Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 251/1998 Sb., účinné od 10. 11. 1998

Předchozí stránka

účinné od 1. 1. 1999Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba zkoušenou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
  účinné od 1. 1. 1999Je možno použít dospělé potkany, králíky nebo morčata, případně i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty. Provádí-li se subchronický dermální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
  účinné od 1. 1. 1999Pro každou úroveň dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávkování
  účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít nejméně tři hladiny dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.
  účinné od 1. 1. 1999Nejvyšší hladina dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední hladina dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 hladiny dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední hladinou dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
  účinné od 1. 1. 1999Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové hladiny může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Limitní test
  účinné od 1. 1. 1999Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Doba pozorování
  účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
účinné od 1. 1. 1999Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 28 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.
účinné od 1. 1. 1999Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla, u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.
účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovací plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.
účinné od 1. 1. 1999Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným způsobem vhodným k očištění pokožky.
účinné od 1. 1. 1999Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání.
účinné od 1. 1. 1999Pozorování v kleci zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:
účinné od 1. 1. 1999(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
účinné od 1. 1. 1999(b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
účinné od 1. 1. 1999(c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno (přičemž trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu), alaninamino transferasa (dříve glutamát- pyruvát transaminasa) a aspartátamino transferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát transaminasa), ornithin dekarboxylása, gama-glutamyl transpeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
účinné od 1. 1. 1999(d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
účinné od 1. 1. 1999Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem aplikace.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
  účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
  účinné od 1. 1. 1999Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, přídatné pohlavní orgány, žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), (hrudní kost s kostní dření), (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní), a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Histopatologická vyšetření
  účinné od 1. 1. 1999(a) Úplné histopatologické vyšetření normální a exponované kůže, orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny.
  účinné od 1. 1. 1999(b) Je třeba vyšetřit všechna makroskopická postižení.
  účinné od 1. 1. 1999(c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.
  účinné od 1. 1. 1999(d) Používá-li se potkanů, plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se mají histopatologicky vyšetřovat k zjištění příznaků infekce, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou dávkou.
  účinné od 1. 1. 1999(e) Používá-li se satelitní skupiny, musí se provést histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.

účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi a procentuálně počet zvířat
účinné od 1. 1. 1999s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
  účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
  1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, krmení,
  2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky pokusu,
  3. účinné od 1. 1. 1999- úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
  4. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
  5. účinné od 1. 1. 1999- hladina bez účinku, pokud ji lze stanovit,
  6. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj, o přežití zvířat do konce sledování,
  7. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických nebo jiných účinků,
  8. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
  9. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
  10. účinné od 1. 1. 1999- oftalmologické nálezy,
  11. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky
  12. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
  13. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
  14. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
  15. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
  16. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
  17. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.29 SUBCHRONICKÁ TOXICITA - INHALAČNÍ
účinné od 1. 1. 1999(90denní opakovaná inhalační expozice, studie na hlodavcích)
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 90 dnů. Použije-li se pro dosažení potřebné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Experimentální podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Pokusná zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický inhalační test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný druh a kmen.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou úroveň koncentrace je třeba použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat další skupinu (satelitní skupinu) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší koncentraci a během následujících 28 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Expoziční koncentrace
        účinné od 1. 1. 1999Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina (případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se použije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky). S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen
        účinné od 1. 1. 1999v malém počtu. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Trvání expozice
        účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují po dobu 6 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. V případě specifických požadavků je možné použít i jiných dob expozice.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Expoziční zařízení
        účinné od 1. 1. 1999Pro expozici zvířat se používá dynamické inhalační zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby co nejvíce bránil shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry
        účinné od 1. 1. 1999v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Doba pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozic i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 90 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Během expozice se nepodává potrava ani voda.
      účinné od 1. 1. 1999Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.
      účinné od 1. 1. 1999Měření nebo monitorování podmínek expozice:
      1. účinné od 1. 1. 1999a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
      2. účinné od 1. 1. 1999b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zoně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15%. U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Při vývoji generátoru aerosolu je třeba analysovat velikostí částic tak, aby byla získána představa o stabilitě. Během expozic se měří tak často, jak je to potřeba pro posouzení stálosti distribuce velikosti částic.
      3. účinné od 1. 1. 1999c) Teplota a vlhkost vzduchu
      4. účinné od 1. 1. 1999d) Během expozice a po ní se zvířata systematicky pozorují a zjištění se zaznamenávají; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat i spotřeba potravy se zaznamenávají týdně. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, pitvají. Umírající zvířata je třeba vyřadit a pitvat.
      účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:
      účinné od 1. 1. 1999(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale přinejmenším u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
      účinné od 1. 1. 1999(b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.
      účinné od 1. 1. 1999(c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu na lačno (trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninamino transferasa (dříve glutamát- pyruvát transaminasa) a aspartátamino transferasa séra (dříve glutamát-oxalacetát transaminasa), ornithin dekarboxylása, gama-glutamyl transpeptidása, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro rozšíření spektra pozorovaných účinků.
      účinné od 1. 1. 1999(d) Anylýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.
      účinné od 1. 1. 1999Pokud nejsou přiměřená dřívější kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem expozic.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
        účinné od 1. 1. 1999Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, plíce ( mají se vyjmout neporušeny, zvážit a fixovat vhodným médiem, tak aby se zachovala struktura plic - perfusní fixace se považuje za vhodnou), tkáň nasofaryngu, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, hypofýza, štítná žláza/příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Histopatologická vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999(a) Úplné histopatologické vyšetření respiračního systému a ostatních orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, která byla exponována nejvyšší koncentraci, a u zvířat kontrolní skupiny.
        účinné od 1. 1. 1999(b) Je třeba vyšetřit všechny makroskopické léze.
        účinné od 1. 1. 1999(c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.
        účinné od 1. 1. 1999(d) Plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední koncentrací se mají histopatologicky vyšetřovat, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině
        účinné od 1. 1. 1999s vysokou koncentrací.
        účinné od 1. 1. 1999(e) Používá-li se satelitní skupiny, provede se histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lezemi, typ leze a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o průběhu pokusu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, krmení,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky pokusu: Popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis likvidace odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v experimentálním boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu.
    3. účinné od 1. 1. 1999- údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají obsahovat tyto údaje:
      1. účinné od 1. 1. 1999a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením,
      2. účinné od 1. 1. 1999b) teplota a vlhkost vzduchu,
      3. účinné od 1. 1. 1999c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu),
      4. účinné od 1. 1. 1999d) povaha vehikula, pokud bylo užito,
      5. účinné od 1. 1. 1999e) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
      6. účinné od 1. 1. 1999f) medián velikostí částic (u aerosolu),
    1. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
    2. účinné od 1. 1. 1999- úroveň bez účinku, pokud je možné ji stanovit,
    3. účinné od 1. 1. 1999- doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
    4. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických nebo jiných účinků,
    5. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    6. účinné od 1. 1. 1999- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
    7. účinné od 1. 1. 1999- oftalmologické nálezy,
    8. účinné od 1. 1. 1999- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
    9. účinné od 1. 1. 1999- biochemická vyšetření a jejich výsledky,
    10. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy,
    11. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    12. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,
    13. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    14. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.30 TESTOVÁNÍ CHRONICKÉ TOXICITY
1. účinné od 1. 1. 19991. METODIKA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka je podávána normálně sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis testovací metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Zvířata jsou chována při standardních podmínkách aspoň 5 dní před započetím testu. Před testem jsou zdravá, mladá zvířata náhodně rozdělena do exponovaných a kontrolních skupin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Testovací podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce nebo jiné). Je třeba použít zdravé a mladé jedince běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou úroveň dávky je třeba použít nejméně 40 zvířat (20 samic a 20 samců), stejně i pro kontrolní skupinu. Samice by měly být nullipary a neměly by být březí. Pokud je záměrem utratit některá zvířata před dokončením testu, je třeba použít přiměřeně vyšší počet zvířat.
        účinné od 1. 1. 1999V případě jiných druhů zvířat (nehlodavců) je možné použít menší počet zvířat, ale ne méně než 4 od každého pohlaví ve skupině.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávky a frekvence exposic
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít aspoň tři dávky a jednu kontrolní skupinu. Nejvyšší dávka by měla vyvolat jasné projevy toxicity bez nadměrné úmrtnosti. Nejnižší dávka by neměla vyvolat prokazatelné projevy toxicity. Střední dávky by měly být voleny ve středním pásmu mezi vysokými a nízkými dávkami. Výběr dávek by měl vzít v úvahu výsledky předchozích studií.
        účinné od 1. 1. 1999Obvykle jsou zvířata exponována denně. V případě, že testovaná látka je podávána v pitné vodě nebo v potravě, je třeba zajistit, aby k ní měla zvířata stálý přístup.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Kontroly
        účinné od 1. 1. 1999Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu k exponované skupině, vyjma exposice testované látce.
        účinné od 1. 1. 1999Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Způsob aplikace
        účinné od 1. 1. 1999Dva hlavní způsoby aplikace jsou orální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu exposice člověka.
        účinné od 1. 1. 1999Použití dermální aplikace vyvolává značné technické problémy. Chronická systémová toxicita v důsledku kožního vstřebání může být normálně odvozena z výsledku orálního testu a znalosti rozsahu kožního vstřebávání, odvozené z předchozích testů kožní toxicity.
        účinné od 1. 1. 1999Orální studie
        účinné od 1. 1. 1999Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
        účinné od 1. 1. 1999Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
        účinné od 1. 1. 1999Inhalační studie
        účinné od 1. 1. 1999Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
        účinné od 1. 1. 1999Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dnů v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
        účinné od 1. 1. 1999Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studia a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
        účinné od 1. 1. 1999Exposiční komory
        účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují v inhalačních komorách jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.
        účinné od 1. 1. 1999Měření nebo monitorování zahrnuje:
        účinné od 1. 1. 1999(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně;
        účinné od 1. 1. 1999(b) koncentrace: během denní exposice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty;
        účinné od 1. 1. 1999(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně;
        účinné od 1. 1. 1999(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během exposic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Trvání studie
        účinné od 1. 1. 1999Expozice látce by měla trvat nejméně 12 měsíců.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Dodatečná pozorování by měla být prováděna denně s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztráty zvířat ze studie, např. pitva nebo uložení do lednice u zvířat, která jsou nalezena mrtvá a isolace nebo utracení zvířat, která jsou slabá nebo moribundní. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.
        účinné od 1. 1. 1999Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.
        účinné od 1. 1. 1999Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.2 Hematologická vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců resp. od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od stejných potkanů. Navíc by měl být odebrán vzorek před testem od nehlodavců.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.
        účinné od 1. 1. 1999Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.3 Analýza moči
        účinné od 1. 1. 1999Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
        účinné od 1. 1. 1999- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
        účinné od 1. 1. 1999- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
        účinné od 1. 1. 1999- mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.4 Biochemické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
        účinné od 1. 1. 1999- celková koncentrace proteinů,
        účinné od 1. 1. 1999- koncentrace albuminu,
        účinné od 1. 1. 1999- testy na funkci jater (např. aktivita bázické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminasy¹, glutamát acetát transaminasy²), gamma glutamyl transpeptidasy, ornithin dekarboxylasy,
        účinné od 1. 1. 1999- metabolismus glycidů, např. krevní glukosa na lačno,
        účinné od 1. 1. 1999- testy na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.5 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.
        účinné od 1. 1. 1999Všechny orgány a tkáně by měly být uchovány pro histopatologické vyšetření. To se obvykle týká následujících orgánů a tkání: mozku³ (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsku mozkového, štítné žlázy a příštítných tělísek, thymu, trachey a plic, srdce, aorty, slinných žlaz, jater³, sleziny, ledvin³, nadledvinek³, jícnu, žaludku, dvanácterníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tračníku, konečníku, močového měchýře, lymfatických uzlin, slinivky, gonád³, akcesorních pohlavních orgánů, samičí mléčné žlázy, kůže, svaloviny, periferního nervu, míchy (krční, hrudní a bederní), sterna s kostní dření a stehenní kosti včetně kloubů, a očí. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.
        účinné od 1. 1. 1999Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.6 Histopatologie
        účinné od 1. 1. 1999Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, mají být zkoumány mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:
        účinné od 1. 1. 1999(a) mikroskopické vyšetření všech uchovaných orgánů a tkání s kompletním popisem všech lézí nalezených:
        účinné od 1. 1. 19991. u všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během studie,
        účinné od 1. 1. 19992. u všech zvířat ze skupiny s vysokou dávkou a kontrolní skupiny
        účinné od 1. 1. 1999(b) orgány či tkáně ukazující abnormity způsobené nebo pravděpodobně způsobené testovanou látkou jsou zkoumány také ve skupinách s nižšími dávkami,
        účinné od 1. 1. 1999(c) tam, kde výsledky svědčí pro významné zkrácení normální délky života zvířat nebo vyvolání účinků, které by mohly ovlivnit toxickou odpověď, skupina s nejblíže nižší dávkou se vyšetří popsaným způsobem,
        účinné od 1. 1. 1999(d) informace o incidenci lézí, které se normálně vyskytují v použitém kmeni zvířat, ve stejných laboratorních podmínkách, t.j. historické kontrolní údaje, jsou nezbytné pro správné posouzení významnosti změn pozorovaných u zvířat s aplikovanou látkou.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje by měly být sumarizovány ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujících léze a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy lézí. Výsledky by měly být vyhodnoceny odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o testu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o testu bude, pokud možno, obsahovat následující informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky testu: popis exposičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu.Údaje o exposici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. standardní odchylka) a měly by zahrnovat:
      účinné od 1. 1. 1999(a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením
      účinné od 1. 1. 1999(b) teplotu a vlhkost vzduchu
      účinné od 1. 1. 1999(c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu)
      účinné od 1. 1. 1999(d) povahu vehikula, je-li použito
      účinné od 1. 1. 1999(e) skutečné koncentrace v dýchací zóně
      účinné od 1. 1. 1999(f) mediány velikosti částic (je-li to relevantní)
    1. účinné od 1. 1. 1999- dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace
    2. účinné od 1. 1. 1999- údaje o toxické odpovědi podle pohlaví a dávky
    3. účinné od 1. 1. 1999- neúčinná (dávková) úroveň
    4. účinné od 1. 1. 1999- doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce
    5. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických a jiných účinků
    6. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byl pozorován každý abnormální příznak a jeho další vývoj
    7. účinné od 1. 1. 1999- data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti
    8. účinné od 1. 1. 1999- oftalmologické nálezy
    9. účinné od 1. 1. 1999- použité hematologické testy a výsledky
    10. účinné od 1. 1. 1999- testy klinické biochemie a všechny výsledky (včetně výsledků analýzy moči)
    11. účinné od 1. 1. 1999- pitevní nálezy
    12. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů
    13. účinné od 1. 1. 1999- statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod
    14. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků
    15. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.31 STUDIE TERATOGENITY - HLODAVCI A NEHLODAVCI
1. účinné od 1. 1. 19991. METODIKA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testovací metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se podává v odstupňovaných dávkách nebo koncentracích několika skupinám březích pokusných zvířat, jedna dávka na každou skupinu, alespoň v tom období březosti, ve kterém dochází k organogenezi. Krátce před očekávaným datem porodu jsou březí samice utraceny a jejich děloha i s obsahem je použita k dalšímu studiu. Tato testovací metoda zahrnuje studium embryo- a fetotoxicity.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis testovací metody
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Příprava
      účinné od 1. 1. 1999Mladé, dospělé samice, které nikdy nebyly březí, stejného věku a velikosti jsou aklimatizovány při laboratorních podmínkách aspoň 5 dní před započetím testu. Potom jsou připuštěni samci s ověřenou plodností. Oplozené samice jsou náhodně rozděleny do experimentálních skupin.
      účinné od 1. 1. 1999Oplodnění může být zajištěno přirozenou cestou nebo umělou inseminací. Testovaná látka je podávána samicím denně. Aplikace začíná časně po implantaci a pokračuje během období organogeneze. Den před termínem jsou plody vyjmuty hysterektomií a podrobeny sledování abnormalit skeletu a vnitřních orgánů včetně sledování možnosti zpomaleného růstu, opožděné osifikace a krvácení do střeva.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Testovací podmínky
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.1 Experimentální zvířata
        účinné od 1. 1. 1999Běžně používanými druhy jsou potkan, myš, křeček a králík. Preferovanými druhy jsou potkan a králík. Je třeba používat všeobecně zavedené kmeny. Používaný kmen by neměl mít nízkou plodnost a měly by být u něj známy reakce na teratogeny. Zvířata jsou chována jednotlivě.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.2 Počet a pohlaví
        účinné od 1. 1. 1999Pro každou dávku je třeba použít aspoň 20 březích potkanů, myší nebo křečků nebo 12 březích králíků. Ke sledování teratogenního potenciálu studované látky je třeba zajistit dostatečný počet vrhů a mláďat.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.3 Dávky
        účinné od 1. 1. 1999Je třeba použít aspoň tři dávky a jednu kontrolní skupinu. V případě, že je testovaná látka podána ve vehikulu, je třeba zahrnout do studie i skupinu, které bylo podáno samotné vehikulum. Je třeba také znát toxikologické vlastnosti vehikula: nesmí být teratogenní ani mít vliv na reprodukční schopnosti. Se zvířaty v kontrolní(ch) skupině(ách) se zachází stejným způsobem jako se zvířaty v testovací skupině s výjimkou aplikace testované látky. Pokud to fyzikálně chemické nebo biologické vlastnosti dovolují, pak nejvyšší dávka testované látky by v ideálním případě měla u matek vyvolat takové projevy toxicity, jako je mírné snížení váhy, ale už ne více jak 10 % úmrtí. Nízká úroveň dávek by neměla vyvolat viditelné účinky. Střední dávky by měly být voleny tak, aby byly geometricky rozloženy mezi nízkou a vysokou dávku.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.4 Limitní test
        účinné od 1. 1. 1999V případě, že látka s nízkou toxicitou při dávce nejméně 1000 mg.kg^-1 prokazatelně nevyvolá projevy embryotoxicity ani teratogenicity, není třeba testovat na jiných úrovních dávek.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.5 Doba exposice
        účinné od 1. 1. 1999Nultým dnem testu je den, kdy je pozorována vaginální zátka a/nebo spermie (pokud možno). Doba aplikace by měla zahrnovat období hlavní organogeneze. Za toto období je možno považovat 6. až 15. den u potkana a myši, 6. až 14. den u křečka a 6. až 18. den u králíka. V případě, že je za nultý den považován den, kdy bylo pozorováno páření nebo byla provedena umělá inseminace, je třeba připočítat k předchozím údajům jeden den. Podle jiné alternativy končí aplikace jeden den před očekávaným porodem.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.2.6 Období pozorování
        účinné od 1. 1. 1999Každý den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další sledování a opatření jsou prováděna za účelem minimalizace ztrát během studie.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Popis postupu
      účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka je aplikována orálně sondou, denně ve stejnou dobu.
      účinné od 1. 1. 1999Testovaným samicím se testovaná látka podává denně během příslušného období testu. Dávka může být vztažena na váhu samic na počátku podávání látky nebo, vzhledem k rychlému nárůstu hmotnosti během březosti, zvířata mohou být periodicky vážena a dávka upravována podle posledního vážení. Všechny známky toxicity je třeba ihned zaznamenat včetně doby nástupu, stupně a trvání. Samice vykazující známky potratu nebo předčasného porodu je třeba utratit a řádně makroskopicky vyšetřit. V pozorování je třeba pokračovat i po ukončení podávání látky až do doby přibližně jeden den před porodem. Hlavním účelem je postihnout většinu období březosti, ale vyhnout se komplikacím při interpretaci výsledků po přirozeném porodu. Pozorování zvířat v kleci by mělo zahrnovat přinejmenším změny kůže a srsti, očí a sliznic, dále dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování. Každý týden je třeba měřit spotřebu potravy a vážit zvířata.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.3.1 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999Pokud dojde k uhynutí během nebo na konci studie je třeba u samic makroskopicky vyšetřit na morfologické abnormity nebo patologické změny, které mohly mít vliv na průběh březosti. Ihned po smrti je třeba odstranit dělohu a její obsah vyšetřit s ohledem na úmrtí embryí a zárodků a zjistit počet živých zárodků. Obvykle je možné určit dobu úmrtí zárodků v děloze. U potkanů a králíků je možné stanovit počet žlutých tělísek. Je třeba určit pohlaví zárodků a zaznamenat váhu jednotlivých zárodků a vypočítat průměr. Po vyjmutí je třeba jednotlivě zevně vyšetřit každý zárodek. U potkanů, myší a křečků je třeba vyšetřit kosterní abnormity u zhruba jedné třetiny až poloviny vrhu a u zbytku vhodnými metodami vyšetřit abnormity měkkých tkání. U králíků je třeba každý zárodek důkladně vyšetřit pitvou z hlediska abnormit vnitřností a skeletu.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje je třeba shrnout ve formě tabulky, udávající pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat, která zabřezla, počet a procento živých zárodků a zárodků s abnormalitami skeletu nebo měkkých tkání a vztah výskytu abnormit k příslušnosti k určitým vrhům. Výsledky se hodnotí vhodnou statistickou metodou. Je možno použít jakékoliv uznávané statistické metody.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o testu.
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o testu by měla pokud možno obsahovat následující informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, potrava,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky testu,
    3. účinné od 1. 1. 1999- dávky (včetně vehikula pokud bylo použito) a koncentrace,
    4. účinné od 1. 1. 1999- projevy toxicity pro každou dávku,
    5. účinné od 1. 1. 1999- dávka bez účinku (pokud ji bylo možno stanovit),
    6. účinné od 1. 1. 1999- dobu úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila do konce testu,
    7. účinné od 1. 1. 1999- údaje o tělesné hmotnosti a spotřebě potravy,
    8. účinné od 1. 1. 1999- délka březosti a údaje o vrhu (včetně historických údajů),
    9. účinné od 1. 1. 1999- údaje o zárodcích (živé/mrtvé, pohlaví, defekty skeletu a měkkých tkání),
    10. účinné od 1. 1. 1999- údaje o jednotlivých vrzích (živé/mrtvé plody, pohlaví, defekty skeletu a měkkých tkání),
    11. účinné od 1. 1. 1999- statistické vyhodnocení výsledků,
    12. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    13. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.32 TEST KARCINOGENITY
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip metody
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka je podávána obvykle sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity, zvláště vývinu tumorů.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    účinné od 1. 1. 1999Zvířata se chovají v pokusných podmínkách ustájení a krmení nejméně pět dní před započetím testu. Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Experimentální zvířata
      účinné od 1. 1. 1999Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Počet a pohlaví
      účinné od 1. 1. 1999Pro hlodavce se užije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) pro každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty je třeba zvýšit o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Dávkové úrovně a frekvence exposic.
      účinné od 1. 1. 1999Zvolí se při nejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory.
      účinné od 1. 1. 1999Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.
      účinné od 1. 1. 1999Volba dávkových úrovní by měla vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.
      účinné od 1. 1. 1999Exposice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.4 Kontroly
      účinné od 1. 1. 1999Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu ks exponovanou skupinou, vyjma exposice testované látce.
      účinné od 1. 1. 1999Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.5 Způsob aplikace
      účinné od 1. 1. 1999Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu exposice u člověka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.1 Orální studie
        účinné od 1. 1. 1999Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
        účinné od 1. 1. 1999Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.2 Dermální studie
        účinné od 1. 1. 1999Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.3 Inhalační studie
        účinné od 1. 1. 1999Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
        účinné od 1. 1. 1999Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dnů v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
        účinné od 1. 1. 1999Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studia a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
        účinné od 1. 1. 1999Exposiční komory
        účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnout 5% objemu komory.
        účinné od 1. 1. 1999Měření nebo monitorování zahrnuje:
        účinné od 1. 1. 1999(a) Průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně;
        účinné od 1. 1. 1999(b) Koncentrace: během denní exposice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty.
        účinné od 1. 1. 1999(c) Teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně.
        účinné od 1. 1. 1999(d) Měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během exposic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.6 Trvání studie
      účinné od 1. 1. 1999Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířate použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života resp. s nízkým spontánním výskytem tumorů, doba ukončení by měla být 24 měsíců pro myši a křečky a 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.
  1. účinné od 1. 1. 19991.3 Popis postupu
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.1 Pozorování
      účinné od 1. 1. 1999Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.
      účinné od 1. 1. 1999Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Moribundní zvířata jsou utracena a pitvána.
      účinné od 1. 1. 1999Klinické příznaky a mortalita by měly být zaznamenány u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.
      účinné od 1. 1. 1999Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
      účinné od 1. 1. 1999Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.2 Klinická vyšetření
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.1 Hematologie
        účinné od 1. 1. 1999Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.
        účinné od 1. 1. 1999Za 12 měsíců, za 18 měsíců a před utracením zvířat se provede krevní nátěr ze všech zvířat. Diferenciál bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, zvláště údaje získané před utracením, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.2 Pitva
        účinné od 1. 1. 1999Kompletní pitva by měla být provedena u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena, protože byla nemocná. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat.
        účinné od 1. 1. 1999Následující orgány a tkáně by měly být uchovány ve vhodných médiích pro možné budoucí histopatologické vyšetření: mozek (včetně řezů prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítná žláza a příštítná tělíska, tkáň thymu, trachea a plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, pankreas, gonády, děloha, akcesorní pohlavní orgány, kůže, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, representativní lymfatická uzlina, samičí mléčná žláza, svalovina stehna, periferní nerv, sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubu, mícha na třech úrovních (krční, střední hrudní a bederní) a oči.
        účinné od 1. 1. 1999Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální způsob uchování těchto tkání. Naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické vyšetření. V inhalačních studiích by měl být uchován celý respirační trakt včetně nosní dutiny, hltanu a hrtanu.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.3 Histopatologické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999(a) Úplná histopatologie se provede v orgánech a tkáních všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během testu a u všech zvířat skupiny kontrolní a s nejvyšší dávkou..
        účinné od 1. 1. 1999(b) Všechny tumory viditelné okem a léze, které jsou podezřelé jako tumory, se vyšetří mikroskopicky u všech skupin.
        účinné od 1. 1. 1999(c) Je-li významný rozdíl v incidenci neoplastických lézí mezi skupinou s vysokou dávkou a kontrolní skupinou, histopatologické vyšetření se provede v daném orgánu či tkáni i v dalších skupinách.
        účinné od 1. 1. 1999(d) Je-li přežití ve skupině s vysokou dávkou podstatně nižší než u kontrol, měla by být kompletně zkoumána i skupina s nejbližší nižší dávkou.
        účinné od 1. 1. 1999(e) Je-li ve skupině s vysokou dávkou doklad o vyvolání toxických nebo jiných účinků, které by mohly ovlivnit neoplastickou odpověď, je třeba kompletně vyšetřit nejblíže nižší dávkovou úroveň.
1. účinné od 1. 1. 19992. ÚDAJE
  účinné od 1. 1. 1999Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujích tumory zjištěné během testu, doba jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.
1. účinné od 1. 1. 19993. ZPRÁVA
  1. účinné od 1. 1. 19993.1 Zpráva o testu
    účinné od 1. 1. 1999Zpráva o testu bude, pokud možno, obsahovat následující informace:
    1. účinné od 1. 1. 1999- živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
    2. účinné od 1. 1. 1999- podmínky testu:
      účinné od 1. 1. 1999Popis exposičního zařízení: včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu. Údaje o exposici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. směrodatná odchylka) a měly by zahrnovat:
      účinné od 1. 1. 1999(a) rychlost průtoku vzduchu v inhalačním zařízení,
      účinné od 1. 1. 1999(b) teplotu a vlhkost vzduchu,
      účinné od 1. 1. 1999(c) nominální koncentraci (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu),
      účinné od 1. 1. 1999(d) povahu vehikula, je-li použito,
      účinné od 1. 1. 1999(e) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
      účinné od 1. 1. 1999(f) medián velikosti částic (tam kde je relevantní),
    1. účinné od 1. 1. 1999- dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
    2. účinné od 1. 1. 1999- incidence tumorů podle pohlaví, dávky a typu tumoru,
    3. účinné od 1. 1. 1999- doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce,
    4. účinné od 1. 1. 1999- výskyt toxických účinků podle pohlaví a dávky,
    5. účinné od 1. 1. 1999- popis toxických a jiných účinků,
    6. účinné od 1. 1. 1999- doba, kdy byl pozorován jakýkoliv abnormální příznak a jeho další vývoj,
    7. účinné od 1. 1. 1999- data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
    8. účinné od 1. 1. 1999- použité hematologické testy a výsledky,
    9. účinné od 1. 1. 1999- nálezy patologicko-anatomické,
    10. účinné od 1. 1. 1999- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    11. účinné od 1. 1. 1999- statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod,
    12. účinné od 1. 1. 1999- diskuse výsledků,
    13. účinné od 1. 1. 1999- interpretace výsledků.

účinné od 1. 1. 1999B.33 KOMBINOVANÝ TEST CHRONICKÉ TOXICITY/KARCINOGENITY
1. účinné od 1. 1. 19991. METODA
  1. účinné od 1. 1. 19991.1 Princip testu
    účinné od 1. 1. 1999Cílem kombinovaného testu chronické toxicity/karcinogenity je určit chronické a karcinogenní účinky látky u některého druhu savců po dlouhodobé exposici.
    účinné od 1. 1. 1999Pro tento účel je test karcinogenity doplněn alespoň jednou exponovanou satelitní skupinou a kontrolní satelitní skupinou. Dávka použitá pro tuto satelitní skupinu může být vyšší než nejvyšší dávka použitá při testu karcinogenity. Zvířata v testu karcinogenity jsou zkoumána jak na obecnou toxicitu, tak na karcinogenní odpověď. Zvířata v exponované satelitní skupině jsou testována na obecnou toxicitu.
    účinné od 1. 1. 1999Testovaná látka se podává obvykle sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity a vývoje tumorů.
  1. účinné od 1. 1. 19991.2 Popis metody
    účinné od 1. 1. 1999Zvířata se chovají v pokusných podmínkách ustájení a krmení nejméně pět dní před započetím testu. Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.1 Experimentální zvířata
      účinné od 1. 1. 1999Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.2 Počet a pohlaví
      účinné od 1. 1. 1999Pro hlodavce se použije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) na každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty se zvýší o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.
      účinné od 1. 1. 1999Exponovaná satelitní skupina (skupiny) pro hodnocení patologie jiné než jsou tumory by každá měla obsahovat 20 zvířat pro každé pohlaví, zatímco satelitní skupina kontrol by měla obsahovat 10 zvířat každého pohlaví.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.3 Dávkové úrovně a frekvence exposic.
      účinné od 1. 1. 1999Pro test karcinogenity se zvolí přinejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory. Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.
      účinné od 1. 1. 1999Při volbě dávkových úrovní by se měly vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.
      účinné od 1. 1. 1999Pro účely testování chronické toxicity jsou v testu zahrnuty satelitní exponované skupiny a souběžná kontrolní satelitní skupina. Vysoká dávka pro exponovaná satelitní zvířata by měla vyvolat zřetelné příznaky toxicity.
      účinné od 1. 1. 1999Exposice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.4 Kontroly
      účinné od 1. 1. 1999Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma exposice testované látce.
      účinné od 1. 1. 1999Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.5 Způsob aplikace
      účinné od 1. 1. 1999Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobnému způsobu exposice u člověka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.1 Orální studie
        účinné od 1. 1. 1999Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
        účinné od 1. 1. 1999Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dní v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.2 Dermální studie
        účinné od 1. 1. 1999Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.
      1. účinné od 1. 1. 19991.2.5.3 Inhalační studie
        účinné od 1. 1. 1999Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální insfilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
        účinné od 1. 1. 1999Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dní v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
        účinné od 1. 1. 1999Volba přerušované nebo kontinuální exposice zavisí na cílech studie a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
        účinné od 1. 1. 1999Exposiční komory
        účinné od 1. 1. 1999Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísunu kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.
        účinné od 1. 1. 1999Měření nebo monitorování zahrnuje:
        účinné od 1. 1. 1999(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně,
        účinné od 1. 1. 1999(b) koncentrace: během denní exposice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty,
        účinné od 1. 1. 1999(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně,
        účinné od 1. 1. 1999(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během exposic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
    1. účinné od 1. 1. 19991.2.6 Trvání studie
      účinné od 1. 1. 1999Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života resp. s nízkým spontánním výskytem tumorů, doba ukončení by měla být 24 měsíců pro myši a křečky a 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.
      účinné od 1. 1. 1999Satelitní skupiny 20 dávkovaných zvířat pro každé pohlaví a 10 připojených kontrolních zvířat každého pohlaví použitých pro testování chronické toxicity by měly být v pokusu aspoň 12 měsíců. U těchto zvířat by mělo být plánováno utracení tak, aby umožnilo odlišení patologie, která má vztah k testované látce, od komplikujících projevů stárnutí.
  1. účinné od 1. 1. 19991.3 Popis postupu
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.1 Pozorování
      účinné od 1. 1. 1999Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.
      účinné od 1. 1. 1999U zvířat exponované satelitní skupiny (skupin) se provádí v přiměřených intervalech klinické vyšetření.
      účinné od 1. 1. 1999Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Moribundní zvířata by měla být utracena a pitvána.
      účinné od 1. 1. 1999Klinické příznaky včetně neurologických a očních nálezů a mortalita se zaznamenávají u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.
      účinné od 1. 1. 1999Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
      účinné od 1. 1. 1999Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.
    1. účinné od 1. 1. 19991.3.2 Klinická vyšetření
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.1 Hematologie
        účinné od 1. 1. 1999Hematologická vyšetření (např.obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo další měření srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od týchž potkanů.
        účinné od 1. 1. 1999Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.
        účinné od 1. 1. 1999Diferenciální obraz bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.2 Analýza moči
        účinné od 1. 1. 1999Vzorky moči od 10 potkanů od každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
        účinné od 1. 1. 1999- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
        účinné od 1. 1. 1999- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
        účinné od 1. 1. 1999- mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.3 Biochemické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech ne-hlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
        účinné od 1. 1. 1999-celková koncentrace proteinů,
        účinné od 1. 1. 1999-koncentrace albuminu,
        účinné od 1. 1. 1999-testy na funkci jater (např. aktivita bázické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminasy¹, glutamát acetát transaminasy²), gamma glutamyl transpeptidasy, ornithin dekarboxylasy,
        účinné od 1. 1. 1999-metabolismus cukrů, např. krevní glukosa na lačno,
        účinné od 1. 1. 1999-test na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
      1. účinné od 1. 1. 19991.3.2.4 Makroskopické patologické vyšetření
        účinné od 1. 1. 1999Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné léze, tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

Následující stránka