Platné znění

Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

zrušený předpis

Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISHDodatek 2

Vypěstuje se 72 hodinová kultura virulentního kmene C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 nebo PD 406) na základním médiu MTNA a suspenduje se v 10 mMfosfátového pufru pro získání hustoty přibližně 1 až 2 × 108 buněk schopných tvorby kolonií/ml. Toho se obvykle dosáhne prostřednictvím slabě zakalené suspenze odpovídající optické hustotě 0,20 – 600 nm.

Výkrojky pletiva se odeberou z pupkových konců 200 hlíz odebraných z produkce odrůdy s bílou slupkou, u které je jisté, že je prosta C. m. subsp. sepedonicus.

Pupkové výkrojky se zpracují obvyklým způsobem a resuspenduje se peleta v 10 ml.

Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.

Přenese se 100 µl suspenze C. m. subsp. sepedonicus do první mikrozkumavky. Nechá se protřepat.

V následujících pěti mikrozkumavkách se provedou desetinná ředění.

Šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako pozitivní kontrola. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako negativní kontroly. Mikrozkumavky se opatří štítkem.

Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Skladování probíhá při teplotě – 16 až – 24 °C až do doby použití.

Přítomnost a množství C. m. subsp. sepedonicus v kontrolních vzorcích by měla být nejprve potvrzena prostřednictvím imunofluorescence.

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Pro IF a FISH testy se provedou kvantitativní rozbory pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.

Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být C. m. subsp. sepedonicus zjištěn v nejméně v 106 a 104 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

Pufry pro testovací postupyDodatek 3

OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

  1. 1. Pufry pro extrakci
    1. 1.1. Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

      Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy
      Na2 HPO4 (bezvodý)4,26 g
      KH2PO42,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

      Užitečné mohou být následující složky:

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy
      ÚčelMnožství (na litr)
      Lubrolové vločkyProtisrážlivý prostředek (*)0,5 g
      DC silikonový odpěňovačOdpěňovací činidlo (*)1,0 ml
      TetrasodiumpyrofosfátAntioxidační činidlo1,0 g
      Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP ‒ 40)Vázání inhibitorů PCR50 g
      (*) pro použití při extrakci homogenizací
    1. 1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

      Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy
      Na2HPO4 .12H2O2,7 g
      NaH2PO4 . 2H2O0,4 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

  1. 2. Pufry pro IF test
    1. 2.1. Pufry pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)

      Tento pufr se používá k ředění protilátek.

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy
      Na2HPO4 .12H2O2,7 g
      NaH2PO4 . 2H2O0,4 g
      NaCl8,0 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min

    1. 2.2. IF-pufr-Tween

      Tento pufr se používá k mytí sklíček.

      Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.

    1. 2.3. Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6

      Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy
      Na2HPO4 .12H2O3,2 g
      NaH2PO4 . 2H2O0.15 g
      Glycerol50 ml
      Destilovaná voda100 ml

      Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield® (Vector Laboratories) nebo Citifluor® (Leica).

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněkDodatek 4

  1. 1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).
  2. 2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).
    1. kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více jamkami a
    2. s = plocha pole objektivu.
    1. kde i = koeficient pole (v rozmezí od 8 ‒ 24 podle typu okuláru),
    2. K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),
    3. G = zvětšení objektivu (100 ×, 40 × atd.).
  1. 3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).
    1. kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a
    2. F = zřeďovací faktor resuspendované pelety

Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicusDodatek 5

  1. 1. Obecná růstová média
    1. Živný agar (Nutrient agar = NA)
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
      Živný agar (Difco)23 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

      Živný dextrózový agar (Nutrient dextrose agar = NDA)

      Difco bakto živný agar obsahující 1 % D(+) glukózy (monohydrátu). Provede se sterilizace v autoklávu při 121 C po dobu 20 min.

    1. Kvasnično-pepton-glukózový agar (Yeast peptone glucose agar = YPGA)
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
      Kvasnicový extrakt (Difco)5,0 g
      Baktopepton (Difco)5,0 g
      D(+) glukóza (monohydrát)10,0 g
      Baktoagar (Difco)15,0 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

    1. Médium s kvasnicovým extraktem a minerálními solemi (Yeast extract mineral salts medium = YGM)
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
      Kvasnicový extrakt (Difco)2,0 g
      D(+) glukóza (monohydrát)2,5 g
      K2HPO40,25 g
      KH2PO40,25 g
      MgSO4 . 7H2O0,1 g
      MnSO4 . H2O0,015 g
      NaCl0,05 g
      FeSO4 . 7H2O0,005 g
      Baktoagar (Difco)18,0 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí a provede se sterilizace 0,5 l média v autoklávu při 115 °C po dobu 20 min.

  1. b) Validovaná selektivní růstová média
    1. Médium MTNA

      Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechny složky médií z BDH.

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
      Kvasnicový extrakt (Difco)2,0 g
      Manit2,5 g
      K2HPO40,25 g
      KH2PO40,25 g
      MgSO4 . 7H2O0,1 g
      MnSO4 . H2O0,015 g
      NaCl0,05 g
      FeSO4 . 7H2O0,005 g
      Agar (Oxoid č. 1)16,0 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí, pH se upraví na 7,2. Po autoklávování (při 121 °C po dobu 15 min.) a ochlazení na 50 C se přidají antibiotika: trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin B 0,01 g.

      V zásobě se nechají roztoky antibiotik: trimethoprim (Sigma) a nalidixic acid (Sigma) (obě 5 mg/ml) v 96 % metanolu, amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxidu. Zásobní roztoky jsou sterilizované filtrací.

    2. Poznámka:
      1. Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.
    1. Médium NCP-88
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
      Živný agar (Difco)23,0 g
      Kvasnicový extrakt (Difco)2,0 g
      D-manit5,0 g
      K2HPO42,0 g
      KH2PO40,5 g
      MgSO4 . 7H2O0,25 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Složky se rozpustí,upraví se pH na 7,2. Po autoklávování a ochlazení na 50 °C se přidají následující antibiotika: polymyxin B sulphate (Sigma) 0,003g, nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g.

      Antibiotika se rozpustí pro přípravu zásobních roztoků následovně: nalidixic acid v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50% etanolu, polymyxin B sulphate v destilované vodě. Zásobní roztoky se sterilizují filtrací.

    2. Poznámka:

      Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.

Validované protokoly a činidla pro PCRDodatek 6

  • Poznámka:
    1. Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103 až 104 buněk C. m. subsp. sepedonicus na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií.
    1. 1. Vícenásobný PCR protokol s interní PCR kontrolou (Pastrik, 2000)
      1. 1.1. Oligonukleotidní primery
        Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
        primer PSA-15'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
        primer PSA-R5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
        primer NS-7-F5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
        primer NS-8-R5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'

        Předpokládaná velikost amplikonu z DNA C. m. subsp. sepedonicus šablony = 502 bp (sada PSA-primerů).

        Předpokládaná velikost amplikonu z interní PCR kontroly 18S rRNA = 377 bp (sada NS- primerů).

      1. 1.2. Reakční směs PCR
        Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
        ČinidloMnožství na reakciKonečná koncentrace
        Sterilní voda (UPW)15,725 µl
        10× PCR pufr (1) (15 mM MgCl2)2,5 µl1×(1,5 mM MgCl2)
        BSA (frakce V) (10 %)0,25 µl0,1 %
        Směs d-nTP (20 mM)0,125 µl0,1 mM
        Primer PSA-1 (10 µM)0,5 µl0,2 µM
        Primer PSA-R (10 µM)0,5 µl0,2 µM
        Primer NS-7-F(10 µM) (2)0,1 µl0,04 µM
        Primer NS-8-R (10 µM) (2)0,1 µl0,04 µM
        Taq polymeráza (5 U/µl) (1)0,2 µl1,0 U
        Vzorkové množství5,0 µl
        Celkový objem25,0 µl
      2. (1) Metody byly validovány za použití Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq nebo Gold) a Gibco BRL.
      3. (2) Koncentrace primerů NS-7 F a NS-8-R byla optimalizována pro extrakci pupkové části bramboru za použití homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz oddíl 6.1 písm. a) a 6.2). Při použití extrakce třepáním nebo jinými metodami izolace DNA je nutná nová optimalizace koncentrací činidla.
      1. 1.3. Reakční podmínky pro PCR
        1. Postupuje se podle následujícího programu:
          Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
          1 cyklus:i)3 minuty při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
          10 cyklůii)1 minuta při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
          iii)1 minuta při teplotě 64 °C (připojení primerů)
          iv)1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
          25 cyklův)30 sekund při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)
          vi)30 sekund při teplotě 62 °C (připojení primerů)
          vii)1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)
          1 cyklusviii)5 minut při teplotě 72 °C (závěrečná prodlužování)
          ix)Udržuje se při teplotě 4 °C
        2. Poznámka:
          1. Tento program je optimalizován pro použití s tepelným cyklerem MJ Research PTC 200. Při použití jiných modelů může být nutná modifikace kroků cyklů ii), iii) iv), v), vi) a vii).
      1. 1.4. Analýzy ampliconu restriktivním enzymem

        Produkty PCR amplifikované z DNA C. m. subsp. sepedonicus produkují charakteristickou mnohotvárnost délky fragmentu s enzymem Bgl II po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Fragmenty získané z fragmentu specifického pro C. m. subsp. sepedonicus mají rozměry 282 bp a 220 bp.

    1. 2. Příprava nanášecího pufru
      1. 2.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)
        Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
        Bromfenolová modř5g
        Destilovaná voda50 ml

        Nanášecí pufr

        Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
        Glycerol (86 %)3,5 ml
        Bromfenolová modř300 µl
        Destilovaná voda6,2 ml
    1. 3. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR
      TRIS48,4 g
      Ledová kyselina octová11,42 ml
      EDTA (sodná sůl)3,72 g
      Destilovaná voda1,00 l

      Před použitím se zředí na 1x.

      Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).

    Validovaná činidla pro FISH testDodatek 7

    1. 1. Oligosondy

      Sonda specifická pro Cms CMS-CY3-01: 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'

      Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3'

    1. 2. Fixační roztok

      [UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ! POUŽÍVAT RUKAVICE A NEVDECHOVAT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]

      1. i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
      2. ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.

      [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ pH!]

      1. iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
      2. iv) Poznámka:

      Alternativní fixační roztok: 96 % etanol.

    1. 3. 3x Hybmix
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      NaCl2,7 M
      Tris-HCl60 mM (pH 7,4)
      EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)15 mM

      Zředí se až 1x, podle potřeby.

    1. 4. Hybridizační roztok
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      1x Hybmix
      Sodium dodecyl sulfát (SDS)0,01 %
      Sonda EUB 3385 ng/µl
      Sonda CMSCY3015 ng/µl

      Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.

      Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      2 sklíčka8 sklíček
      Sterilní ultra čistá voda50,1200,4
      3x hybmix30,0120,0
      1 % SDS0,93,6
      sonda EUB 338 (100 ng/µl)4,518,0
      sonda CMSCY301 (100 ng/µl)4,518,0
      Celkový objem (µl)90,0360,0
      1. Poznámka.:
        1. Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.
    1. 5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test
      Na2HPO48,52 g
      KH2PO45,44 g
      Destilovaná voda1,001

      Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

    Pěstování lilku vejcoplodéhoDodatek 8

    Semena lilku vejcoplodého (Solanum melongena) se vysejí do pasterizovaného výsevního substrátu. Semenáčky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přepichují do pasterizovaného pěstebního substrátu.

    Lilek by se měl pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

    Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Pěstování lilku vejcoplodého
    Délka dne:14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
    Teplota:den:21 až 24 °C,
    noc:15 °C.
    Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Pěstování lilku vejcoplodého
    Vhodné odrůdy lilku vejcoplodého„Black Beauty“,
    „Long Tom“,
    „Rima“,
    „Balsas“.

    Dodavatel: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

    Dodatek 9

    Gramovo barvení v Huckerově modifikaci (Doetsch, 1981) (1)

    1. Roztok krystalové violeti
    2. Rozpustí se 2 g krystalové violeti v 20 ml 95 % etanolu.
    3. Rozpustí se 0,8 g šťavelanu amonného v 80 ml destilované vody.

    Oba roztoky se smíchají.

    1. Lugolův jódový roztok
      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Pěstování lilku vejcoplodého
      Jód1 g
      Jodid draselný2 g
      Destilovaná voda300 ml

      Pevné látky se společně rozetřou pomocí tloučku v misce. Nasypou se do vody a míchají se v uzavřené nádobě do rozpuštění.

    1. Safraninový roztok kontrastního barviva

      Zásobní roztok:

      Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH Pufry pro testovací postupy Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus Validované protokoly a činidla pro PCR Validovaná činidla pro FISH test Pěstování lilku vejcoplodého
      Safranin O2,5 g
      95 % etanol100 ml

      Zamíchá se a uloží se.

      Ředění: 1:10 pro přípravu pracovního roztoku.

      1. Postup barvení
        1. 1. Připraví se roztěry, vysuší se na vzduchu a fixují se zahřátím.
        2. 2. Sklíčko se zalije roztokem krystalové violeti a nechá se působit 1 minutu.
        3. 3. Krátce se omyje pod tekoucí vodou.
        4. 4. Zalije se Lugolovým jódovým roztokem a nechá se působit po dobu jedné minuty.
        5. 5. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.
        6. 6. Odbarvuje se pomocí po kapkách přidávaného 95 % etanolu tak dlouho, pokud se vyplavuje barvivo, nebo ponořením za jemného pohybování do etanolu na dobu 30 sekund.
        7. 7. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.
        8. 8. Zalije se safraninovým roztokem a nechá se působit 10 s.
        9. 9. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.

        Grampozitivní bakterie se zbarví fialově modře, gramnegativní bakterie se zbarví růžovočerveně.

      2. (1) Mohou se také použít komerčně dostupné roztoky nebo barvicí soupravy.

    LITERATURA

    1. 1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp.
    2. 2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213‒218.
    3. 3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147‒152.
    4. 4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. V: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21‒23.
    5. 5. Hugh, R a Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24‒26.
    6. 6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335‒345.
    7. 7. Janse, J. D. a J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., č. 17, 1987, pp. 1‒10.
    8. 8. Jansing, H. a K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590‒601.
    9. 9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.
    10. 10. Klement Z.; Rudolph, K a D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
    11. 11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114‒118.
    12. 12. Lelliott, R. A., E. Billing a A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470‒489.
    13. 13. Lelliott, R. A. a P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101‒106.
    14. 14. Li, X. a S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.
    15. 15. Mills, D., Russell, B., W. a J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853‒861.
    16. 16. Pastrik, K. -H. a R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687‒693.
    17. 17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155‒165.
    18. 18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.
    19. 19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. a Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095‒1100.
    20. 20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. ‒ 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.
    21. 21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.
    22. 22. Smith, N. C; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739‒748.
    23. 23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481‒527.
    24. 24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281‒295.
    25. 25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. a A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546‒4554.