Platné znění

Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Dodatek 2

Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum

  1. a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci
    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Živný agar (NA)
    Živný agar (Difco)23,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
    Kvasnicový extrakt (Difco)5,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)5,0 g
    D(+) Glukóza (monohydrát)10,0 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Sacharózopeptonový agar (SPA)
    Sacharóza20,0 g
    Bacto-Peptone (Difco)5,0 g
    K2 HPO40,5 g
    MgSO4 . 7H2O0,25 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l
    pH 7,2–7,4

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Kelmanovo tetrazoliové médium
    kasein hydrolyzát (Difco)1,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)10,0 g
    Dextróza5,0 g
    Bacto-Agar (Difco)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.

  1. b) Validované selektivní živné půdy

    Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Základní živná půda
    Casamino kyseliny (Difco)1,0 g
    Bacto-Pepton (Difco)10,0 g
    Glycerol5,0 ml
    Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2)15,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Krystalová violeť (Sigma)5 mg/l
    Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004)600 000 U (přibližně 100 mg)/l
    Bacitracin (Sigma B-0125)1 250 U (přibližně 25 mg)/l
    Chloramfenikol (Sigma C-3175)5 mg/l
    Penicilín-G (Sigma P-3032)825 U (přibližně 0,5 mg)/l
    2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma)50 mg/l
    1. Poznámky:
      1. 1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R. solanacearum.
      2. 2. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1-2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.
      3. 3. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.

    Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.

    Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.

    Nutno zabránit přílišnému vysušení média.

    Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.

  1. c) Validované obohacené živné půdy

    Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)

    Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.

    Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
    Sacharóza10 g
    Proteázový pepton5g
    K2 HPO40,5 g
    MgSO40,25 g
    NaNO30,25 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.

    Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.

Dodatek 3

  1. A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál
    1. a) Izolované bakteriální kultury

      Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:

      1. 1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.
      2. 2. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.
      3. 3. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.

      Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum
      Kód NCPPBSMT
      #      		Jiné kódyZemě původuBiovar
      NCPPB 41536CFBP 4582, Pr 3020, EURS11Egypt2
      NCPPB 415410CFBP 4585, 550, EURS21Turecko2
      NCPPB 385712CFBP 4587, Pr 1140, EURS26Anglie2
      NCPPB 158423CFBP 4598, EURS49Kypr2
      NCPPB 250524CFBP 4599, EURS50Švédsko2
      NCPPB 415526CFBP 4601, 502, EURS55Belgie2
      NCPPB 4156 (*)71(*)PD 2762, CFBP 3857Nizozemsko2
      NCPPB 415766LNPV 15.59Francie2
      NCPPB 415839CFBP 4608, Port 448, EURS80Portugalsko2
      NCPPB 416069IVIA-1632-2Španělsko2
      NCPPB 416176B3BNěmecko2
      NCPPB 32541CFBP 2047, KEL60-1, R842USA1
      NCPPB 396742CFBP 4610, R285, GONg7Kostarika1
      NCPPB 402843CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205Kolumbie2
      NCPPB 398544CFBP 4612, R578, CIP312Peru2T
      NCPPB 398945CFBP 4613, R568, CIP226Brazílie2T
      NCPPB 399646CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225Peru3
      NCPPB 399747CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131Austrálie3
      NCPPB 402948CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861Srí Lanka4
      NCPPB 400549CFBP 4616, R470Filipíny4
      NCPPB 401150CFBP 4617, R288, HEmps2Čína5
      (*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).
    2. Poznámka:
      1. Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.

      3. Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů
      Kód NCPPBSMT
      #      		Jiné kódyIdentifikace
      NCPPB 416251CFBP 1954Bacillus polymyxa(1)
      NCPPB 416352CFBP 1538Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1)
      NCPPB 4164-CFBP 2227Burkholderia cepacia (2)
      NCPPB 4165-CFBP 2459Ralstonia pickettii(2)
      NCPPB 416658CFBP 3567, CSL Pr1150Ralstonia pickettii(1)
      NCPPB 416760CFBP 4618, PD 2778Ralstonia sp. (1)
      NCPPB 112753CFBP 3575Burkholderia andropogonis (1)
      NCPPB 35354CFBP 3572Burkholderia caryophylli(1)
      NCPPB 94555CFBP 3569Burkholderia cepacia (1)
      NCPPB 370856CFBP 3574Burkholderia glumae (1)
      NCPPB 359057CFBP 3573Burkholderia plantarii (1)
      NCPPB 372659CFBP 3568Banana Blood Disease Bacterium (1)(2)(3)
      NCPPB 416861CFBP 4619, IPO S339Enterobacter sp. (1)
      NCPPB 416962IPO 1695Enterobacter sp. (1)
      NCPPB 417063CFBP 4621, IPO S306Ochrobactrum anthropi(1)(2)
      NCPPB 417164CFBP 4622, IPO 1693Curtobacterium sp.(1)(2)
      NCPPB 417265IPO 1696aPseudomonas sp.(1)
      NCPPB 4173-PD 2318Aureobacterium sp. (2)
      NCPPB 417481IVIA 1844.06Flavobacterium sp. (1)(2)
      (1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem.
      (2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6).
      (3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.
    1. b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál

      Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.

      Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.

      Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 103 až 104 a 104 až 106 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.

      Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 106 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.

  1. B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH

    Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 108 buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.

    Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.

    Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

    Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.

    Přenese se 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..

    Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.

    Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.

    Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.

    Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.

    Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

    Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

    Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 106 a 104 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Pufry pro testovací postupyDodatek 4

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

  1. 1. Pufry pro extrakci
    1. 1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

      Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Na2 HPO4 (bezvodý)4,26 g
      KH2PO42,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

      Užitečné mohou být následující složky:

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      ÚčelMnožství (na litr)
      Lubrolové vločkyProtisrážlivý prostředek (*)0,5 g
      DC silikonový odpěňovačOdpěňovací činidlo (*)1,0 ml
      TetrasodiumpyrofosfátAntioxidační činidlo1,0 g
      Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40)Vázání inhibitorů PCR50 g
      (*) pro použití při extrakci homogenizací
    1. 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

      Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Na2HPO4.12H2O2,7 g
      NaH2PO4. 2H2O0,4 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

  1. 2. Pufry pro IF test

    Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

    Tento pufr se používá k ředění protilátek.

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
    Na2HPO4.12H2O2,7 g
    NaH2PO4 . 2H2O0,4 g
    NaCl8,0 g
    Destilovaná voda1,00 l

    Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

    IF-pufr-Tween

    Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.

    Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

    Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

    Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
    Na2HPO4 .12H2O3,2 g
    NaH2PO4 . 2H2O0.15 g
    Glycerol50 ml
    Destilovaná voda100 ml

    Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield® (Vector Laboratories) nebo Citifluor® (Leica).

  1. 3. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA
    1. 3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Na2CO36,36 g
      NaH CO311,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

      Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).

    1. 3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      NaCl80,0 g
      KH2PO42,0 g
      Na2HPO4 . 12H2O29,0 g
      KCl2,0 g
      Destilovaná voda1,00 l
    1. 3.3. PBS-Tween
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS100 ml
      10 % Tween 205 ml
      Destilovaná voda895 ml
    1. 3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS10,0 ml
      Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)2,0 g
      10 % Tween 200,5 ml
      Sušené mléko0,5 g
      Destilovaná vodadoplnit do 100 ml
    1. 3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Diethanolamin97 ml
      Destilovaná voda800 ml

      Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.

      Doplní se do 1 l destilovanou vodou.

      Přidá se 0,2 g MgCl2.

      Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.

  1. 4. Pufry pro účely testu DASI ELISA
    1. 4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Na2CO31,59 g
      NaH CO32,93 g
      Destilovaná voda1 000 ml

      Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.

    1. 4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      NaCl80,0 g
      Na2HPO4.12H2O27 g
      NaH2PO4 . 2H2O4g
      Destilovaná voda1 000 ml
    1. 4.3. PBS-Tween
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      10 x PBS50 ml
      10 % Tween 205 ml
      Destilovaná voda950 ml
    1. 4.4 Substrátový pufr, pH 9,8
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy
      Diethanolamin100 ml
      Destilovaná voda900 ml

      Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.

Dodatek 5

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

  1. 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).
  2. 2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).
    1. kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a
    2. s = plocha pole objektivu.
    1. kde i = koeficient pole (v rozmezí 8 – 24 podle typu okuláru),
    2. K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),
    3. G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).
  1. 3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).
    1. kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a
    2. F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Validované protokoly a činidla pro PCRDodatek 6

  • Poznámka:
    1. Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103 až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).
    1. 1. Protokol PCR Seal et al. (1993)
      1. 1.1. Oligonukleotidové primery

        Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

        Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp

      1. 1.2. Reakční směs PCR
        Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW17,65 µl
        10× pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)2,5 µl1x (1,5mM MgCl2)
        Směs dNTP (20mM)0,25 µl0,2 mM
        Primer OLI-1 (20 µM)1,25 µl1µM
        Primer Y-2 (20 µM)1,25 µl1µM
        Taq polymerasa (5U/µl) (1)0,1 µl0,5 U
        Množství vzorku2,0 µl
        Celkové množství25 µl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
      1. 1.3. Reakční podmínky PCR
        1. Provede se následující cyklický proces:
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          1 cyklus:i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
          35 cyklů:ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
          iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
          iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
          1 cyklus:v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
          vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:
        1. Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
      1. 1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.

    1. 2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)
      1. 2.1. Oligonukleotidové primery

        Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'

        Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.

      1. 2.2. Reakční směs PCR
        Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW16,025 µl
        10x pufr PCR (1)2,5 µl1x (1,5 mM MgCl2)
        BSA (frakce V) (10 %)0,25 µl0,1 %
        Směs dNTP (20mM)0,125 µl0,1 mM
        Primer Ps-1 (10 µM)0,5 µl0,2 µM
        Primer Ps-2 (10 µM)0,5 µl0,2 µM
        Taq polymerasa (5U/µl) (1)0,1 µl0,5 U
        Množství vzorku5,0 µl
        Celkové množství25,0 µl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        Poznámka:
        Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.
      1. 2.3 Reakční podmínky PCR
        1. Provede se následující cyklický proces:
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          1 cyklusi) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
          iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
          1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
          vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:
        1. Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
      1. 2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.

    1. 3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)
      1. 3.1. Oligonukleotidové primery

        Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

        Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

        Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

        Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

        Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).

        Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).

      1. 3.2. Reakční směs PCR
        Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
        ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
        Sterilní UPW12,625 µl
        10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)2,5 µl1x (1,5 mM MgCl2)
        BSA (frakce V) (10 %)0,25 µl0,1 %
        Směs dNTP (20mM)0,125 µl0,1 mM
        Primer RS-1-F (10 µM)2,0 µl0,8 µM
        Primer RS-1-R (10 µM)2,0 µl0,8 µM
        Primer NS-S-F (10 µM)(2)0,15 µl0,06 µM
        Primer NS-6-R (10 µM)(2)0,15 µl0,06 µM
        Taq polymeráza (5U/µl)(1)0,2 µl1,0 U
        Množství vzorku5,0 µl
        Celkové množství25,0 µl
        (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)).
        Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.
      1. 3.3. Reakční podmínky PCR
        1. Provede se následující cyklický proces:
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          1 cyklus:i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
          iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
          1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
          vi) nechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:
        1. Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
      1. 3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu

        Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.

    1. 4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)
      1. 4.1. Oligonukleotidové primery

        Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

        Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

        Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

        1. Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:
          1. s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
          2. s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp
      1. 4.2. Reakční směs PCR
        1. a) Protokol PCR specifický pro biovar 1/2
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
          Sterilní UPW12,925 µl
          10x pufr PCR(1)2,5 µl1x (1,5 mM MgCl2)
          BSA (frakce V) (10 %)0,25 µl0,1 %
          Směs dNTP (20mM)0,125 µl0,1 mM
          Primer Rs-1-F (10 µM)2,0 µl0,8 µM
          Primer Rs-1-R (10 µM)2,0 µl0,8 µM
          Taq polymeráza (5U/µl)(1)0,2 µl1,0 U
          Množství vzorku5,0 µl
          Celkové množství25,0 µl
          (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
        1. b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          ReagencieMnožství v reakciKonečná koncentrace
          Sterilní UPW14,925 µl
          10x pufr PCR (1)2,5 µl1x (1,5 mM MgCl2)
          BSA (frakce V) (10 %)0,25 µl0,1 %
          Směs dNTP (20mM)0,125 µl0,1 mM
          Primer Rs-1-F (10 µM)1,0 µl0,4 µM
          Primer Rs-3-R (10 µM)1,0 µl0,4 µM
          Taq polymeráza (5U/µl) (1)0,2 µl1,0 U
          Množství vzorku5,0 µl
          Celkové množství25,0 µl
          (1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
      1. 4.3. Reakční podmínky PCR
        1. Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:
          Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
          1 cyklus:i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          35 cyklů:ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
          iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
          iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
          1 cyklus:v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
          vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
      2. Poznámka:
        1. Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
      1. 4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

        Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.

    1. 5. Příprava nanášecího pufru
      1. 5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)
        Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
        Bromfenolová modř5g
        Destilovaná (redestilovaná) voda50 ml
      1. 5.2. Nanášecí pufr
        Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
        Glycerol (86 %)3,5 ml
        Bromfenolová modř (5,1)300 µl
        Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát)6,2 ml
    1. 6. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR
      TRIS48,4 g
      Ledová kyselina octová11,42 ml
      EDTA (sodná sůl)3,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Před použitím se zředí na 1X.

      Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

    Validovaná činidla pro FISH testDodatek 7

    1. 1. Oligosondy

      Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'

      Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'

    1. 2. Fixační roztok

      [UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

      1. i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
      2. ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]
      3. iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
    1. 3. 3x Hybmix
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      NaCl2,7 M
      Tris-HCl60 mM (pH 7,4)
      EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)15 mM

      Zředí se až 1x, podle potřeby.

    1. 4. Hybridizační roztok
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      1x Hybmix
      Sodium dodecyl sulfát (SDS)0,01 %
      Formamid30 %
      Sonda EUB 3385 ng/µl
      Sonda OLI-1 nebo OLI25 ng/µl

      Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

      Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
      Počet sklíček146810
      Sterilní ultra čistá voda23,192,4138,6184,8231,0
      3 x Hybmix30,0120,0180,0240,0300,0
      1 % SDS0,93,65,47,29,0
      Formamid27,0108,0162,0216,0270,0
      Sonda EUB 338 (100 ng/µl)4,518,027,036,045,0
      Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/µl)4,518,027,036,045,0
      Celkové množství90,0360,0540,0720,0900,0
    2. Poznámka:
      1. Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.
    1. 5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0
      Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
      Na2HPO48,52 g
      KH2PO45,44 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Dodatek 8

    Pěstování lilku a rajčete

    Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do pasterizovaného pěstebního substrátu.

    Rostliny lilku a rajčete by se měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi Pěstování lilku a rajčete
    Délka dne: 14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
    Teplota:den:21 až 24 °C,
    noc:14 až 18 °C.
    Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi Pěstování lilku a rajčete
    Vhodná odrůda lilku vejcoplodého:„Black Beauty“
    Vhodná odrůda rajčete:„Moneymaker“

    Dodavatelé: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

    LITERATURA

    1. 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.
    2. 2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.
    3. 3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;373-380.
    4. 4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.
    5. 5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.
    6. 6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.
    7. 7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.
    8. 8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.
    9. 9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.
    10. 10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.
    11. 11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.
    12. 12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
    13. 13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.
    14. 14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
    15. 15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
    16. 16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
    17. 17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
    18. 18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.
    19. 19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
    20. 20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
    21. 21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
    22. 22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
    23. 23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
    24. 24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.
    25. 25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.
    26. 26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.
    27. 27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.
    28. 28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.
    29. 29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.
    30. 30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.