena co nejvíce, a výsledky by měly být uvedeny. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl nadrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.

        1. XI.1.5.3 Postup

          Do každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 gramech zkušební látky a přidá se po 1 000 ml vody. Ukáže-li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být odpovídajícím způsobem upraven. Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 °C. Měly by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost/extrahovatelnost zhodnotit z hmotnosti suchého zbytku na filtru nebo ze usazeniny po odstředění.

          Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a podíl o nízké molekulové hmotnosti na druhé straně. V případě vážkového stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkušební látky, s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.

          Chování při rozpouštění/extrakci polymerů ve vodě při 37 °C a pH 2 a 9 může být stanoveno způsobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 °C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných tlumivých roztoků, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH3.

          V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky, jsou-li k dispozici dostatečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění/extrakci je omezeno na přímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Zkouška by měla být rovněž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.

        1. XI.1.5.4 Analýza
          1. XI.1.5.4.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

            Je možné, že jsou k dispozici metody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných/extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah složek, které nejsou specifické pro polymer.

            1. Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je možná buď dostatečně citlivou metodou, např.
              1. — stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem peroxodisíranem nebo dichromanem za účelem uvolnění CO2 a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,
              2. — atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP) v případě silikonu nebo polymerů obsahujících kov,
              3. — UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií v případě arylových polymerů,
              4. — kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC-MS) v případě vzorků s nízkou molekulovou hmotností,

            nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou zbytku.

            Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zbytek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoliv složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru.

            Jsou-li přítomny relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty od přítomného monomeru nebo derivátů monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů.

            V některých případech může být dostačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha a zvážení suchého zbytku.

          1. XI.1.5.4.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

            Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku.

            Provede se vážkové stanovení nerozpuštěného/neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají-li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě se vysuší za vakua při 40 °C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti.

    1. XI.2 DATA
      1. XI.2.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

        Po každou ze tří baněk by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypočtená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měla by být uvedena jednotlivá čísla pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad).

      1. XI.2.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

        Pro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojitých experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).

        Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě nebývá přímá analýza obvykle nezbytná.

        Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech výchozích hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodnotami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech.

    1. XI.3 ZPRÁVY
      1. XI.3.1 Protokol o zkoušce
        1. Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
          1. XI.3.1.1 Zkušební látka
            1. — dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).
          1. XI.3.1.2 Experimentální podmínky
            1. — popis použitých postupů a experimentálních podmínek,
            2. — popis analytických a detekčních metod.
          1. XI.3.1.3 Výsledky
            1. — výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých rozpouštědlech, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd.,
            2. — výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/g polymeru,
            3. — hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (byla-li stanovena),
            4. — hodnota pH každého vzorku,
            5. — informace o hodnotách pro slepý pokus,
            6. — podle potřeby upozornění na chemickou nestabilitu zkušební látky během zkušebních postupů a analytických postupů,
            7. — všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků.
    1. XI.4 LITERATURA

      (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

Příloha č. 2

k vyhlášce č. 222/2004 Sb.

METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ

  1. I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY – metoda C.1 podle přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)
    1. I.1. METODA
      1. I.1.1 ÚVOD

        Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

        Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

      1. I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.

        Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

      1. I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

        Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

      1. I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

        Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50).

      1. I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

        Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

        Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).

        Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.

        Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací.

        U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

        U látek, které

        1. i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
        2. ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
        3. iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
        4. musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.

        Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

        pH by se nemá změnit o více než 1.

      1. I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. Mohou být použity tři postupy:
          1. Statická zkouška:

            Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)

          1. Semistatická metoda:

            Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně po delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.

          1. Průtoková metoda:

            Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.

          1. I.1.6.1 Činidla
            1. I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

              Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

              Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

              Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

              Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.

              Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

            1. I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění

              Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l-1 (vztaženo na CaCO3) a pH od 6,0 do 8,5.

          1. I.1.6.2 Přístroje

            Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:

            1. — systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),
            2. — přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
            3. — vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
            4. — vhodný přístroj pro měření teploty,
            5. — pH-metr.
          1. I.1.6.3 Testovací ryby

            Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.

            Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).

            Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.

            1. I.1.6.3.1 Chov
              1. Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:
                1. Obsádka:

                  Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.

                1. Voda:

                  Viz 1.6.1.2.

                1. Osvětlení:

                  Osvětlení 12 až 16 h denně.

                1. Koncentrace rozpuštěného kyslíku:

                  Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.

                1. Krmení:

                  Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.

            1. I.1.6.3.2 Mortalita
              1. Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
                1. — mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,
                2. — mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde-li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,
                3. — mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.
          1. I.1.6.4 Aklimatizace

            Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.

          1. I.1.6.5 Zkušební postup

            Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

            Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

            V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.

            1. Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
              1. — délka expozice: 96 h;
              2. — počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
              3. — nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
              4. — obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
              5. — zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
              6. — voda: viz 1.6.1.2;
              7. — osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
              8. — teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ±1 °C;
              9. — koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
              10. — krmení: žádné.

            Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.

            Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).

            Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.

            Limitní zkouška

            S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

            Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

            Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC50 větší než 100 mg·l-1. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC50 větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)

            Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.

    1. I.2 DATA A HODNOCENÍ

      Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro každou expoziční dobu mortalita v procentech proti koncentraci.

      Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou délku expozice hodnoty LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

      V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

      Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostatečnou informací o tom, že se LC50 nachází mezi těmito hodnotami.

      Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

    1. I.3 ZPRÁVY
      1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
        1. — údaje o testovacích rybách (vědecký název, kmen, dodavatel, veškerá předchozí ošetření, velikost a počet ryb použitých při každé zkušební koncentraci);
        2. — zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota);
        3. — u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
        4. — koncentrace všech pomocných látek;
        5. — přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
        6. — jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
        7. — výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
        8. — důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti o něm (např. statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována obsádka ryb atd.);
        9. — popis zkušebního zařízení;
        10. — světelný režim;
        11. — koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků každých 24 h;
        12. — důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
        13. — tabulka kumulativních hodnot mortality při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování;
        14. — graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
        15. — podle možnosti hodnoty LC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti);
        16. — použité statistické metody stanovení hodnot LC50;
        17. — při použití referenční látky a údaj o získaných výsledcích;
        18. — nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky úhyn ryb;
        19. — nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100 % mortalitu.
    1. I.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

      (2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods – NFT 90-303, June 1985.

      (3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow–Through methods – NFT 90-305, June 1985.

      (4) ISO 7346/1, /2, /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton –Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

      (5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.

      (6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

      (7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

      (8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

      (9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

      (10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

      (11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

      (12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA-AWWA-WPCF, 1975.

      (13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

      (14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

      (15) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99.

      (16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

      (17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

      (18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

      (19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

      (20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

    DODATEK 1

    Upravená voda

    Příklad vhodné ředicí vody

    Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

    Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm–1.

    Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

    Zásobní roztoky:

    Příloha č. 2 METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ DODATEK 1 Upravená voda
    CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.11,76 g
    MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.4,93 g
    NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.2,59 g
    KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.0,23 g

    Upravená ředicí voda

    Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

    Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

    pH musí být 7,8 ± 0,2.

    Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

    Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzdušňována.

    Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l–1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l–1.

    1. Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

    DODATEK 2

    Druhy ryb doporučené pro zkoušení

    Příloha č. 2 METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení
    Doporučený druhDoporučený rozsah
    teplot při zkoušce
    (°C)    		Doporučená
    celková délka ryb
    (cm)
    Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)
     (Hamilton - Buchanan), danio pruhované    		20 až 243,0 ± 0,5
    Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
     (Rafinesque), střevle    		20 až 245,0 ± 2,0
    Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae)
     (Linneanus 1758), kapr obecný    		20 až 246,0 ± 2,0
    Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
     (Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský    		20 až 243,0 ± 1,0
    Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
     (Peters 1859), živorodka duhová    		20 až 243,0 ± 1,0
    Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
    (Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá    		20 až 245,0 ± 2,0
    Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)
     (Walbaum 1988), pstruh duhový    		12 až 176,0 ± 2,0
    Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)
    (Linneanus 1758), jelec jesen    		20 až 246,0 ± 2,0
    1. Opatřování ryb
      1. Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

    DODATEK 3

    Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci

    1. Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru
      Obrázek
  1. II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – metoda C.2 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. II.1 METODA
      1. II.1.1 ÚVOD

        Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

        Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

      1. II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        Požadavek směrnice stanovit LC50 pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.

        Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).

        Imobilizace:

        Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.

        Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

      1. II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

        Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.

      1. II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

        Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.

        Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC50 se stanoví podle možnosti výpočtem.

        Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

      1. II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

        Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

        Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.

        Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.

        Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l-1. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg·l-1.

        Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

        U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

        1. U látek, které
          1. i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
          2. ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
          3. iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
          4. musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.

        Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

        pH by se nemělo změnit o více než 1.

      1. II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. II.1.6.1 Činidla
          1. II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

            Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

            Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.