Platné znění

Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků

  1. - tělesná hmotnost zvířat P generace,
  2. - pitevní nálezy,
  3. - detailní popis všech mikroskopických nálezů,
  4. - statistické zpracování všech údajů, pokud je možné,
  5. - diskuse výsledků
  6. - interpretace výsledků.
  1. B.35 REPRODUKČNÍ TOXICITA - DVOUGENERAČNÍ TEST
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Princip testovací metody.

        Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.

        Samci rodičovské (P) generace dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.

        Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň dvou estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus.

        Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví a potom, v době gravidity a kojení, pouze samicím. Po odstavení je látka podávána zvířatům filiální generace F1 v průběhu růstu do dospělosti, v době páření a až do doby odstavení F2 generace.

        Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.

      1. 1.2 Popis testovací metody.
        1. 1.2.1 Příprava

          Před zahájením testu jsou zdravá zvířata náhodně rozdělena do dvou skupin - kontrolní a exponované skupiny. Rodičovská zvířata (P) jsou chována nejméně 5 dnů před zahájením pokusu v těch podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také možné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dní v týdnu.

        1. 1.2.2 Pokusná zvířata

          Dává se přednost potkanům nebo myším. Používají se zdravá P zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a váhy nebo věku. Plodnost musí být ověřena u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahajením aplikace.

        1. 1.2.3 Počet a pohlaví

          Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování, kojení, růst a vývoj potomstva generace F1 od početí do dospělosti, a vývoj jejich potomstva generace F2 až do odstavení.

        1. 1.2.4 Podmínky testu

          Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.

        1. 1.2.5 Dávkování

          Použijí se alespoň tři exponované skupiny a jedna kontrolní. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v největším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a utilizaci potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.

          Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě, pokud to dovolí fyzikálně-chemické vlastnosti látky a její biologické účinky, vyvolávat toxicitu a nikoli mortalitu v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky ani u rodičů ani u potomstva.

          Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví na základě individuální hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny hmotnosti. V případě těhotných samic, dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6.dni od začátku těhotenství.

        1. 1.2.6 Limitní test

          V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající jasnou mateřskou toxicitu, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.

      1. 1.3 Popis postupu
        1. 1.3.1 Plán pokusu

          Denní aplikace samcům rodičovské generace P začne ve věku pěti až devíti týdnů, aspoň po pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje deset týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění nebo se pokračuje v aplikaci a jsou použiti pro případnou produkci dalších vrhů a jsou utraceni a vyšetřeni někdy před koncem pokusu.

          Denní aplikace samicím rodičovské generace P začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň dva týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé tři týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F1 potomstva. Je přípustná změna dávkovacího plánu podle znalostí o vlastnostech studované látky, např. o indukci metabolismu resp.o bioakumulaci.

          Aplikace zvířatům generace F1 začíná po odstavu a končí jejich utracením.

        1. 1.3.2 Postup při připouštění

          Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).

          V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.

          Vzhledem k vývoji spermiogenese, zvířata generace F1 se nepoužívají pro připouštění do věku 11 týdnů u myší a 13 týdnů u potkanů. Pro připouštění zvířat generace F1 se náhodně vyberou páry z různých vrhů téže dávkové skupiny. Zvířata nepoužitá se utratí po odstavu.

          Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních organů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.

        1. 1.3.3 Velikost vrhů

          Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, např. 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat. Standardizace vrhů generace F2 se provede obdobně.

        1. 1.3.4 Pozorování

          Každé zvíře má být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří týdně jak před, tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P a F1 zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.

          Doba gestace se počítá od dne 0 těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomalií.

          Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření na možné defekty. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve 4.a 7.dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.

        1. 1.3.5 Patologie
          1. 1.3.5.1 Pitva

            Všechna dospělá zvířata generací P a F1 se utrácejí, jakmile není nutné je déle uchovávat pro posouzení účinků látky na reprodukci. Zvířata generace F1 nevybraná pro připouštění a všechna zvířata generace F2 se utratí po odstavení.

            Po utracení nebo úmrtí se všechna rodičovská zvířata P a F1 makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality anebo patologické změny, se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mlaďata uhynulá nebo moribundní se vyšetří na defekty.

          1. 1.3.5.2 Histopatologické vyšetření

            Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagina, varlata, epididymis, semenné kanálky, koagulační žlázka, prostata, hypofysa a další cílové orgány všech zvířat generací P a F1 se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech P a F1 zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku, která byla vybrána pro připouštění, a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu. Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analyze.

    1. 2. ÚDAJE

      Údaje se sumarizují v tabulkách, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet těhotných samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.

      Numerické výsledky mají být zpracovány příslušnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3.1 Zpráva o experimentu

        Zpráva o experimentu by měla pokud možno obsahovat následující údaje:

        1. - druh /kmen použitých zvířat,
        2. - údaje o toxické odezvě v závislosti na dávce a pohlaví, včetně ukazatelů plodností, gestace a životashopnosti,
        3. - dobu uhynutí v průběhu studie nebo zda zvířata přežila do ukončení pokusu,
        4. - tabulka uvádějící hmotnost u každého vrhu, průměrnou hmotnost jednotlivých mláďat a individuální hmotnost potomků před utracením,
        5. - toxické a další účinky na reprodukci, potomstvo a postnatální růst,
        6. - den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
        7. - tělesná hmotnost zvířat P a F1 generace, vybraných pro připouštění,
        8. - pitevní nálezy,
        9. - detailní popis všech mikroskopických nálezů, - statistické zpracování všech údajů, pokud je možné,
        10. - diskuse výsledků,
        11. - interpretace výsledků.
  1. B.36 TOXIKOKINETIKA
    1. 1. METODIKA
      1. 1.1 Princip testovací metody

        Testovaná látka se podává vhodnou cestou. V závislosti na zaměření studie látka může být podávána jednorázově nebo opakovaně v průběhu stanovené doby, jedné nebo několika skupinám experimentálních zvířat. Látka resp. její metabolity jsou pak podle účelu studie stanovovány v tělních tekutinách, tkáních anebo v exkretech.

        Studie mohou být prováděny s “neznačenou“ či “značenou“ formou testované látky. Jestliže je použito značení, umístí se tak, aby poskytlo co nejvíce informací o osudu sloučeniny v organismu.

      1. 1.2 Popis testovací metody
        1. 1.2.1 Přípravy

          Zdravá mladá zvířata jsou aklimatizována na laboratorní podmínky nejméně po dobu pěti dnů před testováním. Před zahájením testování jsou zvířata náhodně rozdělena do skupin. Pro řešení specielních otázek se může použít velmi mladých, pregnantních či premedikovaných zvířat.

        1. 1.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

            Toxikokinetické studie se provádějí na jednom či více vhodných živočišných druzích. Měly by se provádět na druzích užívaných nebo uvažovaných pro užití v jiných toxikologických studiích zabývajících se testovanou látkou. Jestliže jsou pro testování používáni hlodavci, neměla by být variabilita hmotnosti vyšší než ± 20 % průměrné hodnoty.

          1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

            Pro studium absorpce a vylučování se užije nejprve 4 zvířat pro každou jednotlivou dávku. Pro testování není dávána přednost určitému pohlaví, ale za určitých podmínek může vzniknout potřeba provádět studie na obou pohlavích. Jestliže jsou nalezeny rozdílné odpovědi u různých pohlaví, potom je třeba testovat 4 zvířata každého pohlaví. V případě ostatních druhů zvířat (jiných než hlodavců) je možné použít menší počet zvířat.

            Je-li studována tkáňová distribuce, pak při určení počáteční velikosti skupiny zvířat je třeba brát v úvahu jak počet zvířat, která budou utracena v každém časovém bodu, tak počet časových bodů v nichž bude testování prováděno.

            Je-li studován metabolismus, pak velikost skupiny zvířat je úměrná potřebám studie.

            Zahrnuje-li studie větší počet dávek a sledovaných časových intervalů, pak velikost skupiny zvířat by měla počítat s počtem časových intervalů a plánovaným utrácením zvířat, ale ve skupině nesmí být méně než 2 zvířata. Velikost skupiny zvířat by měla být dostatečná na to, aby pro látku resp. její metabolity poskytla přijatelné charakteristiky ve fázi retence, rovnovážného stavu a deplece.

          1. 1.2.2.3 Dávky

            V případě jednorázového podání by měly být použity nejméně 2 různé dávky testované látky. Měla by to být nízká dávka látky, po které nebyly pozorovány žádné toxické účinky a vysoká dávka, po které mohou být nalezeny změny v toxikokinetických parametrech nebo která vyvolává toxické účinky.

            V případě opakovaného podávání je většinou dostatečné podání nízkých dávek látky. Za určitých podmínek může být nezbytné i podávání vysoké dávky.

          1. 1.2.2.4 Způsob aplikace

            Toxikokinetické studie by měly být prováděny stejným způsobem aplikace a je-li to vhodné i se stejným vehikulem tak, jak jsou používány v ostatních toxikologických studiích. Testovaná látka je obvykle podávána orálně sondou nebo v potravě, aplikována na kůži, nebo podávána inhalačně po určenou dobu skupině experimentálních zvířat. Intravenosní podání testované látky může být užitečné pro stanovení relativního vstřebávání při jiných způsobech aplikace. Navíc, krátce po intravenosní aplikaci látky mohou být získány důležité informace o distribuci látky v organismu.

            Nemělo by se zapomínat na možnou interferenci vehikula s testovanou látkou. Pozornost by měla být rovněž věnována rozdílům ve vstřebávání v případě, je-li testovaná látka podána sondou nebo v potravě, a potřebě přesného stanovení dávky, zvláště je-li testovaná látka podávána v potravě.

          1. 1.2.2.5 Doba sledování

            Všechna zvířata by měla být sledována denně a příznaky toxicity i další relevantní klinické údaje zaznamenávány spolu s údaji o jejich počátku, velikosti a trvání.

      1. 1.3 Popis postupu

        Po zvážení pokusných zvířat je testovaná látka podána způsobem přiměřeným účelu. Ve zdůvodněných případech je možno nechat zvířata před podáním testované látky vyhladovět.

        1. 1.3.1 Absorpce

          Ke sledování rychlosti a rozsahu absorpce podávané látky mohou být použity různé metody s nebo bez referenční skupiny1, a to např.:

          1. - stanovení množství testované látky a ev. jejích metabolitů v exkretech např. v moči, žluči, stolici, vydechovaném vzduchu a také jejích zbytků v karkasu,
          2. - porovnání biologické odpovědi ( např. studie akutní toxicity) mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
          3. - porovnání množství látky resp. jejích metabolitů vylučovaných ledvinami mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
          4. - stanovení plochy pod křivkou závislosti koncentrací testované látky a ev. jejích metabolitů v plazmě na čase a porovnání s daty získanými v referenční skupině.
        1. 1.3.2 Distribuce

          V současné době jsou dostupné 2 přístupy, z nichž pro analýzu distribučního schematu mohou být použity jeden či oba:

          1. - při použití celotělové autoradiografie lze získat užitečné kvalitativní informace;
          2. - kvantitativní informace poskytuje stanovení koncentrací a množství testované látky a ev. jejích metabolitů v tkáních a orgánech získaných ze zvířat v různých časových intervalech po zahájení expozice.
        1. 1.3.3 Vylučování

          Při studiu vylučování se sbírá moč, stolice, vydechovaný vzduch, v určitých případech žluč. Množství testované látky a ev. jejích metabolitů se v těchto exkretech stanovuje několikrát po podání látky, a to buď do vyloučení 95 % z podaného množství nebo nejvýše 7 dnů od počátku vylučování.

          Ve specielních případech může být potřebné sledovat také vylučování testované látky v mléce v době laktace testovaných zvířat.

        1. 1.3.4 Metabolismus

          K určení rozsahu a schematu metabolismu látky se biologické vzorky analyzují vhodnými technikami. Měla by být objasněna struktura metabolitů a navrženo odpovídající metabolické schema tam, kde je třeba odpovědět na otázky z předcházejících toxikologických studií. Pro získání informací o metabolismu může být prospěšné provedení in vitro studií.

          Další informace o vztahu mezi metabolismem a toxicitou látky lze získat z biochemických studií např. studiem účinků látky na enzymy metabolického systému, sledováním poklesu endogenních neproteinových sloučenin obsahujících - SH skupiny a nebo vazby látky na makromolekuly.

    1. 2. ÚDAJE

      Získané údaje se podle typu prováděné studie sumarizují v tabulkách, pokud možno doplněných grafickým znázorněním.

      Pro každou testovanou skupinu se uvedou průměry a charakteristiky variability ve vztahu k času, dávce, tkáni a orgánům (pokud je to relevantní). Stupeň vstřebání a množství a rychlost vylučování se stanoví vhodnými metodami. V případě metabolických studií by měla být identifikována struktura metabolitů a navrženy metabolické cesty studované látky.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu

        Podle typu prováděné studie by zpráva o testu měla obsahovat pokud možno následující údaje:

        1. - živočišný druh, kmen, zdroj, životní podmínky, výživa,
        2. - charakteristika značeného materiálu, jestliže byl použit,
        3. - velikost dávky a intervaly podání,
        4. - způsob(y) podání a všechna použitá vehikula,
        5. - toxické a i ostatní pozorované účinky,
        6. - metody stanovení testované látky a ev. jejích metabolitů v biologickém materiálu včetně vydechovaného vzduchu,
        7. - tabulky výsledků rozdělené podle pohlaví, dávky, režimu, času, tkání a orgánů,
        8. - uvedení rozsahu vstřebávání a vylučování v závislosti na čase,
        9. - metody užité pro charakterizaci a identifikaci metabolitů v biologickém materiálu,
        10. - metody užité pro biochemická stanovení týkající se metabolismu,
        11. - navrhované schema pro metabolismus,
        12. - diskusi výsledků,
        13. - interpretaci výsledků.
  1. B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Úvod

        Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

        Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka není neurotoxická.

      1. 1.2 Definice

        Do skupiny látek označených v názvu této metody jako “organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

        Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků, a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

      1. 1.3 Referenční látky

        Referenční látka může být testována na pozitivní kontrolní skupině k průkazu, že v laboratorních podmínkách se reakce testovaných druhů podstatně nezměnila.

        Příkladem široce používané látky s pozdním neurotoxickým účinkem je tri-o-tolylfosfát (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, chemický název: tris(2-metylfenyl)ester kyseliny fosforečné, syn: tri-o-kresylfosfát (TOCP).

      1. 1.4 Princip testovací metody

        Testovaná látka se podává orálně v jediné dávce slepicím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se po dobu 21 dnů pozorují, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. 21 dnů po podání látky jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

      1. 1.5 Popis metody testování
        1. 1.5.1 Příprava

          Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Nejméně 5 dní před zahájením studie jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu.

          Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

          Testovaná látka se podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné v vhodném vehikulu jako je např. kukuřičný olej, pevné se doporučuje rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

      1. 1.6 Experimentální podmínky
        1. 1.6.1.1 Pokusná zvířata

          Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

        1. 1.6.1.2 Počet a pohlaví

          Kromě testovací skupiny se použije jak kontrolní skupina s vehikulem, tak pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

          V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby aspoň šest z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (po třech prvý a druhý den po podání) a šest přežilo 21 denní pozorování.

          Pozitivní kontrolní skupina se může testovat souběžně nebo se může použít kontrolní skupina z nedávné historie. Má mít aspoň šest slepic, kterým se podává látka vyvolávající pozdní neurotoxicitu, tři slepice jsou určeny pro biochemii a tři slepice pro histologii. Doporučuje se periodicky doplňovat historické údaje, když se v provádějící laboratoři změní některý ze základních prvků testu (např. plemeno, potrava, podmínky chovu).

        1. 1.6.1.3 Volba dávek

          Má být provedena předběžná studie s využitím příslušného počtu slepic a skupin v různých úrovních dávek, aby se dala stanovit úroveň, která bude použita v hlavní studii. Určitá úmrtnost je v této předběžné studii nezbytná pro stanovení přiměřené dávky v hlavní studii. Aby se zabránilo úmrtí pro akutní cholinergní účinky, používá se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky. K odhadu maximální neletální dávky testovaných látek může být použito různých typů testovacích metod (viz metoda B.l bis). Historické údaje pro slepice nebo jiné toxikologické informace mohou být také nápomocné při výběru dávky.

          Úroveň dávky testované látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší s přihlédnutím k výsledkům předběžné studie výběru dávky a hornímu limitu dávky 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Případné úhyny by neměly ovlivnit přežití dostatečného počtu zvířat pro biochemii (šest) a po 21 dnech pro histologii (šest). Atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky, se má použit jako ochrana před akutními cholinergními účinky.

        1. 1.6.1.4 Limitní test

          Jestliže test s dávkou nejméně 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice vyskytující se u lidí naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

        1. 1.6.1.5 Doba pozorování

          Doba pozorování je 21 dnů.

        1. 1.6.2 Popis postupu

          Po aplikaci prostředku, ochraňujícího před úmrtím na následky akutního cholinergního účinku, je testovaná látka podána v jediné dávce.

          1. 1.6.2.1 Všeobecné pozorování

            Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují několikrát v průběhu prvních dvou dnů a pak aspoň jednou denně po dobu 21 dní nebo dokud nebudou utraceny podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání abnormálního chování. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vykazující patologické změny vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata a zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba vyřadit, humánním způsobem utratit a pitvat.

          1. 1.6.2.2 Tělesnáh motnost

            Všechny slepice se zváží těsně před podáním testované látky a pak aspoň jednou týdně.

          1. 1.6.2.3 Biochemie

            Šest slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem a tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny (je-li skupina použita) se usmrtí v prvních dnech po aplikaci látky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také n. ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Běžně se usmrcují tři slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrcují pouze po 24 hodinách. Jestliže pozorování klinických příznaků naznačuje, že toxická látka se v organismu pohybuje velmi pomalu (hodnotí se nástup cholinergních příznaků), pak je výhodnější odebrat vzorky tkáně dvakrát ze tří zvířat, a to mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.

            U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

          1. 1.6.2.4 Pitva

            Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celkový stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

          1. 1.6.2.5 Histopatologické vyšetření

            Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfúzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha - řezy míchy se provádějí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální, z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

    1. 2. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

      Negativní výsledky o účincích sledovaných touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) běžně nevyžadují další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

      Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

      Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelace mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

      Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

      Testovaná zvířata:

      1. - použité plemeno;
      2. - počet a stáří zvířat;
      3. - zdroj, podmínky ustájení atd.;
      4. - hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku studie.

      Podmínky testování:

      1. - podrobné údaje o přípravě, stabilitě a homogenitě testované látky;
      2. - zdůvodnění výběru vehikula;
      3. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
      4. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody;
      5. - zdůvodnění vybrané úrovně dávek;
      6. - specifikace podávaných dávek, včetně podrobných údajů o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikované látky;
      7. - podrobné údaje o podání ochranného přípravku.

      Výsledky:

      1. - údaje o tělesné hmotnosti;
      2. - údaje o toxických odpovědích podle dávkových skupin, včetně úmrtnosti;
      3. - charakter, stupeň a trvání klinických příznaků (ať vratných nebo nevratných);
      4. - podrobný popis biochemických vyšetření a jejich výsledky;
      5. - pitevní nálezy;
      6. - podrobný popis všech histopatologických nálezů;
      7. - statistické vyhodnocení výsledků, u kterých je to možné.

      Diskuse výsledků

      Hodnocení a Interpretace.

    1. 4. LITERATURA

      Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 418.

  1. B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE
    1. 1. METODA
      1. 1.1 Úvod

        Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

        Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka není neurotoxická.

        Tento 28denní test pozdní neurotoxicity poskytuje informace o možném zdravotním riziku vznikajícím z expozic opakovaných během určitého krátkého časového období. Poskytne informace o závislosti odpovědi na dávce a může poskytnout odhad rozpětí dávkových úrovní, ve kterém nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky. Tato úroveň se používá pro stanovení kritérií bezpečné expozice.

      1. 1.2 Definice

        Do skupiny látek označených v názvu této metody jako “organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

        Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků, a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

      1. 1.3 Princip testovací metody

        Testovaná látka se podává denně orálně slepicím po dobu 28 dnů. Zvířata jsou sledována nejméně jednou denně, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza ještě 14 dnů po poslední dávce. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny 24 a 48 hodin po posledním podání látky. Dva týdny po poslední dávce jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

      1. 1.4 Popis testovací metody
        1. 1.4.1 Příprava

          Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Nejméně 5 dní před zahájením studie jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu.

          Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

          Testovaná látka se podává orálně, denně 7 dní v týdnu, buď sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu jako je např. kukuřičný olej. Pevné se doporučuje rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

        1. 1.4.2 Experimentální podmínky
          1. 1.4.2.1 Pokusná zvířata

            Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

          1. 1.4.2.2 Počet a pohlaví

            Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu s vehikulem. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

            V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby aspoň šest z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (po třech v každém ze dvou časových bodů) a šest přežilo čtrnáctidenní pozorování po ukončení expozice.

          1. 1.4.2.3 Volba dávek

            Dávkové úrovně se zvolí s přihlédnutím ke třem výsledkům z akutního testu na pozdní neurotoxicitu a k dalším údajům o toxicitě nebo kinetice testované látky. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, nejlépe příznaky pozdní neurotoxicity, nezpůsobit žádné uhynutí ani zřejmé utrpení. Dále se zvolí řada klesajících dávek způsobem, který umožní sledovat závislost účinku na dávce. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity.

          1. 1.4.2.4 Limitní test

            Jestliže test s dávkou nejméně 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti a den, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice vyskytující se u lidí naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

          1. 1.4.2.5 Doba pozorování

            Všechna zvířata se pozorují nejméně jednou denně po dobu expozice a 14 dnů po ní, nebo do utracení a do pitvy podle plánu.

        1. 1.4.3 Popis postupu

          Testovaná látka se podává sedm dní v týdnu po 28 dnů.

          1. 1.4.3.1 Všeobecné pozorování

            Pozorování má začít okamžitě po začátku podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují nejméně jednou denně po 28 dnů a dalších 14 dnů po ukončení aplikace, do utracení podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na ně omezovat. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice, zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě, jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba vyloučit, humánním způsobem utratit a pitvat.

          1. 1.4.3.2 Tělesná hmotnost

            Všechny slepice se zváží těsně před prvním podáním testované látky a pak alespoň jednou týdně.

          1. 1.4.3.3 Biochemie

            Šest slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem se usmrtí v prvních dnech po aplikaci poslední dávky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také n.ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Obvykle se usmrcují tři slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách po posledním podání dávky. Jestliže údaje z akutní studie nebo jiných studií (např. toxikokinetických) naznačují, že je výhodnější jiná doba usmrcení po poslední aplikaci, pak se doporučuje použít tuto dobu a zdůvodnění uvést v dokumentaci.

            U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

          1. 1.4.3.4 Pitva

            Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celková stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

          1. 1.4.3.5 Histopatologické vyšetření

            Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfúzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha (řezy míchy se provádí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální), z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

            Nejprve se vyšetří fixované tkáně všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s nejvyšší dávkou. Pokud se najdou u zvířat skupiny s nejvyšší dávkou známky účinku, provede se histologické vyšetření i na slepicích ze skupin, které dostaly dávku střední a nízkou.

    1. 2. SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

      Pokud jsou výsledky získané touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) negativní, běžně se neprovádí další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

      Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

      Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelaci mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

      Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

    1. 3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Zpráva o průběhu pokusu

      Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

      Testovaná zvířata:

      1. - použité plemeno,
      2. - počet a stáří zvířat,
      3. - zdroj, podmínky ustájení atd.,
      4. - hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku studie.

      Podmínky testování:

      1. - podrobné údaje o přípravě, stabilitě a homogenitě testované látky,
      2. - zdůvodnění výběru vehikula,
      3. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
      4. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody,
      5. - zdůvodnění vybrané úrovně dávek,
      6. - specifikace podávaných dávek, včetně podrobných údajů o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikované látky,
      7. - zdůvodnění doby pro odběr na biochemické vyšetření, je-li jiná než 24 a 48 hodin.

      Výsledky:

      1. - údaje o tělesné hmotnosti,
      2. - údaje o toxických odpovědích podle dávkových skupin, včetně úmrtnosti,
      3. - úroveň bez účinku (NOAEL),
      4. - charakter, stupeň a trvání klinických příznaků (ať vratných nebo nevratných),
      5. - podrobný popis biochemických vyšetření a jejich výsledky,
      6. - pitevní nálezy,
      7. - podrobný popis všech histopatologických nálezů,
      8. - statistické vyhodnocení výsledků, u kterých je to možné.

      Diskuse výsledků

      Hodnocení a Interpretace

    1. 4. LITERATURA

      Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 419.

OBSAH PŘÍLOHY

Zpráva o průběhu pokusu Zpráva o průběhu pokusu OBSAH PŘÍLOHY
Strana
B.1.Akutní toxicita orální (per os) 7827
B.1.bis Akutní toxicita orální (per os) - metoda fixní dávky 7831
B.1.tris Akutní toxicita (orální) - metoda stanovení třídy akutní toxicity 7836
B.2.Akutní toxicita (inhalační) 7850
B.3.Akutní toxicita (dermální) 7854
B.4.Akutní toxicita (kožní dráždivost) 7858
B.5.Akutní toxicita (oční dráždivost)7862
B.6.Senzibilizace kůže7867
B.7.Subakutní toxicita orální (28denní opakovaní aplikace) 7875
B.8.Subakutní toxicita inhalační (28denní opakovaní aplikace) 7881
B.9.Subakutní toxicita dermální (28denní opakovaní dívka) 7886
B.10.Mutagenita (in vitro cytogenetický test na savčích buňkách) 7890
B.11.Mutagenita (in vivo cytogenetická analýza chromosomu kostní dřeně savců7893
B.12.Mutagenita (micronukleus test)7896
B.13.Mutagenita (Escherichia coli - test zpětné mutace)7899
B.14.Mutagenita (Salmonella typhimurium - test zpětné mutace)7902
B.15.Genové mutace - Saccharomyces cerevisiae7905
B.16.Mitotickí rekombinace - Sacchoromyces cerevisiae 7908
B.17.In vitro test na genové mutace v savčích buňkách 7911
B.18.Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňky in vitro 7914
B.19.SCE - výměna sesterských chromatid in vitro 7918
B.20.Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster 7921
B.21.Test transformace savčích buněk in vitro 7924
B.22.Dominantní letální test u hlodavců7927
B.23.Cytogenetická analýza savčích zárodečných buněk in vivo 7930
B.24.Spot test u myší7933
B.25.Přenosné translokace u myší 7936
B.26.Subchronická toxicita orální (90denní opakované podávání per os, studie na hlodavcích)7940
B.27.Subchronická toxicita orální (90denní opakované podávání per os, studie na nehlodavcích)7944
B.28.Subchronická toxicita dermální (90denní opakovaní aplikace, studie na hlodavcích) 7948
B.29.Subchronická toxicita inhalační (90denní opakovaní inhalační expozice, studie na hlodavcích) 7953
B.30.Testování chronické toxicity 7958
B.31.Studie teratogenity - hlodavci a nehlodavci 7964
B.32.Test karcinogenity 7967
B.33.Kombinovaný test chronické toxicity/karcinogenity 7973
B.34.Reprodukční toxicita - jednogenerační test7981
B.35.Reprodukční toxicita - dvougenerační test7985
B.36.Toxikokinetika 7989
B.37.Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - akutní expozice7993
B.38.Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - 28denní opakovaní expozice 7998
  1. 1) § 2 odst. 8 písm. f) až n) zákona č. 157/1998 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých dalších zákonů.
  2. 2) Zákon č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání, ve znění zákonů č. 162/1993 Sb., č. 193/1994 Sb., č. 243/1997 Sb. a č. 30/1998 Sb.
  3. 3) Směrnice Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj pro zkoušení chemikálií. Oddíl 4 – vliv na zdraví (OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4 – Health Effects).
  4. 1) Vyšetření na lačno je žádoucí pro řadu měření v séru a plazmě, zvláště pro glukózu. Hlavní důvod pro toto doporučení je to, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně, hladovění přes noc by mohlo mít vliv na celkový metabolismus a u aplikace v potravě by zasáhla do pravidelnosti expozice testované látce. Pokud se odebírá krev na lačno, je třeba biochemické vyšetření provést až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu testu.
  5. 1 nyní známá jako sérová alanin aminotransferasa
  6. 2 nyní známá jako sérová aspartát aminotransferasa
  7. 3 tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců, a dále štítná žláza (s přištítnými tělísky) ze všech nehlodavců, mají být zváženy
  8. 3 tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců mají být zváženy.
  9. 1 V této metodě se referenční skupinou rozumí ta, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost dávky