Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

PŘÍLOHA 1

Zkratky a definice

1. Primární (základní) biologický rozklad:

   jsou změny chemické struktury látky podrobené biologickému působení, vedoucí ke ztrátě specifických vlastností látky.

1. Úplný (konečný) biologický rozklad (aerobní):

   je stupeň rozkladu látky dosažený v podmínkách jejího úplného zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové buněčné hmoty (biomasy).

1. Snadná biologická rozložitelnost:

   je arbitrážní klasifikací látek, které byly podrobeny vyhledávacím zkouškám úplné biologické rozložitelnosti; výsledky těchto zkoušek jsou natolik přesvědčivé, že lze přijmout předpoklad, že se látky budou ve vodném prostředí a za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.

1. Inherentní biologická rozložitelnost:

   klasifikace chemických látek, pro které jsou nepochybné důkazy o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) při použití kterékoliv metody zkoušení.

1. Odstranitelnost:

   je přístupnost látek možnosti být odstraněny při biologickém čištění odpadních vod bez nepříznivého ovlivňování normálního průběhu čisticích pochodů. Všeobecně, látky snadno biologicky rozložitelné jsou odstranitelné, neplatí to ale pro všechny inherentně rozložitelné látky. Spolupůsobit mohou také abiotické procesy.

1. Lag(ová) fáze:

   je, ve zkoušce úbytku (die-away, odstranění, vymizení), doba od inokulace do dosažení alespoň 10 % biologického rozkladu. Lag fáze je obvykle velmi variabilní a špatně reprodukovatelná.

1. Doba rozkladu:

   je doba od konce lag fáze do dosažení 90 % maximálně dosažitelného rozkladu.

1. 10 denní okno

   je 10 dnů, které bezprostředně následují po dosažení 10 % rozkladu.

PŘÍLOHA 2

Výpočet a stanovení vhodných skupinových parametrů

V závislosti na zvolené zkušební metodě je požadována znalost některých úhrnných parametrů. V další části přílohy jsou popsány některé postupy jak takovéto parametry odvodit. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.

1. 1. Obsah uhlíku

   Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví elementární analýzou zkoušené látky.

1. 2. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)

   Teoretická spotřeba kyslíku (TSK) může být spočítána ze znalosti elementárního složení nebo z výsledků elementární analýzy. Pro látku obecného složení

   C_cH_hCl_clN_nNa_naO_oP_pS_s

   1. o molekulové hmotnosti MH, bez nitrifikace,
   1. nebo s nitrifikací

1. 3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)

   Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví postupem VI.

1. 4. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)

   Rozpuštěný organický uhlík je definován jako organický uhlík jakékoliv chemické látky nebo směsi ve vodě, který projde filtrem s velikostí pórů 0,45 µm.

   Vzorky ze zkušebních nádob se filtrují bezprostředně po odběru ve filtrační aparatuře přes vhodný filtr. Prvních 20 ml (toto množství může být zmenšeno při použití malých filtrů) se vylije. Objemy 10 - 20 ml nebo menší, v případě nástřiku (objem závisí na potřebném objemu pro analýzu), se uschovávají pro analýzu. Koncentrace DOC se stanovuje pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, jež je ekvivalentní nebo menší než 10 procent počáteční koncentrace použité ve zkoušce.

   Filtrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den mohou být konzervovány uložením v chladu při teplotě 2 - 4 °C po dobu 48 h nebo při teplotách nižších než - 18 °C po dobu delší.

   1. Poznámky:
      1. Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tudíž může obsahovat několik mg rozpustného uhlíku, jenž může interferovat při stanovení biologické rozložitelnosti. Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením v deionizované vodě 3 krát jednu hodinu. Filtry se pak skladují ve vodě po dobu 1 týdne. Každé balení filtrů musí být zkoušeno, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík.
      2. V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkoušené látky na filtru. Proto je potřebné tuto možnost ověřit.
      3. Místo filtrace může být použito pro rozlišení mezi TOC a DOC odstřeďování při 40 000 m.s^-1 (4000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není vhodná při počáteční koncentraci DOC < 10 mg.l^-1, protože nelze odstranit všechny bakterie nebo se může zpětně rozpouštět uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.

LITERATURA

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12 th ed., Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand,1965

Wagner, R. Vom Wasser, 1976, Vol. 46, 139

DIN Entwurf 38 409, Teil 41 - Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Grupe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs

(CSB) (H41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13(1), 169.

PŘÍLOHA 3

Vyhodnocení biologické rozložitelnosti těžce rozpustných látek

Při stanovení biologické rozložitelnosti látek těžce rozpustných ve vodě si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.

Protože homogenní kapaliny způsobují zřídka problémy při odebírání vzorků doporučuje se tuhé látky nejprve vhodným způsobem homogenizovat a tím zabránit chybám způsobeným nehomogenitou. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům vzorků obsahujících jen několik mg ze směsí látek, které obsahují velká množství nečistot.

V průběhu zkoušek se mají používat různé způsoby míchání. Pozornost musí být věnována tomu, aby míchání bylo přiměřené pro udržení látky v disperzi ale zároveň, aby nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrných střižným silám.

K vytvoření stabilní emulze se může použít emulgátor, který není toxický pro bakterie, není biologicky rozložitelný a nesmí v průběhu zkoušky pěnit.

Stejná kritéria jako na emulgátory se aplikují na rozpouštědla.

Pro tuhé zkoušené látky se nedoporučují tuhé nosiče. Takovéto nosiče však mohou být vhodné pro zkoušení olejovitých látek.

V případě, že se použijí pomocné látky jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče musí se provést odpovídají slepý pokus.

Pro studium biologické rozložitelnosti těžce rozpustných látek lze použít kteroukoliv ze tří respirometrických zkoušek (CO₂, BSK, MITI).

LITERATURA

de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.

Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.

PŘÍLOHA 4

Vyhodnocení biologické rozložitelnosti látek potenciálně toxických pro inokulum

V případech, kdy se látka po zkouškách snadné biologické rozložitelnosti jeví jako obtížně rozložitelná, doporučuje se rozlišit, zda jde o inhibiční působení nebo o odolnost látky vůči rozkladu (Reynolds et al., 1987).

Ve zkoušce toxicity a biologické rozložitelnosti se použijí stejná nebo podobná inokula.

Ke zjištění toxicity látky, která se zkouší na snadnou biologickou rozložitelnost (zkoušky podle metod IV. A - F) se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu nebo stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.

Chceme.li se vyhnout inhibici z důvodu toxicity měla by být koncentrace zkoušené látky použitá v pokusech podle metod IV menší než I/10 EC₅₀ (nebo menší než EC₂₀) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC₅₀ > 300 mg.l^-1 nemají pravděpodobně toxické účinky při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti podle metod IV. Hodnoty EC_{50 <} 20 mg.l^-1 mohou při následném zkoušení pravděpodobně způsobovat potíže. Lze doporučit práci s nízkými koncentracemi, což vyžaduje použití přesné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvích IV. E nebo použití ¹⁴C značených látek. Vyšší koncentrace zkoušené látky může případně umožnit použití adaptovaného inokula. V tomto případě se ale přichází o specifičnost zkoušky snadné biologické rozložitelnosti, jako základního klasifikačního kriteria metod zkoušení podle IV.

LITERATURA

Reynolds, L. et. al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.

PŘÍLOHA 5

Oprava na spotřebu kyslíku při nitrifikaci

Chyby při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, jsou málo významné (ne větší než 5 procent) i když dochází k nepravidelné oxidaci amoniakálního dusíku ve slepém pokusu a v řádné zkoušce. Ovšem zkoušení látek, obsahujících dusík může být provázeno vážnými chybami.

1. V případě, že je pozorována neúplná nitrifikace, musí být spotřeba kyslíku měřenou směsí opravena o spotřebu na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, vycházejíc z předpokladu platnosti následujících rovnic:

1. Celkově:

Z rovnice (1) vychází spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH₄Cl na dusitan 96 g, což je faktor 3,43 (96:28). Stejným způsobem lze z rovnice (3) vypočítat spotřebu kyslíku na oxidaci amoniakálního dusíku na dusičnan 128 g, což dává faktor 4,57 (128:28).

Protože popsané reakce jsou následné, působené určitými různými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při jejím poklesu dochází ke vzniku určité koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku na tvorbu dusičnanů se získá násobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, spotřeba kyslíku na zvýšení obsahu dusitanů se získá násobením tohoto přírůstku faktorem 3,43 nebo při poklesu obsahu dusitanů jsou ztráty kyslíku přepočitatelné faktorem -3,43.

1. To znamená:
   1. Kyslík spotřebovaný pro tvorbu dusičnanů = 4,57. přírůstek koncentrace dusičnanů
   2. Kyslík spotřebovaný pro tvorbu dusitanů = 3,43. přírůstek koncentrace dusitanů
   3. Kyslík ztracený při úbytku NO2 = - 3,43. přírůstek koncentrace dusičnanů

Takže

spotřeba kyslíku na nitrifikaci = ±3,43. změna koncentrace dusitanů + 4,57. změna koncentrace dusičnanů

a z toho

spotřeba kyslíku pro oxidaci uhlíku = celková spotřeba - spotřeba na nitrifikaci.

Alternativně v případech, kdy se stanoví pouze celkový oxidovaný dusík může se spotřeba kyslíku na nitrifikaci v prvním přiblížení získat násobením přírůstku koncentrace oxidovaného dusíku faktorem 4,57.

Opravená spotřeba kyslíku příslušná oxidaci uhlíku se pak srovnává s TSK NH₃, jak je uvedeno v příloze 2.

1. V ROZLOŽITELNOST - BIOLOGICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU
   1. 1 METODA
      1. 1. 1 ÚVOD

         Cílem této metody je měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek. Výsledky dosažitelné touto metodou platí v první řadě pro látky rozpustné ve vodě; v zásadě lze touto metodou zkoušet i těkavé a ve vodě obtížně rozpustné látky.

         Metodu lze použít jen pro organické látky, které v koncentracích používaných při zkoušce nemají žádný inhibiční účinek na inokulum. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, je pro zajištění její dostatečné dispergace případně třeba použít zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.

         Při interpretaci nižších hodnot získaných jako výsledek zkoušky a při volbě vhodných koncentrací při zkoušení může být užitečná znalost údajů o toxicitě zkoušené látky.

      1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

         Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého množství rozpuštěné látky za předepsaných podmínek.

         Výsledky se udávají jako g spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkoušené látky.

      1. 1. 3. REFERENČNÍ LÁTKY

         Doporučuje se použít vhodnou referenční látku pro přezkoušení aktivity inokula.

      1. 1. 4. PRINCIP METODY

         Určité množství zkoušené látky se rozpustí nebo disperguje ve vhodném živném médiu bohatém na kyslík, poté se naočkuje inokulem a za stálé předepsané teploty se ve tmě inkubuje. BSK se stanoví na základě rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku před začátkem a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně 5 dní, avšak ne více než 28 dní.

         Souběžně s touto zkouškou je třeba provést slepý pokus bez zkoušené látky.

      1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

         Stanovení BSK není možné považovat za bezpečné stanovení biologické rozložitelnosti dané látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za první posouzení (vyhledávací, skríningovou).

      1. 1. 6 POPIS METODY

         Připraví se roztok nebo disperze zkoušené látky o vhodné koncentraci. Poté se stanoví BSK pomocí některé vhodné národní nebo mezinárodní standardizované metody.

   1. 2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ

      BSK zkoušené látky se vypočítá podle zvolené metody a vyjádří se v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.

   1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Uvede se použitá metoda. Jako biochemická spotřeba kyslíku se uvede průměrná hodnota nejména tří platných výsledků měření. Je třeba uvést všechny informace a poznámky důležité pro interpretaci výsledků, zejména co se týká nečistot, skupenství, toxických účinků a složení zkoušené látky, které by mohly ovlivnit výsledek.

      Pokud bylo použito aditivum pro inhibici biologické nitrifikace, je třeba to uvést.

   1. 4 LITERATURA
      1. Seznam normovaných metod, např.:
         1. NF T 90-103: Determination of the Biochemical Oxygen Demand
         2. NBN 4O7: Biochemical Oxygen Demand
         3. NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV)
         4. The Determination of Biochemical Oxygen Demand, Methods for the examination of Water and Associated Materials, HMSO, London.
         5. ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

1. VI ROZLOŽITELNOST - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU
   1. 1 METODA
      1. 1. 1 ÚVOD

         Účelem metody je stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek za určených standardizovaných laboratorních podmínek.

         Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků je užitečné znát údaje o chemickém vzorci zkoušené látky (např. obsah halidů, organické sole železa nebo chlorované uhlovodíky).

      1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

         Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky. Vyjadřuje se jako množství kyslíku oxidačního činidla, které spotřebuje oxidovaná látka za určených laboratorních podmínek.

         Výsledek zkoušky se udává v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.

      1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

      1. 1. 4. PRINCIP METODY

         Určité množství látky, rozpuštěné nebo rozptýlené ve vodě, se oxiduje zahříváním s dichromanem draselným v prostředí silné kyseliny sírové pod zpětným chladičem za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru. Přebytečný dichroman se stanoví titrací standardním roztokem síranu železnato-amonného.

         U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý.

      1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

         CHSK je „indikátorem oxidovatelnosti“ a jako taková je využívána jako praktický nástroj ke stanovení obsahu organických látek

         Výsledek zkoušky mohou zkreslit chloridy. Rovněž anorganické redukující nebo oxidující látky mohou stanovení chemické spotřeby kyslíku zkreslit.

         Některé cyklické sloučeniny a mnoho sloučenin těkavých (např. nižší mastné kyseliny) se v této zkoušce neoxidují úplně.

      1. 1. 6 POPIS METODY

         Nejprve se připraví roztok nebo disperze zkoušené látky tak, aby se dosáhlo CHSK mezi 250 a 600 mg. l^-1.

      2. Poznámka:
         1. V případě špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek je možné odvážit a vnést přímo do zkušební baňky s vodou množství práškovité nebo kapalné látky odpovídající přibližně 5 mg CHSK.
         2. CHSK je často možné s výhodou, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit variantní metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnavačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto modifikací se obvykle úspěšně stanoví i látky obtížně stanovitelné konvenční metodou - např. kyselina octová. Metoda vyhovuje i v případě pyridinu. Jestliže se koncentrace dichromanu draselného zvýší na 0,0416 mol.l^-1 (0,25 N), může se zvýšit přímo navažované množství látek na 5 - 10 mg, což usnadňuje stanovení látek obtížně rozpustných ve vodě.

      V ostatních případech se CHSK stanoví vhodnou národní nebo mezinárodní metodou.

   1. 2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ

      Experimentálně zjištěná hodnota CHSK se vypočítá pomocí příslušné standardizované metody a vyjádří se v g chemické spotřeby kyslíku na g zkoušené látky.

   1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

      Mělo by se uvést, která referenční metoda byla použita.

      Chemickou spotřebu kyslíku je třeba určit nejméně ze tří výsledků měření. Zpráva má obsahovat všechny informace a poznámky důležité pro interpretaci výsledků, např. o nečistotách zkoušené látky nebo o fyzikálním stavu a složení látky, pokud tyto faktory ovlivňují výsledky.

      Je třeba uvést použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

   1. 4 LITERATURA

      (1) Kelkenberger, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

      (2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

      1. Seznam normovaných metod, např.:
         1. NBN T 91 - 201 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
         2. ISBN O 11 7512494 Chemical Oxygen Demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
         3. NF T 90 - 101 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
         4. DS 217 = water analysis Determination of the Chemical Oxygen Demand
         5. DIN 38409 - H - 41 Determination of the Chemical Oxygen Demand (COD) within the range above 15 mg/l
         6. NEN 3235 5. 3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik
         7. ISO DP 6060 Water Quality: Chemical oxygen Demand Dichromate Methods

1. VII ROZLOŽITELNOST - ABIOTICKÁ HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH
   1. 1 METODA

      Metoda je založena na doporučeních OECD (1).

      1. 1. 1 ÚVOD

         Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. U látek, které jsou jen málo biologicky rozložitelné má obvzláštní význam a může ovlivnit persistenci dané látky v životním prostředí.

         Většina hydrolýzních reakcí probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, takže poločasy jsou nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků z koncentrací použitých v laboratoři na podmínky životního prostředí.

         Mimo to byly u řady chemických sloučenin uvedeny příklady uspokojivé shody dat naměřených v čisté a v přírodní vodě (2).

         Pro používání této zkušební metody je užitečné znát již předem údaj o tenzi par dané látky.

         Metoda je vhodná jen pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty zpravidla ovlivňují výsledky.

         Chování látek při hydrolýze je nutno zkoumat při hodnotách pH obvykle se vyskytujících v životním prostředí (pH 4 - 9).

      1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
         1. Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou, která se dá znázornit výměnou skupiny X za skupinu OH:

            RX + HOH = ROH + HX (1)

         1. Rychlost, kterou ubývá koncentrace RX, je dána vztahem:

            rychlost = k.[ H₂O ].[ RX ] (2)

         1. Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce v přebytku, popisuje se tento typ reakce obvykle jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je zjištěná rychlostní konstanta dána výrazem:

            kobs = k.[ H₂O ] (3)

            1. a lze ji určit pro dané pH a teplotu T z výrazu:

               (4)

               1. kde
                  1. t = čas,
                  2. Co = koncentrace látky v čase nula,
                  3. Ct = koncentrace látky v čase t,
                  4. 2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a logaritmem při základu 10.

         Koncentrace je možné udávat v g.l^-1 nebo v mol.l^-1.

         Jednotkou konstanty k_obs je (čas)^-1.

         1. „Poločas“, t_1/2, je definován jako doba, po jejímž uplynutí je počáteční množství látky sníženo o 50 %:

            C_t = 1/2.C_o (5)

         1. Z rovnic (4) a (5) plyne, že

            t_1/2 = 0,693/k_obs (6)

      1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

         1. Jako standardní látky byly použity (1):
            1. Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
            2. 0, 0 - diethyl - 0 - (6 - methyl-2-(1methylethyl)- 4 - pyrimidinyl) - ester kyseliny thiofosforečné (Dimpylat, Diazinon).
      1. 1. 4 PRINCIP METODY

         Látka se rozpustí v malé koncentraci ve vodě; kontrolují se pH a teplota.

         Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

         Logaritmy koncentrace se vynesou proti času. Je-li získaná závislost lineární, je možné získat rychlostní konstantu 1. řádu ze směrnice přímky (viz odst.2).

         Není -li možné rychlostní konstantu zjistit při zadané teplotě přímo, je obvykle možné ji odhadnout podle Arrheniova vztahu, který udává teplotní závislost rychlostních konstant. Za tím účelem se vynesou logaritmy rychlostních konstant získaných při jiných teplotách proti reciproké hodnotě absolutní teploty (K). Z lineárního průběhu je možné extrapolovat nebo interpolovat hodnoty těch rychlostních konstant, které nebyly určeny přímo.

      1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

         V literatuře (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

         Reprodukovatelnost závisí zejména na kontrole pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve zvláštních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

      1. 1. 6 POPIS METODY
         1. 1. 6. 1 Činidla
            1. 1. 6. 1. 1 Tlumivé roztoky

               Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0; 7,0 a 9,0.

               Pro tento účel je třeba připravit tlumivé roztoky za použití chemikálií čistoty pro analýzu a destilované nebo deionizované vody. V příloze jsou uvedeny některé příklady těchto systémů.

               Použitý tlumivý roztok může ovlivnit rychlost hydrolýzy. Při tomto zjištění je třeba zvolit jiný tlumivý roztok. V literatuře (2) se doporučuje použít místo fosforečnanových boritanové a acetátové tlumivé roztoky.

               Není -li známo pH tlumivých roztoků pro příslušnou teplotu zkoušky, je nutné ho stanovit cejchovaným pH - metrem při zvolené teplotě s přesností na 0,1 jednotek pH.

            1. 1. 6. 1. 2 Zkoušené roztoky

               Zkoušená látka se rozpustí ve zvoleném tlumivém roztoku. Koncentrace by neměla překročit 0,01 mol.l^-1 nebo polovinu nasycené koncentrace, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

               Používání organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen pro látky s nižší rozpustností ve vodě. Množství látky zprostředkující rozpouštění má být menší než 1 % a nemá ovlivnit průběh hydrolýzy.

         1. 1. 6. 2 Aparatura

            Používají se skleněné baňky se zátkami (bez tuku).

            Pokud jsou látka nebo složky tlumivého roztoku těkavé, nebo pracuje-li se při vyšších teplotách, měly by se přednostně používat zkušební nádoby utěsněné nebo uzavřené septem, s co nejmenším objemem plynu nad kapalinou v nádobě.

         1. 1. 6. 3 Analytická metoda

            Použitá analytická metoda je dána druhem zkoušené látky. Musí být dostatečně přesná a citlivá, aby dokázala zjistit úbytek počáteční koncentrace o 10 %. Musí být dostatečně specifická, aby umožnila stanovení zkoušené látky v koncentraci zkušebního roztoku a může být tvořena kombinací vhodných analytických technik.

         1. 1. 6. 4 Zkušební podmínky

            Zkoušky se provádějí za použití zařízení s kontrolou teploty nebo s použitím termostatované lázně, nastavené na 0,5 °C přesně. Vhodnými opatřeními je nutné zabránit fotolytickým vlivům.

            Dále je nutné učinit veškerá vhodná opatření, aby se odstranil rozpuštěný kyslík (např. se po 5 minut před přípravou roztoku nechá procházet dusík nebo argon).

         1. 1. 6. 5 Metoda měření
            1. 1. 6. 5. 1 Předběžná zkouška

               Pro všechny látky se musí provést předběžná zkouška při 50 ± 0,5 °C a při každé ze tří hodnot pH 4,0; 7,0 a 9,0. Je třeba provést dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH rozhodnout, zda při 50 °C je poločas (t_1/2) menší než 2,4 hodiny nebo zda po 5 dnech zhydrolyzuje méně než 10 %. (Je možné odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den nebo delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu prokáže, že při 50 °C se za 2,4 hodiny zhydrolyzuje 50 % nebo více zkoušené látky nebo po 5 dnech méně než 10 % při všech třech hodnotách pH (4,0; 7,0; 9,0), nejsou další experimenty nutné. V ostatních případech a v případech jednotlivých hodnot pH, pro která tomu tak není, se provede zkouška č. 1.

            1. 1. 6. 5. 2 Zkouška č. 1

               Při hodnotách pH, pro které se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek, provede se zkouška č. 1. Pracuje se při jedné teplotě, nejlépe při 50 °C ± 0,5 °C a pokud možno ve sterilních podmínkách.

               Za účelem prověření průběhu reakce podle pseudo prvního řádu se pro každou zvolenou hodnotu pH bere pro pokrytí oblasti mezi 20 % a 70 % hydrolýzy dostatečný počet vzorků (ne méně než 4).

               Pro každé pH, při kterém se provádí zkouška č. 1, se stanoví řád reakce.

               Odhad rychlostních konstant při 25 °C:

               Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda ze zkoušky č. 1 lze usuzovat na reakci pseudoprvního řádu nebo ne.

               Pokud ze zkoušky č. 1 nelze s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky č. 2.

               Vyplývá-li ze zkoušky č. 1 s jistotou reakce pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky č. 3 (alternativně je možné za zvláštních okolností vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím údajů ze zkoušky č. 1, viz odstavec 3. 2).

            1. 1. 6. 5. 3 Zkouška č. 2
               1. Tato zkouška se provádí při každém pH, pro které se to na základě výsledků zkoušky č. 1 ukázalo potřebným:
                  1. - buď při teplotě nižší než 40 °C,
                  2. - nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

               Při každém pH a každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 2, je třeba provést v nejméně 6 přiměřených časových intervalech měření v oblasti stupně hydrolýzy 20 až 70 %

               Při každém pH se provede opakované měření při jedné teplotě. Pokud se zkouška č. 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, je vhodné opakovat měření nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

               Pro každé pH a každou teplotu, pro které se provádí zkouška č. 2, je třeba, pokud je to možné, provést grafický odhad poločasu (t_1/2).

            1. 1. 6. 5. 4 Zkouška č. 3
               1. Zkouška se provede při každém pH, pro které se to ukázalo potřebným na základě výsledků zkoušky č. 1:
                  1. - buď při teplotě nižší než 40 °C,
                  2. - nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

               Při každém pH a při každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 3 se zvolí tři měřicí body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; spočítá se konstanta k_obs a t_1/2.

   1. 2 ÚDAJE
      1. Při reakčním chování podle pseudoprvního řádu je možné konstanty reakční rychlosti k_obs vypočítat pro každé pH a každou teplotu regresní analýzou nebo je zjistit graficky vynesením logaritmů koncentrací proti času, přičemž se použije výrazu:

         k_obs = - směrnice.2,303

      Dále je možné vypočítat t_1/2 z rovnice (6).

      Je-li to možné, stanovit k₂₅ (pro 25 °C) použitím Arrheniovy rovnice.

      Pokud chování neodpovídá pseudoprvnímu řádu, viz 3. 1.

   1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3. 1 ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
         1. Zpráva o průběhu pokusu by měla pokud možno obsahovat tyto údaje:
            1. - popis látky,
            2. - výsledky získané s referenčními látkami,
            3. - princip a detaily použité analytické metody,
            4. - pro každý experiment: teplotu, pH, složení tlumivého roztoku, tabulku se všemi údaji koncentrace - čas,
            5. - u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k_obs a t_1/2 včetně metody výpočtu,
            6. - u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, grafické znázornění vztahu logaritmu koncentrace proti času,
            7. - všechny údaje a pozorování potřebné pro interpretaci výsledků.
      1. 3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ