Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Příprava vzorku Zkoušení vzorku Metoda nejpravděpodobnějšího počtu Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet bakterií Účinnost kultivační půdy a validita metod na stanovení počtu Interpretace výsledků

2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků (zkoušky na specifické mikroorganismy)

V těchto obecných metodách se předpokládá použití určitých selektivních půd. Vlastností společnou pro všechny selektivní půdy je, že subletálně poškozené mikroorganismy nejsou zachyceny. Jelikož subletálně poškozené mikroorganismy jsou důležité pro kvalitu výrobku, jejich oživení musí být zahrnuto do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy.

Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se tyto účinky odpovídajícím způsobem.

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Přestože zkouška byla určena pro zjištění bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae, je známo, že mohou být nalezeny i jiné typy mikroorganismů (např. Aeromonas, Pseudomonas).

Důkaz. Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h). Obal se protřepe a obsah homogenizátu A odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se kvantitativně přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.

Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství obohacené tekuté půdy E se přidají z homogenizátu A a/nebo z jeho ředění množství odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g nebo 0,1 ml, 0,01 ml a 0,001 ml zkoušeného výrobku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného výrobku, které dává pozitivní výsledek a největší množství zkoušeného výrobku, které dává negativní výsledek.

Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.

Tab. 2.6.13-1

Escherichia coli

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Obsah nádoby se protřepe a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se přenese do 100 ml půdy G a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovu půdu H a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst červených, nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli. Ta se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.

Salmonella

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale použije se místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. 1 ml obohacené kultury se přenese do 10 ml tekuté půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.

Pseudomonas aeruginosa

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misku s agarovou půdou N a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, výrobek vyhovuje. Jestliže se objeví růst gramnegativních tyčinek, vhodné množství z morfologicky odlišných izolovaných kolonií se přenese do tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže při 41 °C až 43 °C není pozorován žádný růst.

Staphylococcus aureus

Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Vyočkuje se na misku s agarovou půdou O a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Černé kolonie grampozitivních koků obklopené jasnou zónou indikují přítomnost S. aureus. Výsledek je možno potvrdit vhodnými biochemickými zkouškami, jako jsou koagulasová a deoxyribonukleasová zkouška. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se na agarové půdě O neobjeví popsaný typ kolonií nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.

Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky

Dále uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované tekuté půdy.

Postupuje se následujícím způsobem. Dále uvedené zkušební kmeny se 18 h až 24 h kultivují samostatně ve zkumavkách obsahujících vhodné tekuté půdy při 30 °C až 35 °C:

Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých mikroorganismů v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a na Salmonelly, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pro všechny mikroorganismy se má dosáhnout pozitivního výsledku.

Klostridie

Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro výrobky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.

1. 1. Zkouška na klostridie. Zkoušený výrobek se zpracuje tak, jak je popsáno v obecné metodě (2.6.12). Připraví se dvě stejné dávky odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku. Jedna dávka se zahřívá 10 min na 80 °C a potom se rychle ochladí. Po protřepání se z ní naočkuje 10 ml do zkumavky (38 mm x 200 mm) nebo do jiné vhodné nádoby obsahující 100 ml živné půdy P. Druhá dávka se nezahřívá a naočkuje se stejným způsobem do druhé zkumavky. Obě zkumavky se inkubují za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na tekutou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin a inkubují se opět 48 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.

   Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na tekutou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se ža aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

1. 2. Stanovení počtu Clostridium perfringens

   Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavce nebo v jiné vhodné nádobě s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou část lékopisu.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycbolanový agar s xylosou a lysinem)

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)

Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá se 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ± 0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

Neutralizační činidla

Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 přednostně před sterilizací. Jestliže se použijí, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.

Typický neutralizační roztok má následující složení:

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.

Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

Příprava vzorku Zkoušení vzorku Metoda nejpravděpodobnějšího počtu Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet bakterií Účinnost kultivační půdy a validita metod na stanovení počtu Interpretace výsledků Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie Tab. 2.6.13-1 Escherichia coli Salmonella Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky Klostridie Doporučené živné půdy a roztoky Neutralizační činidla

2.6.14 Bakteriální endotoxiny

Pět metod uvedených v tomto článku je určeno ke zjištění, zda koncentrace endotoxinu v přípravku, který má v lékopise článek obsahující limit pro bakteriální endotoxiny, vyhovuje tomuto limitu. Výrobci, kteří mají v úmyslu se přesvědčit, zda-li např. jejich výrobní postupy snižují koncentraci endotoxinu v přípravku během výroby, nejsou vázáni postupy uvedenými v tomto článku.

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny se používá lyzát z amebocytů ostrorepa, Limulus polyphemus (LAL test). Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinu, hodnotě pH a teplotě. K reakci je nutná přítomnost určitých dvojmocných kationtů, enzymatický komplex podporující srážení a srážlivý protein, které jsou obsaženy v lyzátu. Štěpení chromogenního peptidu v roztoku lyzátu po aktivaci endotoxiny obsaženými v roztoku lze též použít ke stanovení koncentrace endotoxinů z koncentrace uvolněného barviva.

V této kapitole je popsáno pět následujících metod:

Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška

Metoda B. Semikvantitativní gelová metoda

Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda

Metoda D. Chromogenní peptidová kinetická metoda

Metoda E. Chromogenní peptidová metoda konečného bodu

Jestliže je v článku uvedena zkouška na endotoxiny bez uvedení metody, provede se zkoušení gelovou metodou A, která byla pro přípravek validována. Jinak se zkouška provádí metodou validovanou pro přípravek a uvedenou v článku.

V článcích jsou uvedeny požadavky na bakteriální endotoxiny jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neobsahuje více endotoxinu, než je limitní koncentrace. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.

Před provedením zkoušky na endotoxiny na zkoušeném přípravku je nutno ověřit:

1. - zda použité zařízení neadsorbuje endotoxiny,
2. - hodnotu lambda (λ) použitého lyzátu. Lambda je definována jako deklarovaná citlivost lyzátu uvedená na obalu (gelová metoda) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky (kvantitativní metoda),
3. - nepřítomnost interferujících faktorů.

Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.

Není-li v článku pro přípravek, který je analyzován, uvedeno jinak, uplatňují se u všech pěti metod stejné požadavky popsané pro metodu A až metodu E.

V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.

Ve zkoušce se používá tento referenční přípravek a tato zkoumadla.

Referenční endotoxin BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách (m.j.) porovnáním s mezinárodním standardem.

Lyzát z amebocytů limula. Je vyroben podle požadavků odpovědné autority země výrobce. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ,); ta je uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže dává negativní výsledek v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxiny ve zkoušeném přípravku. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.

Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,0 až 8,0 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek.

Není-li uvedeno jinak, ve zkoušce se pro přípravu roztoků a ředění použije voda pro LAL.

Gelové metody

Metody A a B jsou založeny na tvorbě pevného gelu v roztoku obsahujícím bakteriální endotoxiny po smíchání a inkubaci s lyzátem. U obou metod je požadováno ověřit citlivost lyzátu udanou výrobcem podle postupu uvedeného v části Citlivost lyzátu a prokázat nepřítomnost interferujících faktorů podle postupu uvedeného v části Interferující faktory.

Metody A a B se odlišují v tom, že metoda A ověřuje, zda oba vzorky zkoušeného přípravku obsahují méně endotoxinu, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v odpovídajícím článku, zatímco v metodě B se koncentrace endotoxinu ve zkoušeném přípravku stanoví semikvantitativně a geometrický průměr ve zkoušeném přípravku koncentrace endotoxinu je nižší, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v lékopisném článku.

Následující části: Postup, Citlivost lyzátu a Interferující faktory se používají u obou metod A a B.

Postup. Odpovídající objem lyzátu se nakape do všech zkumavek nebo jiných vhodných nádob (např. podložní sklo) vyhřátých na teplotu 37 °C ± 1 °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla stanovena experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní reakce se hodnotí tvorba pevného gelu, který se neporuší při opatrném převrácení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.

Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 λ, λ, 0,5 λ a 0,25 λ, kde λ je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň poslední ředění každé série dává negativní výsledek. Postupem uvedeným v části Postup zkoušky se zkouší všechna ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu, u které byla v každé sérii ředění zjištěna pozitivní reakce. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší více než dvojnásobně od hodnoty deklarované, je uvedená citlivost potvrzena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.

Interferující faktory. pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla mívá pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku, ve kterých již není endotoxin zjistitelný. Tyto vzorky se použijí ve zředění nepřesahujícím nejvyšší účinné ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:

kde jsou obě hodnoty vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v miligramu přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku ve zkoušeném roztoku (v miligramech v mililitru nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku v mililitru), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků přípravků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na obalu.

Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. V opačném případě, kdy zkoušený přípravek působí inhibici nebo aktivaci, se interferující faktory odstraní vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorbované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.

Jestliže zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce v ředění nižším, než je MVD, zkouška se opakuje za použití MVD.

Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem a endotoxiny se získají ve vodě pro LAL nebo ve vhodném tlumivém roztoku. Pro každý zkoušený přípravek je stanoven zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu.

Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje se zkoušeným přípravkem, ke kterému se přidá referenční endotoxin BRP a použije se jeden ze zvolených způsobů na odstranění interferujících faktorů.

METODA A. GELOVÁ METODA (LIMITNÍ ZKOUŠKA)

Zkouška na endotoxin ve zkoušeném přípravku. Provádí se dvojmo, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití takového ředění, které nepřevyšuje maximální účinné ředění zkoušeného přípravku, který v případě nutnosti byl ještě podroben některému ze způsobů odstraňujících interferující faktory.

Zároveň se zkouší negativní kontrola tvořená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční endotoxin BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu a z nichž jedna obsahuje zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi ave druhé negativní, zkouška se opakuje; zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.

METODA B. SEMIKVANTITATIVNÍ GELOVÁ METODA

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Je-li třeba, vzorky určené ke zkoušení se zpracují postupem odstraňujícím interferující faktory. Připraví se tyto roztoky:

1. a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujích faktorů. Použije se voda pro LAL k přípravě dvou nezávislých sériových ředění zkoušeného vzorku po čtyřech zkumavkách v koncentraci 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění, se kterým byla provedena kontrola na odstranění interferujících faktorů,
2. b) dvě řady po čtyřech zkumavkách obsahující vodu pro LAL a referenční endotoxin BRP v koncentraci 2 λ, λ, 1/2 λ, a 1/4 λ,
3. c) dvojici zkumavek se zkoušeným přípravkem v samostatně připraveném ředění, které bylo použito ke kontrole na interferující faktory a s referenčním endotoxinem BRP o koncentraci 2 λ,
4. d) voda pro LAL (jako negativní kontrola).

Zkouška se provede postupem uvedeným v části Citlivost lyzátu. Zkoušku lze hodnotit, jsou-li splněny tři následující podmínky:

1. - výsledek v roztoku (d) je negativní,
2. - výsledky v roztocích (c) jsou pozitivní,
3. - geometrický průměr koncentrace endotoxinu v roztocích (b) je v rozmezí 1/2 λ až 2 λ.

Pro každé ředění (a) se stanoví nejnižší koncentrace přípravku, která dává pozitivní výsledek, tedy obsahuje 1 m.j. endotoxinu v mililitru. Jestliže byl původní roztok zkoušeného přípravku ředěn faktorem d₁ aby vyhověl zkoušce na interferující faktory, a tento roztok byl dále ředěn faktorem d₂ k získání nejnižší koncentrace s pozitivním výsledkem, pak množství endotoxinu v m.j./ml v původním roztoku zkoušeného přípravku se rovná λ x d₁ x d₂. Vypočítá se geometrický průměr ze dvou výsledků obou ředění (a). Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže geometrický průměr koncentrací endotoxinu je nižší než limitní koncentrace endotoxinu uvedená v příslušném článku.

Kinetické metody

Obě metody, turbidimetrická kinetická (metoda C) a chromogenní peptidová kinetická metoda (metoda D) používají lineární regresi logaritmu odpovědi na logaritmu koncentrace endotoxinu. Způsob provedení je uveden v části Postup pro každou metodu zvlášť; části Ověření parametrů standardní křivky, Interferující faktory a Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku jsou vhodné jak pro turbidimetrickou kinetickou metodu, tak pro chromogenní peptidovou kinetickou metodu.

METODA C. TURBIDIMETRICKÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Vhodným zařízením se měří reakční čas potřebný k dosažení předem určeného stupně zákalu v roztoku, ke kterému byl vhodným způsobem přidán lyzát Koncentrace endotoxinu v roztoku se vypočítá z logaritmu reakčního času a kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

Rychlost změny zákalu v lineární části regresní křivky se též může použít ke stanovení koncentrace endotoxinu.

METODA D. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ KINETICKÁ METODA

Postup. Měří se reakční čas potřebný k dosažení předem určené intenzity zbarvení po uvolnění barviva z vhodného chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát; zbarvení se stanoví spektrofotometricky při vhodné vlnové délce. Koncentrace endotoxinu v roztoku se odvodí z logaritmu reakčního času pomocí kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.

METODA C A METODA D

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se nejméně dvě samostatné řady, každá nejméně o čtyřech koncentracích referenčního endotoxinu BRP v požadovaném rozsahu. Limity uvedené výrobcem by se neměly překročit. Použije se nejméně jedna koncentrace na jednu jednotku v logaritmické stupnici a jako negativní kontrola voda pro LAL. Do každé zkumavky se přidá stejný objem lyzátu a u metody D vhodné množství chromogenního peptidu. Měří se reakční čas, jak bylo uvedeno výše.

Pro každou zkumavku se stanoví logaritmus reakčního času jako funkce logaritmu koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese logaritmu reakčního času na logaritmu koncentrace endotoxinu za použití standardní metody (metoda nejmenších čtverců).

Regresní křivka má signifikantní sklon a je signifikantně lineární; obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedené výrobcem lyzátu.

Stanoví se počet logaritmicky stejně vzdálených koncentrací, pro které je regresní křivka lineární. Je-li tímto číslem trojice (λ₁, λ₂, λ₃), použije se druhá koncentrace λ₂ jako λ_m ve zkoušce na interferující faktory a ve stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Jestliže je toto číslo rovno 4 nebo 5, použije se v tomto případě třetí koncentrace λ₃ jako λ_m.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu jako antilogaritmus průměrné logaritmické koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % hodnoty λ_m zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku se mohou zkoušet bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % hodnoty λ_m je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A. Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nej vyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

kde λ_l < λ_mˊ < λ_m

Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

1. a) dvojice samostatně připravených roztoků zkoušeného přípravku ve stejném ředění jaké bylo použito ke kontrole odstranění interferujících faktorů,
2. b) dvojice samostatně připravených roztoků obsahujících referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m nebo λ_mˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),
3. c) tři logaritmicky stejně vzdálené koncentrace referenčního endotoxinu BRP pokrývající lineární část regresní křivky. Každé ředění se připraví dvakrát,
4. d) voda pro LAL jako negativní kontrola.

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou dvojici roztoků (a) a (b) pomocí regresní křivky připravené z kontrolní série (c).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

1. - výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,
2. - výsledky kontrolní série (c) vyhovují požadavkům uvedeným v Ověření parametrů standardní křivky,
3. - množství endotoxinu, vypočítané z geometrického průměru koncentrace endotoxinu v roztocích (b) po odečtení geometrického průměru koncentrace endotoxinu roztoků (a), je vyšší než 50 % a nižší než 200 %. Vypočítá se množství v procentech jako podíl výsledku po odečtení λ_m nebo λ_mˊ (podle toho, která hodnota byla použita) a výsledek se násobí 100.

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λ_m nebo λ_mˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.

METODA E. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ METODA KONEČNÉHO BODU

Postup. Při vhodné vlnové délce se měří spektrometrem koncentrace barviva uvolněného po inkubaci z roztoku obsahujícího endotoxin, lyzát a chromogenní peptid. Koncentrace endotoxinu se vypočítá z absorbace při zvolené vlnové délce pomocí kalibrační křivky připravené postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky.

Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.

Připraví se čtyři samostatné řady referenčního endotoxinu BRP ve vodě pro LAL tak, aby přesahovala rozmezí uvedené výrobcem lyzátu; rozmezí má obsahovat limit (λ) deklarovaný výrobcem. Použije se kontrolní roztok připravený podle návodu výrobce lyzátu.

Do každé zkumavky se přidají předepsaná množství lyzátu a chromogenního peptidu a směs se inkubuje po dobu stanovenou výrobcem.

Reakce se zastaví a měří se absorbance při vhodné vlnové délce.

Pro každou zkumavku v každé čtveřici ředění se do grafu zaznamená absorbance každé koncentrace jako funkce koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese absorbance na koncentraci použitím standardní analytické metody (metoda nejmenších čtverců). Regresní křivka má signifikantní sklon a je lineární, obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu. Vypočítá se koncentrace endotoxinu λ_m, což je aritmetický průměr nejvyšší (λ_h) a nejnižší (λ_l) koncentrace endotoxinu, při které je regresní křivka lineární. Všechny hodnoty se uvedou v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.

Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.

Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu.

Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % a nejvýše 200 % hodnoty λ_m, zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku mohou být zkoušeny bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.

Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % nebo vyšší než 200 % hodnoty λ_m, je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A.

Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nejvyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

kde λ_l < λ_mˊ < λ_m.

Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.

Připraví se tyto roztoky:

1. a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujících faktorů,
2. b) dva samostatně připravené roztoky obsahující referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m nebo λ_mˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),
3. c) dvojice roztoků referenčního endotoxinu BRP o koncentraci λ_h a dvojice roztoků o koncentraci λ_l,
4. d) voda pro LAL jako negativní kontrola.

Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Po inkubaci se ve všech roztocích (a), (b), (c) a (d) změří absorbance. Absorbance roztoků (c) a (d) se použije pro výpočet regresní křivky a vypočítá se koncentrace endotoxinu v roztocích (a) a (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:

1. - výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,