Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 251/1998 Sb., účinné od 10. 11. 1998

Předchozí stránka

účinné od 1. 1. 1999Provokační expozice (challenge): experimentální expozice subjektu dříve vystaveného testované látce po indukčním období pro stanovení, zda subjekt odpoví reakcí přecitlivělosti.

účinné od 1. 1. 19991.3 Referenční látky

účinné od 1. 1. 1999Citlivost a spolehlivost použité experimentální metody by měla být ověřována každých šest měsíců s použitím látek, o kterých je známo, že mají mírný až středně silný senzibilizační účinek pro kůži.

účinné od 1. 1. 1999U správně provedeného testu se očekává reakce na mírné/střední senzibilátory nejméně 30 % u metody s adjuvans, a nejméně 15 % u metody bez adjuvans.

účinné od 1. 1. 1999Přednost se dává následujícím látkám:

účinné od 1. 1. 1999

Číslo CAS	Číslo EINECS	chemický název	generický /obchodní název
101-86-0	202-983-3	2-hexyl-3-fenyl-2-propenal	alfa-hexylcinnamaldehyd
149-30-4	205-736-8	2-merkaptobenzothiazol	kaptax
94-07-7	202-303-5	Ethyl ester kyseliny p-aminobenzoové	benzokain

účinné od 1. 1. 1999Mohou nastat okolnosti, kdy při dostatečném odborném zdůvodnění mohou být použity jiné kontrolní látky splňující výše uvedená kritéria.

účinné od 1. 1. 19991.4 Princip testovací metody
účinné od 1. 1. 1999Pokusná zvířata jsou nejprve exponována testované látce intradermálními injekcemi případně epidermální aplikací (indukční expozice). Po období 10 až 14 dnů (indukční období), v průběhu kterého se může rozvinout imunitní reakce, jsou zvířata exponována provokační dávce. Rozsah a stupeň kožní reakce na provokační expozici u testovaných zvířat je porovnáván s rozsahem a stupněm reakce u kontrolních zvířat, která podstoupí klamnou expozici v době indukce a je jim aplikována provokační dávka.

účinné od 1. 1. 19991.5 Popis testovacích metod
účinné od 1. 1. 1999Jestliže je považováno za nezbytné odstranit testovanou látku, provede se to s použitím vody nebo vhodného rozpouštědla tak, aby nebyla narušena vzniklá kožní reakce nebo integrita pokožky.
1. účinné od 1. 1. 19991.5.1 Maximizační test na morčatech (GPMT)
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.1 Příprava
    účinné od 1. 1. 1999Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.2 Experimentální podmínky
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.2.1. Pokusná zvířata
      účinné od 1. 1. 1999Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.2.2. Počet a pohlaví
      účinné od 1. 1. 1999Lze použít samce i samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Exponovanou skupinu tvoří nejméně 10 zvířat a nejméně 5 zvířat je třeba v kontrolní skupině. Použije-li se menšího počtu než 20 testovaných a 10 kontrolních morčat a není možné dojít k závěru, že testovaná látka je senzibilizátor, doporučuje se testování na dalších zvířatech, aby se dosáhlo celkového počtu nejméně 20 testovaných a 10 kontrolních zvířat.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.2.3 Dávkové úrovně
      účinné od 1. 1. 1999Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, kterou zvířata celkově dobře snášejí a která je nejvyšší působící mírné až střední podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech. Pro tento účel lze uvážit použití zvířat, kterým bylo aplikováno FCA.
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.3. Popis postupu
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.3.1. Indukce
      účinné od 1. 1. 1999Den 0 - Testovaná skupina
      účinné od 1. 1. 1999Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do lopatkové oblasti zbavené srsti symetricky podle střední linie:
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 2: testovaná látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncentraci;
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 3: testovaná látka ve zvolené koncentraci připravená ve směsi FCA s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1.
      účinné od 1. 1. 1999Pro injekci 3 se látky ve vodě rozpustné rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo látky nerozpustné se rozptýlí v nezředěném FCA. Konečná koncentrace testované látky pro injekci 3 má být stejná jako pro injekci 2.
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 směrem ke kaudální části testovací plochy.
      účinné od 1. 1. 1999Den 0 - Kontrolní skupina
      účinné od 1. 1. 1999Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do stejných míst jako u testovaných zvířat:
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 2: neředěné vehikulum;
      účinné od 1. 1. 1999Injekce 3: Směs vehikula (50 %, váha / objem) se směsí FCA/vody nebo fyziologického roztoku v poměru 1 : 1 (objem / objem).
      účinné od 1. 1. 19995. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny
      účinné od 1. 1. 1999Přibližně dvacet čtyři hodin před lokální indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se na testovací plochu po důkladném ostříhání případně oholení natře 0,5 ml 10 % laurylsulfátu sodného ve vazelíně, za účelem navození místního podráždění.
      účinné od 1. 1. 19996. - 8. den - Testovaná skupina
      účinné od 1. 1. 1999Testovací plocha se zbaví srsti. Testovanou látkou ve vhodném vehikulu je napuštěn filtrační papír (2 x 4 cm), který se pak přiloží na testovací plochu a fixuje pomocí okluzivního obvazu na dobu 48 hodin. Výběr vehikula se řídí odbornými důvody; pevné látky jsou jemně rozetřeny a převedeny do vhodného vehikula; kapaliny lze aplikovat přímo.
      účinné od 1. 1. 19996. - 8. den - Kontrolní skupina
      účinné od 1. 1. 1999Testovací plocha se znovu zbaví srsti. Samotné vehikulum se nanese a zafixuje podobně jako u exponované skupiny na dobu 48 hodin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.3.2. Provokace
      účinné od 1. 1. 199920. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny
      účinné od 1. 1. 1999Boky exponovaných i kontrolních zvířat jsou zbaveny srsti. Na jeden bok zvířete je aplikována testovaná látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se stejným způsobem aplikuje pouze vehikulum (pokud je to třeba). Plátky se pomocí okluzivního obvazu udržují v kontaktu s kůží po 24 hodiny.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.1.3.3. Pozorování a vyhodnocení: testované a kontrolní skupiny
      1. účinné od 1. 1. 1999— přibližně 21 hodin po odstranění náplasti se provokační plocha vyčistí, důkladně ostříhá případně oholí a v případě potřeby depiluje;
      2. účinné od 1. 1. 1999— přibližně po dalších třech hodinách (přibližně 48 hodin od začátku aplikace provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamenává se podle stupnice uvedené v dodatku;
      3. účinné od 1. 1. 1999— přibližně 24 hodin po tomto pozorování se provede druhé pozorování a záznam reakce kůže (72 hodin).
      účinné od 1. 1. 1999Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.
      účinné od 1. 1. 1999Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině. Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona / Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.
1. účinné od 1. 1. 19991.5.2 Buehlerův test
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.1 Příprava
    účinné od 1. 1. 1999Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.2 Experimentální podmínky
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.2.1. Pokusná zvířata
      účinné od 1. 1. 1999Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.2.2. Počet a pohlaví
      účinné od 1. 1. 1999Lze použít samce a/nebo samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.
      účinné od 1. 1. 1999Použije se minimálně 20 zvířat v testované skupině a nejméně 10 zvířat v kontrolní skupině.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.2.3 Dávkové úrovně
      účinné od 1. 1. 1999Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, která je nejvyšší působící mírné ale ne velmi silné podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech.
      účinné od 1. 1. 1999Pro testované látky rozpustné ve vodě je vhodné použít vodu nebo zředěný nedráždící roztok detergentu jako vehikula. Pro jiné látky je preferován 80 % roztok etanol / voda pro indukci a aceton pro provokaci.
  1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.3 Postup
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.3.1. Indukce
      účinné od 1. 1. 1999Den 0 - Testovaná skupina
      účinné od 1. 1. 1999Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Systém plátkového testu se dokonale nasytí testovanou látkou ve vhodném vehikulu (výběr vehikula se řídí odbornými důvody; kapaliny lze případně aplikovat přímo).
      účinné od 1. 1. 1999Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin.
      účinné od 1. 1. 1999Systém plátkového testu musí být okluzivní. Vhodný je bavlněný polštářek, ať už kruhový nebo čtverhranný, s plochou přibližně 4 - 6 cm². Je preferováno přidržení s použitím vhodného přidržovače, aby se zajistila okluze. Jestliže je použito obvázání, mohou být nutné další expozice.
      účinné od 1. 1. 1999Den 0 – Kontrolní skupina
      účinné od 1. 1. 1999Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Na testovací plochu je naneseno pouze vehikulum, a to podobným způsobem jako u testované skupiny. Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin. Pokud je možno prokázat, že negativní kontrolní skupina není nutná, lze použít čisté kontrolní skupiny bez aplikace.
      účinné od 1. 1. 19996. - 8. a 13. - 15. den -Testovaná a kontrolní skupina
      účinné od 1. 1. 1999Stejná aplikace jako v den 0 se provede na stejnou testovací plochu na tomtéž boku (zbavenou případně srsti) 6.-8. den a znovu 13.-15. den.
    1. účinné od 1. 1. 19991..5.2.3.2. Provokace
      účinné od 1. 1. 199927. - 29. den - Testovaná a kontrolní skupina
      účinné od 1. 1. 1999Neošetřený bok testovaných a kontrolních zvířat je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Okluzivní plátek obsahující příslušné množství testované látky v maximální nedráždivé koncentraci se aplikuje na zadní část neošetřeného bok testovaných a kontrolních zvířat. Na přední část neošetřeného boku testovaných a kontrolních zvířat se případně může aplikovat okluzní plátek s vehikulem. Překrývací plátky nebo komůrky jsou přidržovány v kontaktu s kůží vhodným obvazem po dobu 6 hodin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.5.2.3.3. Pozorování a hodnocení
      1. účinné od 1. 1. 1999— přibližně 21 hodin po odstranění plátku se provokační plocha zbaví srsti;
      2. účinné od 1. 1. 1999— přibližně o tři hodiny později (přibližně 30 hodin po aplikaci provokačního plátku) se pozorují kožní reakce a zaznamenávají podle stupnice uvedené v dodatku;
      3. účinné od 1. 1. 1999— přibližně po dalších 24 hodinách (tj. přibližně 54 hodin po aplikaci provokačního plátku) se kožní reakce znovu pozorují a zaznamenají.
      účinné od 1. 1. 1999Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.
      účinné od 1. 1. 1999Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.
      účinné od 1. 1. 1999Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona/Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

účinné od 1. 1. 19992. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ (GPMT A BUEHLERŮV TEST)
účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky, ze které musí být pro každé pokusné zvíře patrná reakce kůže při každém pozorování.

účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA (GPMP A BUEHLERŮV TEST)
účinné od 1. 1. 1999Pokud byl proveden před zahájením testu na morčatech test screeningový, je třeba uvést popis tohoto testu nebo jeho citaci (např. LLNA - test regionálních lymfatických uzlin, MEST - test ztluštění ucha u myší) včetně všech podrobností postupu a výsledků získaných pro testované a referenční látky.
1. účinné od 1. 1. 19993.1. Zpráva o průběhu pokusu (GPMT a Buehlerův test)
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
  účinné od 1. 1. 1999Pokusná zvířata:
  1. účinné od 1. 1. 1999— použitý kmen morčat;
  2. účinné od 1. 1. 1999— počet, stáří a pohlaví zvířat;
  3. účinné od 1. 1. 1999— podmínky chovu, strava atd.;
  4. účinné od 1. 1. 1999— hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a konci testu.
  účinné od 1. 1. 1999Experimentální podmínky:
  1. účinné od 1. 1. 1999— způsob přípravy místa pro plátkový test;
  2. účinné od 1. 1. 1999— podrobné informace o materiálech a technice plátkového testu;
  3. účinné od 1. 1. 1999— výsledek pilotní studie se závěrem o indukčních a provokačních koncentracích pro vlastní test;
  4. účinné od 1. 1. 1999— podrobné informace o přípravě, aplikaci a odstranění testované látky;
  5. účinné od 1. 1. 1999— zdůvodnění výběru vehikula;
  6. účinné od 1. 1. 1999— koncentrace a celková množství testované látky a vehikula, použitá pro indukci a provokaci.
  účinné od 1. 1. 1999Výsledky:
  1. účinné od 1. 1. 1999— souhrn výsledků poslední kontroly citlivosti a spolehlivosti (viz 1.3.) včetně použité referenční látky, její koncentrace a vehikula;
  2. účinné od 1. 1. 1999— všechna pozorování pro každé zvíře včetně systému klasifikace;
  3. účinné od 1. 1. 1999— slovní popis charakteru a stupně pozorovaných účinků;
  4. účinné od 1. 1. 1999— všechny histopatologické nálezy.
  účinné od 1. 1. 1999Diskuse výsledku
  účinné od 1. 1. 1999Závěry

účinné od 1. 1. 19994. LITERATURA
účinné od 1. 1. 1999Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 406.

účinné od 1. 1. 1999Dodatek

účinné od 1. 1. 19995.1 Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení vyvolaných patologických reakcí
1. účinné od 1. 1. 19990 = žádná viditelná změna;
2. účinné od 1. 1. 19991 = slabé nebo skvrnité zarudnutí kůže;
3. účinné od 1. 1. 19992 = středně výrazné a splývající zarudnutí kůže;
4. účinné od 1. 1. 19993 = intenzívní zarudnutí a zduření kůže.

účinné od 1. 1. 19995.2 Klasifikace potenciálu senzibilizace
účinné od 1. 1. 1999Podle frekvence pozitivity při provokační expozici, tj. podle toho kolik zvířat v rámci pokusu bylo danou látkou senzibilizováno, se látka klasifikuje jako
1. účinné od 1. 1. 1999slabý alergen (I.st.) - 0-8% zvířat
2. účinné od 1. 1. 1999mírný alergen (II.st.) - 9-28% zvířat
3. účinné od 1. 1. 1999středně silný alergen (III.st.) - 29-64% zvířat
4. účinné od 1. 1. 1999silný alergen (IV.st.) - 65-80% zvířat
5. účinné od 1. 1. 1999extrémní alergen (V.st.) - 81-100% zvířat

účinné od 1. 1. 1999B.7. SUBAKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ
účinné od 1. 1. 1999(28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se podává denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Pitva se provede u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během pokusu; také zvířata, která přežijí konec pokusu, se utratí a pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2. Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1. Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Zdravá mladá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní skupiny a jednotlivých experimentálních skupin. Klece jsou uspořádány tak, aby se co nejvíce vyloučil vliv umístění klece. Každé jednotlivé zvíře je jednoznačně označeno. Nejméně 5 dní před začátkem studie jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu.
      účinné od 1. 1. 1999Testovanou látku lze podávat sondou nebo v potravě nebo v pitné vodě, podle účelu studie a fyzikálně-chemických vlastností látky.
      účinné od 1. 1. 1999Pokud je to třeba, rozpustí nebo suspenduje se testovaná látka ve vhodném nosiči (vehikulu). Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku / suspenze, pak použití roztoku / emulze v jedlém rostlinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem. Je nezbytné ověřit stabilitu látky v zvoleném vehikulu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2. Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1. Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Dává se přednost potkanům, ale je možno použít i jiného druhu hlodavců. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavu a v každém případě dříve než zvířata dosáhnou věku 9 týdnů.
        účinné od 1. 1. 1999Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít zvířata stejného kmene a ze stejného zdroje.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2. Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu.
        účinné od 1. 1. 1999Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3. Volba dávek
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud se podle dostupných informací nedá očekávat účinek při denní dávce 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti, je možno provést limitní test. Nejsou-li taková data k dispozici, lze provést předběžnou vyhledávací studii za účelem stanovení dávek.
        účinné od 1. 1. 1999Při výběru dávek je třeba vzít v úvahu všechny existující údaje z toxikologických a toxikokinetických studií o testované látce případně látkách příbuzných.
        účinné od 1. 1. 1999Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí ani velké utrpení. Dále se vyberou dávky v klesající řadě tak, aby umožnily prokázat závislost účinku na dávce. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity (NOAEL). Obvykle je vhodný dvoj- až čtyřnásobný odstup mezi sousedními dávkami; pokud je potřeba pokrýt větší rozsah dávek, je lepší přidat čtvrtou dávkovou skupinu, než zvolit příliš velký odstup mezi dávkami (např. faktor větší než 10).
        účinné od 1. 1. 1999Pokud se testovaná látka podává v potravě nebo pitné vodě, je důležité zajistit, aby podávané množství látky neovlivňovalo výživu a vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít stejné potravy.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4. Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999Neprokáže-li test provedený zde popisovaným způsobem žádné toxické účinky při dávce 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den nebo při takové koncentraci v potravě nebo vodě, která této dávce odpovídá, a pokud toxicita testované látky nevyplývá z analogie s příbuznými látkami, je možno od provedení kompletního testování při třech dávkových úrovních upustit. Toto pravidlo limitního testu platí, pokud údaje o expozici lidí nenaznačují, že je třeba testovat při vyšších dávkách.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5. Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Doba pozorování je 28 dní. Zvířata satelitní skupiny jsou pozorována nejméně dalších 14 dnů bez aplikace s cílem zachytit případné zpožděné účinky a pro posouzení přetrvávání nebo vratnosti účinku.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3. Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířatům se podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů, ve zdůvodněných případech 5 dní v týdnu. Denní dávka se podává jednorázově žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. Objem by neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Neplatí to u látek dráždivých a leptavých, u kterých je třeba obvykle počítat se stupňovanými účinky při vyšších koncentracích.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Všeobecné pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Všeobecné klinické pozorování se provádí nejméně jednou denně, nejlépe v tutéž denní dobu a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po aplikaci. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede zběžná prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata moribundní a zvířata projevující silnou bolest nebo stres jsou vyřazena, utracena humánním způsobem a pitvána.
        účinné od 1. 1. 1999Důkladné klinické vyšetření všech zvířat se provede před první aplikací (za účelem intraindividuálního porovnání) a dále nejméně jednou týdně. Toto pozorování se děje mimo chovnou klec v standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou denní dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému, standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily co nejméně; osoba, provádějící pozorování by nejlépe neměla znát příslušnost zvířat do dávkových skupin.
        účinné od 1. 1. 1999Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů, změny dýchání a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic) a případně další. Zaznamenávají se změny chůze, polohy, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (vytrvalé čisticí pohyby nebo kroužení) nebo bizarních vzorců chování (např. sebepoškozování, pohyb pozadu).
        účinné od 1. 1. 1999Ve čtvrtém týdnu aplikace se otestují reakce na různé senzorické podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), změří se síla úchopu a celková motorická aktivita. Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v literatuře (viz Všeobecný úvod, část B).
        účinné od 1. 1. 1999Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu aplikace lze případně vynechat, pokud 28-denní studie slouží jako předběžná studie pro následující studii subchronickou (90-denní); v tom případě je pozorování funkčních poruch zařazeno do této dlouhodobé studie. Ovšem i v tomto případě jsou údaje o funkčních poruchách ve čtvrtém týdnu 28-denní studie vhodným východiskem pro výběr dávek pro subchronickou studii.
        účinné od 1. 1. 1999Výjimečně lze vynechat pozorování funkčních poruch u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu zvířete vadily.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Tělesná hmotnost a příjem potravy a vody
        účinné od 1. 1. 1999Zvířata se váží nejméně jednou týdně. Spotřeba potravy a vody se měří nejméně jednou týdně, také v případě aplikace v pitné vodě.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.3 Hematologie
        účinné od 1. 1. 1999Hematologické vyšetření na konci pokusu zahrnuje stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a změření srážlivosti krve.
        účinné od 1. 1. 1999Krev se odebere těsně před nebo v průběhu utracení zvířete, místo odkud se krev odebrala se zaznamená. Krev se skladuje za vhodných podmínek.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.4 Biochemická analýza
        účinné od 1. 1. 1999Biochemická analýz krve za účelem posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na játra a ledviny, se provede u všech zvířat těsně před nebo v průběhu utracení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Doporučuje se nechat zvířata bez potravy přes noc před odběrem krve⁽¹¹⁾. Vyšetření plazmy a sera zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových proteinů, albuminu, aktivity alespoň dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky ( jako alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama glutamyltranspeptidáza, sorbitoldehydrogenáza). Změření dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v některých případech poskytnout užitečné informace.
        účinné od 1. 1. 1999Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev příp. krvinky.
        účinné od 1. 1. 1999Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru.
        účinné od 1. 1. 1999Další charakteristiky je třeba stanovit u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce: stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno, lipidů, specifických hormonů, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.
        účinné od 1. 1. 1999Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované nebo očekávané účinky dané látky.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud nejsou k dispozici údaje o normálních hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba uvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.5. Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů, dutiny lební, hrudní a břišní, a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat se řádně očistí od ulpěných tkání a co nejdříve po sekci se zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        účinné od 1. 1. 1999Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými změnami, mozek (reprezentativní oblasti včetně hemisfér, mozečku a mostu), míchu, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezinu, srdce, brzlík, štítnou žlázu, průdušnici a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a pak ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. dělohu, prostatu), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zvolit i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba uchovat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.6. Histopatologická vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.
        účinné od 1. 1. 1999Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.
        účinné od 1. 1. 1999U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.
1. účinné od 1. 1. 19992. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
  účinné od 1. 1. 1999K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úmrtí jednotlivých zvířat, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.
  účinné od 1. 1. 1999Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
  účinné od 1. 1. 1999Pokusná zvířata:
  1. účinné od 1. 1. 1999— živočišný druh / kmen;
  2. účinné od 1. 1. 1999— počet, stáří a pohlaví zvířat;
  3. účinné od 1. 1. 1999— zdroj, podmínky chovu, potrava atd.;
  4. účinné od 1. 1. 1999— hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu, dále v týdenních intervalech a na konci testu.
  účinné od 1. 1. 1999Podmínky testování:
  1. účinné od 1. 1. 1999— zdůvodnění výběru vehikula, pokud je jiné než voda;
  2. účinné od 1. 1. 1999— zdůvodnění výběru dávek;
  3. účinné od 1. 1. 1999— podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě diety, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku;
  4. účinné od 1. 1. 1999— podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
  5. účinné od 1. 1. 1999— přepočet z koncentrace látky v dietě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg na kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v dietě nebo vodě);
  6. účinné od 1. 1. 1999— podrobné údaje o potravě a kvalitě vody (včetně druhu a zdroje);
  účinné od 1. 1. 1999Výsledky:
  1. účinné od 1. 1. 1999— tělesná hmotnost a její změny;
  2. účinné od 1. 1. 1999— spotřeba potravy a vody;
  3. účinné od 1. 1. 1999— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávkové úrovně, včetně popisu příznaků toxicity;
  4. účinné od 1. 1. 1999— povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda jsou vratné nebo nevratné;
  5. účinné od 1. 1. 1999— posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity;
  6. účinné od 1. 1. 1999— výsledky hematologického vyšetření s příslušnými normami;
  7. účinné od 1. 1. 1999— výsledky biochemického vyšetření s příslušnými normami;
  8. účinné od 1. 1. 1999— tělesná hmotnost při utracení a hmotnosti orgánů;
  9. účinné od 1. 1. 1999— pitevní nálezy;
  10. účinné od 1. 1. 1999— podrobný popis všech histopatologických nálezů;
  11. účinné od 1. 1. 1999— údaje o absorpci, pokud byly získány;
  12. účinné od 1. 1. 1999— statistické zpracování výsledků.
  účinné od 1. 1. 1999Diskuse výsledků:
  účinné od 1. 1. 1999Závěry:
1. účinné od 1. 1. 19994. LITERATURA
  účinné od 1. 1. 1999Tato metoda je analogická metodě OECD TG 407.

účinné od 1. 1. 1999B.8. SUBAKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Úvod
    účinné od 1. 1. 1999Před pokusem je třeba získat údaje o testované látce: rozdělení velikosti částic, tenze par, bod tání, bod varu, bod vzplanutí a výbušnost (jsou-li stanovitelné).
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 28 dní. Použije-li se pro dosažení vhodné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.3 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou testovanou skupinu je třeba použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat vysoké koncentraci satelitní skupinu 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů a během následujících 14 dnů sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.3 Expoziční koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina, případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se užije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší koncentrace by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.4 Trvání expozice
        účinné od 1. 1. 1999Trvání expozice má být 6 hodin denně; v případě specifických požadavků je možné použit i jiných dob expozice.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.5 Expoziční zařízení
        účinné od 1. 1. 1999Pro pokusy se zvířaty se používá dynamické expoziční zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se zamezilo co nejvíce shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5% objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.6 Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozice i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 28 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 14 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírně negativního tlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.
      účinné od 1. 1. 1999Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací.
      účinné od 1. 1. 1999Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.
      účinné od 1. 1. 1999Měření nebo monitorování podmínek expozice:
      1. účinné od 1. 1. 1999a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
      2. účinné od 1. 1. 1999b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zoně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15%.. U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic týdně v každé testované skupině.
      3. účinné od 1. 1. 1999c) Teplota a vlhkost vzduchu pokud možno kontinuálně.
      účinné od 1. 1. 1999Během expozice a po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.
      účinné od 1. 1. 1999Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      účinné od 1. 1. 1999Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:
      1. účinné od 1. 1. 19991. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
      2. účinné od 1. 1. 19992. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferasa v séru (dříve známá jako glutamátpyruvát-transaminasa), aspartátaminotransferasa séra (dříve známá jako glutamátoxalacetát-transaminasa), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.
      účinné od 1. 1. 1999Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.
      účinné od 1. 1. 1999Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně (dýchací systém, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny a srdce, i všechny orgány s makroskopickými změnami nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření. Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným mediem, tak aby se zachovala struktura.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.3.2 Histopatologické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší koncentrace, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.
  účinné od 1. 1. 1999Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto k informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ústájení, krmení atd.,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky pokusu: popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis likvidace odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu,
    3. účinné od 1. 1. 1999- údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají pokud možno obsahovat tyto údaje: a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením; b) teplota a vlhkost vzduchu; c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu); d) povaha vehikula, pokud bylo užito; e) skutečná koncentrace v dýchací zóně; f) hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (GSD),
    4. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
    5. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
    6. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických nebo jiných účinků,
    7. účinné od 1. 1. 1999- úroveň bez účinku,
    8. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky, a jejich další vývoj,
    9. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    10. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    11. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky,
    12. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
    13. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    14. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    15. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    16. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.9. SUBAKUTNÍ TOXICITA - DERMÁLNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se nanáší na kůži denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10% povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu. Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba danou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Je možno používat dospělé potkany, králíky nebo morčata. Je možno použít i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou hladinu dávek použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které se aplikuje skupině s nejvyšší dávkou. Nejvyšší dávka má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední dávkou a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
        účinné od 1. 1. 1999Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové úrovně může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky otravy. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a dobu, kdy se objeví a případně opět odezní příznaky otravy.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 28 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 14 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.
      účinné od 1. 1. 1999Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla; u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.
      účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou immobilizaci však nelze doporučit. Jako alternativní metody je možno použít " ochranného límce“.
      účinné od 1. 1. 1999Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo s použitím jiného vhodného způsobu očištění pokožky.
      účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      účinné od 1. 1. 1999Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:
      1. účinné od 1. 1. 19991. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
      2. účinné od 1. 1. 19992. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferasa v séru (dříve známá jako glutamátpyruvát-transaminasa), aspartátaminotransferasa séra (dříve glutamát-oxalacetáttransaminasa), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.
      účinné od 1. 1. 1999Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.
      účinné od 1. 1. 1999Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně např. normální a exponovaná kůže, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny, srdce i všechny orgány s makroskopickými lézemi nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Histopatologické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou, objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.
  účinné od 1. 1. 1999Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- údaje o zvířatech (druh, kmen, původ, podmínkách chovu, krmení atd.),
    2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky ( včetně druhu obvazu; okluzivní nebo neokluzivní),
    3. účinné od 1. 1. 1999- úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    4. účinné od 1. 1. 1999- úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    5. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a dávky,
    6. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
    7. účinné od 1. 1. 1999- toxické nebo jiné účinky,
    8. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    9. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    10. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    11. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky,
    12. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
    13. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    14. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    15. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    16. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.10. MUTAGENITA (“IN VITRO“ CYTOGENETICKÝ TEST NA SAVČÍCH BUŇKÁCH)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Tento cytogenetický test in vitro je krátkodobý test mutagenity pro detekci strukturálních aberací chromozomů v kultivovaných savčích buňkách. Lze použít jak kultur stabilizovaných buněčných linií, tak primárních kultur. Po expozici testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti savčího exogenního metabolického aktivačního systému je do buněčné kultury aplikován mitotický jed (např. kolchidin) ke kumulaci dělících se buněk (C metafáze). Buňky jsou ve vhodné době zpracovány a pak připraveny mikroskopické preparáty. Preparáty jsou obarveny a metafáze jsou analyzovány z hlediska chromozomálních abnormalit.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Buňky
        účinné od 1. 1. 1999Používají se stabilizované buněčné linie, nebo kultury primárních buněk, např. buňky čínského křečka nebo lidské lymfocyty. Před aplikací na buňky se testované chemické látky rozpustí v kultivačním médiu nebo ve vhodném vehikulu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Metabolický aktivační systém
        účinné od 1. 1. 1999Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i za absence vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji je používána post-mitochondriální frakce doplněná kofaktory, připravená z jater hlodavců ovlivněných enzymatickým induktorem.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      účinné od 1. 1. 1999Počet kultur
      účinné od 1. 1. 1999Pro každý experimentální bod se používají nejméně dvě kultury.
      účinné od 1. 1. 1999Negativní a positivní kontroly
      účinné od 1. 1. 1999Rozpouštědlo (jestliže jako rozpouštědlo není použito kultivační médium nebo voda), aktivační směs, aktivační směs a rozpouštědlo, a neovlivněná kultura jsou použity jako negativní kontroly.
      účinné od 1. 1. 1999Mimoto zahrnuje každý experiment pozitivní kontrolu. Použije-li se k aktivaci testované chemické látky směs pro metabolickou aktivaci, je třeba jako pozitivní kontrolu použít sloučeninu, která prokazatelně vyžaduje metabolickou aktivaci.
      účinné od 1. 1. 1999Koncentrace
      účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři koncentrace studované látky. Rozpětí koncentrací by mělo být takové, aby se hodnota dekadického logaritmu lišila nejméně o jednu, přičemž nejvyšší koncentrace by měla blokovat mitotickou aktivitu asi o 50 %, nebo vykazovat jiné známky cytotoxicity. Jestliže není látka toxická, měla by být testována až na hranici rozpustnosti, nebo do maximální koncentrace 5 mg/ml.
      účinné od 1. 1. 1999Kultivační podmínky
      účinné od 1. 1. 1999Je třeba používat vhodná kultivační média a dodržovat kultivační podmínky (např. teplotu, kultivační nádoby, koncentraci CO₂ a vlhkost).
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Příprava kultur
        účinné od 1. 1. 1999Stabilizované buněčné linie: Buňky se získají ze zásobních kultur (např. trypsinací nebo setřepáním), vysejí se ve vhodné hustotě do kultivačních nádob a kultivují při 37 °C.
        účinné od 1. 1. 1999Lidské lymfocyty: ke kultivačnímu médiu se přidá fytohemaglutinin, bovinní sérum, antibiotika a plná heparinizovaná krev. Kultivace probíhá při 37 °C.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Expozice kultur testované látce
        účinné od 1. 1. 1999(a) Expozice bez směsi pro metabolickou aktivaci
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba, aby všechny expozice pokrývaly nejméně trvání jednoho celého buněčného cyklu. Okamžik fixace je třeba volit tak, aby byly analyzovány první vyskytnuvší se mitózy po expozici.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud expozice nepokrývá celou dobu buněčného cyklu, je třeba volit různé doby fixace, aby se akumulovaly buňky, které byly během expozice v různých fázích buněčného cyklu (tj. G₁, S a G₂).
        účinné od 1. 1. 1999Testované chemické látky se přidávají ke kulturám stabilizovaných buněčných linií v exponenciální fázi růstu. Kultury lidských lymfocytů se exponují v semisynchronní fázi růstu.
        účinné od 1. 1. 1999(b) Expozice se směsí pro metabolickou aktivaci
        účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka by měla být přítomna spolu s aktivačním systémem co nejdéle, aniž by přitom vyvolávala toxický účinek na buňky. Pokud by tato expozice neměla z důvodu toxicity obsáhnout dobu celého buněčného cyklu, je třeba volit různé doby fixace, aby se akumulovaly buňky, které byly během expozice v různých fázích buněčného cyklu (např.G₁, S a G₂).
        účinné od 1. 1. 1999Zpracování buněk:
        účinné od 1. 1. 1999Buněčné kultury jsou ovlivněny inhibitorem dělícího vřeténka po odpovídající dobu před jejich zpracováním. Každá kultura je zpracovávána pro přípravu preparátů k analýze chromozómů samostatně.
        účinné od 1. 1. 1999Je potřeba buňky zpracovat nejméně ve dvou časových bodech. Doporučuje se, aby jeden časový bod odpovídal přibližně jednomu buněčnému cyklu a druhý byl později. Tím se mají pokrýt všechny fáze buněčného cyklu a počítat s jeho případným zpožděním.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.3 Analýza chromozómů - příprava mikroskopických preparátů
        účinné od 1. 1. 1999Příprava zahrnuje vystavení buněk hypotonizaci, fixaci, nanesení na podložní sklíčko a obarvení.
        účinné od 1. 1. 1999Analýza
        účinné od 1. 1. 1999Nejméně 100 dobře rozprostřených metafází na kulturu se analyzuje na chromozomové aberace. Podložní sklíčka se před analýzou zakódují. U lidských lymfocytů se analyzují pouze metafáze se 46 centromerami.
        účinné od 1. 1. 1999Ve stabilizovaných buněčných liniích se vyhodnocují metafáze, jejichž počet se od modálního počtu liší o ± 2 centromery.
        účinné od 1. 1. 1999Kromě toho je třeba pro každou dávkovou úroveň zhodnotit mitotický index nebo jiný ukazatel cytotoxicity.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se shrnou do tabulky. Aberace chromatidového typu (gapy, zlomy, výměny), aberace chromozomového typu (gapy, zlomy, minutes, prstence, dicentrické a polycentrické chromozomy) a počet aberantních metafází (včetně gapů a bez gapů) se uvedou samostatně pro všechny exponované kultury a kontrolní kultury.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se zpracují odpovídajícími statistickými metodami.
  účinné od 1. 1. 1999Výsledky se porovnají s odpovídajícími negativními kontrolami.
  účinné od 1. 1. 1999Provádějí se nejméně 2 nezávislé experimenty. Jeden experiment bude postačující, je-li to vědecky zdůvodnitelné. Není nezbytně nutné provádět druhý experiment za zcela identických podmínek jako první experiment. K získání užitečných údajů je možné některé podmínky druhého experimentu pozměnit.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
  1. účinné od 1. 1. 1999- použité buňky,
  2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky: složení média, koncentrace CO₂, teplota při kultivaci, doba kultivace, dávkování, doba expozice, doba působení a koncentrace mitotického jedu, typ metabolického aktivačního systému, pozitivní a negativní kontroly,
  3. účinné od 1. 1. 1999- počet buněčných kultur,
  4. účinné od 1. 1. 1999- počet analyzovaných metafází (samostatné údaje pro jednotlivé kultury,
  5. účinné od 1. 1. 1999- mitotický index nebo jiné známky cytotoxicity
  6. účinné od 1. 1. 1999- typ a počet aberací pro exponovanou a kontrolní kulturu, modální počet chromozomů v použitých stabilizovaných buněčných liniích,
  7. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení,
  8. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
  9. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.11. MUTAGENITA (“IN VIVO“ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA CHROMOSOMŮ KOSTNÍ DŘENĚ SAVCŮ)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Tento cytogenetický test in vivo je krátkodobý test mutagenity pro detekci strukturálních chromozomových aberací. Všeobecně se analyzují chromozomové aberace v prvních mitózách po expozici. U chemických mutagenů je většina indukovaných aberací chromatidového typu.
    účinné od 1. 1. 1999Při této metodě se používají savci, kterým se vhodnou cestou aplikují testované látky a kteří se v určitých okamžicích usmrtí pro zpracování buněk kostní dřeně. Před usmrcením zvířat se tato navíc exponují mitotickému jedu, např. kolchicinu, ke kumulaci dělících se buněk (C-metafáze). Z buněk se připraví mikroskopické preparáty sušené na vzduchu a obarví se. Metafáze se mikroskopicky vyšetřují k určení chromozomových aberací.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky se rozpustí ve fyziologickém roztoku. Pokud jsou v něm nerozpustné, rozpustí se nebo suspendují ve vhodném vehikulu.
      účinné od 1. 1. 1999Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Použije-li se pro usnadnění dávkování vehikulum, nesmí ani reagovat s testovanou látkou, ani působit toxicky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Používají se hlodavci, např. potkani, myši nebo čínští křečci. Zdravá dospělá zvířata v mladém věku se náhodně rozdělí do exponovaných a kontrolních skupin.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999V každé experimentální i kontrolní skupině se používá nejméně pět samic a pět samců. Pokud plán experimentu předpokládá více intervalů zpracování po expozici, je třeba použít 10 zvířat na každý interval zpracování a skupinu.
        účinné od 1. 1. 1999Pro skupinu positivní kontroly postačuje jeden časový interval zpracování buněk.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Obvykle by se měly testované látky aplikovat jen jednou. Na základě toxikologických informací jsou možné opakované aplikace. Jsou však na místě jen tam, kde testovaná látka nemá žádné cytotoxické účinky na buňky kostní dřeně. Obvyklými způsoby aplikace jsou orální aplikace nebo intraperitoneální injekce. Podle potřeby jsou vhodné i jiné způsoby aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Pro pozitivní kontrolu se používá látka, o které je známo, že způsobuje in vivo chromozomové aberace. Negativní kontrolní skupina (s rozpouštědlem) tvoří rovněž součást každého experimentu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Volba dávek
        účinné od 1. 1. 1999V základním kroku se používá jedna dávka testované látky. Jde o maximální tolerovanou dávku nebo takovou dávku, která vyvolává určité příznaky cytotoxicity, např. částečnou inhibici mitózy.
        účinné od 1. 1. 1999Maximální (limitní) dávka u „netoxických“ sloučenin, jejíž efekt po jednorázové aplikaci musí být zhodnocen, je 2 000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti.
        účinné od 1. 1. 1999Jestliže se použije opakované dávkování, limitní dávka je 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti a den.
        účinné od 1. 1. 1999Je možno zvolit další dávky, je-li pro to vědecký podklad.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud test slouží jako verifikační metoda, měla by se použít nejméně dvě další dávkování.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Test může být proveden dvěmi různými způsoby:
      účinné od 1. 1. 1999(a) Zvířatům se jednou aplikuje maximální tolerovaná dávka. Buňky jsou odebírány 24 h po aplikaci. Jestliže výsledky jsou v této fázi jasně positivní, další odběr buněk není nutný. Jestliže však výsledky jsou negativní, nebo pochybné, zvolí se dva časové intervaly odběru buněk v rozmezí 6 - 48 h, aby testovanou látkou byl ovlivněn celý buněčný cyklus.
      účinné od 1. 1. 1999Jestliže jsou použity další úrovně dávek, zpracování by se mělo provést v nejcitlivějším časovém intervalu a pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.
      účinné od 1. 1. 1999(b) Pokud z informací o farmakokinetice a metabolismu vyplývá, že jsou vhodné opakované aplikace, jsou možné. Zvířata by se pak měla usmrtit 6 a 24 hodin po poslední aplikaci.
      účinné od 1. 1. 1999Zpracování kostní dřeně
      účinné od 1. 1. 1999Před usmrcením zvířat se jim intraperitoneálně vstříkne vhodná dávka mitotického jedu, aby se získal dostatečně velký počet buněk, které jsou v C-metafázi. Kostní dřeň se získá vypláchnutím izotonickým roztokem z obou stehenních kostí zvířat, která byla usmrcena bezprostředně předtím. Po vhodném hypotonickém zpracování se buňky fixují, nakapou na sklíčko a po vysušení na vzduchu se obarví.
      účinné od 1. 1. 1999Analýza
      účinné od 1. 1. 1999Podložní sklíčka se před mikroskopickou analýzou zakódují. Na jedno zvíře se vyšetřuje na strukturální chromozómové aberace nejméně 50 dobře rozprostřených metafází s úplným počtem centromer. Mimoto je možno pro každé zvíře stanovit mitotický index.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se shrnou do tabulky. Chromatidové a izochromatidové aberace (gapy, zlomy, výměny), a mitotické indexy, pokud byly zjištěny, se uvedou samostatně pro všechna exponovaná i kontrolní zvířata. Mimoto je třeba pro každou experimentální i kontrolní skupinu uvést průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
  1. účinné od 1. 1. 1999- druh, kmen a stáří použitých zvířat,
  2. účinné od 1. 1. 1999- počet zvířat (samců/samic) v experimentálních a kontrolních skupinách,
  3. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky: detailní popis expozice resp. odběr vzorků, dávkování, trvání expozice, použitý mitotický jed a jeho koncentrace,
  4. účinné od 1. 1. 1999- počet analyzovaných metafází na jedno zvíře,
  5. účinné od 1. 1. 1999- mitotický index, pokud je znám,
  6. účinné od 1. 1. 1999- druh a počet aberací samostatně pro exponovaná a kontrolní zvířata,
  7. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení,
  8. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
  9. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.12. MUTAGENITA (MICRONUCLEUS TEST)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Mikronukleus test je krátkodobý test pro důkaz poškození chromozomů nebo poškození dělicího aparátu chemickými látkami in vivo. Základem této metody je zvýšený výskyt mikrojader v polychromatických erytrocytech exponovaných zvířat ve srovnání s kontrolními zvířaty.
    účinné od 1. 1. 1999Mikrojádra se tvoří z fragmentů chromozomů nebo celých chromozómů opožděných v mitóse. Při vývoji erytrocytů z erytroblastů je jádro vytlačeno, zatímco mikronukleus může zůstat v cytoplasmě. V tomto testu se proto vyhodnocují mladé polychromní erytrocyty z kostní dřeně laboratorních savců, kterým byla vhodnou cestou aplikována testovaná látka. Kostní dřeň se vypláchne ze stehenních kostí zvířat, zhotoví se nátěry a obarví se. Mikroskopicky se zjišťuje počet mikrojader v polychromních erytrocytech a mimoto se stanoví poměr polychromních erytrocytů k normochromním.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky se rozpustí v isotonickém roztoku. Pokud jsou v něm nerozpustné, rozpustí se nebo se suspendují ve vhodném vehikulu. Použije-li se vehikulum, nesmí ani reagovat s testovanou látkou, ani působit toxicky. Obvykle se používají čerstvě připravené roztoky testované látky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Doporučuje se používat myši, je však možno používat i jiné savce. Zdravá dospělá zvířata v mladém věku se náhodně rozdělí do exponovaných a kontrolních skupin.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999V každé experimentální i kontrolní skupině se používá nejméně pět samic a pět samců. Pokud plán experimentu předpokládá více intervalů zpracování po expozici, je třeba použít 10 zvířat na každý interval zpracování a skupinu. Pro skupinu positivní kontroly postačuje jeden časový interval zpracování buněk.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Obvykle by se měly testované látky aplikovat jen jednou. Na základě toxikologických informací jsou možné opakované aplikace. Jsou však na místě jen tam, kde testovaná látka nemá žádné cytotoxické účinky na buňky kostní dřeně. Obvyklými způsoby aplikace jsou orální aplikace nebo intraperitoneální injekce. Podle potřeby jsou vhodné i jiné způsoby aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Při každém experimentu se používají jak pozitivní, tak negativní (s rozpouštědlem) kontroly.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Volba dávek
        účinné od 1. 1. 1999V základním kroku se používá jedna dávka testované látky. Jde o maximální tolerovanou dávku nebo takovou dávku, která vyvolává určité příznaky cytotoxicity, např. změnu v poměru polychromních a normochromních erytrocytů
        účinné od 1. 1. 1999Maximální (limitní) dávka u „netoxických“ sloučenin, jejíž efekt po jednorázové aplikaci musí být zhodnocen, je 2 000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti.
        účinné od 1. 1. 1999Jestliže se použije opakované dávkování, limitní dávka je 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti a den.
        účinné od 1. 1. 1999Je možno zvolit další dávky, je-li pro to vědecký podklad.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud test slouží jako verifikační metoda, měla by se použít nejméně dvě další dávkování.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Test může probíhat dvěma různými způsoby:
      účinné od 1. 1. 1999(a) Zvířata jsou exponována testované látce jednou. Zpracování by se mělo provést v okamžiku nejvyšší četnosti mikrojader, který se však může lišit u různých látek. Proto je kostní dřeň odebírána nejméně ve dvou intervalech ne však dříve než 12 h a ne později než 48 h po aplikaci testované látky.
      účinné od 1. 1. 1999Jestliže jsou použity další úrovně dávek, zpracování by se mělo provést v nejcitlivějším okamžiku a pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.
      účinné od 1. 1. 1999(b) Pokud z informací o farmakokinetice a metabolismu vyplývá, že jsou vhodné opakované aplikace, je možné je použít. Zvířata by se pak měla usmrtit v jednom intervalu ne dříve, než 12 h po poslední aplikaci.
      účinné od 1. 1. 1999Zpracování kostní dřeně
      účinné od 1. 1. 1999Kostní dřeň se získá vypláchnutím bovinním sérem z obou stehenních kostí zvířat, která byla usmrcena bezprostředně předtím. Sedimentace buněk se provádí centrifugováním, supernatant se odstraní. Kapky homogenní buněčné suspenze se nanesou na podložní sklíčko, připraví se nátěry a po vysušení na vzduchu se obarví.
      účinné od 1. 1. 1999Analýza
      účinné od 1. 1. 1999Podložní sklíčka se před mikroskopickou analýzou zakódují. Na jedno zvíře se pro stanovení četnosti mikronukleů analyzuje nejméně 1000 polychromních erytrocytů.
      účinné od 1. 1. 1999Poměr normochromních erytrocytů k polychromním se stanoví pro každé jednotlivé zvíře z 1000 erytrocytů.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se shrnou do tabulky. Počet vyhodnocených polychromních erytrocytů, počet polychromních erytrocytů s mikronukley, procento buněk s mikronukley a poměr normochromních a polychromních erytrocytů se uvedou samostatně pro všechna exponovaná zvířata i pro kontrolní zvířata. Mimoto je třeba pro každou experimentální i kontrolní skupinu uvést průměrné hodnoty a směrodatné odchylky. Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
  1. účinné od 1. 1. 1999- druh, kmen a stáří použitých zvířat,
  2. účinné od 1. 1. 1999- počet zvířat (samců/samic) v experimentálních a kontrolních skupinách,
  3. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky: detailní popis expozice a odběru vzorků, dávkování, údaje o toxicitě, o negativních a pozitivních kontrolách,
  4. účinné od 1. 1. 1999- kritéria pro klasifikaci mikronukleů,
  5. účinné od 1. 1. 1999- vztah dávka-účinek, je-li to možné
  6. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení,
  7. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
  8. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.13. MUTAGENITA (ESCHERICHIA COLI - TEST ZPĚTNÉ MUTACE)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Reverzní systém na tryptofanu (trp) závislých kmenů E. coli je mikrobiální test, v němž se měří změna trp^- → trp⁺ indukovaná chemickými látkami, které způsobují záměny bazí v genomu organismu.
    účinné od 1. 1. 1999Bakterie se vystaví působení testované látky s přídavkem a bez přídavku systému metabolické aktivace. Po přiměřené inkubační době na minimálním médiu se spočítají kolonie revertant a porovnají s počtem spontánních revertujících buněk v neovlivněné kontrolní kultuře a v kontrolní kultuře s přídavkem pouze rozpouštědla.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    účinné od 1. 1. 1999K provedení experimentu je možno použít dvou metod:
    účinné od 1. 1. 1999(1) metody s předinkubací
    účinné od 1. 1. 1999(2) přímý miskový test; při něm se smísí bakterie a testovaná látka s vrchním agarem a vylije se na povrch Petriho misky se selektivním médiem.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Bakterie
        účinné od 1. 1. 1999Bakterie se kultivují při 37 °C do pozdní exponenciální, resp. do časné stacionární fáze. Hustota buněk má činit asi 10⁸ - 10⁹ na 1 ml.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Metabolická aktivace
        účinné od 1. 1. 1999Bakterie mají být vystaveny působení testované látky jak s přídavkem, tak i bez přídavku vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaný systém je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Testovací kmeny
        účinné od 1. 1. 1999Používají se tři kmeny - WP2, WP2 uvr A a WP2 uvr A pKM 101. Je nezbytné používat standardizované metody kultivace a uchovávání kultur kmenů. Je třeba kontrolovat podmínky růstu a genetické vlastnosti kmenů, jejich citlivost vůči ultrafialovému záření a mitomycinu C a rezistenci kmene WP2 uvr A pKM 101 vůči ampicilinu. Počet spontánních revertant má být pro všechny kmeny v rozmezí očekávaného rozptylu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Média
        účinné od 1. 1. 1999Pro růst a selekci mutantů se používá vhodné selektivní médium společně s vhodným vrchním agarem.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Je nutno současně nasadit jak neexponované kultury, tak kultury doplněné rozpouštědly. Pozitivní kontroly je nutno provádět pro tyto dva účely:
        účinné od 1. 1. 1999a) Potvrzení citlivosti bakteriálních kmenů. Pro testy bez metabolické aktivace je možno jako positivní kontroly používat metylmetansulfonát, 4-nitrochinolinoxid nebo etylnitrosomočovinu.
        účinné od 1. 1. 1999b) Důkaz aktivity odpovídajícího metabolického aktivačního systému. Jako pozitivní kontrolní látka je pro ověření metabolické aktivity pro všechny kmeny vhodný 2-aminoantracen. Pokud je to možné, měla by se pozitivní kontrola provést s látkou, která patří ke stejné třídě chemických látek jako testovaná látka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Koncentrace testované látky na jednu misku
        účinné od 1. 1. 1999Použije se nejméně pět různých koncentrací testované látky, které se od sebe liší o semilogaritmické rozdíly. Látky se zkoušejí až po mez rozpustnosti resp. toxicity. Toxicita se prokáže snížením počtu spontánních revertant, sníženým růstem pozadí nebo na základě přežívání bakterií v exponovaných kulturách. Netoxické látky je třeba testovat až do koncentrace 5 mg/misku, než je možno je považovat za negativní.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Podmínky inkubace
        účinné od 1. 1. 1999Inkubace misek se provádí při 37 °C 48 až 72 hodin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Při přímém miskovém testu bez metabolické aktivace se přidá testovaná látka a 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury k 2,0 ml vrchního agaru. Při testech s metabolickou aktivací se po přidání testované látky a bakterií k vrchnímu agaru přidá 0,5 ml aktivační směsi s vhodným množstvím postmitochondriální frakce. Obsah každé zkumavky se promísí a vylije na povrch misky se selektivním médiem. Po ztuhnutí vrchního agaru se misky inkubují při 37 °C 48 až 72 hodin. Po uplynutí inkubační doby se spočítají revertantní kolonie na misku.
      účinné od 1. 1. 1999Při metodě s předinkubací se připraví směs z testované látky, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury a vhodného množství aktivační směsi nebo stejného množství tlumivého roztoku a určitou dobu se inkubuje, než se přidá 2,0 ml vrchního agaru. Další průběh se neliší od miskové metody.
      účinné od 1. 1. 1999U obou metod je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Uvedou se počty revertantních kolonií na misku jak pro kontrolní série, tak pro série s testovanou látkou. Je třeba uvést jednotlivé i průměrné hodnoty revertant na misku a směrodatné odchylky jak pro testovanou látku, tak pro kontrolní stanovení.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.
  účinné od 1. 1. 1999Je třeba provést nejméně dva nezávislé pokusy. Není nutné, aby druhý pokus proběhl identicky s prvním experimentem. Může být výhodné změnit určité podmínky testu a získat tak další důležité údaje.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
  1. účinné od 1. 1. 1999- bakterie a použité kmeny;
  2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky: koncentrace, toxicita, složení médií, metodika (preinkubace - inkubace), metabolický aktivační systém, referenční látky, negativní kontroly;
  3. účinné od 1. 1. 1999- počet kolonií na misku, průměrná hodnota revertant na misku, směrodatná odchylka, vztah dávka-účinek, pokud je to možné;
  4. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků;
  5. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.14. MUTAGENITA (SALMONELLA TYPHIMURIUM - TEST ZPĚTNÉ MUTACE)

účinné od 1. 1. 19991. METODA

účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
účinné od 1. 1. 1999Reverzní systém na histidinu (his) závislých kmenů Salmonelly typhimurium je mikrobiální test, ve kterém se měří změna his^- → his⁺ indukovaná chemickými látkami typu záměny bazí nebo posunových mutací v genomu organismu.
účinné od 1. 1. 1999Bakterie se vystaví působení testované látky s přídavkem a bez přídavku metabolického aktivačního systému a nanesou se na minimální médium. Po přiměřené inkubační době se spočítají kolonie revertovaných buněk a porovnají s počtem spontánních revertant v neexponované kontrolní kultuře a v kontrolní kultuře s přídavkem pouze rozpouštědla.

účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody

účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Bakterie
  účinné od 1. 1. 1999Čerstvě připravené bakteriální kultury se kultivují při 37 °C do pozdní exponenciální, resp. do časné stacionární fáze růstu. Hustota buněk má činit asi 10⁸ - 10⁹ buněk na ml.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Metabolická aktivace
  účinné od 1. 1. 1999Bakterie mají být vystaveny působení testované látky jak s přídavkem, tak i bez přídavku vhodného metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaný systém je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory.

účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky

účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Testovací kmeny
účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně čtyři kmeny - TA 1535, TA 1537 nebo TA 97, TA 98 a TA 100. Doplňkově je možno používat další kmeny jako TA 1538 a TA102. Je nezbytné používat jednotné metody kultivace a uchovávání kultur kmenů. Musí být kontrolovány podmínky růstu a genetické vlastnosti kmenů, jejich citlivost vůči ultrafialovému záření a krystalové violeti a jejich rezistenci vůči ampicilinu. Počet spontánních revertant se má pohybovat pro všechny kmeny v rozmezí očekávaného rozptylu.

účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Média
účinné od 1. 1. 1999Je třeba používat vhodné selektivní médium v kombinaci s vhodným vrchním agarem.

účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

účinné od 1. 1. 1999Je nutno současně nasadit jak neexponované kultury, tak kontrolní kultury exponované rozpouštědlům.

účinné od 1. 1. 1999Pozitivní kontroly je nutno provádět pro tyto dva účely:

účinné od 1. 1. 1999a) Potvrzení citlivosti bakteriálních kmenů. Pro testy bez metabolické aktivace je možno používat tyto látky:

účinné od 1. 1. 1999

Dodatek Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace: Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu
Kmen	Látka používaná pro reverzi
TA 1535, TA 100	azid sodný
TA 1538, TA 98, TA 97	2-nitrofluoren
TA 1537	9-aminoakridin
TA 102	kumenhydroperoxid

účinné od 1. 1. 1999b) Důkaz aktivity vhodného metabolizujícího systému. Jako pozitivní kontrolní látka je pro ověření metabolické aktivity pro všechny kmeny vhodný 2-aminoantracen. Pokud je to možné, měla by se pozitivní kontrola provést s látkou, která patří ke stejné třídě chemických látek jako testovaná látka.

účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Koncentrace testované látky na jednu misku
účinné od 1. 1. 1999Použije se nejméně pět různých koncentrací testované látky, které se od sebe liší o semilogaritmické rozdíly. Látky se zkoušejí až po mez rozpustnosti resp. toxicity. Toxicita se prokáže snížením počtu spontánních revertant, sníženým růstem pozadí nebo podle přežívání bakterií v exponovaných kulturách. Netoxické látky je třeba zkoušet až do koncentrace 5 mg/misku, než je možno je považovat za negativní.

účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Podmínky inkubace
účinné od 1. 1. 1999Inkubace misek se provádí při 37 °C 48 až 72 hodin.

účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
účinné od 1. 1. 1999Při přímém miskovém testu bez metabolické aktivace se přidá testovaná látka a 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury k 2,0 ml vrchního agaru. Při testech s metabolickou aktivací se po přidání testované látky a bakterií k vrchnímu agaru přidá 0,5 ml aktivační směsi s vhodným množstvím postmitochondriální frakce. Obsah každé zkumavky se promísí a vylije na povrch misky se selektivním médiem. Po ztuhnutí vrchního agaru se misky inkubují při 37 °C 48 až 72 hodiny. Po uplynutí inkubační doby se spočítají revertantní kolonie na misku. Při metodě s předinkubací se připraví směs sledované látky, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury, vhodného množství aktivační směsi nebo stejného množství tlumivého roztoku a předběžně se inkubuje, načež se přidá 2,0 ml vrchního agaru. Další průběh se neliší od miskové metody.
účinné od 1. 1. 1999U obou metod je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci.

účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
účinné od 1. 1. 1999Uvedou se počty revertantních kolonií na misku jak pro kontrolní série, tak pro série s testovanou látkou.
účinné od 1. 1. 1999Je třeba uvést jednotlivé i průměrné hodnoty revertantních kolonií na misku a směrodatné odchylky jak pro testovanou látku, tak pro kontrolní stanovení.
účinné od 1. 1. 1999Údaje se vyhodnotí pomocí vhodných statistických metod.
účinné od 1. 1. 1999Je třeba provést nejméně dva nezávislé pokusy. Není nutné, aby druhý pokus proběhl identicky s prvním experimentem. Může být výhodné změnit určité podmínky testu a získat tak další důležité údaje.

účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu
účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje pokud možno tyto informace:
1. účinné od 1. 1. 1999- bakterie a použitý kmen,
2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky: koncentrace, toxicita, složení médií, metody (preinkubace - inkubace), metabolický aktivační systém, referenční látky, negativní kontroly,
3. účinné od 1. 1. 1999- počet kolonií na misku, průměrná hodnota revertantních kolonií na misku, směrodatná odchylka, vztah dávka-účinek, pokud je to možné,
4. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
5. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.15 GENOVÉ MUTACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být užity pro určení produkce genových mutací indukovaných chemickými látkami bez a s metabolickou aktivací.
    účinné od 1. 1. 1999Jsou využívány forward mutační systémy u haploidních kmenů, jako je míravznikumutací z červených, adenin vyžadujících mutant (ade-l, ade-2) na dvojité, adenin vyžadující bílé mutanty a selektivní systémy jako je indukce resistence ke canavaninu a cykloheximidu.
    účinné od 1. 1. 1999Nejlépe ověřený reversní mutační systém zahrnuje využití haploidního kmene XV 185-14C s okrovými (ochre) nonsense mutacemi ade 2-l, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Mutace jsou vratné působením mutagenů typu záměny bazí, které indukují mutace ve specifickém místě, nebo okrové supresorové mutace. XV 185-14C nese rovněž his 1 -7 marker, missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.
    účinné od 1. 1. 1999U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D₇, který je homozygotní pro ilv 1-92.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.
      účinné od 1. 1. 1999Metabolická aktivace
      účinné od 1. 1. 1999Buňky mají být exponovány testovaným látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
      účinné od 1. 1. 1999Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Testovací kmeny
        účinné od 1. 1. 1999Haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D₇ jsou nejužívanější pro studie genových mutací. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Media
        účinné od 1. 1. 1999Odpovídající kultivační media jsou užívána pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Kultivační podmínky
        účinné od 1. 1. 1999Misky jsou inkubovány po sedm dní při 28 až 30 °C ve tmě.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Frekvence spontánních mutací
        účinné od 1. 1. 1999Frekvence spontánních mutací u subkultur má být v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.7 Počet replikací
        účinné od 1. 1. 1999Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu s prototrofními buňkami a u životnosti buněk. U experimentů užívajících markery jako hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí musí být počet misek zvýšen, aby byly získány statisticky relevantní údaje.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu

Následující stránka

účinné od 1. 1. 1999Dodatek

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu

účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu