Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 251/1998 Sb., účinné od 10. 11. 1998

Předchozí stránka

účinné od 1. 1. 1999Ovlivnění kmenů S. cerevisiae je obvykle prováděno ve zkumavce v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách: 1-5 x 10⁷ buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 30 °C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné. Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí genových mutací.

účinné od 1. 1. 1999Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.

účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
účinné od 1. 1. 1999Údaje mají být presentovány v tabulkové formě a zahrnují počet kolonií, počet mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací. Všechny výsledky mají být potvrzeny nezávislým experimentem. Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
  1. účinné od 1. 1. 1999- použitých kmenech,
  2. účinné od 1. 1. 1999- podmínkách testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
  3. účinné od 1. 1. 1999- podmínkách vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
  4. účinné od 1. 1. 1999- počtu kolonií, počtu mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací, vztahu dávky a účinku, pokud je to možné,
  5. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
  6. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.16 MITOTICKÁ REKOMBINACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Mitotická rekombinace u Saccharomycs cerevisiae může být detekována mezi geny (obecněji mezi genem a jeho centromerou) a uvnitř genů. První případ je nazýván mitotické překřížení a vytváří reciproční produkty, kdežto druhý případ je většinou nereciproční a je nazýván genová konverse. Překřížení je obecně testováno na základě tvorby recesivních homozygotních kolonií nebo sektorů vzniklých u heterozygotních kmenů, genová konverse je testována na základě tvorby prototrofních revertant vzniklých u auxotrofního heteroalelického kmene, který nese dvě různé defektní alely téhož genu. Nejčastěji užívané kmeny pro detekci mitotické genové konverse jsou D₄ (heteroalelický v ade 2 a trp 5), D₇ (heteroalelický v trp 5), BZ₃₄ (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotické překřížení produkující červené a růžové sektory může být testováno u D₅ nebo D₇ (který rovněž měří mitotickou genovou konversi a reversní mutace v ilv 1-92). Oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely ade 2.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.
      účinné od 1. 1. 1999Metabolická aktivace
      účinné od 1. 1. 1999Buňky mají být vystaveny působení testovaných látek jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného exogenního metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Testovací kmeny
        účinné od 1. 1. 1999Nejužívanější jsou diploidní kmeny D₄, D₅, D₇ a JD1. Užití jiných kmenů může být rovněž vhodné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Media
        účinné od 1. 1. 1999Odpovídající kultivační media jsou užívána pro určení přežívajících buněk a frekvenci mitotické rekombinace
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. Musí být brán ohled na cytotoxicitu a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.
        účinné od 1. 1. 1999Buňky mohou být vystaveny působení testované látky buď ve stacionární fázi nebo během růstu po dobu až 18 h. Kultury dlouhodobě ovlivňované mají být mikroskopicky kontrolovány pro tvorbu spor, jejichž přítomnost test znehodnocuje.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Podmínky inkubace
        účinné od 1. 1. 1999Misky jsou inkubovány ve tmě po čtyři až sedm dní při 28-30 °C. Misky použité pro průkaz červených a růžových sektorů tvořených mitotickým překřížením mají být umístěny v chladničce (cca 4 °C) po další 1 - 2 dny před počítáním, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Spontánní frekvence mitotické rekombinace
        účinné od 1. 1. 1999Mají být užity subkultury s frekvencí spontánních mutací v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.7 Počet replikací
        účinné od 1. 1. 1999Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu prototrofních buněk tvořených mitotickou genovou konversí a pro určení životnosti buněk. V případě testování recesivní homozygosity tvořené mitotickým překřížením má být počet misek zvýšen, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.8 Postup
        účinné od 1. 1. 1999Ovlivnění S. cerevisiae probíhá obvykle jako zkumavkový test v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách. 1-5 × 10⁷ buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 30 °C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné.
        účinné od 1. 1. 1999Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí mitotické rekombinace.
        účinné od 1. 1. 1999Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje mají být presentovány v tabulkové formě a zahrnují počet kolonií, počet rekombinací, přežívajících buněk a frekvenci rekombinací.
  účinné od 1. 1. 1999Výsledky mají být potvrzeny v nezávislém experimentu.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má, pokud možno, obsahovat následující informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- použité kmeny,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
    3. účinné od 1. 1. 1999- podmínky vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
    4. účinné od 1. 1. 1999- počet kolonií, počet rekombinant, přežívajících buněk a frekvence rekombinací, vztah dávky a účinku, pokud je to možné, statistické hodnocení dat,
    5. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    6. účinné od 1. 1. 1999- vyhodnocení výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.17 “IN VITRO“ TEST NA GENOVÉ MUTACE V SAVČÍCH BUŇKÁCH
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Buněčné kultury savčích buněk mohou být použity k detekci mutací indukovaných chemickými látkami. Nejširší použití mají buněčné linie včetně myších lymfomových buněk L5178Y, CHO a V-79 linie buněk čínského křečka. V těchto buněčných liniích jsou nejčastěji užívanými systémy detekce mutací v lokusech thymidin kinasy (TK), hypoxanthin guanin phosphoribosyl transferasy (HPRT), (dříve HGPRT) a Na⁺/K⁺ ATPasy. Systémy TK a HPRT detekují mutace párování basí; frameshift mutace a malé delece. Systém Na⁺/K⁺ detekuje pouze mutace párování basí.
    účinné od 1. 1. 1999Buňky s deficiencí thymidin kinasy (TK), vyvolanou forward mutací TK⁺ - TK^-, jsou resistentní k bromodeoxyuridinu (BrDU), fluorodeoxyuridinu (FdU) nebo trifluorothymidinu (TFT), protože tyto antimetabolity nejsou inkorporovány do buněčných nukleotidů “salvage“ enzymatickým systémem thymidin kinasy. Nukleotidy potřebné pro buněčný metabolismus jsou získávány výhradně syntésou de novo. Jestliže v přítomnosti thymidin kinasy jsou BrDU, FdU, nebo TFT inkorporovány do nukleotidů, je výsledkem inhibice buněčného metabolismu a cytotoxický efekt. Proto jsou mutované buňky schopné proliferace v přítomnosti BrDU, FdU, nebo TFT, zatímco normální buňky obsahující thymidin kinasu nejsou proliferace schopny. Podobně buňky s deficiencí HPRT jsou selektivně resistentní k 8-azaguaninu (AG) nebo k 6-thioguaninu (TG). Buňky s alterací Na⁺/K⁺ ATPasy jsou selektivně resistentní k ouabainu.
    účinné od 1. 1. 1999Cytotoxicita je stanovena měřením účinku testovaného materiálu na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency) nebo rychlostí růstu kultury. Frekvence mutací je určována inokulací známého počtu buněk jak do média obsahujícího selektivní látky k detekci mutovaných buněk, tak do média bez selektivních látek k určení počtu přežívajících buněk. Po ukončení kultivace jsou počítány kolonie. Frekvence mutací je určována z počtu kolonií mutovaných buněk korigovaného počtem přežívajících buněk.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Kriteria kvality
    účinné od 1. 1. 1999Žádná.
  1. účinné od 1. 1. 19991.3 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.1 Příprava
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.1.1 Buňky
        účinné od 1. 1. 1999Pro tento test je dostupná řada buněčných linií. Patří mezi ně sublinie L5178Y, buňky čínského křečka CHO, nebo V-79 s výraznou citlivostí k chemickým mutagenům, s vysokou schopností vytvářet kolonie (cloning efficiency) a s nízkou frekvencí spontánních mutací. U buněk musí být pravidelně kontrolována stabilita karyotypu a měly by být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty. Ostatní typy buněk mohou být použity pouze s podmínkou, že oprávněnost jejich použití jako testu pro chemicky indukované genové mutace je plně prokázána.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.1.2 Médium
        účinné od 1. 1. 1999Musí být použita vhodná kultivační média a dodrženy vhodné kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost). Média a séra musí být vybrána s ohledem na selektivní system a typ buněk použitých v testu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.1.3 Testovaná látka
        účinné od 1. 1. 1999Testované látky se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu nebo ve vhodném rozpouštědle. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk nebo rychlost růstu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.1.4 Metabolický aktivační systém
        účinné od 1. 1. 1999Buňky musí být exponovány testované látce jak v přítomnosti, tak i bez použití exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.1 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Do každého experimentu musí být zařazeny positivní kontroly zahrnující jak přímo působící látky, tak látky vyžadující metabolickou aktivaci. Zároveň musí být také použity negativní kontroly (s rozpouštědlem).
        účinné od 1. 1. 1999Dále jsou uvedeny příklady látek, které mohou být použity jako positivní kontroly:
        účinné od 1. 1. 1999- přímo působící látky: etylmetansulfonát, hycanthon,
        účinné od 1. 1. 1999- nepřímo působící látky (vyžadující metabolickou aktivaci): 2-acetylaminofluoren, 7,12-dimetylbenzantracen, N-nitrosodimetylamin.
        účinné od 1. 1. 1999Je-li to potřeba, zařazuje se dodatečná positivní kontrola ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.2 Koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Musí být použito několik koncentrací testované látky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace indukuje nízkou úroveň přežívajících buněk a počet přežívajících buněk v nejnižší koncentraci má být přibližně stejný jako v negativní kontrole.
        účinné od 1. 1. 1999Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.3 Vlastní experiment
      účinné od 1. 1. 1999Počet buněk použitých pro jednu kulturu musí být odvozen od spontánní frekvence mutací. Obvykle se používá počet živých buněk, který je 10ti násobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací.
      účinné od 1. 1. 1999Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu, ve většině případů postačuje délka expozice v délce 2 - 5 hodin. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce společně jak s vhodným metabolickým systémem, tak i bez něho. Po ukončení expozice jsou buňky promyty čistým médiem bez testované látky a dále kultivovány, aby mohla být zhodnocena jejich viabilita a projev mutačního fenotypu.
      účinné od 1. 1. 1999Ke konci fáze exprese, která by měla být dostatečně dlouhá k vyvolání optimální fenotypické exprese indukovaných mutací, jsou buňky kultivovány v médiu s a bez selektivních látek ke zhodnocení počtu mutací a životnosti buněk.
      účinné od 1. 1. 1999Všechny výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se shrnou do tabulky. Počet mutací a přežívání buněk musí být vyjádřeno pro testovanou látku i pro kontroly a pro každou misku samostatně. Dále je třeba uvést průměrný počet kolonií na misku a směrodatnou odchylku. Frekvence mutací musí být vyjádřena jako počet mutantů na počet přežívajících buněk. Přežívání buněk a schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency se vyjadřuje jako procento hodnot kontrolní skupiny.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje musí být vyhodnoceny pomocí vhodných statistických metod.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
2. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
  1. účinné od 1. 1. 1999- použité buněčné linii, počtu kultur v pokusu, metodách udržování buněčných kultur,
  2. účinné od 1. 1. 1999- podmínkách experimentu: složení média, koncentrace CO₂, koncentrace testované látky, použité rozpouštědlo, kultivační teplota, délka kultivace, trvání fáze exprese (včetně počtu inokulovaných buněk a subkultur), trvání expozice, hustota buněk během expozice, druh použitého metabolického aktivačního systému, positivní a negativní kontroly, použité selektivní látky,
  3. účinné od 1. 1. 1999- zdůvodnění výběru koncentrací,
  4. účinné od 1. 1. 1999- metodě použití k výpočtu živých a mutovaných buněk,
  5. účinné od 1. 1. 1999- statistickém vyhodnocení,
  6. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
  7. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.18 POŠKOZENÍ DNA REPARACE - NEPLÁNOVANÁ SYNTÉZA DNA - SAVČÍ BUŇKY IN VITRO
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Test neplánované syntézy DNA (UDS) umožňuje měřit reperační syntézu DNA po excizi a odstranění části DNA obsahující oblast poškození indukovaného chemickými, nebo fyzikálními faktory. Test je založen na inkorporaci značeného tymidínu (³H-TdR) do DNA savčích buněk, které nejsou v S fázi buněčného cyklu. Vzestup ³H-TdR je stanoven autoradiograficky, nebo kapalnou scintilační metodou (LSC) v exponovaných buňkách. Používají se primární buněčné kultury potkaních hepatocytů, které jsou exponovány testovanou látkou jak v přítomnosti tak i v nepřítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému. UDS může být také stanovena v systému in vivo.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky a sloučeniny použité jako kontrolní, nebo referenční se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Další ředění se provádí jenom kultivačním médiem. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk.
      účinné od 1. 1. 1999Používají se pouze primokultury potkaních hepatocytů, lidských lymfocytů, nebo stabilizovaných buněčných linií (lidské diploidní fibroblasty).
      účinné od 1. 1. 1999Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Počet kultur
        účinné od 1. 1. 1999Pro každý experimentální bod je potřeba nejméně dvou buněčných kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo méně, je-li to vědecky zdůvodnitelné) pro LSC UDS.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999V každém experimentu musí být současně zařazeny negativní a positivní kontroly v přítomnosti i v nepřítomnosti metabolického aktivačního systému.
        účinné od 1. 1. 1999Jako positivní kontrolu lze pro potkaní hepatocyty použít 7,12-dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA), nebo 2-acetylaminofluoren (2-AAF). Jako positivní kontrolu pro stabilisované buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC bez metabolické aktivace lze použít 4-nitroquinolin-N-oxid (4-NQO). Jako positivní kontrolu při použití metabolického aktivačního systému lze použít N-dimethylnitrosamin.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Koncentrace testované látky
        účinné od 1. 1. 1999Musí být použito několik koncentrací testované látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat toxický efekt.
        účinné od 1. 1. 1999Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Buňky
        účinné od 1. 1. 1999Pro udržování kultur musí být použito vhodné růstové médium, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost. Stabilizované buněčné linie musí být pravidelně kontrolovány na přítomnost Mycoplasmat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Metabolická aktivace
        účinné od 1. 1. 1999Pro primokultury hepatocytů se metabolický aktivační systém nepoužívá. Stabilizované buněčné linie a lymfocyty jsou exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Vlastní experiment
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Příprava kultur
        účinné od 1. 1. 1999Stabilizovaná buněčná linie se připravuje ze zásobní kultury (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C.
        účinné od 1. 1. 1999Krátkodobé kultury potkanních hepatocytů se připravují tak, že se umožní čerstvě isolovaným hepatocytům přichytit se ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.
        účinné od 1. 1. 1999Kultury lidských lymfocytů jsou založeny pomocí vhodné metody.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Expozice kultur testované látce
        účinné od 1. 1. 1999Primární hepatocyty potkana. Čerstvě isolované hepatocyty potkana jsou exponovány testované látce v médiu obsahujícím ³H-TdR po vhodnou dobu. Po ukončené expozici je médium odstraněno, buňky promyty, fixovány a sušeny. Sklíčka jsou ponořena do autoradiografické emulse (alternativně může být použit stripping film), exponována, vyvolána, obarvena a vyhodnocena.
        účinné od 1. 1. 1999Stabilizované buněčné linie a lymfocyty
        účinné od 1. 1. 1999Autoradiografické techniky: Buněčné kultury jsou exponovány testované látce po vhodnou dobu a pak jsou vystaveny působení ³H-TdR. Doba působení je závislá na druhu testované látky, aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení nejvyššího vrcholu UDS je třeba ³H-TdR přidat současně s testovanou látkou, nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy je ovlivněn možnou interakcí mezi testovanou látkou a ³H-TdR. K odlišení mezi UDS a semikonzervativní replikací DNA se užívá arginin deficientní médium, nízký obsah séra, nebo aplikace hydroxyurey do kultivačního média což způsobí inhibici semikonzervativní replikace DNA.
        účinné od 1. 1. 1999Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí testované látce je třeba blokovat vstup buněk do S-fáze, jak bylo shora uvedeno. Buňky jsou pak exponovány testované látce jak bylo popsáno pro autoradiografii. Na konci kultivace je DNA extrahována z buněk a stanoven celkový obsah DNA a určen rozsah inkorporace ³H-TdR.
        účinné od 1. 1. 1999Jestliže jsou použity ve shora uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.4 Analýza
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.4.1 Vyhodnocení autoradiografie
        účinné od 1. 1. 1999Při vyhodnocování UDS v buněčné kultuře se jádra v S-fázi nehodnotí. Hodnotí se nejméně 50 buněk v každém experimentálním bodě. Preparáty je třeba zakódovat před vyhodnocováním. V každém preparátu se hodnotí několik náhodně vybraných polí. Množství inkorporovaného ³H-TdR v cytoplasmě se určí v zóně o velikostí tří jader v cytoplasmě každé hodnocené buňky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.4.2 Vyhodnocení LSC
        účinné od 1. 1. 1999Pro stanovení LSC UDS se použije přiměřený počet kultur pro každou koncentraci testované látky a pro kontroly.
        účinné od 1. 1. 1999Výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje musí být uvedeny v tabulkách.
  1. účinné od 1. 1. 19992.1 Vyhodnocení autoradiografie
    účinné od 1. 1. 1999Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn nalezených mimo buněčné jádro se zaznamenávají odděleně.
    účinné od 1. 1. 1999Rozsah inkorporace ³H-TdR do cytoplasmy a počet zrn v jádře je hodnocen pomocí průměru, mediánu a modu.
  1. účinné od 1. 1. 19992.2 Vyhodnocení LSC
    účinné od 1. 1. 1999Inkorporace ³H-TdR se zaznamenává jako dpm/μg DNA. Průměrná hodnota dpm/μpg DNA spolu se směrodatnou odchylkou se používají k vyjádření distribuce inkorporace.
    účinné od 1. 1. 1999Údaje se vyhodnocují vhodnými statistickými metodami.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- použitých buňkách, jejich hustotě a číslu pasáže v době ovlivnění kultury, počtu buněčných kultur,
    2. účinné od 1. 1. 1999- metodách použitých k udržování kultury, médiu, teplotě, koncentraci CO₂,
    3. účinné od 1. 1. 1999- testované látce, rozpouštědle, koncentracích a zdůvodnění jejich výběru v experimentu,
    4. účinné od 1. 1. 1999- metabolickém aktivačním systému,
    5. účinné od 1. 1. 1999- pokusném schématu,
    6. účinné od 1. 1. 1999- positivních a negativních kontrolách,
    7. účinné od 1. 1. 1999- použitých autoradiografických metodách,
    8. účinné od 1. 1. 1999- způsobech blokování vstupu buněk do S-fáze,
    9. účinné od 1. 1. 1999- postupech použitých k extrakci DNA, a k vyhodnocení celkového obsahu DNA při metodě LSC,
    10. účinné od 1. 1. 1999- vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
    11. účinné od 1. 1. 1999- statistickém vyhodnocení,
    12. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    13. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.19 SCE - VÝMĚNA SESTERSKÝCH CHROMATID IN VITRO
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999SCE je krátkodobý test pro detekci recipročních výměn DNA mezi dvěma sesterskými chromatidami chromozómu. SCE representují výměny identických sekvencí DNA mezi replikačními produkty v identických (homologních) lokusech. SCE pravděpodobně vyžaduje zlom a opětovné spojení, ale je zatím málo znalostí o molekulárním základě tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje diferenční značení sesterských chromatid. Toho se dosahuje inkorporací bromodeoxyuridinu (BrdU) do chromozomální DNA na dobu dvou buněčných cyklů.
    účinné od 1. 1. 1999Savčí buňky in vitro jsou exponovány testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému, je-li to potřebné. Kultivují se po dobu dvou replikačních cyklů v médiu obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se buňky ovlivní inhibitorem dělícího vřeténka (např. kolchicín) k akumulaci buněk v c-metafázi mitózy. Po ukončení kultivace jsou buňky zpracovány a připraveny preparáty pro analýzu chromozómů.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Používají se primokultury, (lidské lymfocyty) nebo stabilizované buněčné linie (ovariální buňky čínského křečka). Buněčné linie musí být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty,
      účinné od 1. 1. 1999Používají se vhodná kultivační média a kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost),
      účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se rozpouští, nebo suspenduje v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Výsledná koncentrace rozpouštědla nesmí významně ovlivnit životnost buněk, rychlost růstu nebo frekvenci SCE,
      účinné od 1. 1. 1999Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti vhodného exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Počet kultur
        účinné od 1. 1. 1999Pro každý experimentální bod se použijí nejméně dvě kultury.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Negativní a pozitivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999V každém experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s látkami s přímým mutagenním účinkem a látky vyžadující metabolickou aktivaci. Dále musí být použita negativní kontrola s použitým rozpouštědlem.
        účinné od 1. 1. 1999Jako positivní kontrolu lze použít:
        účinné od 1. 1. 1999- přímo působící mutageny: etylmetansulfonát
        účinné od 1. 1. 1999- nepřímo působící mutageny: cyklofosfamid
        účinné od 1. 1. 1999Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Testují se nejméně tři dávky. Nejvyšší koncentrace testované látky musí mít signifikantní toxický účinek, ale zároveň musí umožnit adekvátní replikaci buněk. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Příprava kultur
        účinné od 1. 1. 1999Stabilizovaná buněčná linie se připravuje se zásobní kultury (trypsinací, nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C. Pro monovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby na konci kultivace nevytvářely více než z 50 % konfluentní vrstvu. Lze také použít suspensních kultur. Lidské lymfocytární kultury se připraví z heparinizované krve běžnými postupy a inkubují při 37 °C.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Uxpozice kultur
        účinné od 1. 1. 1999Buňky jsou exponovány testované látce v exponenciální fázi růstu po vhodnou dobu. Ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, ale expozice může být prodloužena až na dva buněčné cykly, je-li to třeba. Buňky, které nemají dostatečnou vlastní metabolickou aktivitu, musí být exponovány testovanou látkou v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je testovaná látka z média odstraněna, buňky vymyty a dále kultivovány v růstovém médiu s BrdU dva replikační cykly. Alternativně mohou být buňky exponovány současně s testovanou látkou a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.
        účinné od 1. 1. 1999Lidské lymfocytární kultury jsou exponovány testovanou látkou dokud jsou v semisynchronizovaných podmínkách.
        účinné od 1. 1. 1999Buňky jsou analyzovány v druhém mitotickém dělení po expozici testované látce, která proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s BrdU je třeba udržovat v temnu, nebo ve světle zastíněné žárovky, aby se zabránilo fotolýze DNA ve které je inkorporovaný BrdU.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.3 Zpracování buněk
        účinné od 1. 1. 1999Jednu až čtyři hodniny před ukončením kultivace se do kultur přidá inhibitor dělícího vřeténka (např. kolchicín). Každá kultura se zpracovává samostatně.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.4 Příprava preparátů a barvení
        účinné od 1. 1. 1999Preparáty se připraví standardní cytogenetickou technikou. Barvení preparátů ke znázornění SCE může být provedeno několika technikami (např. fluorescenční plus Giemsa).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.5 Analýza
        účinné od 1. 1. 1999Počet analyzovaných buněk je závislý na spontánní frekvenci SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na každou kulturu. Preparáty musí být zakódovány před analýzou. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U stabilizovaných linií pouze metafáze, které se liší o ±2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se budou analyzovat SCE v oblasti centromery. Výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se zpracovávají tabulkovou formou. Zaznamenává se počet SCE v každé metafázi a počet SCE/chromozóm zvlášť pro každou metafázi v exponovaných i kontrolních skupinách.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se hodnotí vhodnými statistickými metodami.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury,
    2. účinné od 1. 1. 1999- kultivačních podmínkách: složení média, teplotě, koncentraci CO₂, koncentraci testované látky, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce expozice, inhibitoru mitozy a jeho koncentraci i jeho délce působení, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách,
    3. účinné od 1. 1. 1999- počtu kultur pro každý experimentální bod,
    4. účinné od 1. 1. 1999- způsobu přípravy mikroskopických preparátů
    5. účinné od 1. 1. 1999- počtu analyzovaných metafází (odděleně pro každou kulturu)
    6. účinné od 1. 1. 1999- průměrném počtu SCE/buňku a SCE/chromozóm (odděleně pro každou kulturu
    7. účinné od 1. 1. 1999- kritériích hodnocení SCE
    8. účinné od 1. 1. 1999- zdůvodnění výběru koncentrací
    9. účinné od 1. 1. 1999- vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
    10. účinné od 1. 1. 1999- statistickém vyhodnocení,
    11. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    12. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.20 RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ NA POHLAVÍ U DROSOPHILA MELANOGASTER
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Test na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) na Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, jak genových, tak i malých delecí, v zárodečných buňkách hmyzu. Je to test na forward mutace vhodný pro skríning mutací v přibližně 800 lokusech chromozómu X. Tyto representují asi 80 % všech lokusů X-chromozómu. X-chromozóm representuje přibližně 1/5 celého haploidního genómu.
    účinné od 1. 1. 1999Mutace v X-chromozómu se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se normálně rodí heterozygotní samici. SRLS test je výhodný vzhledem k zvláštnímu vzhledu a uspořádání chromozómů.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Zdroje
        účinné od 1. 1. 1999Používají se samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodné dobře popsané linie samic s vícenásobnou inversí X-chromozómu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Testované látky
        účinné od 1. 1. 1999Testované látky se rozpouštějí ve vodě. Látky ve vodě nerozpustné se rozpouštějí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle (např. směs etanolu a Tweenu-60, nebo 80), před aplikací se dále ředí vodou, nebo fyziologickým roztokem. Doporučuje se nepoužívat dimetylsulfoxid (DMSO) jako vehikulum.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.3 Počet zvířat
        účinné od 1. 1. 1999Test má předem určenou citlivost. Spontánní frekvence mutací v kontrolní skupině významně ovlivňuje nutný počet ovlivněných chromozómů, které je třeba analyzovat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.4 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Expozice testované látce se uskutečňuje per os, injekčně, nebo expozicí plynům nebo parám. Zkrmování testované látky se provádí v cukerném roztoku. Je-li to nutné, testovaná látka se rozpustí v 0,7 % roztoku NaCl a injikuje se do hrudní nebo břišní dutiny.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.5 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999V každém pokusu se zařazují negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly. Jestliže má laboratoř k dispozici vhodné historické kontrolní údaje, není třeba zařazovat do experimentu souběžné kontroly.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.6 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Používají se tři dávky testované látky. Pro předběžný orientační odhad se používá jedna dávka rovnající se maximální tolerované koncentraci, nebo vyvolávající známky toxicity. Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Samci divokého typu (ve stáří 3-5 dnů) jsou ovlivněni testovanou látkou a individuálně kříženi s virginními samicemi z linie Muller-5 nebo z jiné vhodné markerové linie (vícenásobná inverse X-chromozómu). Samice jsou vyměněny za čerstvé virginní samice každé dva až tři dny aby byl pokryt celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic je sledován letální efekt korespondující s účinkem testované látky v době expozice na zralé spermie, na spermatidy ve středním, nebo pozdním stádiu, časné spermatidy, spermatocyty a spermatogonie.
      účinné od 1. 1. 1999Heterozygotní F₁ samice narozené z tohoto křížení jsou dále kříženy individuálně (t.j. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V F₂ generaci je v každé kultuře zaznamenávána absence samců divokého typu. Jestliže v kultuře vznikají F₁ samice nesoucí letální mutaci v rodičovském X-chromozómu ( nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromozómem), dcery těchto samic se stejným genotypem jsou dále testovány aby se zjistilo, zda letalita se opakuje v dalších generacích.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Získané údaje se zpracují do formy tabulky. Uvádí se počet hodnocených X-chromozómů, počet afertilních samců a počet chromozómů s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období křížení a pro každého testovaného samce. Zaznamenává se počet clusterů různých velikostí pro každého samce. Výsledky se mají potvrdit v nezávislém experimentu.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Nahromadění recesivních letálních mutací vzniklých v jednom samci má být vzato v úvahu a zhodnoceno vhodným statistickým způsobem.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- použitých liniích, nebo kmenech Drosophily, věku, počtu ovlivněných samců, počtu sterilních samců, počtu vzniklých F₂ kultur, počtu F₂ kultur bez potomků, počtu chromozómů nesoucích letální mutaci pro každé stádium zárodečných buněk,
    2. účinné od 1. 1. 1999- kritériích pro velikost ovlivněných skupin,
    3. účinné od 1. 1. 1999- podmínkách testu: detailní popis ovlivňování a schéma odběru vzorků, výše dávek, údaje o toxicitě, negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly,
    4. účinné od 1. 1. 1999- kritériích počítání letálních mutací,
    5. účinné od 1. 1. 1999- vztahu expozice/účinek, je-li to možné,
    6. účinné od 1. 1. 1999- hodnocení údajů,
    7. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    8. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.21 TEST TRANSFORMACE SAVČÍCH BUNĚK - IN VITRO
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Savčí buňky lze použít pro detekci fenotypických změn in vitro indukovaných chemickými látkami spojených s maligní transformací in vivo. Nejčastěji se používají buňky C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischerových potkanů a test se opírá o změny buněčné morfologie, tvorbu ložisek, nebo změny v uchycení v semisolidním agaru. Méně se používají systémy detekující ostatní fyziologické či morfologické změny v buňkách po expozici karcinogenním látkám. Žádný výsledek in vitro testu není důkazem karcinogenity. Některé systémy jsou schopné detekce promotorů. Cytotoxicita může být zjištěna hodnocením účinku testované látky na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency), nebo ovlivněním rychlosti růstu kultury. Při hodnocení cytotoxicity se vychází ze skutečnosti, že expozice testované látce byla toxikologicky relevantní, ale přesto ji nelze použít k určení frekvence transformace ve všech experimentech, protože u některých mohlo dojít k prodloužení inkubace, nebo k replatingu.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Buňky
        účinné od 1. 1. 1999Existuje řada buněčných linií a primokultur použitelných k testu transformace. Experimentátor musí zajistit, že buňky použité v testu transformace vykazují příslušné fenotypické změny po expozici známým karcinogenem a že test používaný laboratoří je ověřen a že je dokumentována jeho oprávněnost a spolehlivost.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Médium
        účinné od 1. 1. 1999Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro použitý test transformace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.3 Testované látky
        účinné od 1. 1. 1999Testované látky se rozpouštějí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle před ovlivněním buněk. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí ovlivnit životnost buněk, růstovou rychlost nebo výskyt transformace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.4 Metabolická aktivace
        účinné od 1. 1. 1999Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a bez přítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Alternativně mohou být použity buňky s vlastní metabolickou aktivitou, jestliže její vlastnosti jsou vhodné pro testované látky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Do každého experimentu musí být zařazeny positivní kontroly s použitím látek přímo působících, i vyžadujících metabolickou aktivaci. Musí být zařazeny také negativní kontroly (s rozpouštědlem).
        účinné od 1. 1. 1999Příklady látek pro positivní kontroly:
        účinné od 1. 1. 1999- přímo působící látky: etylmetansulfonát, β-propiolakton,
        účinné od 1. 1. 1999- látky vyžadující metabolickou aktivaci: 2-acetylaminofluoren, 4-dimetylaminoazobenzen, 7,12-dimetylbenzantracen.
        účinné od 1. 1. 1999Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Testují se nejméně tři dávky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace způsobují nízkou úroveň přežívání buněk, v nejnižší koncentraci je přežívání buněk přibližně stejné jako v negativní kontrole. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu závislou na použitém testovacím systému. Ta může zahrnovat i opakovanou expozici testované látce spojenou s výměnou média (ev. výměnou čerstvé metabolické aktivační směsi) jestliže se jedná o prolongovanou expozici. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je z buněk propláchnutím odstraněna testovaná látka a kultivace probíhá dále za vhodných podmínek pro transformaci. Pak je zaznamenáván výskyt transformace. Všechny výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje musí být presentovány v tabulkové formě. Je vhodné vyjadřovat přežívání buněk jako procento kontrolní úrovně a frekvenci transformací jako počet transformací na počet přežívajících buněk. Data je třeba zpracovat vhodnými statistickými metodami.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury, počtu kultur,
    2. účinné od 1. 1. 1999- kultivačních podmínkách: koncentraci testované látky, době inkubace, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce a frekvenci expozice, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách, hustotě buněk během expozice, specifikaci sledovaného fenotypu, použití selektivního systému (je-li to vhodné), zdůvodnění výběru koncentrací,
    3. účinné od 1. 1. 1999- metodách vyčíslení živých a transformovaných buněk,
    4. účinné od 1. 1. 1999- statistickém vyhodnocení,
    5. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    6. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.22 DOMINANTNÍ LETÁLNÍ TEST U HLODAVCŮ
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Dominantní letalita způsobuje embryonální, nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárodečné tkáně exponovaného zvířecího druhu. Obecně se přijímá, že dominantní letální mutace jsou způsobeny poškozením chromozómů (strukturální a numerické abnormality). Smrt embrya exponované samice může být také výsledkem toxického účinku.
    účinné od 1. 1. 1999Samci jsou exponováni testované látce a pářeni s neovlivněnými, intaktními samicemi. Vzestup mrtvých implantací na samičku v exponované skupině nad počet mrtvých imlantací v kontrolní skupině vyjadřuje postimplantační ztráty. Preimplantační ztráty se hodnotí na základě počtu žlutých tělísek, nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině. Celková dominantní letalita je součet pre- a postimplantačních ztrát. Výpočet celkové dominantní letality je založen na srovnání živých implantací na samici v exponované skupině k živým implantacím na samici v kontrolní skupině. Snížení počtu implantací v některém intervalu může být způsobeno zánikem buněk (t.j. spermatocytů a/nebo spermatogonií).
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testovanou látku rozpustit, nebo suspendovat ve fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě se ředí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle. Použité rozpouštědlo nesmí reagovat s testovanou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Před aplikací je třeba připravovat čerstvě naředěnou testovanou látku.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se obvykle podává pouze jednou. Na základě toxikologických informací je možné podávat látku opakovaně. Obvyklý způsob aplikace je orální sondou nebo intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné způsoby aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Pro test se doporučují použít potkani, nebo myši. Zdravá, pohlavně dospělá zvířata jsou náhodně rozdělena na exponované a kontrolní skupiny.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít dostatečný počet exponovaných samců s ohledem na spontánní variabilitu hodnocené biologické charkteristiky. Počet se řídí předem zjištěnou detekční citlivostí a silou statistického testu. V typickém případě se na příklad volí takový počet samců, aby se dosáhlo 30 - 50 březích samic na připouštěcí interval.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Positivní a negativní (s rozpouštědlem) kontroly musí být zařazeny do každého experimentu. Jestliže však má laboratoř k dispozici přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávných experimentů, mohou být použity. Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných, nízkých dávkách aby byla prokázána citlivost testu (např. MMS, intraperitoneálně, 10 mg.kg^-1).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Nejčastěji se používají tři dávkové hladiny. Nejvyšší dávka má vyvolávat známky toxicity, nebo snížené fertility u exponovaných zvířat. V některých případech je postačující jedna vysoká dávka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999Netoxické látky se podávají v jedné dávce 5 g.kg^-1, nebo v dávce 1 g.kg^-1.den^-1 při opakované aplikaci.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Existuje několik postupů. Nejčastěji se používá jednorázová aplikace. Může však být použito jiné schéma.
      účinné od 1. 1. 1999Jeden samec je opakovaně křížen s jednou, nebo dvěmi neovlivněnými, intaktními samičkami ve vhodných intervalech po aplikaci látky. Samičky musí být u samců nejméně po dobu trvání jednoho cyklu říje, nebo pokud se neprokáží spermie ve vagině, či vaginální zátka.
      účinné od 1. 1. 1999Počet páření po expozici je dán schématem expozice a musí zahrnovat všechna stádia zárodečných buněk sledovaných po expozici.
      účinné od 1. 1. 1999Samice jsou utraceny cervikální dislokací ve druhé polovině březosti a obsah dělohy je vyšetřen k určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaječníky musí být vyšetřeny k určení počtu žlutých tělísek.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje o počtu samců, počtu březích samic, a počtu nezabřezlých samic jsou uváděny v tabulkách. Výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice jsou uváděny samostatně. Každá samice musí mít záznam o týdnu páření, o dávce podané samci, o počtu živých a mrtvých implantacích.
  účinné od 1. 1. 1999Zhodnocení celkového dominantního letálního efektu je založeno na srovnání počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací v kontrolní skupině. Poměr mrtvých ku živým implantacím v exponované skupině ke stejnému poměru v kontrolní skupině po analýze vypovídá o postimplantačních ztrátách.
  účinné od 1. 1. 1999V tabulce musí být jasně odlišeny časná a pozdní letalita. Musí být zaznamenány i preimplantační ztráty. Ty mohou být vypočítány jako rozdíl mezi počtem corpora lutea a počtem implantací, nebo jako snížení průměrného počtu implantací na dělohu ve srovnání s kontrolou.
  účinné od 1. 1. 1999Údaje jsou vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- druhu, kmeni, věku a váze zvířat, počet zvířat od každého pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
    2. účinné od 1. 1. 1999- testované látce, rozpouštědlu, dávkových hladinách a důvodech jejich výběru, negativních a positivních kontrolách, údajích o toxicitě,
    3. účinné od 1. 1. 1999- způsobu podání a schematu expozice,
    4. účinné od 1. 1. 1999- schéma páření,
    5. účinné od 1. 1. 1999- metodách k průkazu páření,
    6. účinné od 1. 1. 1999- doba usmrcení,
    7. účinné od 1. 1. 1999- kriteria pro počítání dominantních letálních efektů,
    8. účinné od 1. 1. 1999- vztah dávka/odpověď,
    9. účinné od 1. 1. 1999- statistické hodnocení,
    10. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    11. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.23 CYTOGENETICKÁ ANALÝZA SAVČÍCH ZÁRODEČNÝCH BUNĚK IN VIVO
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Tento cytogenetický test in vivo detekuje strukturální chromozómové aberace ve spermatogoniích. Je založen na analýze mitóz spermatogonií z hlediska chromatidových a chromozómových typů aberací.
    účinné od 1. 1. 1999V metodě se používají preparáty z testes savců, kteří byli exponování testované látce vhodným způsobem a usmrceni v různých intervalech. Zvířata jsou před usmrcením ovlivněna inhibitorem dělícího vřeténka, jako je kolchicín, k nahromadění buněk ve stádiu metafáze (C - metafáze). Jsou zhotoveny mikroskopické preparáty, usušeny na vzduchu, obarveny a analyzovány v mikroskopu.
    účinné od 1. 1. 1999Analýza spermatocytů v diakinézi (metafáze I) pro hodnocení mnohočetných translokací po ovlivnění kmenových buněk spermatogonií může poskytnout další užitečné informace.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Testované látky se většinou podávají pouze jednou. Opakovaná aplikace může být použita na základě toxikologických informací. Opakovaná aplikace však může být použita jen v případě, že testovaná látka nevyvolává větší cytotoxický efekt v diferencujících se spermatogoniích.
        účinné od 1. 1. 1999Obvyklý způsob podání je orální aplikace sondou a intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i ostatní způsoby aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Nejčastěji se používají myši a čínský křeček. Mohou však být použity i jiné savčí druhy.
        účinné od 1. 1. 1999Pohlavně dospělí samci jsou náhodným výběrem rozděleni do exponovaných a kontrolních skupin.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.3 Počet zvířat
        účinné od 1. 1. 1999Pro exponované i kontrolní skupiny se použije nejméně po pěti samcích.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.4 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999V každém experimentu musí být použity současně positivní i negativní (s rozpouštědlem) kontroly.
        účinné od 1. 1. 1999Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných nízkých dávkách (např. mitomycin C, intraperitoneálně, 0.3 mg.kg^-1) k průkazu citlivosti testu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.5 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Používá se jedna dávka testované látky. Tato dávka má být maximální tolerovanou dávkou, nebo dávkou vyvolávající známky toxicity. Je-li třeba učit závislost dávka/odpověď, pak je třeba použít nejméně tří dávek (např. k potvrzení slabě positivní odpovědi). Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce jak pro jednorázovou, tak i pro opakovanou aplikaci.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata jsou většinou ovlivněna testovanou látkou pouze jednou. Ve skupinách exponovaných nejvyšší dávce se po expozici odebírají vzorky nejméně ve třech intervalech. Základní interval je 24 h. Jestliže kinetika buněčného cyklu může být ovlivněna testovanou látkou, používají se jeden dřívější a jeden pozdější odběrový interval stejnoměrně rozdělené v rozmezí od 6 do 48 h. Při použití dalších dávkových hladin je třeba vzorky odebrat v nejcitlivějším intervalu, pokud není znám, pak 24 h po aplikaci.
      účinné od 1. 1. 1999Alternativně může být použita opakovaná aplikace a zvířata jsou pak usmrcena 24 h po poslední aplikaci. Mohou být použity další odběrové časy v rozmezí od 6 do 24 h.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Příprava preparátů z testes
        účinné od 1. 1. 1999Před analýzou mitóz spermatogonií je zvířatům infikován intraperitoneálně ve vhodné dávce inhibitor mitózy, např. kolchicín. Ve vhodném intervalu jsou potom zvířata usmrcena. U myší se tento interval pohybuje mezi třemi až pěti hodinami, u čínského křečka více než pět hodin.
        účinné od 1. 1. 1999Používá se metoda sušených preparátů (air-drying). Různé druhy zvířat vyžadují modifikaci standardního postupu. Získaná buněčná suspenze je hypotonizována a fixována. Buňky jsou rozprostřeny na sklíčko a obarveny. Preparáty jsou před analýzou zakódovány.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Analýza
        účinné od 1. 1. 1999Na strukturální chromozómové aberace je analyzováno nejméně 100 dobře rozprostřených metafází s plným počtem centromer. Ke zhodnocení možného cytotoxického efektu se počítá poměr mitóz spermatogonií k prvním a druhým meiotickým metafázím z celého vzorku 100 dělících se buněk na zvíře.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Získané údaje jsou presentovány tabulkovou formou. Pro každé exponované a kontrolní zvíře se všechny typy aberací uvádějí samostatně. Uvádí se celkový počet analyzovaných buněk a celkový počet aberantních buněk na každou skupinu. Pro každý parametr se uvádí průměr a směrodatná odchylka. Je-li to stanoveno, uvádí se v tabulce pro každou exponovanou a kontrolní skupinu průměr poměru mitóz spermatogonií k prvním a druhým meiotickým metafázím.
  účinné od 1. 1. 1999Všechny údaje jsou zhodnoceny vhodnou statistickou metodou.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- druhu a kmeni samců, věku a váze samců,
    2. účinné od 1. 1. 1999- počtu zvířat v každé exponované a kontrolní skupině,
    3. účinné od 1. 1. 1999- podmínkách experimentu, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla, inhibitor dělícího vřeténka,
    4. účinné od 1. 1. 1999- počtu analyzovaných buněk pro každé zvíře v každé skupině,
    5. účinné od 1. 1. 1999- typu a počtu aberací u každého exponovaného a kontrolního zvířete
    6. účinné od 1. 1. 1999- statistickém hodnocení
    7. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    8. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.24 SPOT TEST U MYŠÍ
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Je to in vivo test na myších, u kterých jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u embryí jsou melanoblasty a cílovými geny ty, které kontrolují pigmentaci srsti. Embrya jsou heterozygoti pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace, nebo ztráty dominantních allel v genech melanoblastů jsou vyjádřeny recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrny (spots) pozměněné barvy srsti narozených myší. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, je zaznamenán a jejich frekvence je srovnávána s frekvencí u potomků z kontrol. Myší spot test detekuje především somatické mutace v embryonálních buňkách.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky jsou rozpuštěny, nebo suspendovány v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Použitá rozpouštědla nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxický efekt. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c ^ch p/c ^ch p; brown, b/b; dilute, shon ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) jsou kříženy buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ /ln fz; pearl pe/pe) nebo s kmenem C57 BL (nonagouti, a/a).
        účinné od 1. 1. 1999Mohou být použita i jiná křížení, za předpokladu že budou vznikat nonagouti potomci. Např. křížení mezi kmenem NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Počet a pohlaví zvířat
        účinné od 1. 1. 1999Použije se dostatečný počet zabřezlých samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou dávku. Vhodná velikost vzorku je závislá na počtu skvrn pozorovaných u ovlivněných myší a u kontrolních myší. Negativní výsledky jsou akceptovány pouze v případě, že bylo hodnoceno nejméně 300 potomků samic ovlivněných nejvyšší dávkou.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.3 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Musí být použity kontroly ovlivněné pouze rozpouštědlem (negativní kontroly. Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní hodnoty z téže laboratoře za předpokladu, že jsou homogenní. Nedávné údaje z positivních kontrol získané v téže laboratoři při expozici látce se známým mutagenním účinkem mohou být v tomto testu použity, jestliže u testované látky nebyla mutagenita detekována.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.4 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Obvykle se používá orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Je-li to vhodné, je možné použít inhalační, nebo jiný způsob aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.5 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Používají se nejméně dvě dávky z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo zmenšení velikosti vrhu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata jsou obyčejně ovlivněna testovanou látkou pouze jednou 8., 9., nebo 10. den březosti, přičemž za 1.den březosti se považuje den zjištění vaginální zátky. Tyto dny odpovídají 7.25, 8.25 a 9.25 dnů po koncepci. Opakované ovlivnění látkou lze provést během těchto dnů.
      účinné od 1. 1. 1999Analýza
      účinné od 1. 1. 1999U mláďat je počítán a zaznamenáván počet skvrn mezi třetím a čtvrtým týdnem po porodu. Rozlišují se tři třídy skvrn:
      účinné od 1. 1. 1999(a) bílé skvrny v rozsahu 5 mm ve střední ventrální linii o kterých se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);
      účinné od 1. 1. 1999(b) žluté skvrny typu agouti, se vyskytují v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, a předpokládá se, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS);
      účinné od 1. 1. 1999(c) zbarvené a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti jako výsledek somatických mutací (RS).
      účinné od 1. 1. 1999Všechny tři skupiny jsou zaznamenávány, ale pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením mezi MDS a RS je možné vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.
      účinné od 1. 1. 1999Zaznamenávají se nápadné, velké morfologické malformace potomků.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Získaná data jsou uváděna jako celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat majících jednu, nebo více skvrn vyvolaných somatickými mutacemi. Údaje získané z kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Údaje jsou také uváděny jako získané hodnoty na vrh.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- kmeni použitém při křížení,
    2. účinné od 1. 1. 1999- počtu zabřezlých samic v experimentální a v kontrolní skupině,
    3. účinné od 1. 1. 1999- průměrné velikosti vrhu v experimentální a v kontrolní skupině při porodu a při odstavení,
    4. účinné od 1. 1. 1999- dávkových úrovních testované látky,
    5. účinné od 1. 1. 1999- použitém rozpouštědle,
    6. účinné od 1. 1. 1999- ve kterém dni březosti byla testovaná látka aplikována,
    7. účinné od 1. 1. 1999- o způsobu podání testované látky,
    8. účinné od 1. 1. 1999- celkovém počtu sledovaných potomků, a jejich počet s WMVS, MDS a RS v experimentální a kontrolní skupině,
    9. účinné od 1. 1. 1999- hrubých morfologických malformacích,
    10. účinné od 1. 1. 1999- vztahu dávka/odpověď u RS, je-li to možné,
    11. účinné od 1. 1. 1999- statistickém hodnocení,
    12. účinné od 1. 1. 1999- diskusi výsledků,
    13. účinné od 1. 1. 1999- interpretaci výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.25 PŘENOSNÉ TRANSLOKACE U MYŠÍ
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Test na přenosné translokace u myší detekuje strukturální a numerické chromozómové změny v savčích zárodečných buňkách zachycené v první generaci potomků. Indukované změny jsou reciproké translokace a u samičích potomků ještě ztráty X-chromozómu. Nositelé translokací a XO-samice vykazují sníženou fertilitu, která se využívá pro výběr F₁ potomstva pro cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je způsobena některými typy translokací (X-autosom a c-t typ). Translokace jsou analyzovány mikroskopicky v meiotických buňkách samců ze spermatocytů ve stadiu diakinézy-metafáze I, nebo F1 samců či samčích potomků F₁ samic. Samice XO jsou cytogeneticky identifikovány přítomností pouze 39 chromozómů v mitózách z kostní dřeně.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.1 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Aplikuje se obvykle orálně sondou, nebo intraperitoneální injekcí. Mohou být použity i jiné vhodné způsoby aplikace.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.2 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Pro snadnější křížení a cytologickou verifikaci se pokusy provádí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen. Průměrná velikost vrhu by měla být větší než osm a měla by být relativně konstantní. Používají se zdravá, pohlavně dospělá zvířata.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.3 Počet zvířat
        účinné od 1. 1. 1999Počet zvířat nutně závisí na frekvenci spontánních translokací a na minimálním počtu indukovaných translokací vyžadovaném pro positivní kontrolu.
        účinné od 1. 1. 1999Test se obvykle provádí analýzou samců F₁ potomků. Nejméně 500 samců v F₁ generaci je testováno v každé exponované skupině. Jestliže budou analyzovány také samice F₁ generace potomků, pak se vyžaduje 300 samců a 300 samic.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.4 Negativní a positivní kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Mohou se použít adekvátní výsledky kontrol získané z předchozích pokusů. Jestliže jsou dostupné přijatelné výsledky positivních kontrol z nedávného pokusu z téže laboratoře, mohou být použity.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.1.5 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Používá se jedna dávka, obyčejně nejvyšší dávka vyvolávající minimální toxický efekt ale bez vlivu na reprodukční chování nebo přežívání. Pro stanovení vztahu dávka/odpověď je třeba dvou dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná dávka.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Popis postupu
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Expozice a oplodnění
        účinné od 1. 1. 1999Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.
        účinné od 1. 1. 1999Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů
        účinné od 1. 1. 1999Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility F₁ potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců F₁ generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.
        účinné od 1. 1. 1999(a) Test fertility
        účinné od 1. 1. 1999Snížená fertilita zvířat v F₁ generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.
        účinné od 1. 1. 1999Velikost vrhu: F₁ samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18.dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví F₂ potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány F₁ samice, F₂ potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice-nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0-samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1:1 na 1:2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální F₁ zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první F₂ vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy. F₁ zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří F₂ vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.
        účinné od 1. 1. 1999Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikostí vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní F₁ samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. -16.den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.
        účinné od 1. 1. 1999(b) Cytogenetická analýza
        účinné od 1. 1. 1999Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - matafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni F₁ samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u F₁ samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Získané údaje jsou presentovány tabulkovou formou.
  účinné od 1. 1. 1999Pro každý interval připouštění je zaznamenána průměrná velikost vrhu a poměr pohlaví (sex ratio).
  účinné od 1. 1. 1999Pro odhad ferility F₁ zvířat se uvádí průměrná velikost vrhu kontroly a individuální velikosti vrhů F₁ nosičů translokací. Pro analýzu obsahů dělohy se uvádí průměrný počet živých a mrtvých zárodků v kontrole a individuální počty živých a mrtvých zárodků pro každé připouštění F₁ nosičů translokací.
  účinné od 1. 1. 1999Při cytogenetické analýze diakinéze-metafáze I se uvádí počet typů multivalentních figur a celkový počet buněk pro každého nosiče translokací.
  účinné od 1. 1. 1999Pro F₁ sterilní jedince se zaznamenává počet a doba připuštění. Dále se uvádí váha testes a podrobnosti o cytogenetické analýze.
  účinné od 1. 1. 1999U X0 samic se uvádí průměrná velikost vrhu, sex ratio F₂ potomků a výsledky cytogenetické analýzy.
  účinné od 1. 1. 1999V případě, že pomocí testů fertility byly předběžně vybráni možní nositelé F₁ translokací, je třeba v tabulkách uvést informaci o skutečném počtu potvrzených translokačních heterozygotů.
  účinné od 1. 1. 1999Musí být uvedeny údaje o negativních a positivních kontrolách.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu obsahuje, je-li to možné, informace o:
    1. účinné od 1. 1. 1999- kmenu myší, stáří a váze exponovaných zvířat,
    2. účinné od 1. 1. 1999- počtu rodičovských zvířat pro každé pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
    3. účinné od 1. 1. 1999- experimentálních podmínkách, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla a schéma připouštění
    4. účinné od 1. 1. 1999- počtu a pohlaví mláďat na samici, počet a pohlaví potomků chovaných pro analýzu translokací,
    5. účinné od 1. 1. 1999- době a kritériích analýzy translokací,
    6. účinné od 1. 1. 1999- počet a detailní popis nosičů translokací, včetně údajů o březosti a obsahu dělohy,
    7. účinné od 1. 1. 1999- popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, pokud možno s obrázky,
    8. účinné od 1. 1. 1999- statistické hodnocení,
    9. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    10. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.26 SUBCHRONICKÁ TOXICITA ORÁLNÍ
účinné od 1. 1. 1999(90denní opakované podávání per os, studie na hlodavcích)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.
      účinné od 1. 1. 1999Testovanou látku lze podávat v potravě, sondou, v kapslích nebo v pitné vodě. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná dřívější data, je možno je využít.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. V ideálním případě by na počátku podávání látky měli být potkani mladší než 6 týdnů, v žádném případě starší než 8 týdnů. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou hladinu dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen malý počet. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky.
        účinné od 1. 1. 1999Ve skupině s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
        účinné od 1. 1. 1999Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg^-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování v pravidelných intervalech (týdenních nebo čtrnáctidenních) přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999Provede-li se 90-denní test níže popsanou metodou a nevyvolá-li aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den (nebo dávky vyšší - odpovídající možné expozici člověka, je-li tato známa) žádné toxické účinky, je možno od dalšího testování upustit. Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky, jejich dobu objevení, stupeň a trvání. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999V ideálním případě se zvířatům podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 90dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků.
      účinné od 1. 1. 1999Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Příjem potravy (a příjem vody při podávání testované látky v pitné vodě) a hmotnost zvířat se zaznamenávají týdně.
      účinné od 1. 1. 1999Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.
      účinné od 1. 1. 1999Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:
      účinné od 1. 1. 1999(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      účinné od 1. 1. 1999(b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      účinné od 1. 1. 1999(c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno ( trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninaminotransferasa (dříve pyruvát-transaminasa) a aspartátaminotransferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát-transaminasa), ornithin dekarboxylása, gamaglutamyltranspeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
      účinné od 1. 1. 1999(d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      účinné od 1. 1. 1999Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před podáváním.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        účinné od 1. 1. 1999Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza/ příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice a plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní, a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují v případě, pokud lze na jejich postižení usuzovat z příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999(a) Úplné histopatologické vyšetření orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny.
        účinné od 1. 1. 1999(b) Je třeba vyšetřit všechna makroskopická postižení.
        účinné od 1. 1. 1999(c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v jiných dávkových skupinách.
        účinné od 1. 1. 1999(d) Plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se mají histopatologicky vyšetřovat k zjištění příznaků infekce, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Je třeba také uvážit histopatologické vyšetření jater a ledvin u těchto skupin. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou dávkou.
        účinné od 1. 1. 1999(e) Používá-li se satelitní skupiny, musí se provést histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením a procentuelně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
    2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky, - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    3. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
    4. účinné od 1. 1. 1999- úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    5. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
    6. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických nebo jiných účinků,
    7. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    8. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    9. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    10. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
    11. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
    12. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    13. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    14. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    15. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.27 SUBCHRONICKÁ TOXICITA ORÁLNÍ
účinné od 1. 1. 1999(90denní opakované podávání per os, studie na nehlodavcích)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat (nehlodavcům), a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Testovanou látku lze podávat v potravě nebo může být vhodnější podávání v kapslích. Mohou být použity také jiné způsoby orální aplikace. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Obvykle se jako živočišný druh - nehlodavec používá pes: dává se přednost definovanému plemeni. Je možno používat i jiných druhů nehlodavců. Je třeba pracovat na mladých zdravých zvířatech; v případě psů se má s podáváním začít ve věku od 3 do 6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou úroveň dávek použít nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počet zvířat na konci pokusu musí být takový, aby umožnil vyhodnocení toxických účinků.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávkování
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední úroveň dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky.
        účinné od 1. 1. 1999Ve skupině s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by k uhynutí rovněž nemělo docházet.
        účinné od 1. 1. 1999Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
        účinné od 1. 1. 1999Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg^-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Podává-li se látka přímo, například v kapslích, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování v týdenních intervalech přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
        účinné od 1. 1. 1999Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejná dieta.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999Provede-li se 90denní test níže popsanou metodou a nevyvolá-li aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den (nebo dávky vyšší - odpovídající možné expozici člověka, je-li tato známa) žádné toxické účinky, je možno od dalšího testování upustit. Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky, jejich dobu objevení, stupeň a trvání. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999V ideálním případě se zvířatům podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 90dnů. Podává-li se látka jiným způsobem než v potravě, považuje se za přijatelné podávat látku 5 dní v týdnu.
      účinné od 1. 1. 1999Pozorování zahrnuje (ale není na ně omezeno) změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování.
      účinné od 1. 1. 1999Příjem potravy (a příjem vody při podávání testované látky v pitné vodě) a hmotnost zvířat se zaznamenávají týdně.
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně jednou denně je třeba provádět pečlivá klinická vyšetření s vhodnými opatřeními k minimalizaci ztrát zvířat pro studii. Po skončení studie se pitvají všechna zvířata, která přežila. Umírající zvířata je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
      účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat včetně kontrolních se obvykle provedou následující vyšetření:
      účinné od 1. 1. 1999(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      účinné od 1. 1. 1999(b) Na začátku testu, a potom buď v měsíčních intervalech nebo uprostřed a dále na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      účinné od 1. 1. 1999(c) Na začátku testu, a potom buď v měsíčních intervalech nebo uprostřed a dále na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno (přičemž trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninamino transferasa (dříve pyruvát transaminasa séra) a aspartátamino transferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát transaminasa), ornithin dekarboxylása, gama-glutamyl transpeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků. Před odběrem vzorků krve by nehlodavci měli hladovět (ne více než 24 hodin).
      účinné od 1. 1. 1999(d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        účinné od 1. 1. 1999Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník, jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), a (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999Úplné histopatologické vyšetření orgánů a v tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny. Histopatologické vyšetření zvířat z dalších dávkových skupin se provede na orgánech, u kterých byla nalezena poškození u skupiny s nejvyšší dávkou, nebo když je to indikováno na základě klinických pozorováni.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením, typy poškození a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, plemeno nebo kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
    2. účinné od 1. 1. 1999- experimentální podmínky,
    3. účinné od 1. 1. 1999- úroveň dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
    4. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
    5. účinné od 1. 1. 1999- úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
    6. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj, o přežití zvířat do konce sledování,
    7. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických nebo jiných účinků, ( zejména klinické nálezy),
    8. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    9. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    10. účinné od 1. 1. 1999- oftalmologické nálezy,
    11. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    12. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
    13. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
    14. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    15. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    16. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    17. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.28 SUBCHRONICKÁ TOXICITA DERMÁLNÍ
účinné od 1. 1. 1999(90denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se aplikuje denně na kůži po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.
      účinné od 1. 1. 1999Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu.

Následující stránka