Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Zkušební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaCO₃.

VÝPOČTY A STATISTIKA

Navrhuje se dvoufázový přístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, při nichž nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tělesná délka. Tento přístup se doporučuje, neboť toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromě toho tak bude pro každou expozici měřen zhruba stejný počet ryb, čímž se zajistí validita statistiky zkoušky.

STANOVENÍ LC₅₀ a EC₅₀

1. Procento přežití jiker a čerstvých plůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních skupinách podle Abbottovy rovnice (4):
   1. kde:
      1. P = korigované procento přežití
      2. P´ = procento přežití pozorované ve zkušební koncentraci
      3. C = procento přežití v kontrolní skupině

Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC₅₀ na konci zkoušky.

Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC₅₀ zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).

ODHAD LOEC A NOEC

Cílem zkoušky na jikrách a váčkových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichž byl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).

LITERATURA

(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.

(2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str.

(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰rbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181.

(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.

(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81.

(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117.

(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531.

(10) Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.

DODATEK 2

ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY

DODATEK 3

ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY

DODATEK 4

NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

1. XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
   1. XVI.1 METODA

      Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998).

      1. XVI.1.1 ÚVOD

         Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

         Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků.

         K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

      1. XVI.1.2 DEFINICE

         Akutní orální toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od orálního podání jedné dávky zkoušené látky.

         Dávka: je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje hmotností (µg) zkoušené látky na jeden testovací organismus (µg na včelu). Skutečnou dávku u každé včely nelze vypočítat, neboť se včely krmí kolektivně. Lze však odhadnout průměrnou dávku (celkové požité množství zkoušené látky dělené počtem včel v klícce).

         LD₅₀ (střední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje v µg zkoušenou látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

         Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý.

      1. XVI.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Včely jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD₅₀ pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

      1. XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
         1. Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. — průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
            2. — LD₅₀ pro referenční látku odpovídá předpokládané hodnotě.
      1. XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
         1. XVI.1.5.1 Včelstvo

            Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

         1. XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

            Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.

            Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l^-1 (50% (m/V)). Po podání zkušební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by měl umožňovat zaznamenání příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

         1. XVI.1.5.3 Příprava včel

            Shromážděné včely se náhodně rozdělí do klícek, které se náhodně umístí v experimentální místnosti.

            Před začátkem zkoušky mohou včely až 2 h hladovět. Doporučuje se, aby nebyla včelám před expozicí podávána potrava, aby byly na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího ústrojí. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

         1. XVI.1.5.4 Příprava dávek

            Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, může být rozptýlena přímo v 50% cukerném roztoku. U technických přípravků a látek s nízkou rozpustností ve vodě mohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkoušené látky a měla by být stejná pro všechny zkoušené koncentrace. Obecně je přiměřená 1% koncentrace vehikula a neměla by být překračována.

            Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouštědlem/nosičem v koncentraci použité v dávkách.

      1. XVI.1.6 POSTUP
         1. XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

            Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD₅₀ na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD₅₀. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

            Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).

         1. XVI.1.6.2 Referenční látka

            V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD₅₀. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD₅₀, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 – 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

         1. XVI.1.6.3 Expozice
            1. XVI.1.6.3.1 Podávání dávek

               Každé zkušební skupině včel se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).

            1. XVI.1.6.3.2 Délka zkoušky

               Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.

         1. XVI.1.6.4 Pozorování

            Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

            Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

         1. XVI.1.6.5 Limitní zkouška

            V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD₅₀ je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

   1. XVI.2 DATA A ZPRÁVY
      1. XVI.2.1 DATA

         Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-odezva pro každý čas pozorování a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD₅₀) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotřebována, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD₅₀ se vyjádří v µg zkoušené látky na včelu.

      1. XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
         1. Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
            1. XVI.2.2.1 Zkoušená látka
               1. — fyzikální stav a relevantní fyzikálněchemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
               2. — údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
            1. XVI.2.2.2 Testovací druh
               1. — vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru včel, datum výběru,
               2. — informace o včelstvech použitých pro výběr testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
            1. XVI.2.2.3 Zkušební podmínky
               1. — teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
               2. — podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
               3. — metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouštědlo a jeho koncentrace),
               4. — metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jeli použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
               5. — uspořádání zkoušky, např. použité zkušební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
               6. — datum zkoušky.
            1. XVI.2.2.4 Výsledky
               1. — výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
               2. — primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou koncentraci v každém čase pozorování,
               3. — graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky,
               4. — hodnoty LD₅₀ s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkoušenou látku a pro referenční látku,
               5. — statistické metody použité pro stanovení LD₅₀,
               6. — mortalita v kontrolních skupinách,
               7. — jiné pozorované nebo naměřené biologické účinky, např. neobvyklé chování včel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost spotřebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,
               8. — jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné důležité informace.
   1. XVI.3 LITERATURA

      (1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. březen 1993.

      (2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 – 125.

      (3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

      (4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

      (5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.

1. XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.17 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
   1. XVII.1 METODA

      Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998).

      1. XVII.1.1 ÚVOD

         Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

         Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků. K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

      1. XVII.1.2 DEFINICE

         Akutní kontaktní toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkoušené látky.

         Dávka: je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje v hmotnosti (µg) zkoušené látky na jednoho zkušebního živočicha (µg na včelu).

         LD₅₀ (střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje v µg zkoušené látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

         Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je-li zcela nepohyblivý.

      1. XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouška trvá 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD₅₀ pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

      1. XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
         1. Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. — průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
            2. — LD₅₀ pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu.
      1. XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
         1. XVII.1.5.1 Výběr včel

            Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

         1. XVII.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

            Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. klícky by měly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách.

            Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l^-1 (50% (m/V)) a podává se za použití včelího krmítka po dobu zkoušky podle libosti. Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

         1. XVII.1.5.3 Příprava včel

            Shromážděné včely mohou být za účelem aplikace zkušební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

         1. XVII.1.5.4 Příprava dávek

            Zkušební látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo ve vodě se smáčedlem. Jako organické rozpouštědlo se upřednostňuje aceton, mohou však být použity i jiná rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštění ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

            Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpuštění zkušební látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a roztok s rozpouštědlem/nosičem.

      1. XVII.1.6 POSTUP
         1. XVII.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

            Počet zkoušených dávek a jejich paralelních experimentů by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD₅₀ na hladině spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD₅₀. Počet dávek se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

            Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách.

            Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Je-li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, zařadí se další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo.

         1. XVII.1.6.2 Referenční látka

            V rámci zkušebních skupin musí být použita referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD₅₀. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách. Upřednostňovanou referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD₅₀, 24 h, kontaktně v rozmezí 0,10 – 0,30 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

         1. XVII.1.6.3 Expozice
            1. XVII.1.6.3.1 Podávání dávek

               U narkotizovaných včel se jednotlivě provede lokální aplikace. Včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkušební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je-li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem.

            1. XVII.1.6.3.2 Délka expozice

               Zkouška má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h, pokud kontrolní mortalita nepřekračuje 10 %.

         1. XVII.1.6.4 Pozorování

            Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je-li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

            Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

         1. XVII.1.6.5 Limitní zkouška

            V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD₅₀ je vyšší než tato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří paralelních zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenční látky. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

   1. XVII.2. DATA A ZPRÁVY
      1. XVII.2.1 DATA

         Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-reakce pro každý čas pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potřeby 72 h, 96 h) a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD₅₀) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD₅₀ se vyjádří v µg zkušební látky na včelu.

      1. XVII.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE

         Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

         1. XVII.2.2.1 Zkoušená látka
            1. — fyzikální stav a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
            2. — údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
         1. XVII.2.2.2 Testovací druh
            1. — vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru shromáždění včel, datum výběru,
            2. — informace o včelstvech použitých pro shromáždění testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
         1. XVII.2.2.3 Zkušební podmínky
            1. — teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
            2. — podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
            3. — metody aplikace zkoušené látky, např. použité nosně rozpouštědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použité anestetikum,
            4. — uspořádání zkoušky, např. použité zkušební dávky a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
            5. — datum zkoušky.
         1. XVII.2.2.4 Výsledky
            1. — výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
            2. — primární data: data: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém čase pozorování,
            3. — graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky;
            4. — hodnoty LD₅₀ s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkoušenou látku a referenční látku,
            5. — statistické metody použité pro stanovení LD₅₀,
            6. — mortalita v kontrolních skupinách,
            7. — jiné pozorované nebo změřené biologické účinky a jakékoli neobvyklé reakce včel,
            8. — jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody a jiné důležité informace.
   1. XVII.3 LITERATURA

      (1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. March 1993.

      (2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 – 125.

      (3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

      (4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

      (5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.

1. XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE/ DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU – metoda C.18 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
   1. XVIII.1. METODA

      Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení půdní adsorpce/desorpce násadovou rovnovážnou metodou (Batch Equilibrium Method) (2000).

   1. XVIII.1.1 ÚVOD

      Tato metoda se opírá o okružní testy a seminář o výběru půd pro vývoj zkoušky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovněž o existující národní metodiky (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).

      Studie adsorpce/desorpce jsou užitečné pro získávání důležitých informací o mobilitě a distribuci chemických látek v půdních, vodních a vzdušných složkách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Informace lze použít k předpovědi nebo např. odhadu dostupnosti chemické látky pro rozklad, (22, 23), transformace a příjmu organismy (24), vymývání půdním profilem, (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28); těkání z půdy (21, 29, 30); odtoku z půdního povrchu do vod (18, 31, 32). Data o adsorpci mohou být použita pro účely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35).

      Rozdělení chemické látky mezi půdu a vodní fázi je složitý proces, který závisí na řadě různých faktorů: na chemické povaze látky (12, 36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách půdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou srážky, teplota, sluneční svit a vítr. Početné fenomény a mechanismy účastnící se adsorpce chemické látky v půdě tedy nelze v celém rozsahu definovat zjednodušeným laboratorním modelem, na jakém je založena tato metoda. Přestože nelze tímto pokusem podchytit všechny možné případy z životního prostředí, poskytuje cenné informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska životního prostředí. Viz také obecný úvod.

   1. XVIII.1.2 POUŽITÍ

      Tato metoda je zaměřena na odhad adsorpčního/desorpčního chování látky v půdách. Cílem je získat sorpční charakteristiky, které lze použít pro předpověď rozdělení za nejrůznějších podmínek v životním prostředí; k tomuto účelu se pro chemickou látku stanovují rovnovážné adsorpční koeficienty v různých půdách jako funkce půdních charakteristik (např. obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, půdní textury a pH). Pro co nejširšího podchycení interakcí dané látky s půdami vyskytujícími se v přírodě musí být použity při zkoušce různé druhy půd.

      V této metodě vyjadřuje adsorpce proces vázání chemické látky na půdní povrch; nerozlišuje se mezi různými adsorpčními procesy (fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchově katalyzovaný rozklad, adsorpce velkých množství nebo chemická reakce. Adsorpce na koloidních částicích (průměr < 0,2 µm) vznikajících v půdě se nebere v úvahu.

      Půdními parametry, které jsou považovány za nejdůležitější, jsou: obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), obsah jílu a půdní textura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) a pro disociující sloučeniny také pH (3, 4, 42). Dalšími půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci určité látky jsou efektivní kationtová výměnná kapacita (ECEC), obsah amorfních oxidů železa a hliníku, zejména u vulkanických a tropických půd (4) a rovněž měrný povrch (49).

      1. Zkouška je navržena pro posouzení adsorpce chemické látky na různých druzích půd s různým obsahem organického uhlíku, jílu, různou půdní texturou a různým pH. Je trojstupňová:
         1. Stupeň 1: Předběžná zkouška za účelem stanovení:
            1. — poměru půda/roztok,
            2. — rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze,
            3. — adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a stálosti zkoušené látky v průběhu zkoušky.
         1. Stupeň 2: Screeningová zkouška: studie adsorpční kinetiky a stanovení distribučních koeficientů K_d a K_ou pro pět druhů půd a jednu koncentraci.
         2. Stupeň 3: Stanovení Freundlichových isotherm za účelem zjištění vlivu koncentrace na velikost adsorpce na půdách.

      Studie desorpce prostřednictvím desorpční kinetiky/ Freundlichových desorpčních isotherm (dodatek 1).

      1. XVIII.1.3 DEFINICE A JEDNOTKY

         VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

         Symbol	Definice	Jednotky
         Ati	procento adsorpce v čase ti	%
         Aeq	procento adsorpce v adsorpční rovnováze	%
         	množství zkoušené látky adsorbované na půdě v čase ti	µg
         	množství zkoušené látky adsorbované na půdě za časový interval ∆ti	µg
         	množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze	µg
         m0	množství zkoušené látky ve zkušební nádobě na začátku adsorpční zkoušky	µg
         	množství zkoušené látky naměřené v podílu v okamžiku ti	µg
         	množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze	µg
         mpůda	množství půdní fáze vyjádřené v suché hmotnosti půdy	g
         Czás	hmotnostní koncentrace zásobního roztoku látky	µg∙cm-3
         C0	počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou	µg∙cm-3
         	hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýza	µg∙cm-3
         	množství látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze	µg∙cm-3
         	hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpční rovnováze	µg∙cm-3
         V0	počáteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou během adsorpční zkoušky	cm3
         	objem podílu, ve kterém je látka stanovována	cm3
         Kd	distribuční koeficient pro adsorpci	cm3∙g-1
         Kou	adsorpční koeficient normalizovaný na organický uhlík	cm3∙g-1
         Kom	distribuční koeficient normalizovaný na obsah organického materiálu	cm3∙g-1
         	Freundlichův adsorpční koeficient	µg1-1/n(cm3)1/n∙g-1
         1/n	Freundlichův exponent
         Dti	procento desorpce v čase ti	%
         D∆ti	procento desorpce za časový interval ∆ti	%
         Kdes	zdánlivý desorpční koeficient	cm3∙g-1
         	Freundlichův desorpční koeficient	µg1-1/n (cm3)1/n∙g-1
         	množství zkoušené látky desorbované z půdy v čase ti	µg
         	množství zkoušené látky desorbované z půdy za časový interval ∆ti	µg
         	analyticky stanovené množství látky ve vodné fázi v desorpční rovnováze	µg
         	celkové množství zkoušené látky desorbované v desorpční rovnováze	µg
         	množství látky, která zůstává adsorbovaná na půdě po uplynutí časového intervalu ∆ti	µg
         	množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze	µg
         	množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě v desorpční rovnováze	µg∙g-1
         	hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v desorpční rovnováze	µg∙cm-3
         VT	celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou	cm3
         VR	objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2	cm3
         	objem podílu odebraného k analýze od okamžiku ti během experimentu pro studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou	cm3
         	objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (paralelní metoda)	cm3
         	objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby ke stanovení zkoušené látky v desorpční rovnováze	cm3
         MB	množstevní bilance	%
         mE	celkové množství zkoušené látky extrahované z půdy a ze stěn zkušební nádoby ve dvou krocích	µg
         Vrec	objem supernatantu získaný po dosažení adsorpční rovnováhy	cm3
         Pov	rozdělovací koeficient oktanol/voda
         pKa	disociační konstanta
         Sv	rozpustnost ve vodě	g∙l-1

      1. XVIII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Známé objemy roztoků zkoušené látky o známé koncentraci, značené nebo neznačené radionuklidy, se v 0,01M CaCl₂ přidají k půdním vzorkům o známé sušině, které byly předběžně uvedeny do rovnováhy s 0,01M CaCl₂. Směs se přiměřenou dobu protřepává. Půdní suspenze se poté oddělí centrifugací a podle požadavků zfiltruje a vodná fáze se analyzuje. Množství zkoušené látky adsorbované na půdním vzorku se vypočte z rozdílu mezi počátečním množstvím zkoušené látky v roztoku a množstvím, které v něm zbylo na konci experimentu (nepřímá metoda).

         Alternativně lze adsorbované množství zkoušené látky stanovit také přímo analýzou půdy (přímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje postupnou extrakci vhodným rozpouštědlem se doporučuje v případech, kdy nelze přesně stanovit rozdíl koncentrací látky v roztocích. Jde například o tyto případy: adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušebních nádob, nestálost zkoušené látky v poměru k délce experimentu, nízká adsorpce s malou změnou koncentrace v roztoku a vysoká adsorpce, jejímž důsledkem je nízká koncentrace, kterou nelze přesně stanovit. Použije-li se látka značená radioizotopy, lze extrakci půdy obejít analýzou půdní fáze spočívající v jejím spálení a v měření kapalinovou scintilační spektrometrií. Měření kapalinovou scintilační spektrometrií je nespecifickou technikou, která nerozlišuje mezi mateřskými a transformačními produkty; měla by tedy být použita pouze tehdy, je-li zkoušené chemická látka po celou dobu studie stálá.

      1. XVIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

         Chemikálie musí být analytické čistoty. Doporučuje se použití radioizotopově neznačených zkoušených látek se známým složením a alespoň 95% čistotou, nebo zkoušených látek značených radioizotopy, které mají známé složení a jsou radioizotopově čisté. U stopovačů s krátkým poločasem rozpadu musí být provedena korekce na rozpad.

         1. Před prováděním zkoušek adsorpce-desorpce by měly být o zkoušené látce známy tyto informace:
            1. a) rozpustnost ve vodě (A.6);
            2. b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta;
            3. c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7);
            4. d) rozdělovací koeficient (A.8);
            5. e) snadná rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní transformace v půdě;
            6. f) pK_a disociovatelných látek;
            7. g) přímá fotolýza ve vodě (tj. UV-Vis absorpční spektrum ve vodě, kvantový výtěžek) a fotodegradace v půdě.
      1. XVIII.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

         Zkouška je použitelná u látek, pro něž existuje analytická metoda s dostatečnou správností. Důležitým parametrem, který může ovlivnit spolehlivost výsledku, zejména při nepřímé metodě, je stálost zkoušené látky po celou dobu zkoušky. Je tedy nezbytné ověřit stabilitu v předběžné studii; je-li v průběhu zkoušky pozorována transformace látky, doporučuje se, aby byla v hlavní studii provedena analýza jak půdní, tak vodné fáze.

         Obtíže mohou nastat při provádění této zkoušky u látek s nízkou rozpustností ve vodě (S_v < 10^-4 g∙l^-1) a rovněž u silně nabitých látek v důsledku toho, že koncentraci ve vodné fázi nelze změřit s dostatečnou správností. V těchto případech musí být podniknuty další kroky. Doporučení pro řešení těchto problémů je uvedeno v příslušných částech této metody.

         Při zkoušení těkavých látek je třeba dbát na to, aby nedošlo v průběhu studie ke ztrátám.

      1. XVIII.1.7 POPIS METODY
         1. XVIII.1.7.1 Přístroje, pomůcky a reakční činidla
            1. Standardní laboratorní vybavení, zejména:
               1. a) Zkumavky nebo nádoby pro provedení experimentů. Je důležité, aby tyto zkumavky nebo nádoby
                  1. — patřily k centrifuze, aby se minimalizovaly nepřesnosti v důsledku manipulace a přenášení,
                  2. — byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkoušené látky na jejich stěnách.
               1. b) Mísicí zařízení: překlápěcí mísič nebo rovnocenné zařízení; mísič musí v průběhu mísení udržovat půdu v suspenzi.
               2. c) Centrifuga: nejlépe vysokootáčková, např. s odstředivým zrychlením > 3 000 g, s nastavením teploty, schopná odstředit z vodného roztoku částice o průměru větším než 0,2 µm. Kyvety by měly být během třepání a centrifugace opatřeny víčky, aby nedošlo ke ztrátám těkavých látek a vody; aby se minimalizovala adsorpce na víčkách, použijí se víčka z neadsorbujících materiálů, např. víčka se závitem potažená teflonem.
               3. d) Volitelné: filtrační zařízení; filtry o velikosti pórů 0,2 µm, sterilní, na jedno použití. Zvláštní pozornost by měla být věnována volbě filtračního materiálu, aby na něm nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky; u špatně rozpustných zkoušených látek se organický filtrační materiál nedoporučuje.
               4. e) Analytické přístroje vhodné pro měření koncentrace zkoušené látky.
               5. f) Laboratorní sušárna umožňující udržovat teplotu od 103 °C do 110 °C.
         1. XVIII.1.7.2 Charakterizace a výběr půd

            Půdy by měly být charakterizovány třemi parametry, které jsou považovány za nejdůležitější pro adsorpční kapacitu: obsahem organického uhlíku, obsahem jílu a půdní texturou a hodnotou pH. Jak již bylo uvedeno, (viz oddíl Použití), mohou mít vliv na další adsorpci/desorpci určité látky fyzikálně-chemické charakteristiky půdy a měly by být v takových případech zohledněny.

            Metody použité pro charakterizaci půdy jsou velmi důležité a mohou významně ovlivnit výsledky. Doporučuje se tedy, aby bylo podle odpovídající metody ISO (ISO-10390-1) pH měřeno v 0,01M CaCl₂ (jde o roztok použitý při zkoušení adsorpce/desorpce). Doporučuje se rovněž, aby byly ostatní důležité půdní charakteristiky stanoveny standardními metodami (např. ISO „Handbook of Soil Analysis“); to umožní, aby byla analýza sorpčních dat založena na mezinárodně standardizovaných půdních parametrech. Některé existující standardní metody analýzy a charakterizace půdy jsou uvedeny v literatuře (50 – 52). Ke kalibraci metod zkoušení půd se doporučují referenční půdy.

            Návod pro výběr půd pro adsorpční/desorpční experimenty je uveden v tabulce 1. Sedm vybraných druhů půd pokrývá půdní druhy vyskytující se v mírném zeměpisném pásmu. V případě disociovatelných zkoušených látek by měly vybrané půdy pokrývat širokých rozsah pH, aby bylo možné hodnotit adsorpci látky v její disociované a nedisociované formě. Návod k volbě počtu různých půd, které mají být použity v jednotlivých stádiích zkoušky, je uveden v bodě 1.9. Provedení zkoušky.

            Upřednostňují-li se jiné druhy půd, měly by být charakterizovány stejnými parametry a jejich charakteristiky by se měly pohybovat ve stejném rozpětí jako v tabulce 1, třebaže kritériím neodpovídají přesně.

            Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci

            VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci

            Druh půdy	Rozsah pH (v 0,01M CaCl2)	Obsah organického uhlíku (%)	Obsah jílu (%)	Textura půdy1
            1	4,5 - 5,5	1,0 - 2,0	65 - 80	jíl
            2	> 7,5	3,5 - 5,0	20 - 40	jílovitohlinitá
            3	5,5 - 7,0	1,5 - 3,0	15 - 25	prachovitohlinitá
            4	4,0 - 5,5	3,0 - 4,0	15 - 30	hlinitá
            5	< 4,0 - 6,0 2	< 0,5 - 1,5 2,3	< 10 - 15 2	hlinitopísčitá
            6	> 7,0	< 0,5 - 1,0 2,3	40 - 65	jílovitohlinitá/jíl
            7	< 4,5	> 10	< 10	písek/hlinitopísčitá

         2. ¹ Podle FAO a severoamerického systému (85).
         3. ² Hodnoty jednotlivých parametrů by měly pokud možno ležet v uvedeném rozsahu. Vyskytnou-li se obtíže při hledání vhodného půdního materiálu, jsou přijatelné hodnoty ležící pod uvedeným minimem.
         4. ³ U půd s obsahem organického uhlíku nižším než 0,3 % může být porušena korelace mezi obsahem organického uhlíku a adsorpcí. Doporučují se tedy půdy s minimálním obsahem organického uhlíku 0,3 %.
         1. XVIII.1.7.3 Sběr a uchovávání půdních vzorků
            1. XVIII.1.7.3.1 Sběr

               Není doporučena žádná specifická technika odběru vzorků; technika odběru závisí na účelu studie (53, 54, 55, 56, 57, 58).

               1. Je třeba zohlednit:
                  1. a) nezbytné jsou informace o historii lokality; zahrnují informace o lokalitě, vegetaci, použití pesticidů nebo hnojiv, o biologických vnosech nebo náhodné kontaminaci. Pokud jde o popis místa odběru, měla by být dodržena doporučení normy ISO o vzorkování půd (ISO 10381-6);
                  2. b) místo odběru musí být definováno souřadnicemi UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) nebo zeměpisnými souřadnicemi; to by mohlo umožnit opakovaný odběr dané půdy v budoucnu nebo usnadnit definování půdy podle různých klasifikačních systémů používaných v různých zemích. Kromě toho by měla být vzorkován pouze horizont A do maximální hloubky 20 cm. Zvláště je-li u půdního druhu č. 7 součástí půdy horizont 0_h, měl by být zahrnut do vzorkování.

               Půdní vzorky by měly být přepravovány v kontejnerech a za teploty, jež zaručí, že nedojde k výrazné změně původních charakteristik půdy.

            1. XVIII.1.7.3.2 Uchovávání

               Přednost se dává se použití čerstvě odebraných půd. Pouze není-li to možné, mohou být půdy uchovávány při teplotě okolí, případně vysušené na vzduchu. Pro dobu uchovávání neexistuje žádný doporučený limit, ale půdy uchovávané déle než tři roky by měly být před použitím analyzovány na obsah organického uhlíku, pH a CEC (kationtovou výměnnou kapacitu).

            1. XVIII.1.7.3.3 Zpracování půdních vzorků a jejich příprava ke zkoušce

               Půdy se vysuší na vzduchu při teplotě okolí (nejlépe při 20 – 25 °C). Rozrušení půd se provede minimální silou, aby se původní textura půdy změnila co nejméně. Půdy se prosejí na sítu ≤ 2 mm; při prosévání by měla být dodržována doporučení normy ISO (ISO 10381-6). Doporučuje se opatrná homogenizace, neboť zlepšuje reprodukovatelnost výsledků. Vlhkost každé půdy se stanoví na třech dílčích vzorcích zahříváním na 105 °C, dokud se významně mění hmotnost (přibližně 12 h). Ve všech výpočtech je hmotností půdy hmotnost po sušení (sušina), tj. hmotnost půdy korigovaná na obsah vlhkosti.

         1. XVIII.1.7.4 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

            Zkoušená látka se rozpustí v 0,01M roztoku CaCl₂ v destilované nebo deionisované vodě; roztok CaCl₂ se použije jako vodná rozpouštědlová fáze ke zlepšení centrifugace a minimalizaci kationtové výměny. Koncentrace zásobního roztoku by měla být nejlépe o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti použité analytické metody. Tento práh zabezpečuje přesnost měření s ohledem na metodiku, jež je základem tohoto postupu; kromě toho by měla být koncentrace zásobního roztoku pod rozpustností zkoušené látky ve vodě.

            Zásobní roztok se připravuje nejlépe těsně před aplikací na půdní vzorky a uchovává se uzavřený v temnu při 4 °C. Skladovatelnost závisí na stálosti zkoušené látky a na její koncentraci v roztoku.

            Pouze u špatně rozpustných látek (S_v < 10^-4 g∙l^-1) může být nezbytné použít solubilizační činidlo, je-li obtížné zkoušenou látku rozpustit. Solubilizační činidlo: a) by mělo být mísitelné s vodou, např. methanol nebo acetonitril, b) jeho koncentrace by neměla překročit 1 % celkového objemu zásobního roztoku a ještě méně by ho mělo být v roztoku přicházejícím do kontaktu s půdou (nejlépe v koncentraci nižší než 0,1 %), a c) nemělo by být surfaktantem nebo by nemělo podléhat solvolytickým reakcím se zkoušenou chemickou látkou. Použití solubilizačního činidla by mělo být uvedeno a odůvodněno v přehledu dat.

            Jinou možností u špatně rozpustných látek je jejich přimíchání do systému (spiking): zkoušená látka se rozpustí v organickém rozpouštědle a alikvot se přidá do směsi půdy a 0,01M roztoku CaCl₂ v destilované nebo deionisované vodě. Obsah organického rozpouštědla ve vodné fázi by měl být co nejnižší a obvykle by neměl překročit 0,1 %. Nedostatkem přimíchání v organickém rozpouštědle je nereprodukovatelnost objemu. To může znamenat zanesení další nepřesnosti, neboť koncentrace zkoušené látky a spolurozpouštědla nebývají ve všech zkouškách tytéž.

      1. XVIII.1.8 PŘEDPOKLADY PRO PROVEDENÍ ZKOUŠKY ADSORPCE/DESORPCE
         1. XVIII.1.8.1 Analytická metoda

            Klíčovými parametry, které mohou mít vliv na správnost měření sorpce, jsou správnost metody analýzy jak roztoku, tak adsorbované fáze, stálost a čistota zkoušené látky, dosažení sorpční rovnováhy, velikost změny koncentrace v roztoku, poměr půda/roztok a změny v půdní struktuře během ustavování rovnováhy (35, 59 – 62). Některé příklady týkající se problematiky správnosti jsou uvedeny v dodatku 2.

            Spolehlivost použité analytické metody musí být ověřována při koncentracích, které se mohou vyskytnout v průběhu zkoušky. Je na experimentátorovi, aby vyvinul vhodnou metodu s náležitou správností, přesností, reprodukovatelností, mezí stanovitelnosti a výtěžkem. Návodem k provedení takové zkoušky je níže uvedený experiment.

            Vhodný objem 0,01M CaCl₂, např. 100 cm³, se protřepává 4 h s např. 20 g půdy o vysoké adsorpční schopnosti, tj. s vysokým obsahem organického uhlíku a jílu; tato hmotnost a objem se mohou měnit podle požadavků analýzy, avšak poměr půda/roztok 1:5 je vhodnou výchozí hodnotou. Směs se odstředí a vodnou fázi lze zfiltrovat. K vodné fázi se přidá určitý objem zásobního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo nominální hodnoty v koncentračním rozsahu, který se může vyskytnou v průběhu zkoušky. Tento objem by neměl překročit 10 % konečného objemu vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně. Roztok se analyzuje.

            Založí se jeden slepý pokus s půdou a roztokem CaCl₂ (bez zkoušené látky) s cílem odhalit náhodné chyby analytické metody a matricové jevy způsobené půdou.

            Mezi analytické metody, které mohou být použity v sorpčních měřeních, patří plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází, (GLC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), spektrometrie (např. GC/hmotnostní spektrometrie, HPLC/hmotnostní spektrometrie) a kapalinová scintilační spektrometrie (pro látky značené radioizotopy). Bez ohledu na použitou analytickou metodu se za přiměřené považují výtěžky od 90 % do 110 % nominální hodnoty. Má-li být možné provést stanovení a zhodnocení poté, co dojde k rozdělení, musí být meze stanovitelnosti analytické metody alespoň o dva řády nižší než nominální koncentrace.

            Charakteristiky a meze stanovitelnosti analytické metody použitelné pro provedení studií adsorpce hrají významnou roli při definování zkušebních podmínek a při celém experimentálním provedení zkoušky. Tato metoda sleduje obecný experimentální postup a obsahuje doporučení a pokyny pro alternativní řešení, jsou-li analytická metoda a laboratorní vybavení omezeny.

         1. XVIII.1.8.2 Výběr optimálních poměrů půda/roztok

            Výběr vhodných poměrů půda/roztok pro sorpční studie závisí na distribučním koeficientu K_d a na požadovaném relativním stupni adsorpce. Změna koncentrace látky v roztoku je určující pro statistickou správnost měření v důsledku formy adsorpční rovnice a omezení analytické metodiky při stanovování koncentrace chemické látky v roztoku. V obecné praxi je tedy užitečné určit několik pevných poměrů, pro něž je adsorbovaný podíl vyšší než 20 %, nejlépe > 50 % (62), a dbát na to, aby byla koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi dostatečně vysoká pro její správné změření. To je zvláště důležité u vysokých adsorbovaných podílů.

            1. Vyhovující přístup k výběru vhodných poměrů půda/voda je založen na odhadu hodnoty K_d buď předběžnými studiemi, nebo zavedenými metodami odhadu (dodatek 3). Vhodný poměr lze poté vybrat na základě grafického provedení závislosti poměru půda/roztok na K_d pro daný adsorbovaný podíl (obrázek 1). V tomto grafickém vyjádření se předpokládá, že je adsorpční rovnice lineární¹. Použitelný poměr se získá upravením rovnice pro K_d (4) do tvaru rovnice (1):

               VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci

               (1)

               1. nebo do její logaritmické formy při předpokladu

               VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci

               (2)

            

            Distribuční koeficient K_d(cm³∙g^-1)

            Obrázek 1. Vztah mezi poměry půda/roztok a hodnotou K_d při různých adsorbovaných podílech zkoušené látky

            Na obrázku 1 jsou uvedeny požadované poměry půda/roztok jako funkce K_d pro různé úrovně adsorpce. Například při poměru půda/roztok 1:5 a při K_d rovno 20 by došlo přibližně k 80% adsorpci. Má-li dojít při téže hodnotě K_d k 50% adsorpci, musí být použit poměr 1:25. Tento přístup k výběru vhodných poměrů půda/roztok umožňuje výzkumníkovi pružně vyhovět experimentálním potřebám.

            Obtíže nastávají v oblastech, kdy se chemická látka adsorbuje silně nebo velmi slabě. Je-li adsorpce nízká, doporučuje se poměr půda/roztok 1:1, třebaže u některých vysloveně organických druhů půdy může být k získání suspenze nezbytný nižší poměr. Analytická metodika měření malých změn koncentrace roztoku musí být pečlivá; v opačném případě bude měření nepřesné. Na druhé straně se může při velmi vysokých distribučních koeficientech K_d dospět až k poměru půda/roztok 1:100, má-li v roztoku zůstat významné množství chemické látky. Je však třeba dbát na dobré promíchání a musí být ponechána dostatečná doba k tomu, aby systém dosáhl rovnováhy. Jiným přístupem je v těchto extrémních případech, kdy chybí vhodná metodika, odhadnutí hodnoty K_d metodou založenou například na hodnotách P_ov (dodatek 3). Může být užitečný zvláště u slabě adsorbovaných polárních chemických látek s P_ov < 20 a u lipofilních/silně adsorbovaných chemických látek s P_ov > 10⁴.

      1. XVIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
         1. XVIII.1.9.1 Zkušební podmínky

            Všechny experimenty se provádějí při teplotě okolí a pokud možno při konstantní teplotě od 20 °C do 25 °C.

            Parametry odstřeďování by měly umožnit odstranit z roztoku částice větší než 0,2 µm. Tuto velikost mají nejmenší částice považované za pevné částice a je hranicí mezi pevnými a koloidními částicemi. Návod ke stanovení parametrů odstřeďování je uveden v dodatku 4.

            Nezaručuje-li centrifuga, že budou částice větší než 0,2 µm odstraněny, mohla by být použita kombinace odstřeďování a filtrace přes 0,2µm filtry. Tyto filtry musí být z vhodného inertního materiálu, aby na nich nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky. V každém případě by mělo být ověřeno, že při filtraci nedochází k žádným ztrátám zkoušené látky.

         1. XVIII.1.9.2 Stupeň 1 – předběžná studie

            Účel provedení předběžné studie byl již uveden v oddíle Použití. Návodem pro založení takové studie je níže navržený experiment.

            1. XVIII.1.9.2.1 Výběr optimálních poměrů půda/roztok

               Použijí se dva půdní druhy a tři poměry půda/roztok (šest experimentů). Jeden půdní druh s vysokým obsahem organického uhlíku a nízkým obsahem jílu a druhý půdní druh s nízkým obsahem organického uhlíku a vysokým obsahem jílu. Jsou navrženy následující poměry půda/roztok:

               1. — 50 g půdy a 50 cm³ vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/1),
               2. — 10 g půdy a 50 cm³ vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/5),
               3. — 2 g půdy a 50 cm³ vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/25).

               Minimální množství půdy, se kterým lze experiment provést, závisí na laboratorním vybavení a na účinnostních charakteristikách použitých analytických metod. Doporučuje se však použít alespoň 1 g, a nejlépe 2 g, aby zkouška poskytla spolehlivé výsledky.

               Jeden kontrolní vzorek obsahující pouze zkoušenou látku v 0,01M CaCl₂ (bez půdy) se podrobí naprosto stejným krokům jako zkušební systémy, s cílem ověřit stálost zkoušené látky v roztoku CaCl₂ a její možnou adsorpci na stěnách zkušební nádoby.

               Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí slepý vzorek s každou půdou a celkem 50 cm³ 0,01M roztoku CaCl₂ (bez zkoušené látky). Účelem je kontrola pozaďových hodnot během analýzy s cílem detekovat interferující látky nebo rozeznat kontaminované půdy.

               Všechny experimenty včetně kontrolních a slepých vzorků se provedou alespoň dvojmo. Celkový počet vzorků, které by měly být pro studii připraveny, lze odvodit z metodiky, podle které bude postupováno.

               Metody pro předběžnou studii a hlavní studii jsou zpravidla stejné, výjimky jsou podle potřeby uvedeny.

               Vzorky vysušené na vzduchu se den před experimentem uvedou přes noc (12 h) do rovnováhy protřepáváním s 45 cm³ 0,01M CaCl₂. Poté se určitým objemem zásobního roztoku zkoušené látky upraví konečný objem na 50 cm³. Tento objem přidaného zásobního roztoku: a) by neměl být vyšší než 10 % konečného objemu 50 cm³ vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně; a b) měl by zajistit, že bude počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou (C₀) alespoň o dva řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody; tento práh zabezpečuje možnost provést přesné měření i při vysoké adsorpci (> 90 %) a později stanovit adsorpční izotermy. Doporučuje se rovněž, aby počáteční koncentrace látky (C₀) pokud možno nepřekračovala polovinu hodnoty rozpustnosti látky.

               Příklad výpočtu koncentrace zásobního roztoku látky (C_zás) je uveden níže. Předpokládá se mez stanovitelnosti 0,01 µg·cm^-3 a 90% adsorpce; počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou by tedy měla být nejlépe 1 µg·cm^-3 (o dva řády vyšší, než je mez stanovitelnosti). Za předpokladu, že bude přidán maximální doporučený objem zásobního roztoku, tj. 5 cm³ do 45 cm³ 0,01M roztoku CaCl₂ pro ustavení rovnováhy, (= 10% přídavek zásobního roztoku v celkovém objemu vodné fáze 50 cm³), by měla být koncentrace zásobního roztoku 10 µg·cm^-3; je o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody.

               Hodnota pH vodné fáze se měří před kontaktem s půdou a po něm, neboť hraje významnou roli v celém adsorpčním procesu, zvláště u disociujících látek.

               Směs se protřepává, dokud se neustaví adsorpční rovnováha. Doba nezbytná k dosažení rovnováhy v půdě silně kolísá v závislosti na chemické látce a půdě; zpravidla stačí 24 h (77). V předběžné studii lze vzorky odebírat postupně v průběhu míchání po 48 h (například 4, 8, 24, 48 h). Čas analýzy by měl být volen pružně s ohledem na pracovní plán laboratoře.

               Existují dvě možnosti, jak provádět analýzu zkoušené látky ve vodném roztoku: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Je třeba zdůraznit, že ačkoli je paralelní metoda experimentálně náročnější, je její matematické zpracování jednodušší (dodatek 5). Volba metodiky, podle které bude postupováno, se však ponechává na experimentátorovi, který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení a prostředky.

               1. a) Paralelní metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví tolik vzorků, kolik bude časů, v nichž se má provést vyšetření adsorpční kinetiky. Po centrifugaci a podle požadavku po filtraci se z první zkušební nádoby odebere pokud možno celá vodná fáze a měří se např. po 4 h; vodná fáze druhé zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 8 h, vodná fáze třetí zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 24 h atd.
               2. b) Sériová metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví pouze dva vzorky. V definovaných časových intervalech se směs zcentrifuguje a fáze se oddělí. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokračuje s původní směsí. Následuje-li po centrifugaci filtrace, měla by mít laboratoř zařízení pro filtraci malých podílů vodné fáze. Doporučuje se, aby celkový objem odebraného podílu nepřesahoval 1 % celkového objemu roztoku, aby se významně nezměnil poměr půda/roztok a aby se nesnížilo množství rozpuštěné látky dostupné během zkoušky pro adsorpci.

               Procento adsorpce A_ti se pro každý čas (t_i) vypočte z nominální počáteční koncentrace a naměřené koncentrace v odběrovém čase (t_i) po korekci na hodnoty ze slepého pokusu. Sestrojí se křivky závislosti A_ti na čase (obrázek 1 v dodatku 5) za účelem odhadu míry dosažení rovnovážného plató². Rovněž se vypočte hodnota K_d v rovnováze. Na základě této hodnoty se z obrázku 1 vyberou vhodné poměry půda/roztok tak, aby adsorpce dosahovala více než 20 % a nejlépe více než 50 % (61). Všechny příslušné rovnice a zásady pro sestrojování křivek jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5.

            1. XVIII.1.9.2.2 Stanovení rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze

               Jak již bylo uvedeno, umožňuje křivka závislosti A_ti nebo na čase odhadnout dobu nezbytnou pro dosažení adsorpční rovnováhy a adsorbované množství zkušební látky v rovnováze. Příklady těchto křivek jsou na obrázcích 1 a 2 v dodatku 5. Rovnovážný čas je čas nezbytný k tomu, aby bylo v systému dosaženo plató.

               Nevyskytuje-li se u určité půdy plató, ale nepřetržitý nárůst, může to být způsobeno komplikujícími faktory, jako jsou biologický rozklad a pomalá difuse. Biologický rozklad lze prokázat opakováním experimentu se sterilizovaným vzorkem půdy. Není-li ani v tomto případě dosaženo plató, měl by experimentátor pátrat po jiném jevu, ke kterému by mohlo při jeho studiích docházet; může tak učinit vhodnou změnou experimentálních podmínek (teploty, doby protřepávání, poměrů půda/roztok). Ponechává se na rozhodnutí experimentátora, zda bude pokračovat ve zkušebním postupu i přes případné nedosažení rovnováhy.

            1. XVIII.1.9.2.3 Adsorpce na stěnách zkušební nádoby a stálost zkoušené látky

               Některé informace o adsorpci zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a rovněž o stálosti zkoušené látky lze odvodit z analýzy kontrolních vzorků. Pozoruje-li se úbytek větší, než by odpovídalo obvyklé chybě analytické metody, může docházet k abiotickému rozkladu a/nebo adsorpci na stěnách zkušební nádoby. Tyto dva jevy lze rozlišit důkladným omytím stěn nádoby známým objemem vhodného rozpouštědla a analýzou výplachu na zkoušenou látku. Není-li zjištěna adsorpce na stěnách zkušební nádoby, je úbytek důkazem abiotické nestálosti zkoušené látky. Je-li zjištěna adsorpce, je nezbytné změnit materiál zkušebních nádob. Data o adsorpci na stěnách zkušebních nádob získaná v tomto experimentu však nelze přímo extrapolovat na experiment půda/roztok. Přítomnost půdy bude mít na tuto adsorpci vliv.

               Další informace o stálosti zkoušené látky lze odvodit z množstevní bilance výchozí látky provedené po určitém čase. To znamená, že se na zkušenou látku analyzují vodná fáze, extrakty půdy a stěny zkušební nádoby. Rozdíl mezi množstvím přidané zkoušené látky a součtem množství zkoušené látky ve vodné fázi, v extraktech půdy a na stěnách zkušební nádoby je roven množství, které se rozložilo, vytěkalo a/nebo se neextrahovalo. Má-li být provedena množstevní bilance, mělo by být v době experimentu dosaženo adsorpční rovnováhy.

               Množstevní bilance se provede u obou druhů půd a pro jeden poměr půda/roztok u každé půdy, u něhož je úbytek v rovnováze větší než 20 % a nejlépe větší něž 50 %. Je-li experiment pro nalezení poměru dokončen analýzou posledního vzorku po 48 hodinách, fáze se oddělí centrifugací a podle požadavků filtrací. Odebere se pokud možno veškerá vodná fáze a k půdě se přidá vhodné extrakční rozpouštědlo (extrakční koeficient alespoň 95 %) za účelem extrakce zkoušené látky. Doporučují se alespoň dvě extrakce za sebou. Stanoví se množství zkoušené látky v půdě a v extraktech ze zkušební nádoby a provede se množstevní bilance (rovnice 10, Data a zprávy). Je-li nižší než 90 %, považuje se zkoušená látka za nestálou v poměru k délce zkoušky. Studie však může pokračovat, přičemž se zohlední nestálost zkoušené látky; v takovém případě se doporučuje, aby byly v hlavní studii analyzovány obě fáze.

         1. XVIII.1.9.3 Stupeň 2 – adsorpční kinetika při jedné koncentraci zkoušené látky

            Použije se pět druhů půd vybraných z tabulky 1. Je výhodné zahrnout mezi těchto pět půd některé nebo všechny půdy z předběžné studie. V tomto případě nemusí být stupeň 2 opakován pro půdy použité v předběžné studii.

            Rovnovážný čas, poměr půda/roztok, hmotnost půdního vzorku, objem vodné fáze v kontaktu s půdou a koncentrace zkoušené látky v roztoku se volí na základě výsledků předběžné studie. Analýzy se provádějí nejlépe po 2, 4, 6, 8 (podle možnosti také po 10) a 24 h kontaktu s půdou; protřepávání může být prodlouženo až na maximálně 48 h u chemických látek, u nichž je pro dosažení rovnováhy podle výsledků předběžných studií nezbytný delší čas. Časy, kdy má být provedena analýza, lze volit pružně.

            Každý experiment (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede alespoň dvojmo, aby bylo možné odhadnout rozptyl výsledků. S každým experimentem se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl₂ bez zkoušené látky a se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01M roztoku CaCl₂ (bez půdy), který slouží jako pojistka proti nečekaným výsledkům.

            Procento absorpce se vypočte pro každý čas (A_ti) a pro každý interval (A_∆ti) (podle potřeby) a vynese se proti času. Rovněž se vypočtou distribuční koeficient K_d v rovnováze a adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku K_ou (pro nepolární organické chemické látky).

            Výsledky zkoušky adsorpční kinetiky