Platné znění

Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

zrušený předpis

Viz bod I. 5. 2.

  1. III. 3. 3 Protokol

    Viz bod I. 8.

  1. III. 4 PŘEHLED ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ

    Příklad přehledu výsledků:

    MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD

    1. 1. LABORATOŘ
    2. 2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY
    3. 3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
      1. Název:
        1. Koncentrace zásobního roztoku: mg.l-1 jako chemická látka
        2. Počáteční koncentrace v médiu, to: mg.l-1 jako chemická látka
    1. 4. INOKULUM
      1. Zdroj:
        1. Provedená úprava:
        2. Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:
        3. Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l-1
    1. 5. STANOVENÍ UHLÍKU
      MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD
      Baňka č.DOC po n dnech (mg.l-1)
      0n1n2n3nx
      Zkoušená láka a inokulum1a1
      a2
      a, průměr Ca(t)
      2b1
      b2
      b, průměr Cb(t)
      Čisté inokulum bez zkoušené látky3c1
      c2
      c, průměr Cc(t)
      4d1
      d2
      d, průměr Cd(t)
    1. 6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH ÚDAJŮ
      MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD
      Baňka č.% rozkladu po n dnech
      0n1n2n3nx
      10
      20
      Průměr*0
    2. * D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.
    3. Poznámka: obdobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.
    1. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)
      MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD
      Doba (dny)
      0t
      DOC (mg.l-1)
      ve sterilní kontrole      		Cs(o)Cs(t)
    1. 8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)
      MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD
      Zbývající množství zkoušené chemikálie na konci zkoušky (mg.l-1)% primárního rozkladu
      Sterilní kontrolaSb
      Neočkované zkušební mediumSa
  1. IV. C ZKOUŠKA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO
    1. IV. 1 PRINCIP METODY

      Odměřený objem inokulovaného minerálního média se známou koncentrací zkoušené látky (10 - 20 mg.l-1), která je jediným zdrojem uhlíku je provzdušňovan ve tmě nebo v difusním světle řízeným proudem vzduchu prostého CO2. Rozklad je sledován po dobu 28 dnů podle množství prokukovaného CO2 jímaného v roztoku hydroxidu sodného nebo barnatého, kde je titračně stanoven jako anorganický uhlík. Množství uvolněného CO2, po korekci na slepý pokus, je vyjadřováno jako % TCO2. Stupeň biologického rozkladu může být také stanoven podle DOC stanoveného na začátku a na konci pokusu.

    1. IV. 2 POPIS METODY
      1. IV. 2. 1 Aparatura
        1. a) baňky 2 - 5 l vybavené vzduchovací trubicí, která dosahuje až ke dnu nádoby, a výpustí;
        2. b) magnetická míchačka pro zkoušení špatně rozpustných látek;
        3. c) absorpční nádobky;
        4. d) zařízení pro řízení a měření množství vzduchu;
        5. e) zařízení pro praní vzduchu, pro přípravu CO2 prostého vzduchu, případně akternativně směšovací zařízení na směs CO2 prostého kyslíku a CO2 prostého dusíku z lahví. Má se používat správný poměr 20 % kyslíku a 80 % dusíku;
        6. f) zařízení na stanovení CO2 buď titračně nebo pomocí analyzátorů anorganického uhlíku;
        7. g) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinně);
        8. h) analyzátor DOC (nepovinně).
      1. IV. 2. 2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2..

        Roztok (a) v množství 10 ml se smíchá s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní do 1 l zřeďovací vodou.

      1. IV. 2. 3 Příprava a předúprava inokula

        Inokulum má pocházet z různých zdrojů: aktivovaný kal, odtok z městské čistírny, povrchová voda, půdy či směs z uvedených.

        Viz. část I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

      1. IV. 2. 4 Příprava baněk

        Jako příklad je uváděno uspořádání pro 5 l baňky s obsahem 3 l suspenze.

        V případě použití jiných objemů se hodnoty úměrně upraví tak, aby se zajistilo přesné měření vytvořeného CO2.

        Do každé 5 l baňky se vnese 2400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I. 6. 4. 1 a I. 6. 5) tak, aby koncentrace aktivovaného kalu byla 30 mg.l-1 v konečném objemu 3 l inokulované směsi. Alternativně lze zředit kal tak, aby se získala suspenze 500 - 1000 mg.l-1 v minerálním médiu a to ještě před přídavkem alikvotní části do 5 l baňky k dosažení koncentrace 30 mg.l-1. Tento postup zajišťuje větší přesnost. Mohou být použita i jiná inokula (viz I. 6. 4. 2).

        Inokulovaná směs se přes noc probublává vzduchem prostým CO2 k odstranění absorbovaného CO2.

        Přidá se známý objem zásobního roztoku zkoušené látky a referenční látky, čímž se vytvoří dvojice baněk se živnou koncentrací ze zkoušené a referenční látky v rozmezí 10 až 20 mg.l-1 DOC nebo TOC. Některé lahve se nasazují jako kontrola a to bez chemikálií. Špatně rozpustné látky se přidávají přímo do baněk na hmotnostní nebo objemové bázi nebo se postupuje podle přílohy 3.

        Jestliže je to požadováno, použije se 1 sterilní baňka bez inokula ke zjištění abiotického rozkladu (viz I. 6. 6). Sterilizace se provádí pomocí vhodné koncentrace toxické látky.

        Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média prostého CO2. Mohou se odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha 2) a/nebo specifickou analýzu. Pak se připojí absorpční nádobky.

        V případě použití hydroxidu barnatého se spojují 3 nádobky, každá s obsahem 100 ml 0,0125 mol.l-1 Ba(OH)2 v sérii pro každou 5 l baňku. Roztok musí být prostý sraženiny síranu a uhličitanu barnatého a bezprostředně před použitím musí být stanovena jeho koncentrace. V případě použití hydroxidu sodného spojují se 2 jednotky, z nichž druhá slouží jako kontrola, že všechen CO2 byl absorbován v první nádobce. Jako uzávěry absorpčních nádobek jsou vhodné sérové uzávěry. Do každé nádobky se přidá po 200 ml 0,05 mol NaOH, což je dostatečné k absorpci veškerého CO2, který se uvolní při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů, což se koriguje odečtením slepého pokusu.

      1. IV. 2. 5 Počet baněk v typickém pokusu

        Baňka č. 1 a 2: Zkoušená suspenze

        Baňka č. 3 a 4: Slepý pokus inokula

        Baňka č. 5: Kontrola postupu

        a dále s výhodou a když je to potřebné:

        Baňka č. 6: Abiotická sterilní kontrola

        Baňka č. 7: Kontrola toxicity

        Viz. také část I. 6. 7.

      1. IV. 2. 6 Provedení zkoušky

        Zkouška se zahajuje probubláváním suspenze vzduchem prostým CO2 rychlostí 30 - 100 ml.min-1. Pravidelně se odebírají a analyzují vzorky absorbátu CO2. Doporučuje se, aby v průběhu prvních 10 dnů byly analýzy prováděny každý druhý až třetí den a dále každý pátý den až do 28. dne, což umožňuje určení periody.10 denního okna.

        Na konci pokusu, 28. den, může být odebrán vzorek na stanovení DOC a/nebo na specifickou analýzu, změří se pH suspenze a pak se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl. Provzdušňuje se přes noc k odstranění v suspenzi přítomného CO2. Poslední analýza CO2 se provede 29. den.

        Ve dnech, kdy se měří CO2 se odpojuje ten absorbér, který je nejblíže baňce a roztok hydroxidu se titruje 0,05 mol HCl na fenolftalein. Zbývající absorbér se posune o jedno místo blíže k lahvi a nový absorbér se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125 mol.l-1 hydroxidu barnatého se zapojí na místě posunutého, na konec série. Potřebné titrace se provádí tehdy, je-li pozorována sraženina v prvním absorbéru a před tím než je pozorovatelná ve druhém, nebo nejméně jednou týdně. Alternativně, v případě použití NaOH jako absorbentu, se pomocí injekční stříkačky odebere z absorbéru, který je nejblíže baňce malý vzorek, který se nastříkne přímo do analyzátoru uhlíku.

        Druhý absorbér se analyzuje pouze na konci zkoušky, aby se tak mohl korigovat únik CO2.

    1. IV. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA
      1. IV. 3. 1 Zpracování výsledků
        1. Množství CO2 zachyceného v absorbéru je při titraci dáno:

          mg CO2 = (100.CB - 0,5.V.CA).44

          1. kde
            1. V = spotřeba HCl pro titraci 100 ml v absorbéru
            2. CB = koncentrace roztoku Ba(OH)2 v mol.l-1
            3. CA = koncentrace HCl v mol.l-1
        1. V případě, že CB je 0,0125 mol a CA 0,05 mol je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)2 50 ml a hmotnost CO2 je dána:

        Tedy, v tomto případě se hmotnost produkovaného CO2 získá násobením spotřeby HCl faktorem 1,1.

        Vypočítá se hmotnost CO2 vyprodukovaného samotným inokulem, inokulem se zkoušenou látkou s použitím příslušných výsledků titrace. Jejich rozdíl je hmotnost CO2, který byl vyprodukován samotnou zkoušenou látkou.

        1. Např. když samotné inokulum poskytuje titrací 48 ml a inokulum se zkoušenou látkou 45 ml,

          CO2 z inokula = 1,1. (50 - 48) = 2,2 mg

          CO2 z inokula a zkoušené látky = 1,1.(50 - 45) = 5,5 mg

          a z toho hmotnost CO2 vyprodukovaná zkoušenou látkou je 3,3 mg.

        1. Procentní biologická rozložitelnost se vypočítá z:

          % rozkladu = (mg CO2. 100)/(TCO2. mg zkoušené látky)

          1. nebo

          % rozkladu = (mg CO2. 100)/(mg TOC.3,67)

          1. kde 3,67 je přepočítací koeficient 44/12 pro uhlík na CO2.

        Takto se postupuje pro každé měření jež se provádělo po celou dobu zkoušky vždy s dosazením TCO2 spočítané pro každý den..

        Při absorpci do NaOH se vypočítá hmotnost produkovaného CO2, vyjádřeného jako anorganický uhlík, vynásobením této koncentrace objemem absorpčního roztoku.

        1. Procento rozkladu se vypočítá ze vztahu:

          % TCO2 = [( mg IC ze zk. b. - mg IC ze sl. p.) / mg TOC ve zk. 1]. 100

          1. kde
            1. IC = anorganický uhlík,
            2. sl.p. = slepý pokus,
            3. zk. b. = zkušební baňka
            4. zk. l. = zkoušená látka.

        Úbytek DOC se může spočítat podle části I. Všechny výsledky se zapisují do sestavy dat.

      1. IV. 3. 2 Platnost výsledků

        Počáteční hmotnost anorganického uhlíku ve zkušební suspenzi v minerálním médiu nesmí být na počátku pokusu větší než 5 % celkového uhlíku. Celkové množství CO2 vyvinutého v inokulovaném slepém pokusu nesmí překročit na konci pokusu 40 mg na litr média. V případě, že se získají hodnoty větší než 70 mg CO2. l-1, měly by se experimentální postup i výsledky kriticky posoudit.

        Viz také I. 5. 2.

      1. IV. 3. 3 Zpráva o výsledcích

        Viz část I. 8.

    1. IV. 4 Přehled získaných výsledků
      1. Příklad přehledu výsledků:.

        ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO

        1. 1. LABORATOŘ
        2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
        3. 3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
          1. Název:
            1. Koncentrace zásobního roztoku: mg látky na litr
            2. Počáteční koncentrace v médiu: mg látky v mediu
            3. Množství celkového uhlíku nasazeného do baňky: mg C
            4. TCO2: mg CO2
        1. 4. INOKULUM
          1. Zdroj:
          2. Způsob úpravy:
            1. Předúprava: pokud byla
            2. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg CO2
        1. 5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST
          1. Metoda: Ba(OH)2 / NaOH/ jiná
          MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO
          Čas
          (dny)          		mg CO2 vyvinutého ve zkoušcemg CO2 vyvinutého ve slepém pokusekumulatívní množství vyvinutého CO2 (průměr ve zkoušce mínus průměrTCO2
          kumulatívní CO2.100 TCO2
          12průměr34průměr1212průměr
          ()
          n1
          n2
          n3
          28
        2. Poznámka: podobné uspořádání lze použít i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.
        1. 6. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinně)

          Analyzátor uhlíku

          MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO
          Čas (den)Slepý pokus. mg.l-1Zkoušená látka, mg.l-1
          0Cb(o)Co
          20 (*)Cb(t)C(t)
          (*) nebo na konci inkubace

        1. 7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinně)

          % abiot. rozkladu = (produkce mg CO2 ve steril. podm. po 28 dnech / TCO2).100

  1. IV. D MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA
    1. V. 1 PRINCIP METODY

      Změřený objem inokulovaného minerálního média, jež obsahuje známou koncentraci zkoušené látky (100 mg.l-1 látky, jež poskytují nejméně 50-100 mg.l-1 TSK) jako jediný zdroj uhlíku je míchán v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) po dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanovuje jednak měřením množství elektrolyticky produkovaného kyslíku, který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce nebo ze změn objemu nebo tlaku nebo obou v aparatuře. Vyvinutý CO2 je absorbován v roztoku KOH nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, jenž je zkoušenou látkou spotřebován, korigované o spotřebu slepého pokusu jenž běží paralelně se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK. Případně může být z doprovodné specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace počítána primární biologická rozložitelnost a z analýzy DOC úplný rozklad.

    1. V. 2 POPIS METODY
      1. V. 2. 1 Zařízení
        1. a) vhodný respirometr,
        2. b) regulátor teploty s přesností ± 1 °C nebo lepší,
        3. c) aparatura pro membránovou filtraci,
        4. d) analyzátor DOC (nepovinně),
      1. V. 2. 2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2

        Smíchá se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody a přidá se po 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

      1. V. 2. 3 Příprava a předúprava inokula

        Inokulum má být získáno z různých zdrojů: aktivovaný kal, vyčištěná městská odpadní voda, povrchová voda a půda nebo jejich směs.

        Viz část I. 6. 4, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

      1. V. 2. 4 Příprava nádobek

        S použitím zásobních roztoků se připraví roztoky zkoušené a referenční látky v minerálním médiu, koncentračně ekvivalentní 50 - 100 mg.l-1 TSK.

        V případech, kdy lze vyloučit nitrifikaci vypočítá se TSK za předpokladu tvorby amoniových solí, v opačném případě na bázi tvorby dusičnanů (viz příloha 2.2)

        Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.

        Špatně rozpustné látky se přidávají v pozdějším stádiu (viz dále).

        Má-li se stanovit toxicita zkoušené látky připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční a zkoušenou látku dohromady a to ve stejných koncentracích jako v individuálních roztocích.

        Je-li požadováno stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkoušené látky při obvyklé koncentraci 100 mg TSK.l-1 sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I. 6. 6)

        Připravené roztoky zkoušené a referenční látky se vnesou, nejméně v duplikátech, do nádobek. Do dalších nádobek se vnese pro kontrolu inokula pouze minerální médium a v případě, že je to požadováno, směs zkoušené látky a referenční látky a sterilní roztok.

        V případě, že je zkoušená látka špatně rozpustná, přidává se v této fázi přímo navážením nebo odměřením objemu nebo se postupuje podle přílohy 3. Do absorbéru CO2 se přidá KOH, pelety NaOH nebo jiný absorbent.

      1. V. 2. 5 Počet nádobek v typické zkoušce

        Nádobka č. 1 a 2: zkoušená suspenze

        Nádobka č. 3 a 4: slepý pokus

        Nádobka č. 5: kontrola postupu

        když je to potřebné:

        Nádobka č. 6: sterilní kontrola

        Nádobka č. 7: kontrola toxicity

        Viz část I. 6. 7.

      1. V. 2. 6 Provedení zkoušky

        Po vytemperování nádobek na zvolenou teplotu se do vybraných nádobek přidá inokulum tak, aby se ustavila koncentrace suspendovaných látek ne větší než 30 mg.l-1. Nádobka se zkompletuje, přezkouší na těsnost, pustí se míchání a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není potřebné věnovat pokusu žádnou jinou pozornost vyjma denních odečtů a kontroly teploty a míchání.

        Vypočítá se spotřeba kyslíku z pravidelných a občasných odečtů postupem, jenž doporučuje výrobce přístroje. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v nádobkách a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK počítaná na vznik amoniaku (platí pro látky s obsahem dusíku).

        Je-li to požadováno, odebírá se vzorek z nádobek ke stanovení DOC nebo specifickou analýzu - viz příloha 2. Při prvním odběru z nádobky je nutné znát zbývající objem v nádobce. V případě zkoušky s dusíkatými látkami stanovuje se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů v průběhu 28 dnů a z nich se počítá korekce spotřeby kyslíku podle příohy 5.

    1. V. 3. VÝSLEDKY A ZPRÁVA
      1. V. 3. 1. Zpracování výsledků
        1. Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou po zvoleném času a po korekci na slepý pokus se dělí hmotností zkoušené látky v nádobce. To poskytuje BSK vyjádřenou jako mg.mg-1:

          1. kde
            1. SKZL = spotřeba kyslíku zkoušenou látkou (mg),
            2. SK0 = spotřeba kyslíku ve slepém pokusu (mg),
            3. m = hmotnost zkoušené látky v nádobce.
        1. Procentní biologický rozklad se vypočte z rovnice

          1. nebo ze vztahu

        Je nutné poznamenat, že obě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; upřednostňuje se použití první metody.

        Pro látky, jež obsahují dusík se používá vhodné TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho co je známo nebo odhadováno o výskytu nitrifikace (příloha 2). Jestliže se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha 5).

        V případě, že se stanovuje organický uhlík a /nebo se provedla specifická analýza, počítá se stupeň rozkladu podle odstavce I. 7.

        Všechny výsledky se zapisují do tabulkových sestav.

      1. V. 3. 2 Platnost zkoušky

        Normální spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg.l-1 a nemá být větší než 60 mg.l-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l-1 vyžadují kritické hodnocení výsledků a experimentální techniky.

        V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 % je nutno zkoušku opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

        Viz odst. I.

      1. V. 3. 3 Protokol o zkoušce

        Dále je uveden příklad protokolu.

        MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

        1. 1. LABORATOŘ
        2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
        3. 3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
          1. Název:
          2. Koncentrace zásobního roztoku:
          3. Počáteční koncentrace v médiu:
          4. Objem v nádobce:
          5. TSK nebo CHSK v mg.mg-1 zkoušené látky (NH4, NO3):
        1. 4. INOKULUM
          1. Zdroj:
          2. Provedená úprava:
          3. Předúprava, pokud byla provedena:
          4. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi:
        1. 5. TABULKA SPOTŘEB KYSLÍKU
          MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA
          Čas (dny)
          07142128
          spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou1
          2
          a, průměr
          spotřeba kyslíku (mg) ve slepém pokuse3
          4
          b, průměr
          opravená BSK (mg)(a1 - bm)
          BSK na zkoušené látky(a2 - bm)
          % rozkladu (BSK/TKS).100D1 (a1)
          D2 (a2)
          průměr*
        2. * pokud je mezi D1 a D2 výrazný rozdíl nemůže být počítán jejich průměr
        3. Poznámka: Obdobný formulář může být použit pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.
        1. 6. OPRAVA NA NITRIFIKACI (Viz příloha 5)
          MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA
          Den028Rozdíl
          (i) Koncentrace dusičnanů (mg N.l-1)(N)
          (ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57.N.V) (mg)--
          (iii) Koncentrace dusitanů (mg N.l-1)(N)
          (iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43.N.V) (mg)--
          (ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent--
        1. 7. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinná)

          Analyzátor uhlíku:

          MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA
          Čas (dny)Slepý pokus (mg.l-1)Zkoušená látka (mg.l-1)
          0(CSPO)(C0)
          28*(CSPt)(Ct)
          * nebo na konci inkubace

        1. 8. ROZKLAD VÝCHOZÍ LÁTKY (nepovinně)
          1. Sb = koncentrace ve fyzikálně - chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech
          2. Sa = koncentrace v inokulované nádobě po 28 dnech

          1. kde
            1. % BR = biologický rozklad výchozí látky vyjádřený v %.
        1. 9. ABIOTICKÝ ROZKLAD

          a = spotřeba kyslíku ve sterilní kontrole po 28 dnech, (mg)

          (viz část 1 a 3)

  1. IV. E ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH
    1. VI. 1. PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

      Roztok zkoušené látky, obvykle 2 - 5 mg.l-1 v minerálním médiu, se inokuluje malým množstvím směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvích, bez přístupu světla, při konstantní teplotě.

      Rozklad se sleduje analýzou rozpuštěného kyslíku v průběhu 28 dnů. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na slepý pokus, který se provádí paralelně, se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK.

    1. VI. 2 POPIS METODY
      1. VI. 2. 1 Přístroje
        1. a) BSK lahvičky se sponkami, 250 - 300 ml.
        2. b) Vodní lázeň nebo inkubátor, ve kterých se lahvičky udržují při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) za nepřístupu světla.
        3. c) Velké skleněné lahve 2 - 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček.
        4. d) Kyslíková elektroda a oximetr nebo vybavení a chemikálie pro Winklerovu metodu.
      1. VI. 2. 2 Příprava minerálního média

        Zásobní roztoky se připravují podle I. 6. 2.

        Smíchá se 1 ml roztoků (a) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

      1. VI. 2. 3 Příprava inokula

        Inokulum se běžně získává z odtoku z biologické čistírny nebo z laboratorní jednotky, které čistí převážně komunální odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Běžně se užívá jedna kapka až 5 ml filtrátu na 1 l média. Vhodné množství inokula se musí vyzkoušet (viz. I. 6. 4. 2 a I. 6. 5)

      1. VI. 2. 4 Příprava lahví

        Minerální médium se silně provzdušňuje po dobu 20 minut. V jedné zkoušce je nutné použít jedno minerální médium. Obecně je médium připraveno pro práci po 20 h stání při pracovní teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu. Jeho obsah by měl být okolo 9 mg.l-1 při 20 °C. Všechny operace s médiem nasyceným vzduchem se provádí tak, aby nevznikly bublinky, např. se použije sifon.

        Připravují se paralelní skupiny BSK lahviček pro simultánní měření zkoušené látky a referenční látky. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů byly k dispozici vždy alespoň 2 lahvičky. K tomu, aby bylo možné určit 10 denní okno je potřeba více lahviček.

        Do velkých lahví se do 1/3 naplní provzdušněné médium, pak se přidá zásobní roztok zkoušené látky a referenční látky do zvláštní lahve tak, aby konečná koncentrace látek byla max. 10 mg.l-1. Slepý pokus se nasazuje bez zkoušené a referenční látky.

        Ke zjištění, zda aktivita inokula není limitující, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách klesnout pod 0,5 mg.l-1. Toto omezuje koncentraci zkoušené látky na 2 mg.l-1. Ovšem pro látky těžce rozpustné ve vodě a s nízkou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg.l-1. V některých případech lze doporučit provádět paralelně měření při 2 koncentracích studované látky např 2 a 5 mg.l-1. Běžně se TSK počítá pro tvorbu amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace, počítá se TSK pro tvorbu dusičnanů (viz příloha 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, počítá se korekce z analytických koncentrací dusičnanů.

        V případě, že zkoušená látka je toxická (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), musí se nasadit nové série lahviček.

        Nasazuje se za stejných podmínek jako v předchozím případě.

        Roztok ve velkých lahvích se inokuluje odtokem z biologické čistírny (1 kapka až 5 ml) nebo jiným inokulem jako např. říční vodou (viz I. 6. 4. 2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným médiem a s pomocí hadičky, která sahá na dno, se připraví homogenní roztok.

      1. VI. 2. 5 Počet lahviček běžného pokusu
        1. V běžném pokusu se používají následující lahvičky:
          1. nejméně 10 se zkoušenou látkou a inokulem,
          2. nejméně 10 jen s inokulem,
          3. nejméně 10 s obsahem referenční látky a inokulem
          4. a dále, je-li to zapotřebí 6 lahviček obsahujících zkoušenou látku, referenční látku a inokulum (kontrola toxicity). Pro zjištění 10 denního okna je zapotřebí dvojnásobný počet lahviček.
      1. VI. 2. 6 Provedení zkoušky

        Připravený roztok se ihned po přípravě plní do příslušné skupiny lahviček a to ze spodní čtvrtiny lahve (nikoliv ze dna), tak, aby se všechny lahvičky úplně naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. Lahvičky určené pro počátek pokusu se ihned analyzují na obsah kyslíku Winklerovou metodou nebo pomocí oximetru. Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného. Takto fixované lahvičky, které obsahují hnědě zbarvené hydratované oxidy Mn3+ se skladují na temném místě při teplotě 10 - 20 °C nejdéle po dobu 24 h. Zbývající lahvičky se uzavřou (bez bublinek) a inkubují se při 20 °C ve tmě. Každá série musí být doprovázena slepým pokusem, který kontroluje inokulum.

        V duplicitních lahvičkách se nejméně 1x týdně stanovuje kyslík a to po celou dobu 28 dnů.

        Týdenní vzorky umožňují stanovení 14 denního okna, kdežto vzorky každé 3 - 4 dny dovolují stanovit 10 denní okno, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.

        Pro látky, které obsahují dusík se musí provést korekce na nitrifikaci. To se provádí tak, že se změří kyslík pomocí oximetru a pak se stanoví dusičnany a dusitany. Spotřeba kyslíku na tuto oxidaci se počítá podle přílohy 5.

    1. VI. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA
      1. VI. 3. 1 Zpracování výsledků

        Nejprve se vypočte BSK po každé časové periodě tak, že se odečte spotřeba kyslíku v mg.l-1 slepého pokusu od spotřeby se zkoušenou látkou. Takto získaný výsledek se dělí koncentrací zkoušené látky a tím se získá specifická BSK v mg kyslíku na mg látky. Pak se vypočítá procentní biologická rozložitelnost jako podíl specifické BSK a specifické TSK (počítané podle přílohy 2. 2) nebo CHSK (stanovené analyticky podle přílohy 2. 3).

        1. nebo

        1. kde
          1. zk. l. = zkoušená látka,
          2. sl. p. = slepý pokus.

        Je potřeba podotknout, že tyto dvě metody neposkytují nezbytně stejné výsledky. Upřednostnit by se měla metoda s použitím TSK.

        Pro zkoušenou látku obsahující dusík se používá vhodná TSK (NH4 nebo NO3) podle toho, co se ví nebo očekává o výskytu nitrifikace (viz příloha 5). V případě, že se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle analytických koncentrací dusitanů a dusičnanů.

      1. VI. 3. 2 Platnost výsledků

        Spotřeba kyslíku ve slepých pokusech nesmí být vyšší než 1,5 mg.l-1 po 28 dnech. Vyšší hodnoty vyžadují prozkoumání použité experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku v lahvičkách nesmí být nižší než 0,5 mg.l-1 v jakémkoliv časovém úseku zkoušky. Tyto kyslíkové hladiny jsou platné jen v případě, že metoda, jíž se stanovuje kyslík, je schopná tyto koncentrace přesně měřit.

        Viz také část I.5.2.

      1. VI. 3. 3 Závěrečná zpráva