Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Emulgující aniontová mast

Je to mast emulgující vodu s aniontovým emulgátorem. Obsahuje 2,2 % až 3,2 % alkylsíranů, počítáno jako cetylsíran sodný (C₁₆H₃₃NaO₄S, M_x 344,48).

Příprava

Vlastnosti

Prosvítavá bílá mast slabého charakteristického pachu. Dá se do ní vmíchat voda.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g masti se míchá v kádince s 5,0 g chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5,0 g vody R. Zkoušená mast se rozpustí v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).
2. B. 1 g se v porcelánovém kelímku spálí a vyžíhá. Zbytek se rozpustí mírným zahřátím ve 2 ml kyseliny chlorovodíkové 10% RS a 2 ml vody R a zfiltruje se. Filtrát se použije také ke zkoušce C. Ke 2 ml filtrátu se přidá chlorid barnatý RS1; vylučuje se bílá sraženina nerozpustná v kyselině chlorovodíkové (alkylsíran).
3. C. Barví žlutě nesvítivý plamen (sodík).

Zkoušky na čistotu

Číslo zmýdelnění (2.5.6). Nejvýše 3. 2,000 g se odváží do skládaného filtru, vloží se do Soxhletova extrakčního přístroje a vyluhuje se 1 h asi 30 ml až 50 ml etheru R. Z výluhu se ether oddestiluje a zbytek se použije ke stanovení.

Číslo hydroxylové (2.5.3). 55 až 70.

Stanovení obsahu

2,000 g se v kuželové baňce se zabroušenou zátkou smíchají za mírného zahřátí s 25,0 ml chloroformu R. Po ochlazení se přidá 20,0 ml vody R, 5 ml kyseliny sírové zředěné R, 0,1 ml roztoku žlutě dimethylové R (1 g/l) v chloroformu R a za silného protřepávání se titruje karbethopendeciniumbromidem 0,01 mol/l VS z červeného do žlutého zbarvení chloroformové vrstvy.

1 ml karbethopendeciniumbromidu 0,01 mol/l VS odpovídá 3,445 mg C₁6H₃₃NaO₄S.

Uchovávání

Viz článek Unguenta.

Chráněna před světlem.

Unguentum emulsificans nonionicum

Emulgující neiontová mast

Je to mast emulgující vodu s neiontovým emulgátorem.

Příprava

Vlastnosti

Bílá mast slabého charakteristického pachu. Dá se do ní vmíchat voda.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g masti se míchá v kádince s 5 g chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 g vody R. Zkoušená mast se rozpouští v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).
2. B. 3 g se v porcelánové misce roztaví, přidá se 7 ml vody R teplé 70 °C a míchá se do vychladnutí; vznikne krém. Po přimíchání dalších 15 ml vody R; vznikne stejnorodá emulze typu o/v (emulgující mast).
3. C. 0,1 g se rozpustí ve 2 ml chloroformu R a protřepe se s 2 ml směsi stejných objemových dílů thiokyanatanu amonného RS a roztoku dusičnanu kobaltnatého R (100 g/l); chloroformová vrstva se zbarví modře (sorbimakrogol).

Zkoušky na čistotu

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené masti.

Uchovávání

Viz článek Unguenta.

Chráněna před světlem.

Unguentum molle

Měkká mast

Je to mast emulgující vodu.

Příprava

Vlastnosti

Měkká světle žlutá stejnorodá mast slabého charakteristického pachu. Dá se do ní vmíchat omezené množství vody.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g masti se míchá v kádince s 5 ml chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 ml vody R. Zkoušená mast se ve vodě nerozpouští, v chloroformu se téměř rozpustí. Zakalený chloroformový roztok se použije ve zkoušce C (hydrofobní mast).
2. B. Do 5 g se po částech vmíchá 5 g vody R; vznikne stejnorodá emulze (emulgující mast).
3. C. K zakalenému chloroformovému roztoku ze zkoušky A se přidá 1 ml acetanhydridu R, 0,1 ml kyseliny sírové R a opatrně se promíchá; vznikne sytě zelené zbarvení (cholesterol).
4. D. 2 g se promíchají s 0,2 g síry R a silně se zahřejí; uvolňuje se pach sirovodíku (tekutý parafin).

Zkouška na čistotu

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 3,0. Navážka se rozpustí ve 20 ml chloroformu R a teprve potom se přidá 30 ml kyseliny octové bezvodé R.

Uchovávání

Viz článek Unguentum.

V chladnu a chráněna před světlem.

Vydávání

Před použitím nebo výdejem se promísí.

Unguentum ophthalmicum simplex

Prostá oční mast

Synonymum. Oculentum simplex

Je to sterilní masťový základ pro oční masti, emulgující vodu.

Příprava

Vlastnosti

Měkká světle žlutá stejnorodá mast slabého charakteristického pachu. Dá se do ní vmíchat omezené množství vody.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g se smíchá v kádince s 5 ml chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 ml vody R. Zkoušená mast se rozpouští v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).
2. B. Do 5 g se po částech vmíchá 5 ml vody R; vznikne stejnorodá emulzní mast (emulgující mast).
3. C. Asi 0,5 g se rozpustí v 5 ml chloroformu R, přidá se 1 ml acetanhydridu R, 0,1 ml kyseliny sírové R a opatrně se promíchá; roztok se zbarví sytě zeleně (cholesterol).

Zkoušky na čistotu

Teplota tání (2.2.15). 37 °C až 50 °C. Zkoušená mast se naplní do otevřených skleněných kapilár, které se nechají stát 24 h při teplotě nepřevyšující 10 °C nebo 2 h při 0 °C.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 3,0.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Uchovávání

Viz článek Ocularia.

Chráněna před světlem.

Unguentum simplex

Prostá mast

Je to hydrofobní mast.

Příprava

Vlastnosti

Bílá nebo nažloutle bílá stejnorodá mast.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g se smíchá v kádince s 5 ml chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 ml vody R. Zkoušená mast se rozpustí v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).
2. B. Asi 10 g se roztaví na vodní lázni ve skleněné misce o průměru asi 6 cm s kulatým dnem. Tavenina se nechá vychladnout při 10 °C. Na rozdíl od vepřového sádla má ztuhlá hmota hladký povrch bez paprskovitého vrásnění a je uprostřed bez prohloubeniny.
3. C. 1 g se zahřívá s 2 ml lihu 96% R na vodní lázni do roztavení. Teplá směs se protřepává 30 s a po ochlazení se přidá 1 ml amoniaku 26%) R; vznikne slabě červené zbarvení (propylgallat).

Zkoušky na čistotu

Barva, vlhkost, nečistoty. 10 g se roztaví ve zkumavce na vodní lázni. Vzniklá tavenina není zbarvena intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž₃ (2.2.2, Metoda II) aneopalizuje silněji než porovnávací suspenze III (2.2.1).

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,5.

Číslo jodové (2.5.4). 44 až 58.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 175 až 185; stanoví se s 2,00 g zkoušené masti.

Uchovávání

Viz článek Unguenta.

Chráněna před světlem.

Unguentum Whitfield

Whitfieldova mast

Synonymum. Whitfield unguentum

Je to hydrofobní mast s kyselinou salicylovou (C₇H₆O₃, M_r 138,12) a kyselinou benzoovou (C₇H₆O₂,M_r 122,12).

Obsahuje 4,62 % až 5,38 % C₇H₆O₃ a 11,4 % až 12,6 % C₇H₆O₂.

Příprava

Vlastnosti

Žlutá měkká stejnorodá mast charakteristického pachu.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 g se míchá v kádince s 5 ml chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince míchá s 5 ml vody R. Zkoušená mast se ve vodě nerozpouští, rozpouští se v chloroformu (hydrofobní mast). Chloroformový roztok se použije také ve zkoušce B.
2. B. K chloroformovému roztoku ze zkoušky A se přidá 1 ml acetanhydridu R, 0,1 ml kyseliny sírové R a opatrně se promíchá; vznikne tmavě zelené zbarvení (cholesterol).
3. C. 5 g se rozpustí v dělicí nálevce ve 20 ml benzinu lékařského R a vytřepe se směsí 20 ml vody R a 10 ml lihu 96% R. Vodná vrstva se zfiltruje a použije se také ve zkoušce D. K 5 ml filtrátu se přidá 0,05 ml červeně methylové RS a zneutralizuje se hydroxidem sodným zředěným RS do prvního žlutého zbarvení. Přidá se 5 ml vody R a 0,1 ml chloridu železitého RS1; roztok se zbarví červenofialově (kyselina salicylová) a současně se v roztoku vytvoří hnědočervená klkatá sraženina (kyselina benzoová).
4. D. 5,0 ml filtrátu ze zkoušky C se v baňce se zabroušenou zátkou smíchá s 5 ml bromové vody RS, uzavře se a nechá se stát 15 min. Zfiltruje se a přebytek bromu se odstraní mírným povařením filtrátu do odbarvení. Po ochlazení se přidá 0,05 ml červeně methylové RS a po kapkách se přidává hydroxid sodný zředěný RS do prvního žlutého zbarvení. Po přidání 0,2 ml chloridu železitého RS1 se vylučuje světle hnědočervená sraženina (kyselina benzoová).

Stanovení obsahu

Kyselina benzoová. 1,500 g se rozpustí v dělicí nálevce ve 20 ml etheru R, přidá se 20 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,2 ml modři thymolové RS do žlutozeleného zbarvení a titruje se v dělicí nálevce týmž odměrným roztokem do stejného zbarvení. Ztitrovaná tekutina se dále použije ke stanovení kyseliny salicylové.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 12,21 mg C₇H₆O₂.

Obsah kyseliny benzoové v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. a - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/ VS v mililitrech,
2. n - navážku zkoušeného přípravku v gramech,
3. y - obsah kyseliny salicylové v procentech.

Kyselina salicylová. Ke ztitrované tekutině z předchozí zkoušky se přidá 30 ml roztoku chloridu sodného R (100 g/l) a promíchá se. Po vyčeření se vodná vrstva oddělí a zbytek v dělicí nálevce se dvakrát promyje 30 ml chloridu sodného R (100 g/l). Vyčeřené oddělené vodné vrstvy se spojí a zředí se vodou R na 250,0 ml. Roztok se zfiltruje a k 10,0 ml čirého filtrátu ve 100 ml odměrné baňce se přidá 0,2 ml roztoku síranu amonno-železitého (připraví se rozpuštěním 10 g síranu amonno-železitého R v 70 ml vody R a 20 ml kyseliny dusičné zředěné RS). Poté se připravená směs zředí vodou R na 100,0 ml a měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 525 nm proti kontrolnímu roztoku, kterým je roztok připravený zředěním 0,2 ml roztoku síranu amonno-železitého vodou R na 100,0 ml.

Současně se 30,0 mg kyseliny salicylové CRL rozpustí ve 100ml odměrné baňce v 10 ml lihu 96% R a zředí se vodou R na 100,0 ml. K 10,0 ml tohoto roztoku se ve 100ml odměrné baňce přidá 0,20 ml roztoku síranu amonno-železitého, zředí se vodou R na 100,0 ml a měří se absorbance způsobem popsaným v předchozím odstavci.

Obsah kyseliny salicylové v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. A - absorbanci roztoku zkoušeného přípravku,
2. A_S - absorbanci porovnávacího roztoku,
3. n - navážku zkoušeného přípravku ze stanovení kyseliny benzoové v gramech,
4. n_S - navážku kyseliny salicylové CRL v gramech.

Uchovávání

Viz článek Unguenta.

V chladnu a chráněna před světlem.

Vaccinum actinobacillosis inactivatum ad suem

Inaktivovaná vakcína proti pleuropneumonii prasat

(Actinobacillus pleuropneumoniae)

Je to tekutý přípravek obsahující jednu nebo více následujících složek: jeden nebo více vhodných inaktivovaných kmenů Actinobacillus pleuropneumoniae; toxinů, proteinů nebo polysacharidů odvozených z vhodných kmenů A. pleuropneumoniae ošetřených tak, aby byly neškodné; frakcí toxinů odvozených z vhodných kmenů A. pleuropneumoniae, a je-li třeba, ošetřených tak, aby byly neškodné.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Inokulum se kultivuje ve vhodné živné půdě, každý kmen odděleně. Při pomnožování se kontrolují vhodnými metodami některé parametry, jako růstová křivka, obsah bílkovin a množství příslušných antigenů; nalezené hodnoty jsou v rozmezí schváleném pro jednotlivý výrobek. U sklizeného materiálu se vhodnými metodami ověří čistota a totožnost. Po skončení kultivace se bakteriální suspenze jednotlivých kmenů odděleně shromáždí a vhodnou metodou se inaktivují. Mohou se detoxikovat, purifikovat a koncentrovat. Vakcína může obsahovat adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Výběr kmenů závisí na epidemiologické situaci. Vakcína prokazatelně vyhovuje ve zkouškách bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7) provedených na prasatech. K prokázání bezpečnosti a imunogenity se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost

1. A. Vakcína se všemi doporučenými způsoby podá každé kategorii zvířat, pro kterou je určena. Použitá zvířata nemají protilátky proti sérotypu A. pleuropneumoniae nebo jeho toxinům obsaženým ve vakcíně. Nejméně deseti zvířatům se doporučeným způsobem každému podá dvojnásobná dávka vakcíny. Každému zvířeti se doporučeným způsobem v intervalu podle návodu k použití podá další jedna dávka vakcíny. Zvířata se pozorují 14 dní po poslední vakcinaci. Rektální teplota se zaznamenává den před vakcinací, v den vakcinace, 2 h, 4 h a 6 h po podání vakcíny a ještě další 2 dny. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové reakce. Průměrná teplota se zvýší nejvýše o 1,5 °C au žádného zvířete nepřesáhne zvýšení teploty 2 °C. Pokud je vakcína určena pro březí prasnice, potom se ve zkoušce u této kategorie zvířat prodlužuje pozorovací doba do porodu a zaznamenávají se všechny vlivy na březost a potomstvo.
2. B. Zvířata používaná ve zkoušce imunogenity se rovněž použijí k hodnocení bezpečnosti. Rektální teplota se zaznamenává den před vakcinací, v den vakcinace, 2 h, 4 h a 6 h po podání vakcíny a ještě další 2 dny. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové reakce. Průměrná teplota se zvýší nejvýše o 1,5 °C a u žádného zvířete nepřesáhne zvýšení teploty 2 °C. Místo vpichu se vyšetří na místní postvakcinační reakce. Mikroskopické vyšetření se provede po porážce. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové reakce.
3. C. Zvířata použitá k terénnímu ověření se rovněž využijí k hodnocení bezpečnosti. Zkouška se provede na všech kategoriích zvířat, pro které je vakcína určena. Použijí se nejméně tři skupiny zvířat, v každé je nejméně dvacet kusů a stejné množství skupin po deseti kontrolních zvířatech. Místo vpichu se vyšetří na místní postvakcinační reakce. Rektální teplota se zaznamenává den před vakcinací, v den vakcinace a po celou dobu vzestupu teploty, pokud byl porovnán při zkouškách A a B a ještě další 2 dny po vakcinaci. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové reakce. Průměrná teplota se zvýší nejvýše o 1,5 °C a u žádného zvířete nepřesáhne zvýšení teploty 2 °C.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se může použít k průkazu imunogenity vakcíny.

Zkoušení šarže

Zkouška účinnosti šarže. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti se neprovádí při běžném zkoušení šarží vakcíny, ale dělá se při jedné nebo více příležitostech, podle rozhodnutí nebo souhlasu oprávněné autority. Pokud zkouška není provedena, dělá se jiná vhodná validovaná zkouška, jejíž kritéria pro přijetí jsou v souladu s šarží vakcíny, která vykázala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Následující zkouška se může použít, když byla dostatečně statisticky zhodnocena její korelace se zkouškou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Pěti sérologicky negativním myším o hmotnosti 18 g až 20 g se subkutánně vstříkne vhodná dávka. Pokud je podle návodu vyžadována revakcinace, může se provést, jestliže bylo prokázáno, že to vytvoří vhodně citlivý zkušební systém. Před vakcinací a v daném období mezi 14 až 21 dny po poslední injekci se každému zvířeti odebere krev a připraví se vzorky séra. U jednotlivých sér se stanoví titr specifických protilátek proti všem deklarovaným antigenním složkám; používají se vhodné validované zkoušky - např. ELISA (2.7.1). Vakcína vyhovuje, jestliže hladiny protilátek nejsou prokazatelně nižší než hladiny protilátek získané se šarží, která vykázala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška šarže na bakteriální endotoxiny. Zkouška na bakteriální endotoxiny (2.6.14) se provádí z šarže, nebo kde charakter adjuvantu brání provedení odpovídající zkoušky, provede se zkouška z konečné várky antigenu nebo směsi antigenů před přidáním adjuvantní látky.

Vakcína může obsahovat nejvýše 10⁶m.j. endotoxinu v dávce, pokud není u vyššího množství endotoxinu prokázána bezpečnost.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína vstříkne zdravým sérologicky negativním zvířatům, vyvolá tvorbu specifických protilátek proti antigenním složkám A. pleuropneumoniae uvedeným v označení na obalu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Užívají se dvě prasata nejnižšího stáří předepsaného pro vakcinaci, která nemají protilátky proti sérotypům A. pleuropneumoniae nebo jejich toxinům obsaženým ve vakcíně. Každému praseti se podají předepsaným způsobem dvě dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 14 dní. Rektální teplota se zaznamenává den před vakcinací, v den vakcinace, 2 h, 4 h a 8 h po podání vakcíny a potom ještě další 2 dny. Nezjistí se žádné nadměrné místní ani systémové změny. Může se objevit dočasné zvýšení teploty nepřevyšující 2 °C.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Čelenžní kmen pro zkoušku účinnosti je volen tak, aby zajistil čelenž všech A_p toxinů ¹) vytvářených sérotypy uvedenými ve složení vakcíny. Může být nezbytné provést více než jednu zkoušku s různými čelenžními kmeny.

Nejméně sedm prasat nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, která nemají protilátky proti A. pleuropneumoniae a A_p toxinům, se vakcinuje podle doporučeného schématu. Nejméně sedm nevakcinovaných prasat stejného stáří se použije jako kontrola. Za tři týdny po poslední vakcinaci se všechna prasata čelenžují intranazálně nebo intratracheálně nebo aerosolem ve vhodném množství sérotypem A. pleuropneumoniae. Zvířata se pozorují 7 dní. K zamezení zbytečného týrání se zvláště nemocná kontrolní zvířata porazí a považují se za uhynulá v důsledku nemoci. Na konci doby pozorování se usmrtí všechna přežívající zvířata. Provede se pitva všech zvířat. Plíce, tracheobronchiální mízní uzliny a mandle se vyšetřují na přítomnost A. pleuropneumoniae. Hodnotí se rozsah poškození plic při pitvě. Každému ze sedmi plicních laloků se přidělí nejvyšší možný stupeň poškození z pětičlenné stupnice²) hodnocení. Každé místo v laloku vykazující pneumonii nebo pleuritidu se ohodnotí číslem z pětičlenné stupnice, součet těchto hodnot dává skóre projeden lalok (nejvyšší možné skóre pro celé plíce je 35). Celkové skóre se počítá odděleně pro vakcinovaná a kontrolní zvířata (jestliže je ve skupině sedm prasat, maximální skóre celé skupiny je 245).

Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud vakcinovaná zvířata ve srovnání s kontrolními vykazují nižší úmrtnost; nižší výskyt typických klinických příznaků (dušnost, kašel a zvracení); menší rozsah typického poškození plic; menší počet reizolací A. pleuropneumoniae z plic, tracheobronchiálních mízních uzlin a mandlí. Kde je to možné, hodnotí se incidence statisticky, u skupiny vakcinováných zvířat je významně nižší.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvedou:

1. - antigeny obsažené ve vakcíně,
2. - sérotypy A. pleuropneumoniae, proti kterým vakcína chrání.

Vaccinum adenovirosis caninae inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti adenoviróze psů

Je to suspenze jednoho nebo více vhodných kmenů psího adenoviru 1 (virus infekční hepatitidy psů) anebo psího adenoviru 2. Je inaktivovaná způsobem, který uchová odpovídající imunogenitu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Ke zkoušce inaktivace se použije množství viru, které odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Provedou se dvě pasáže v buněčných kulturách takového typu, jaký byl použit při výrobě, nebo v buněčných kulturách s prokazatelně nejméně stejnou citlivostí. Nezjistí se žádný živý virus.

Vakcína může obsahovat adjuvans.

Složení vakcíny

Vakcína prokazatelně vyhovuje z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7). K prokázání bezpečnosti a imunogenity se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Zkouška se provádí pro každý doporučený způsob podání na zvířatech nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci. Použije se šarže vakcíny, u které byla zjištěna nejvyšší účinnost.

Pro každou zkoušku se použije nejméně deset psů, kteří nemají protilátky proti psímu adenoviru 1 nebo 2. Každému psovi se podají dvě vakcinační dávky. Jestliže doporučené schéma požaduje další dávku, podá se jedna dávka v doporučeném intervalu. Zvířata se pozorují 14 dnů od poslední vakcinace. Psi zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí.

Je-li vakcína určena pro březí samice, vakcinují se zvířata v předepsaném stupni březosti nebo v různých stupních březosti podle doporučené tabulky. Pozorování se prodlouží až do prvního dne po porodu. Zvířata zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí. Nezjistí se nežádoucí účinky na březost ani na potomstvo.

Imunogenita. U vakcíny určené k ochraně proti hepatitidě je vhodná pro průkaz imunogenity zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti. Jestliže je vakcína určena k ochraně proti respiratomím příznakům, je pro průkaz imunogenity nezbytná další zkouška v této indikaci.

Zkoušení šarže

Zkouška účinnosti šarže. Zkouška se neprovádí při běžné kontrole šarží vakcíny, dělá se u určené vakcíny při jedné nebo více příležitostech, podle rozhodnutí nebo po dohodě s oprávněnou autoritou. Pokud zkouška není provedena, dělá se jiná vhodná validovaná zkouška, jejíž kritéria pro přijetí jsou v souladu s šarží vakcíny, která vykázala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška totožnosti

Po podání vakcíny vnímavým zvířatům se vytváří specifické protilátky proti typu nebo typům psího adenoviru, které jsou uvedeny v označení na obalu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma psům nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, kteří nemají neutralizační protilátky proti psímu adenoviru, se doporučeným způsobem podají dvě dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 14 dnů. Psi zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí.

Inaktivace. Provede se zkouška na zbytky infekčního psího adenoviru. Deset dávek vakcíny se naočkuje na vnímavou buněčnou kulturu, za 6 až 8 dnů se provede pasáž. Kultura se udržuje 14 dnů. Nezjistí se živý virus. Jestliže vakcína obsahuje adjuvans, oddělí se adjuvans od tekuté fáze způsobem, který neinaktivuje živý virus nebo jinak nebrání jeho zjištění.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v odstavci Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm psů nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, kteří nemají protilátky proti psímu adenoviru. Doporučeným způsobem a podle doporučeného schématu se vakcinuje pět zvířat. Dvě zvířata slouží jako kontrolní. Za 21 dnů se každému ze sedmi zvířat vstříkne intravenózně takové množství virulentního kmene psího adenoviru, které je schopné u vnímavých psů způsobit úhyn nebo typické příznaky onemocnění. Zvířata se pozorují dalších 21 dnů. Aby se předešlo zbytečnému utrpení, jsou psi s typickými příznaky infekce psím adenovirem šetrným způsobem utraceni. Zkouška je neplatná a opakuje se, pokud jedno nebo obě kontrolní zvířata neuhynou nebo nevykazují typické příznaky vážné infekce psím adenovirem. Vakcína vyhovuje, pokud se vakcinovaná zvířata nacházejí v dobrém zdravotním stavu.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede typ nebo typy psího adenoviru obsaženého ve vakcíně.

Vaccinum clostridii chauvoei ad usum veterinarium¹)

Vakcína proti Clostridium chauvoei pro veterinární použití

Synonymum. Očkovací látka proti Clostridium chauvoei pro veterinární použití

Připravuje se z kultury jednoho či více vhodných kmenů Clostridium chauvoei v tekuté živné půdě. Celá kultura se inaktivuje tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována. K inaktivované kultuře se může přidat vhodné adjuvans.

Zkouška totožnosti

Přípravek chrání vnímavá zvířata proti infekci Clostridium chauvoei.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá a vnímavá zvířata toho druhu, pro který je přípravek určen. Každému z nich se na jedno místo vstříkne doporučeným způsobem dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná výrazná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se podkožně vstříkne množství nepřesahující nejnižší dávku uvedenou v označení jako první dávka. Po 28 dnech se těmto zvířatům vstříkne množství nepřesahující nejmenší dávku uvedenou v označení jako druhá dávka. Za 14 dní po revakcinaci se vakcinovaným i pěti nevakcinovaným kontrolním morčatům nitrosvalově vstříkne vhodné množství virulentní kultury nebo suspenze spor Cl. chauvoei, aktivovaných, je-li třeba, aktivačním agens, jako je chlorid vápenatý. Přípravek vyhovuje, pokud během pěti dnů nejvýše 10 % z vakcinovaných morčat uhyne na infekci Cl chauvoei a naopak všechna kontrolní zvířata uhynou na infekci Cl chauvoei do 48 h po čelenži virulentní kulturou nebo 72 h po čelenži suspenzí spor. Uhyne-li více než 10 %, ale méně než 20 % vakcinovaných morčat, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje, jestliže v druhé zkoušce uhyne nejvýše 10% morčat z vakcinované skupiny a všechna kontrolní zvířata uhynou do 48 h po čelenži virulentní kulturou nebo do 72 h po čelenži suspenzí spor. Aby se předešlo zbytečnému utrpení v důsledku virulentní čelenže, utratí se umírající zvířata a považují se za uhynulá na infekci Cl chauvoei.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede, že se přípravek před použitím roztřepe.

Vaccinum encefalitidis ixodibus advectae inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti klíšťové encefalitidě

Je to tekutý přípravek připravený z vhodného kmene viru klíšťové encefalitidy pomnoženého v kulturách kuřecích embryonálních buněk nebo v jiných vhodných buněčných kulturách a inaktivovaného vhodnou validovanou metodou.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu srovnatelnou s vakcínou, jejíž klinická účinnost a bezpečnost pro člověka byly prokázány. Není-li předepsáno a schváleno jinak, pasáž viru v konečné šarži není vyšší než pasáž viru ve vakcíně použité pro klinické zkoušení.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v kuřecích embryonálních buňkách připravených z vajec pocházejících z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo v jiné vhodné buněčné kultuře (5.2.3).

Virová inokula

Použitý kmen viru je specifikován vývojovými záznamy, které obsahují informace o jeho původu a následném zacházení. Virové inokulum se uchovává při teplotě nižší než –60 °C.

Pouze virové inokulum vyhovující následujícím požadavkům se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. V každém virovém inokulu se vakcinační kmen viru klíšťové encefalitidy prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), nejlépe za použití monoklonálních protilátek.

Koncentrace viru. Pro zajištění pravidelnosti výroby se stanoví koncentrace viru v každém virovém inokulu titrací na vhodné buněčné kultuře.

Cizí agens (2.6.16). Každé virové inokulum vyhovuje požadavkům na cizí agens ve vakcínách pro humánní použití; zkoušky na buněčných kulturách se provedou jen na lidských a opičích buňkách. K neutralizaci vakcinačního viru se přednostně použijí monoklonální protilátky.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Sérum a trypsin použité při přípravě buněčných suspenzí jsou prokazatelně prosty cizích agens. Média pro buněčné kultury mohou obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčné kultury použité při výrobě vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky).

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované sklizně.

Zkouška totožnosti. Obsah viru klíšťové encefalitidy v jednotlivé sklizni se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), přednostně použitím monoklonálních protilátek nebo neutralizací viru v buněčné kultuře.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky vyhovují ve zkoušce na cizí antigeny (2.6.16). Vyrábí-li se vakcína pomocí systému buněčných bank, vyhovují kontrolní buňky ve zkoušce totožnosti.

Koncentrace viru. K prokázání pravidelnosti výroby se stanoví virová koncentrace titrací na vhodné buněčné kultuře.

Inaktivace

Aby se zabránilo interferenci, odstraní se virové agregáty bezprostředně před inaktivačním procesem. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda má být prokazatelně trvale schopná inaktivovat virus klíšťové encefalitidy bez zničení antigenní a imunologické aktivity. Součástí validační studie je inaktivační křivka, znázorňující koncentraci zbytkového živého viru měřenou nejméně třikrát. Použije-li se k inaktivaci formaldehyd, ověří se přítomnost zbytků volného formaldehydu na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Reziduální infekční virus. Množství inaktivované sklizně, odpovídající nejméně deseti lidským dávkám vakcíny, se inokuluje na buňky primárních kuřecích fibroblastů nebo na jiné buňky prokazatelně nejméně stejně citlivé k viru klíšťové encefalitidy, a to nejméně v množství 3 cm² buněčné kultury na 1 ml inokula. Inkubuje se 14 dnů při 37 °C ± 1 °C.

Na konci inkubačního období není patrný cytopatický efekt. Odebere se kultivační médium a inokuluje se po 0,03 ml intracerebrálně nejméně deseti myším starým asi 4 týdny. Myši se pozorují 14 dní. Neprojeví se u nich známky infekce virem klíšťové encefalitidy.

Purifikace

Několik inaktivovaných jednotlivých sklizní se spojí před koncentrací a purifikací vhodnými metodami, nejlépe kontinuálním odstřeďováním v sacharosovém gradientu.

Pouze purifikovaná, inaktivovaná sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Sterilita (2.6.1). Purifikovaná inaktivovaná sklizeň vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Specifická účinnost. Obsah antigenu v purifikované inaktivované sklizni se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Vhodnou metodou se stanoví celkový obsah bílkovin. Specifická účinnost, stanovená jako obsah antigenu v jednotce hmotnosti bílkovin, je v rozmezí schváleném pro přípravek.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více purifikovaných inaktivovaných sklizní.

Pouze konečná várka vakcíny vyhovující následujícím požadavkům se může použít k výrobě šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která odpovídá všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Jestliže zkoušky na volný formaldehyd, bovinní sérumalbumin (je-li použit), pyrogenní látky a stanovení účinnosti byly provedeny s vyhovujícím výsledkem na konečné várce vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se prokáže, že vakcína obsahuje virus klíšťové encefalitidy. Použijí se monoklonální protilátky nebo zkouška imunogenity na myších popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Je-li jako adjuvans použit hydroxid hlinitý nebo hydratovaný fosforečnan hlinitý, vakcína vyhovuje zkoušce uvedené v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd (2.4.18). Nejvýše 0,1 g/l.

Bovinní sérumalbumin. Použije-li se při přípravě vakcíny bovinní sérumalbumin, obsahuje vakcína nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně jedna lidská dávka.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky nezbytné k ochraně myši před působením letální dávky viru klíšťové encefalitidy podané intraperitoneálně s množstvím referenčního přípravku vakcíny proti klíšťové encefalitidě k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je nutné použít schválený referenční přípravek viru klíšťové encefalitidy a pro čelenž vhodný virus klíšťové encefalitidy ze schváleného kmene.

Následující postup je uveden jako příklad metody vhodné pro danou vakcínu.

Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši o hmotnosti 11 g až 17 g pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí nejméně do šesti skupin o vhodném počtu pro zajištění validity zkoušky a pro titraci čelenžní suspenze se použijí nejméně čtyři skupiny myší po deseti jedincích. Použijí se myši téhož pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

Stanovení účinnosti vakcíny. Připraví se nejméně tři vhodná ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku; pro splnění validačních požadavků jsou obvykle nezbytná čtyři až pět ředění. Připraví se ředění tak, aby nejvíce koncentrovaná suspenze ochránila více než 50 % zvířat a nejméně koncentrovaná suspenze méně než 50 %. Jednotlivá ředění pro různé skupiny myší se aplikují subkutánně po 0,2 ml každému zvířeti ve skupině. Po sedmi dnech se injekce opakují za použití stejné řady ředění. Čtrnáct dní po druhé injekci se připraví suspenze čelenžního viru obsahující dávku nejméně 100 LD₅₀ v 0,2 ml. Každé vakcinované myši se intraperitoneálně vstříkne 0,2 ml suspenze. Pro ověření čelenžní dávky se připraví série nejméně tří ředění čelenžní virové suspenze v nejvýše stonásobných ředěních. Myši se rozdělí na pět skupin po deseti myších. Každé skupině se přidělí jedno ředění (jedné skupině čelenžní dávka) a každé myši se intraperitoneálně aplikuje 0,2 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 21 dní po čelenži a počítají se myši uhynulé mezi 7. a 21. dnem po čelenži.

Výpočty. Výsledky se počítají obvyklými statistickými metodami pro kvantální odpověď (např. 5.3 Statistická analýza výsledků biologických zkoušek).

Validační kritéria. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

1. - koncentrace čelenžního viru je nejméně 100 LD₅₀,
2. - pro zkoušenou i srovnávací vakcínu leží ochranná dávka (PD₅₀) mezi nejvyšší a nejnižší podanou dávkou,
3. - statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,
4. - interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 33 % a nejvýše 300 % stanovené účinnosti.

Požadavky na účinnost. K výpočtu průměrné účinnosti se použijí výsledky všech platných zkoušek a jejich intervaly spolehlivosti. Při výpočtu váženého průměru se jako váha použije převrácená hodnota druhé mocniny směrodatné odchylky. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže stanovená účinnost není menší než účinnost schválená oprávněnou autoritou na základě údajů o účinnosti v klinických zkouškách.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - kmen viru použitého pro přípravu,
2. - typ buněk použitých pro výrobu vakcíny.

Vaccinum febris flavae vivum

Živá vakcína proti žluté zimnici

Je to lyofilizovaný přípravek kmene 17D viru žluté zimnice (Flavivirus hominis) pomnoženého na kuřecích embryích. Vakcína se rekonstituuje bezprostředně před použitím předepsaným způsobem na čirou tekutinu.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou živou vakcínu proti žluté zimnici s přijatelnou imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že bude-li přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9) s následující úpravou zkoušky na morčatech: každému morčeti se vstříkne deset lidských dávek a pozorují se 21 dní.

Referenční přípravek. Ve zkoušce na neurotropismus se použije jako referenční přípravek taková šarže vakcíny, která byla s uspokojivými výsledky použita u člověka.

Substrát pro pomnožení viru

Virus pro přípravu matečného a pracovního inokula a všech šarží vakcíny se pomnožuje v tkáních kuřecích embryí z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Kmen 17D je určen podle původních záznamů, které obsahují informaci o původu kmene a následné manipulaci s ním. Inokula viru se připravují ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě pod –60 °C. Matečné a pracovní inokulum neobsahují žádnou lidskou bílkovinu ani přidané sérum.

Není-li jinak vysvětleno a schváleno, virus v konečné vakcíně je na úrovni 204. až 239. pasáže z původně izolovaného kmene 17D. Pracovní inokulum je pouze jedinou pasáží z matečného inokula. Pracovní inokulum se použije bez zprostředkující pasáže jako inokulum pro infikování tkání použitých k výrobě šarže vakcíny, aby bylo zajištěno, že vakcína byla vyrobena pouze jedinou pasáží z matečného inokula, které vyhovělo všem zkouškám na bezpečnost.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k pomnožení viru.

Zkoušky totožnosti. V matečném a pracovním inokulu se virus žluté zimnice prokáže neutralizací sérem v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Cizí agens (2.6.16). Každé pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám:

1. Bakterie a houby - sterilita
2. Mykoplazmata
3. Mykobakterie
4. Ptačí viry
5. Zkouška na dospělých myších (pouze intraperitoneální inokulace)
6. Zkouška na morčatech

Zkouška na opicích. Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám na opicích na virémii (viscerotropismus), imunogenitu a neurotropismus.

Používají se opice druhu Macaca citlivé na virus žluté zimnice, které v době podání virové kultury nejsou prokazatelně imunní vůči žluté zimnici. Jsou zdravé a nebyly dříve intracerebrálně nebo intraspinálně očkovány. Mimo to nebyly očkovány jinými způsoby neurotropními viry nebo antigeny příbuznými viru žluté zimnice. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic.

Použije se zkušební dávka 0,25 ml obsahující množství odpovídající nejméně 5000 myších LD₅₀ a nejvýše 50 000 myších LD₅₀, stanovená titrací infekčního viru a za použití stanoveného vztahu mezi koncentrací viru a myší LD₅₀ (viz Stanovení účinnosti). Zkušební dávka se pod anestezií vstříkne každé opici do frontálního laloku a opice se pozorují nejméně 30 dní.

Virémie (Viscerotropismus). Viscerotropismus je určen množstvím viru obsaženého v séru. Druhý, čtvrtý a šestý den po inokulaci se každé zkoušené opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Z každého séra se připraví ředění 1 : 10, 1 : 100 a 1 : 1000 a každé ředění se naočkuje do skupiny nejméně šesti nádob s buněčnou kulturou používanou ke stanovení virové koncentrace. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže žádné sérum neobsahuje více než ekvivalent 500 myších LD₅₀ v 0,03 ml a nejvýše jedno sérum obsahuje více než ekvivalent 100 myších LD₅₀ v 0,03 ml.

Imunogenita. Za 30 dní od podání zkušební dávky se každé opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže se nejméně 90 % zkoušených opic ukáže jako imunních, což se stanoví vyšetřením jejich séra v dále popsané zkoušce na neutralizaci viru žluté zimnice.

Ukázalo se, že malé ředění séra (např. 1 : 10) může obsahovat nespecifické inhibitory, které ovlivňují tuto zkoušku; takové sérum se upraví, aby se inhibitory odstranily. Alespoň ředění séra 1 : 10, 1 :40 a 1 : 160 od každé opice se smíchají se stejným objemem kultury vakcinačního viru 17D na ředění, které poskytne nejvhodnější počet plaků při použité titrační metodě. Směsi séra s virem se 1 h inkubují ve vodní lázni při 37 °C a pak se ochladí ve vodě s ledem; po 0,2 ml směsi séra s virem se dá na čtyři misky s buněčnou kulturou a postupuje se jako při stanovení koncentrace viru. Podobně se naočkuje deset misek stejným množstvím virové kultury smíchané se stejným objemem zředěného 1 : 10 séra, o němž se ví, že neobsahuje žádné neutralizující protilátky proti viru žluté zimnice. Na konci pozorovací doby se porovná průměrný počet plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a neimunní sérum s průměrným počtem plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a jednotlivá ředění každého opičího séra. Nejvýše 10 % zkoušených opic má sérum, které při ředění 1:10 nestačí snížit počet plaků o 50 %.

Neurotropismus. Neurotropismus se stanoví z klinického pozorování encefalitidy, z výskytu klinických manifestací a histologických lézí při srovnání s deseti zvířaty očkovanými srovnávacím přípravkem. Virové inokulum není přijatelné, jestliže počet a trvání febrilních reakcí nebo klinických známek encefalitidy a patologické nálezy svědčí o změnách vlastnosti viru.

Klinické hodnocení. Opice se po 30 dní denně vyšetřují personálem dobře obeznámeným s klinickými příznaky encefalitidy u primátů (je-li třeba, opice se vyjmou z klecí a vyšetří se na příznaky motorické slabosti nebo křečí). Virové inokulum není přijatelné, jestliže opice po očkování vykazují známky encefalitidy, jako je paralýza nebo neschopnost stát po stimulaci, neboje mortalita vyšší než u referenčního přípravku. Tyto a jiné příznaky encefalitidy, jako jsou parézy, nekoordinace, letargie, třes nebo křeče, jsou převedeny do číselných hodnot, aby se síla příznaků mohla vyjádřit postupnou řadou. Každý den se každá opice ohodnotí počtem bodů na základě stupnice:

Klinické hodnocení jednotlivé opice odpovídá průměru denního bodování: klinické hodnocení inokula je součtem bodů jednotlivých opic. Inokulum není přijatelné, jestliže průměr klinického hodnocení u skupin opic naočkovaných tímto inokulem je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic naočkovaných referenčním přípravkem. Při posuzování přijatelnosti inokula se bere ohled i na jednotlivá zvířata s neobvykle prudkými příznaky.

Histologické hodnocení. Vyšetřuje se těchto pět oblastí mozku:

Krční a bederní ztluštění páteřní míchy se každé rozdělí do šesti bloků: 15 μm řezy z tkáně zalité v parafínu se barví gallocyaninem. Numerické hodnocení každého řezu míchy a struktur v každém řezu mozku je uvedeno níže. Léze jsou hodnoceny následovně:

1. Stupeň 1 - minimální - 1 až 3 malé ohniskové zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta několika neuronů.
2. Stupeň 2 - střední - 4 nebo více ohniskových zánětlivých infiltrátů. Degenerace nebo ztráta neuronů postihující nejvýše jednu třetinu buněk.
3. Stupeň 3 - těžký - střední ohniska nebo difuzní zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta dvou třetin neuronů.
4. Stupeň 4 - záplava - různé, ale často prudké zánětlivé reakce. Degenerace nebo ztráta více než 90 % neuronů.

Bylo zjištěno, že inokulace vakcíny proti žluté zimnici do opičího mozku způsobuje léze v různých anatomických útvarech centrální nervové soustavy o různé frekvenci a síle (I. S. Levenbook et al., Journal of Biological Standardization, 1987, 15, 305-313). Na základě těchto dvou indikátorů se anatomické struktury mohou podle histologického hodnocení zařadit do tří skupin - cílová, chráněná a výběrová. Cílové zóny vykazují silné specifické léze u většiny opic bez ohledu na stupeň neurovirulence inokula. Chráněné zóny vykazují minimální specifické léze u menšiny zvířat. Výběrové zóny vykazují velmi signifikantní nárůst výskytu výrazných specifických lézí v závislosti na stupni neurovirulence inokula. Výběrové a cílové zóny pro opice Macaca cynomolgus a Macaca rhesus jsou uvedeny v tabulce.

Bodové hodnocení výběrové a cílové zóny se použije pro konečné hodnocení inokula. Pro hodnocení jednotlivých opic se sečtou počty reakcí v cílové zóně v každém řezu odděleně podle počtu zkoumaných oblastí. Podobně se vypočítá samostatné hodnocení pro výběrové zóny.

Průměr bodů pro zkoušenou skupinu se vypočítá dvěma způsoby: 1) dělením celkového počtu výběrových zón počtem opic; 2) dělením celkového počtu cílových a výběrových zón počtem opic. Tato dvě hodnocení je možno použít při rozhodování o vhodnosti inokula. Inokulum není možno použít, jestliže počet lézí je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic inokulovaných referenčním přípravkem.

Pomnožováni a sklizeň viru

Všechny práce s kuřecími embryi se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se ve stejnou dobu nepracuje s jiným infekčním agens ani s jinými buňkami. Dvě procenta, ale nejméně dvacet embryí a nejvýše padesát embryí se ponechá jako neinfikovaná kontrola embryí. Po inokulaci a inkubaci v kontrolované teplotě se sklízí jen živá a typická embrya. Stáří embrya v době sklizně viru se odhadne z původního vložení vajec do inkubátoru a mělo by být nejvýše 12 dní. Po homogenizaci a vyčeření odstředěním se výtažek z embryonální dřeně zkouší, jak je popsáno dále, a do dalšího zpracování se uchovává při –70 °C nebo nižší teplotě. Virové sklizně, které vyhoví předepsaným zkouškám, se mohou smíchat. K virové suspenzi se v žádném stupni v průběhu výroby nepřidává žádná lidská bílkovina. Pokud se přidávají stabilizátory, pak prokazatelně nemají na člověka žádné antigenní ani senzibilizující působení.

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Jednotlivá sklizeň obsahuje viry, které se prokážou jako virus žluté zimnice v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Cizí agens (2.6.16). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkouškách na cizí antigeny.

Kontrolní vejce (2.6.16). Kontrolní vejce vyhovují ve zkouškách na cizí antigeny.

Koncentrace viru. Aby se mohlo vypočítat ředění pro konečnou várku vakcíny, zkouší se každá jednotlivá sklizeň způsobem popsaným v odstavci Stanovení účinnosti.

Konečná várka vakcíny

Jednotlivé sklizně, které vyhověly výše předepsaným zkouškám, se spojí a znovu čeří. Provede se stanovení bílkovinného dusíku. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Obsah bílkovinného dusíku. Obsah bílkovinného dusíku před přidáním stabilizátoru je nejvýše 0,25 mg v lidské dávce.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů a lyofilizuje se na obsah vlhkosti, která je prokazatelně vhodná pro stabilitu vakcíny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a vniknutí vlhkosti.

Pouze šarže, která vyhovuje z hlediska tepelné stability a všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu, se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na ovalbumin provedena s uspokojivými výsledky v konečné várce vakcíny, může se u šarže vypustit.

Tepelná stabilita. Vzorky šarže lyofilizované vakcíny se inkubují v suchém stavu 14 dní při 37 °C. V inkubované i neinkubované vakcíně se souběžně stanoví koncentrace viru, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti. Rozdíl v koncentraci viru mezi inkubovanou a neinkubovanou vakcínou nepřesáhne 1,0 log₁₀ a koncentrace viru v lidské dávce inkubované vakcíny je nejméně počet jednotek tvořících plaky (PFU), odpovídající 1 x 10³ myších LD₅₀.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rekonstituuje podle návodu a smíchá se specifickými protilátkami proti viru žluté zimnice, dojde k signifikantnímu snížení její schopnosti infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Ovalbumin. Nejvýše 5 μg ovalbuminu v lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. bakteriálního endotoxinu v lidské dávce.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus se titruje v buněčných kulturách. K validaci každého stanovení se použije vhodný virový referenční přípravek.

Koncentrace viru je nejméně ekvivalent v PFU 1 x 10³ myších LD₅₀ v lidské dávce. Vztah mezi myší LD₅₀ a PFU si stanoví každá laboratoř a schválí jej oprávněná autorita.

Ke stanovení myší LD₅₀ se může použít dále uvedená metoda nebo jiný vhodný postup.

Navržená metoda ke stanovení myší LD₅₀.

Myší LD₅₀. Je to statisticky vypočítané množství virové suspenze, u něhož se očekává vyvolání fatální specifické encefalitidy u 50 % myší vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starých, po intracerebrální inokulaci.

Připraví se vhodné sériové ředění rekonstituované vakcíny v rozpouštědle pro virus žluté zimnice, jako je např. roztok bovinního albuminu R (7,5 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4 nebo jiné rozpouštědlo, které prokazatelně odpovídá udržením infekčnosti viru.

Myším vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starým, se intracerebrálně vstříkne při anestezii 0,03 ml ředění vakcíny. Pro každé ředění se použije skupina o nejméně šesti myších; série ředění se zvolí tak, aby zasahovala od 0 % do 100 % myší mortality. Myši se naočkují ihned po přípravě ředění a pozorují se 21 dní. Všechny úhyny se zaznamenávají. Do výpočtu se zahrnují jenom přežívající myši a úhyny způsobené typickou infekcí žlutou zimnicí. Myši paralyzované dvacátý první den pozorování se počítají jako přežívající.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - kmen viru použitý v přípravku,
2. - že je vakcína připravena z kuřecích embryí,
3. - minimální koncentrace viru,
4. - varování před stykem s dezinfekčními prostředky,
5. - doba, do které se má vakcína po rekonstituci použít.

Vaccimim haemophili stirpe b conjugatum

Konjugovaná vakcína proti hemofilům typu b

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující polysacharid získaný z vhodného kmene Haemophilus influenzae typ b, kovalentně vázaný na bílkovinný nosič. Polysacharid polyribosylribitolfosfat, označovaný jako PRP, je lineární kopolymer složený z opakujících se jednotek 3-β-d-ribofuranosyl-(1→1)-ribitol-5-fosfatu [C₁₀H₁₉O₁₂P)_n] s definovanou molekulovou hmotností. Bílkovinný nosič, je-li konjugován s PRP, je schopen navodit na B-lymfocytech závislou imunitní odpověď na tento polysacharid.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Všeobecná ustanovení

Výrobní proces má prokazatelně poskytovat stále stejné vakcíny, které jsou dostatečně imunogenní a neškodné. Výroba PRP a nosiče je založena na systému jednotné inokulace.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Stabilita šarže a odpovídajících meziproduktů se hodnotí jednou nebo více vybranými zkouškami. Tyto zkoušky mohou zahrnovat stanovení velikosti molekul, stanovení volného PRP v konjugátu a stanovení imunogenity u myší. Na základě výsledků stabilitních zkoušek se vytyčí pro tyto zkoušky požadavky na propuštění, aby se zajistilo, že vakcína bude na konci doby platnosti ještě uspokojivá.

Bakteriální inokula

Barvením podle Grama a inokulací na vhodné půdy se prokáže, že matečné inokulum H.influenzae typu b neobsahuje kontaminující látky. Několik zorných polí se při velkém zvětšení vyšetří tak, aby bylo prohlédnuto nejméně 10 000 mikroorganismů.

Polysacharid H. influenzae typu b (PRP)

H.influenzae typu b se pěstuje v tekuté půdě, která neobsahuje vysokomolekulámí polysacharidy; jestliže některá složka půdy obsahuje krevní substance, postup se validuje, aby se dokázalo, že po purifikačních krocích nejsou tyto substance dále detekovatelné. Bakteriální čistota kultury se prokazuje vhodnými metodami. Kultura může být inaktivovaná. PRP je separován z tekuté kultury a purifikován vhodnou metodou. Těkavé látky včetně vody se v purifikovaném polysacharidu stanoví vhodnou metodou, jako je termogravimetrie (2.2.34); výsledek se použije k přepočtu výsledků jiných zkoušek na vysušenou látku, jak je popsáno dále.

Pouze PRP, který vyhoví následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konjugátu.

Totožnost. PRP se dokáže imunochemickou metodou (2.7.1) nebo jinou vhodnou metodou.

Distribuce molekulové velikosti. Procento PRP vymývané před danou hodnotou K_D nebo v rozsahu hodnot K_D se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30). Přijatelná hodnota je stanovena pro jednotlivé přípravky a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje této hodnotě. Pro informaci jsou v tabulce uvedeny limity pro schvalované výrobky za použití uvedených stacionárních fází. Kde je to vhodné, stanoví se distribuce velikosti molekul po chemické modifikaci polysacharidu.

Validované stanovení stupně polymerizace nebo váženého průměru hmotnosti molekul a disperze molekulových hmotností se mohou použít místo stanovení distribuce molekulové velikosti.

Ribosa (2.5.31). Nejméně 32 %, počítáno na vysušenou látku.

Fosfor (2.5.18). 6,8 % až 9,0 %, počítáno na vysušenou látku.

Bílkoviny (2.5.16). Nejvýše 1,0%, počítáno na vysušenou látku. K detekci 1 % bílkoviny se použije dostatečné množství PRP.

Nukleová kyselina (2.5.17). Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. endotoxinu v mikrogramu PRP.

Zbytkové látky. Kde je to vhodné, provádějí se zkoušky na stanovení zbytkových látek použitých při inaktivaci a purifikaci. Přijatelná hodnota pro každou látku je stanovena pro jednotlivý přípravek a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje limitu. Jestliže validační studie prokázaly odstranění zbytkových látek, zkouška u PRP se může vypustit.

Bílkovinný nosič

Bílkovinný nosič je vybrán tak, aby po konjugaci s PRP byl schopen indukovat imunitní odpověď závislou na T-lymfocytech. Povolené nosiče a konjugační metody jsou uvedeny v tabulce 1.

Bílkovinný nosič je produkován v kultuře vhodných mikroorganismů, ověřené na bakteriální čistotu. Kultura může být inaktivovaná; bílkovinný nosič je purifikován vhodnou metodou. Pouze bílkovinný nosič, který vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k výrobě konjugátu.

Totožnost. Zkouška totožnosti se provede vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1)

Tab. 1. Charakteristiky přípravku a specifikace pro PRP a bílkovinný nosič u běžně schválených přípravků

Vysvětlivky:

Sterilita (2.6.1). Na každou půdu se inokuluje 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho, co je méně.

Difterický toxoid. Difterický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vaccinum diphtheriae adsorbatum a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifíkováného toxoidu.

Tetanický toxoid. Tetanický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vaccinum tetanicum adsorbatum a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifikovaného toxoidu vyjma antigenní čistoty; nejméně 1500 Lf na miligram bílkovinného dusíku.

Difterický protein CRM 197. Obsahuje nejméně 90% difterického CRM 197 proteinu, stanoveného vhodnou metodou. Provádějí se vhodné zkoušky bud’ pro validaci, nebo běžně, aby se prokázalo, že přípravek není toxický.

OMP (komplex bílkovin vnější membrány meningokoka skupiny B). OMP vyhovuje následujícím požadavkům pro lipopolysacharidy a pyrogenní látky.

Lipopolysacharidy. Nejvýše 8 % lipopolysacharidů, stanoveno vhodnou metodou.

Pyrogenní látky (2.6.8). Každému králíkovi se na kilogram živé hmotnosti vstříkne 0,25 μg OMP.

Várka konjugátu

PRP je chemicky modifikován k umožnění konjugace: obvykle je částečně depolymerizován před nebo během tohoto procesu. Před konjugací mohou být do bílkovinného nosiče nebo PRP zavedeny reaktivní funkční skupiny nebo vazebné můstky (spacery). Konjugát se získá kovalentní vazbou PRP a nosiče. Kde je to vhodné, nezreagované funkční skupiny se schopností potenciálně reagovat se blokují vhodnými krycími činidly.

Pouze várka konjugátu, která vyhovuje následujícím předpisům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny. Pro každou zkoušku a každou částečnou složku jsou stanoveny limity přijatelnosti a každá šarže konjugátu prokazatelně vyhoví těmto limitům. Limity jsou uvedeny v tabulce 2. Pro lyofilizovanou vakcínu mohou být některé ze zkoušek provedeny spíše v konečné šarži než ve várce konjugátu, neboť lyofilizační postup může ovlivnit zkoušenou složku.

PRP. Obsah PRP se určí ze stanovení fosforu (2.5.18) nebo ze stanovení ribosy (2.5.31) nebo některou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bílkoviny. Obsah bílkovin se stanoví vhodnou imunochemickou metodou např. (2.5.16).

Poměr PRP k bílkovinám. Poměr se stanoví výpočtem.

Distribuce velikosti molekul. Distribuce velikosti molekul se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30).

Volný PRP. Nenavázaný PRP se stanoví po odstranění z konjugátu, například vylučovací chromatografií nebo hydrofobní chromatografií, ultrafiltrací nebo jinou validovanou metodou.

Volný bílkovinný nosič. Stanoví se vhodnou metodou (která může zahrnovat odvození obsahu výpočtem z výsledků ostatních zkoušek). Množství odpovídá rozmezí stanovenému pro jednotlivý přípravek.

Nezreagované funkční skupiny. Žádné nezreagované funkční skupiny nelze ve várce konjugátu detegovat, jestliže postup validace neprokázal, že nezreagované funkční skupiny detegovatelné v tomto stadiu se odstraní při následujících výrobních krocích (např. vzhledem ke krátkému poločasu).

Zbytkové látky. Odstranění zbytků látek, jako jsou kyanid, EDAC (ethydimethylaminopropylarbodiimid) a fenol, se prokáže vhodnými zkouškami nebo validací výrobního postupu.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška, při níž se na každou půdu použije 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho, co je méně.

Tab. 2. Požadavky na várku konjugátu pro běžně schválené přípravky

Konečná várka vakcíny

K várce konjugátu se před ředěním na konečnou koncentraci vhodným rozpouštědlem může přidat adjuvans, protimikrobní konzervační látka a stabilizátor. Pouze konečná várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita pro přípravu konečné šarže.

Protimikrobní konzervační látka. Je-li to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo ťýzikálně-chemickou metodou. Obsah jev rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou půdu použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje každému z dále uvedených požadavků na Totožnost, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, může být uvolněna pro použití.

Provedení zkoušky na protimikrobní konzervační látky a u tekutých vakcín stanovení účinnosti v konečné várce vakcíny umožňují vynechat tyto zkoušky v šarži.

Hodnota pH (2.2.3). pH vakcíny, je-li třeba, rekonstituované, je v rozmezí schváleném pro přípravek.

Zkouška totožnosti

Totožnost vakcíny je prokázána vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) pro PRP nebo stanovení účinnosti slouží také jako zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Obsah PRP. Nejméně 80 % deklarovaného množství PRP se stanoví buď jako obsah ribosy (2.5.31), nebo fosforu (2.5.18), nebo vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Hliník. Je-li jako adsorbent použit hydroxid hlinitý, vakcína vyhovuje ve zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsahuje nejnižší prokazatelně účinné množství a nejvýše 115 % množství uvedeného na obalu.

Voda (2.5.12). U lyofilizovaných vakcín je obsah vody nejvýše 3 %.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8).Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně následující množství: 1 μg PRP v případě vakcíny s difterickým toxoidem nebo CRM 197 difterickým proteinem jako nosičem; 0,1 μg PRP v případě vakcíny s tetanickým toxoidem jako nosičem; 0,025 μg PRP v případě vakcíny s OMP jako nosičem.

Stanovení účinnosti

Pokud není předepsáno a schváleno jinak, provede se vhodná zkouška imunogenity na myších k průkazu schopnosti indukovat imunitní odpověď závislou na T-lymfocytech. Následující text se uvádí jako příklad zkoušky, která se může používat po validaci.

Použijí se dvě skupiny zdravých myší 6 až 8 týdnů starých z jednoho chovu, nejméně po 8 zvířatech. Myším jedné skupiny se vstříkne ve dnech 0 a 14 podkožně vhodné množství vakcíny. Druhá skupina zůstává jako kontrolní. Ve 21. den se zvířata vykrvácejí. Séra kontrolní skupiny se smíchají. Provede se zkouška na PRP-protilátky v jednotlivých sérech imunizované skupiny a ve směsném vzorku kontrolní skupiny. Použije se vhodná imunochemická metoda, např. ELISA pro IgG (2.7.1). Nejméně polovina očkovaných myší vykazuje sérokonverzi, tj. titr protilátek je nejméně 4x vyšší než ve směsném kontrolním séru.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - počet mikrogramů PRP v lidské dávce,
2. - typ a nominální množství bílkovinného nosiče v jedné lidské dávce.

Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum

Inaktivovaná vakcína proti hepatitidě A adsorbovaná

Je to tekutý přípravek z vhodného kmene viru hepatitidy A pomnoženého v buněčných kulturách, inaktivovaného validovanou metodou a adsorbovaného na minerální nosič. Vakcína je opalescentní suspenze.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce neškodnosti pro imunní séra a humánní vakcíny (2.6.9).

Pokud není doloženo a schváleno jinak, virus v konečném přípravku neprojde více pasážemi z matečného inokula než virus použitý k přípravě vakcíny, která vyhověla v klinických studiích z hlediska neškodnosti a účinnosti.

Referenční přípravek. Část šarže, která byla prokazatelně nejméně tak imunogenní jako šarže, jež v klinické studii na mladých zdravých dospělých vykazovala nejméně 95% sérokonverzi, odpovídající hladině neutralizačních protilátek považované za ochrannou po úplné primární imunizaci, se používá jako referenční přípravek. Jako ochranná hladina protilátek se uznává 0,02 m.j./ml, stanoveno metodou ELISA.

Substrát pro pomnožování viru

Virus se pomnožuje v linii lidských diploidních buněk (5.2.3) nebo v kontinuální linii buněk schválené oprávněnou autoritou.

Inokula

Kmen viru hepatitidy A, který se používá k přípravě matečného inokula, se identifikuje vývojovými záznamy, které obsahují informace o původu kmene a o následné manipulaci s ním.

Pouze inokulum, které odpovídá následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. Každé matečné a pracovní inokulum viru se identifikuje jako virus hepatitidy A pomocí specifických protilátek.

Koncentrace viru. Ke sledování pravidelnosti výroby se stanoví koncentrace viru v každém matečném a pracovním inokulu.

Cizí agens. Matečná a pracovní inokula vyhovují požadavkům na inokula pro virové vakcíny (2.6.16). Jestliže byla pro izolaci virového kmene použita kultura primárních opičích buněk, provedou se navíc opatření, aby se zajistilo, že kmen není kontaminován opičími viry, jako jsou virus opičí imunodeficience a filoviry.

Pomnožování viru a sklizeň

Veškeré činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostorách, kde nejsou zpracovávány jiné buňky. Při přípravě média pro kultivaci buněk se používá schválené sérum živočišného (nikoli lidského) původu. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčné suspenze a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens. Médium pro kultivaci buněk může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky). Několikanásobné sklizně z téže buněčné produkční kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň.

Pouze jednotlivá sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě vakcíny. Jestliže stanovení poměru virové koncentrace k obsahu antigenu provedené na vhodném počtu sklizní prokazuje pravidelnost výroby, může se tato zkouška následně vypustit při běžné kontrole.

Zkouška totožnosti. Zkouška na obsah antigenu slouží také jako zkouška totožnosti jednotlivé sklizně.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Obsah antigenu. Stanoví se obsah antigenu hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) ke sledování pravidelnosti výroby; obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Poměr koncentrace viru k obsahu antigenu. Stálost poměru koncentrace infekčního viru, stanoveného vhodnou metodou na buněčné kultuře, k obsahu antigenu je stanoven validací na vhodném počtu jednotlivých sklizní.

Purifikace a purifikovaná sklizeň

Sklizeň, která může být spojením několika jednotlivých sklizní, se purifikuje validovanými metodami. Jsou-li pro pomnožení viru použity kontinuální buněčné linie, purifikační proces prokazatelně zahrnuje také snížení hladiny DNK hostitelských buněk.

Pouze purifikovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita k přípravě inaktivované sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru v purifikované sklizni se stanoví na vhodné tkáňové kultuře ke sledování pravidelnosti výroby a jako počáteční bod pro sledování inaktivační křivky.

Poměr antigenu k celkové bílkovině. Stanoví se obsah antigenu viru hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Stanoví se obsah celkové bílkoviny validovanou metodou. Poměr obsahu antigenu viru hepatitidy A k obsahu celkové bílkoviny je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v ekvivalentu jedné lidské dávky, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Jestliže to dovolí výrobní proces, lze použít jiné vhodné bílkovinné markéry k průkazu účinné purifikace.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Je-li pro pomnožení viru použita kontinuální buněčná linie, obsah zbytkové DNK hostitelských buněk, stanovený vhodnou imunochemickou metodou, jak je popsáno v článku Producta ab ADN recombinante, je nejvýše 100 μg v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na purifikované sklizni (nebo na inaktivované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Inaktivace a inaktivovaná sklizeň

Několik puntíkovaných sklizní se před inaktivací může spojit. K zamezení interference v inaktivačním procesu se předchází tvorbě virových agregátů nebo se virové agregáty odstraňují bezprostředně před nebo během inaktivačního postupu. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda je prokazatelně schopna stejnoměrně inaktivovat virus hepatitidy A bez poškození antigenní a imunogenní aktivity; součástí validační studie je inaktivační křivka, reprezentující koncentraci zbytkového živého viru, měřenou nejméně třikrát (např. ve dni 0, 1 a 2 inaktivačního postupu). Při použití formaldehydu k inaktivaci se zbytky volného formaldehydu stanoví na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na přítomnost zbytků infekčního viru hepatitidy A inokulací určitého množství inaktivované sklizně. Toto množství odpovídá 5 % šarže, ale nejvýše 1500 dávek vakcíny. Inokuluje se do buněčných kultur téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny, a inkubace probíhá 28 dní. Po dvou pasážích se provede zkouška vhodné citlivosti na přítomnost zbytkového infekčního viru. Ve vzorcích odebraných na konci inaktivace se nenaleznou známky pomnožení viru hepatitidy A. Jako pozitivní kontrola se souběžně použije infekční virus k prokázání vnímavosti buněk a nepřítomnosti interference.

Sterilita (2.6.1). Inaktivovaná virová sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Jestliže se v konečném výrobku nemůže provést validní test na bakteriální endotoxiny, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška v inaktivované sklizni. Obsahuje nejvýše 2 m.j. endotoxinu v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Obsah antigenu. Vhodnou imunochemickou metodou se stanoví obsah antigenu viru hepatitidy A (2.7.1).

Zbytky chemikálií. Viz odstavec Purifikace a purifikovaná sklizeň.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných sklizní. Mohou se přidat schválená adjuvans, stabilizátory a protimikrobní konzervační látky.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Stanovené množství je v rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže