Vyhláška o veterinárních požadavcích na živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury, produkty rybolovu a živé mlže a o veterinárních podmínkách jejich dovozu ze třetích zemí

Příloha č. 1

SEZNAM NÁKAZ RYB, MĚKKÝŠŮ A KORÝŠŮ

Příloha č. 2

SCHVÁLENÁ PÁSMA A HOSPODÁŘSTVÍ PRO RYBY (KONTINENTÁLNÍ)

1. A

   Kontinentální pásma pro ryby

   (příloha č. 1, sloupec 2, seznam II)

   1. 1. Kontinentální pásmo (dále jen „pásmo“) tvoří
      1. a) části území, které zahrnuje celé povodí od pramenů vodních cest po ústí řeky, popřípadě i více než jedno povodí, v němž jsou ryby chovány, drženy nebo loveny, anebo
      2. b) části povodí od pramenů vodních cest po přírodní či umělou přehradu, která brání migraci ryb z dolního toku.

      Velikost a zeměpisná poloha pásma musí být takové, aby byla na nejmenší míru snížena možnost rekontaminace, např. migrujícími rybami. Splnění tohoto požadavku může vyžadovat zřízení nárazníkového pásma, ve kterém budou uskutečňovány programy sledování (monitoringu) a které samo nebude mít status schváleného pásma.

   1. 2. Pásmo může být schváleno, jestliže
      1. a) žádná ryba v něm neprojevovala po dobu nejméně 4 let klinické nebo jiné příznaky jedné či více nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce,
      2. b) všechna hospodářství v pásmu jsou pod státním veterinárním dozorem a během posledních 2 let v nich byly prováděny 2 veterinární kontroly ročně. Tyto kontroly se provádějí v ročních obdobích, kdy teplota vody příznivě ovlivňuje rozvoj uvedených nákaz, a zahrnují alespoň
         1. aa) prohlídku ryb, které vykazují anomálie,
         2. bb) odběr vzorků podle plánu stanoveného Komisí, přičemž vzorky se neprodleně odesílají do schválené laboratoře k vyšetření na patogeny, které přicházejí v úvahu.

         Pásma, ve kterých se podle záznamů nevyskytovaly nákazy uvedené pod písm. a), mohou získat schválení, pokud jejich zeměpisná poloha neumožňuje snadné zavlečení nákazy a pokud v nich fungoval dlouhodobý systém veterinární kontroly nákaz, trvající nejméně po dobu 10 let, během které

         1. - byla sledována všechna hospodářství,
         2. - byl uplatňován systém povinného hlášení nákaz a nebyl hlášen žádný případ nákazy,
         3. - mohly do daného pásma vstupovat jen pohlavní buňky ryb z nákazou nezasaženého pásma nebo hospodářství, které poskytují rovnocenné veterinární záruky a jsou pod státním veterinárním dozorem.

         Období 10 let lze zkrátit na 5 let, jestliže to odůvodňují výsledky vyšetření a jestliže – vedle splnění výše uvedených požadavků – byly v rámci sledování hospodářství provedeny ročně alespoň 2 veterinární kontroly, zahrnující prohlídku ryb, které vykazují anomálie, a odběr vzorků alespoň 30 ryb při každé kontrolní návštěvě,

      1. c) pokud není v pásmu žádné hospodářství, které má být schváleno, jsou v souladu s písmenem b) prováděny po dobu 4 let 2 veterinární kontroly ročně, a to ryb z níže ležící části povodí,
      2. d) laboratorní vyšetření vzorků ryb, odebraných během veterinárních kontrol, skončila s negativními výsledky z hlediska patogenů, které přicházejí v úvahu.

      Jde-li o schválení povodí (jeho části), začínajícího v sousedním státě nebo společného dvěma státům, žádají o schválení oba státy.

   1. 3. Schválení pásma trvá, jestliže
      1. a) ryby vstupující do pásma pocházejí z jiného schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství,
      2. b) každé hospodářství prochází v souladu s bodem 2 písm. b) 2 veterinárními kontrolami ročně s výjimkou hospodářství bez jedinců určených k chovu, která jsou kontrolována jednou ročně. Vzorky se odebírají v každém roce střídavě v 50 % všech hospodářství v pásmu,
      3. c) výsledky laboratorních vyšetření vzorků ryb odebraných při veterinárních kontrolách jsou negativní ve vztahu k původcům nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce,
      4. d) osoby provozující nebo odpovědné za hospodářství vedou záznamy o vstupu ryb do hospodářství, které obsahují všechny informace nezbytné pro stálé sledování zdravotního stavu ryb.
   1. 4. Pozastavení, obnovení a odnětí schválení:
      1. a) Dojde-li k jakémukoli mimořádnému úhynu ryb, popřípadě k jiné skutečnosti, která by mohla vést k podezření, že mezi rybami propukla některá z nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci I, seznamu II) k této vyhlášce, musí být co nejdříve hlášena orgánům vykonávajícím státní veterinární dozor. Státní veterinární správa okamžitě pozastaví schválení pásma nebo jeho části.
      2. b) Vzorek nejméně 10 nemocných ryb musí být v takovém případě zaslán do schválené laboratoře za účelem vyšetření na patogeny, přicházející v úvahu. Výsledky vyšetření musí být neprodleně oznámeny Státní veterinární správě.
      3. c) Jsou-li výsledky laboratorního vyšetření z hlediska příslušných patogenů negativní, ale zároveň pozitivní z jiného důvodu, obnoví Státní veterinární správa schválení.
      4. d) Nelze-li stanovit diagnózu, musí být provedena další veterinární kontrola po 15 dnech od prvního odběru vzorků. Při této kontrole musí být odebráno dostatečné množství vzorků nemocných ryb a odesláno do schválené laboratoře za účelem vyšetření na patogeny, přicházející v úvahu. Jsou-li výsledky těchto vyšetření opět negativní, anebo nevyskytují-li se již v příslušném místě další nemocné ryby, obnoví Státní veterinární správa schválení.
      5. e) Jsou-li výsledky laboratorního vyšetření pozitivní, zruší Státní veterinární správa schválení pásma (jeho části). Jeho obnovení je podmíněno tím, že
         1. aa) v případě výskytu ohniska nákazy všechny ryby v hospodářství, v němž se vyskytla nákaza, budou usmrceny a všechny nakažené, popřípadě kontaminované ryby likvidovány, a hospodářství a jeho vybavení budou dezinfikovány podle pokynů a pod dohledem úředního veterinárního lékaře,
         2. bb) po likvidaci ohniska nákazy budou opět plněny podmínky uvedené v bodě 2.
      1. f) O pozastavení, obnovení a odnětí schválení pásma (jeho části) musí být uvědoměny Komise a členské státy.

1. B

   Kontinentální hospodářství pro ryby

   (příloha č. 1, sloupec 2, seznam II)

   1. 1. Kontinentální hospodářství pro ryby (dále jen „hospodářství“), ležící mimo schválené pásmo, může být schváleno, jestliže
      1. a) je zásobováno vodou ze studny, vrtu nebo pramene. Nachází-li se takový vodní zdroj mimo hospodářství, musí být voda dodávána přímo do hospodářství a musí být vedena potrubím, anebo se souhlasem krajské veterinární správy otevřeným nebo přírodním kanálem, pokud to nemůže být pro hospodářství zdrojem nákazy a pokud to neumožňuje pronikání volně žijících ryb do hospodářství. Vodní kanál musí být pod kontrolou hospodářství, a v případech, kdy to není možné, pod kontrolou orgánů vykonávajících státní veterinární dozor;
      2. b) níže po proudu musí být umístěna přirozená či umělá překážka, která brání pronikání volně žijících ryb do hospodářství;
      3. c) je-li to nezbytné, je hospodářství chráněno proti záplavám a průsaku vody;
      4. d) splňuje přiměřeně požadavky uvedené v části A bodě 2. Je-li požadováno schválení na základě záznamů o nepřítomnosti nákaz a systému veterinární kontroly fungujícího po dobu 10 let, musí se hospodářství alespoň jednou ročně podrobit klinické prohlídce a odběru vzorků, které se vyšetřují ve schválené laboratoři na patogeny, přicházející v úvahu;
      5. e) plní další opatření, ukládaná orgány vykonávajícími státní veterinární dozor, je-li to považováno za nezbytné v zájmu ochrany před zavlečením nákaz. Taková opatření mohou zahrnovat zejména zřízení nárazníkového pásma kolem hospodářství, ve kterém se uskutečňuje program sledování, a zábrany proti vnikání nosičů patogenů do prostorů hospodářství.

      Nicméně:

      1. aa) nové hospodářství, které splňuje požadavky uvedené pod písm. a), b), c) a e) a které zahájilo svou činnost spojenou s rybami i jejich pohlavními buňkami ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu, může získat schválení i bez odběru vzorků, požadovaného pro udělení schválení;
      2. bb) hospodářství, které splňuje požadavky uvedené pod písm. a), b), c) a e) a které po určitém přerušení obnovilo svou činnost spojenou s rybami i jejich pohlavními buňkami ze schváleného pásma nebo ze schváleného hospodářství v neschváleném pásmu, může získat schválení i bez odběru vzorků, požadovaného pro udělení schválení, za předpokladu, že
         1. - nákazová situace v hospodářství za poslední 4 roky jeho provozu je známá orgánům vykonávajícím státní veterinární dozor. Pokud však toto hospodářství bylo v provozu méně než 4 roky, bere se v úvahu skutečná doba jeho provozu,
         2. - hospodářství nepodléhalo mimořádným veterinárním opatřením z hlediska nákaz uvedených v příloze č. 1 (sloupci 1, seznamu II) k této vyhlášce a nijak se v hospodářství proti těmto nákazám nepostupovalo,
         3. - před vstupem ryb a jejich pohlavních buněk do hospodářství došlo k jeho vyčištění a dezinfekci, a to po alespoň patnáctidenním období pod dohledem úředního veterinárního lékaře, v jehož průběhu bylo hospodářství prázdné.
   1. 2. Schválení hospodářství trvá, jsou-li nadále plněny požadavky uvedené v části A bodě 3. Jednou ročně však musí být prováděn odběr vzorků.
   2. 3. Pozastavení, obnovení a odnětí schválení:

      Postupuje se v souladu s podmínkami uvedenými v části A bodě 4.

Příloha č. 3

SEZNAM DRUHŮ ŽIVOČICHŮ POCHÁZEJÍCÍCH Z AKVAKULTURY, POVAŽOVANÝCH ZA NEVNÍMAVÉ K URČITÝM NÁKAZÁM A NEPŘENÁŠEJÍCÍ TYTO NÁKAZY

Příloha č. 4

Příloha č. 5

PLÁNY ODBĚRU VZORKŮ A DIAGNOSTICKÉ METODY PRO ZJIŠŤOVÁNÍ A POTVRZOVÁNÍ VIROVÉ HEMORAGICKÉ SEPTIKÉMIE (VHS) A INFEKČNÍ NEKRÓZY KRVETVORNÉ TKÁNĚ (IHN)

ČÁST I

Plány odběru vzorků a diagnostické metody dozoru nad VHS a IHN za účelem získání a udržení statusu schválené oblasti (pásma) nebo hospodářství v neschválené oblasti (pásmu).

1. I. Kontroly a odběr vzorků
   1. 1. Obecná ustanovení o klinické veterinární kontrole, odběru a výběru vzorků pro dozor nad oblastmi v neschválených oblastech za účelem dosažení a udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN.

      Klinické veterinární kontroly a odběr vzorků tkáně ryb a/nebo ovariální tekutiny, které musí být prováděny v oblastech či v hospodářstvích v neschválených oblastech za účelem dosažení či udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN v souladu s přílohou č. 2 k této vyhlášce (s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS), jsou shrnuty v tabulkách 1A, 1B a 1C. Další podrobnosti jsou stanoveny v části I odd. I. odst. 2 až 4. Tabulky 1A a 1B neplatí pro nová hospodářství a hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky či gametami ze schválené oblasti či schváleného hospodářství v neschválené oblasti, pokud splňují požadavky stanovené v části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (ve směrnici 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)).

      Klinické kontroly musí být prováděny od října do června nebo po dobu, kdy je teplota vody nižší než 14⁰ C. Pokud mají být hospodářství podrobena klinickým kontrolám dvakrát ročně, musí být intervaly mezi kontrolami minimálně čtyři měsíce. Prohlídce jsou podrobeny všechny produkční jednotky (rybníky, nádrže, síťové klece atd.) a zjišťuje se při ní výskyt mrtvých a oslabených ryb nebo ryb, které se chovají nepřirozeně. Zvláštní pozornost musí být věnována oblasti odtoku vody, kde se zpravidla shromažďují oslabené ryby, protože zde proudí voda.

      Vzorky ryb jsou vybírány takto:

      1. - Jestliže jsou přítomni pstruzi duhoví, měly by být pro odběr vzorků vybírány pouze ryby tohoto druhu. Pokud pstruzi duhoví přítomni nejsou, musí být vzorek získán z ryb všech ostatních přítomných druhů vnímavých k infekci virem VHS a/nebo IHN. Druhy musí být ve vzorku zastoupeny poměrně.
      2. - Jestliže je pro produkci ryb využíván více než jeden vodní zdroj, musí být do vzorku zahrnuty ryby reprezentující všechny vodní zdroje.
      3. - Jestliže se zde vyskytují oslabené ryby, ryby chovající se nepřirozeně nebo čerstvě uhynulé ryby (ještě se nerozkládající), jsou tyto ryby vybrány přednostně. Když se zde takové ryby nevyskytují, musí vzorek ryb zahrnovat ryby, které jsou v dobrém zdravotním stavu, vypadají normálně a jsou vybrané takovým způsobem, aby ve vzorku byly poměrně zastoupeny všechny části hospodářství a všechny věkové skupiny.
   1. 2. Zvláštní ustanovení včetně odběru vzorků pro sledování nad oblastmi nebo hospodářstvími v neschválených oblastech za účelem dosažení nebo udržení statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN.
      1. 1. Oblast nebo hospodářství v neschválené oblasti, která je pod úředním dohledem, může získat schválený status pro VHS a/nebo IHN takto:
         1. a) Model A – dvouletý program surveillance
            Poté, co se po nejméně dva roky nevyskytly žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti či jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají být schválena, kontrolována dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého kontrolního období před prvním schválením se nesmí vyskytnout žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro testy musí být odebrány podle tabulky 1A. Vzorky musí být vybrány, připraveny a zkontrolovány podle části I odd. I. až IV. a nálezy laboratorních testů na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
         2. b) Model B – dvouletý program surveillance se sníženým množstvím vzorků
            Podle úředního programu veterinární kontroly, který prokáže, že se v posledních čtyřech letech nevyskytla VHS a/nebo IHN, musí být všechna hospodářství v oblasti nebo jakékoliv hospodářství v neschválené oblasti, která mají získat status schválené oblasti/hospodářství, pod veterinární kontrolou dvakrát ročně po dva roky. Během tohoto dvouletého období, které předchází získání statusu schválené oblasti/hospodářství, se nesmí vyskytnout klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro kontrolu musí být odebrány podle tabulky 1B. Dále musí být vzorky vybrány, připraveny a vyšetřeny dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na přítomnost VHS a/nebo IHN musí vykázat negativní výsledky. Aby mohly být výsledky veterinárního programu kontroly uznány příslušnými úřady za důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN, musí splňovat kritéria a zásady stanovené v části III.
      1. 2. Zvláštní ustanovení pro schválení nových hospodářství nebo hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti.
         Nová hospodářství nebo hospodářství, která obnovují činnost s rybami, vajíčky nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti, mohou získat status schválení podle požadavků části B oddílu 1 písm. aa) nebo bb) přílohy č. 2 k této vyhlášce (směrnice 91/67/EHS, příloha C, část I. kap. A. odst. 6 písm. a) nebo písm. b)). Předpisy o odběru vzorků, stanovené výše v modelech A a B (části I. odd. I. odst. 2.1 písm. a) a písm. b) proto pro tato hospodářství neplatí.
      2. 3. Program surveillance pro udržení statusu schválené oblasti/hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN.
         K udržení statusu schválené oblasti či hospodářství pro VHS a/nebo IHN musí být kontroly a odběr vzorků pro testy prováděny podle tabulky 1C. Vzorky musí být vybírány, připraveny a testovány dle popisu v části I odd. I. až IV. a laboratorní zkoušky na VHS a/nebo IHN musí být negativní.
   1. 3. Příprava a způsob balení vzorků ryb

      Před zabalením nebo transportem do laboratoře musí být rybě sterilními resekčními nástroji odebrány orgány, které musí být uloženy do sterilních plastových zkumavek obsahujících transportní médium (médium buněčných kultur s 10% telecím sérem a antibiotiky). Doporučuje se směs 200 MJ penicilinu, 200 μg streptomycinu a 200 μg kanamycinu na ml, ale mohou být rovněž použita i jiná průkazně účinná antibiotika. Vyšetřují se tyto tkáně: slezina, přední část ledvin a dále srdce nebo mozek. V některých případech musí být vyšetřena i ovariální tekutina (tabulky 1A až C).

      Ovariální tekutina nebo části orgánů maximálně deseti ryb (tabulky 1A až C) mohou být uloženy do jedné sterilní zkumavky obsahující minimálně 4 ml transportního média a reprezentují pak jeden společný vzorek. Tkáňový podíl každého vzorku by měl vážit nejméně 0,5 g.

      Zkumavky by měly být umístěny do izolačních nádob (např. polystyrenových krabic se silnými stěnami), které obsahují dostatečné množství ledu nebo chladicí vložky, aby bylo zajištěno chlazení vzorků během transportu do laboratoře. Je nutno zabránit zmrznutí vzorků. Teplota vzorku během transportu by nikdy neměla být vyšší než 10 °C a při příjmu zásilky by měl být v transportní krabici ještě led, nebo musí být jedna nebo více chladicích vložek úplně, případně částečně zmrzlá.

      Virologické vyšetření je nezbytné zahájit co nejdříve, nejpozději však do 48 hodin po odběru vzorků. Ve výjimečných případech⁽¹⁾ je možno virologické vyšetření zahájit do 72 hodin po odběru materiálu, pokud byl materiál určený k vyšetření chráněn transportním médiem a pokud byly během transportu splněny teplotní požadavky (část I odd. I.3 odst. 3).

      Jestliže mohou být během transportu splněny teplotní požadavky, mohou být zasílány i celé ryby. Celá ryba by měla být zabalena do savého papíru, vložena do plastového sáčku a chlazena, jak je popsáno výše. Ryby mohou být zasílány také živé.

      Zásilky je nutno zabalit a označit podle platných vnitrostátních a mezinárodních dopravních předpisů.

   1. 4. Odběr doplňkového diagnostického materiálu
      Na základě dohody s příslušnou diagnostickou laboratoří mohou být odebrány i jiné tkáně ryb, které pak mohou být připraveny pro dodatečné vyšetření.

1. II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření
   1. 1. Zmrazení ve výjimečných případech

      Pokud se vyskytnou praktické problémy (např. špatné počasí, svátky, problémy v laboratoři, atd.), které znemožní inokulaci buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, mohou být vzorky tkáně v médiu buněčných kultur zmraženy při minimálně -20°C a virologický test může být proveden v průběhu následujících 14 dnů. Tkáň však smí být zmražena a před testem opět rozmražena pouze jednou. O důvodech zmražení tkáňových vzorků (např. bouře, uhynutí buněčných linií atd.) se vedou podrobné záznamy.

   1. 2. Homogenizace orgánů

      Tkáně obsažené ve zkumavkách jsou v laboratoři úplně homogenizovány (buď pomocí homogenizátoru zn. stomacher či mixéru, nebo paličkou ve třecí misce se sterilním pískem) a poté suspendovány v původním transportním médiu.

      Jestliže se jako vzorek použije celá ryba kratší než 4 cm, odřízne se část těla ryby za řitním otvorem a ta se pak nastříhá sterilními nůžkami nebo nařeže sterilním skalpelem na malé kousky. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba o délce 4 až 6 cm, měly by být odebrány vnitřnosti včetně ledvin. Jestliže se jako vzorek použije celá ryba delší než 6 cm, mají být vzorky tkáně odebrány tak, jak je popsáno v části I odd. I. odst. 3. Vzorky tkáně by měly být sterilními nůžkami nebo sterilním skalpelem nadrobno nastříhány nebo nařezány, výše uvedeným způsobem homogenizovány a suspendovány v transportním médiu.

      Konečný poměr mezi tkáňovým materiálem a transportním médiem je v laboratoři nutno upravit na 1:10.

   1. 3. Odstřeďování homogenátu

      Homogenát se odstřeďuje v chlazené odstředivce vychlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g 15 minut, supernatant se odebere a je vystaven působení antibiotik (v této fázi se hodí např. gentamycin v koncentraci 1 mg/ml) buď po dobu čtyř hodin při 15°C nebo přes noc při 4°C.

      Jestliže byly vzorky přepravovány v transportním médiu (tj. působila na ně antibiotika), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.

      Účelem ošetření antibiotiky je, zabránit bakteriální kontaminaci vzorků; není tedy už nutné provádět filtraci přes membránové filtry.

      Jestliže je odebraný supernatant uchováván při -80°C během 48 hodin po odebrání, může být znovu použit pro virologické vyšetření, a to pouze jednou.

      Pokud se vyskytnou praktické potíže (např. porucha inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožňují inokulovat buňky během 48 hodin po odběru vzorků tkání, je možné supernatant zmrazit při -80°C a provést virologocké vyšetření během 14 dnů.

      Před inokulací buněk se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou předem připravenou směsí antisér, obsahující protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15°C nebo maximálně 18 hodin při 4°C. Antisérum musí mít v plakovém neutralizačním testu při 50% neutralizaci titr nejméně 1:2 000.

      Ošetření všech inokul antisérem proti viru IPN (viru, který je v některých oblastech Evropy přítomen v 50 % rybích vzorků) má za úkol zabránit vytvoření CPE, vyvolaného virem IPN v inokulovaných buněčných kulturách. To vede ke zkrácení doby virologického vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, při kterých by výskyt CPE mohl být považován za potenciální znamení VHS nebo IHN.

      Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření inokula antisérem s protilátkami proti viru IPN vynecháno.

1. III. Virologické vyšetření
   1. 1. Buněčné kultury a média

      Buňky linií BF-2 nebo RTG-2 a buď EPC nebo FHM jsou kultivovány při 20 až 30°C ve vhodném médiu, např. Eagleho MEM (nebo jeho modifikacích), s přidáním 10% bovinního fetálního séra a antibiotik ve standardních koncentracích.

      Pokud jsou buňky kultivovány v uzavřených skleněných zkumavkách, doporučuje se pufrovat médium hydrouhličitanem. Médium používané pro kultivaci buněk v otevřených jednotkách může být pufrováno Tris-HCl (23 mM) a hydrouhličitanem sodným (6 mM). pH musí být 7,6 ± 0,2. Buněčné kultury, které se inokulují tkáňovým materiálem, by měly být v době inokulace čerstvé (4 až 48 hodin staré) a v proliferační fázi růstu (ne souvislý monolayer).

   1. 2. Inokulace buněčných kultur

      Buněčné kultury se inokulují orgánovou suspenzí ošetřenou antibiotiky ve dvou stupních ředění, tj. v primárním ředění a dále tímto roztokem zředěným 1:10, čímž je dosaženo výsledného zředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur 1:100 popř. 1:1000 (z důvodu zamezení homologické interferenci). Je nutno inokulovat minimálně dvě buněčné linie (viz část I odd. III. odst. 1). Poměr mezi objemem inokula a objemem média buněčné kultury by měl činit asi 1:10. Pro každé ředění a každou buněčnou linii je nutno použít plochu buněčných kultur o velikosti minimálně 2 cm²; což odpovídá jedné jamce jedné destičky s 24 jamkami. Použití kultivačních destiček se sice doporučuje, ale mohou být použity též jiné podobné nebo větší jednotky.

   1. 3. Inkubace buněčných kultur

      Inokulované buněčné kultury se inkubují 7 až 10 dní při 15°C. Jestliže se barva média buněčné kultury mění z červené na žlutou – což svědčí o kyselé reakci média – je nezbytné upravit pH pomocí sterilního roztoku hydrouhličitanu sodného nebo pomocí rovnocenných substancí, aby se zajistila citlivost buněk k virové infekci.

      Nejméně každých šest měsíců nebo při snížení vnímavosti buněčných kultur k infekci se provádí titrace zmražených zásobních suspenzí viru VHS nebo IHN, aby tak byla ověřena citlivost buněčných kultur k infekci. Doporučený postup je popsán v části IV.

   1. 4. Mikroskopické vyšetření

      Inokulované buněčné kultury se musí pravidelně (minimálně třikrát týdně) prohlížet při zvětšení 40× až 150×, jestli se v nich objevuje CPE. Jestliže je zjištěn zřetelný CPE, musí být virus okamžitě identifikován (podle části IV).

   1. 5. Subkultivace

      Jestliže se po první sedmi- až desetidenní inkubaci nevytvoří cytopatický efekt, provede se subkultivace do čerstvých buněčných kultur, přičemž je nezbytné použít podobnou plochu k růstu buněk jako u primární kultury.

      Stejná množství supernatantů kultivačních médií ze všech kultur nebo jamek, v nichž jsou primární kultury, se v závislosti na buněčné linii slijí do jednoho směsného vzorku za sedm až deset dní po inokulování. Směsné vzorky jsou potom inokulovány do homologních buněčných kultur stejného druhu, a to jednak nezředěné, jednak zředěné 1:10 (přičemž vznikají konečná zředění supernatantu 1:10 nebo 1:100), jak je popsáno v části I odd. III. odst. 2. Popřípadě může být 10 % původního média primární kultury inokulováno přímo do jamky, ve které je neinfikovaná buněčná kultura (přesazování z jamky do jamky). Inokulaci může předcházet předběžná inkubace zředěných inokul s antisérem proti viru IPN ve vhodném ředění, jak je popsáno v části I odd. II. odst. 3.

      Inokulované kultury jsou potom inkubovány sedm až deset dnů při 15°C a kontrolovány podle části I odd. III. odst. 4.

      Jestliže se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, může být v této fázi provedena subkultivace, ale buňky musí být potom inkubovány sedm dní a po dalších sedmi dnech znovu přesazeny. Když se cytopatický efekt vytvoří po uplynutí prvních tří dnů, buňky mohou být přesazeny pouze jednou a dále jsou inkubovány tak, aby uplynulo celkem 14 dní od primární inokulace. V posledních sedmi dnech inkubace by se neměla vyskytnout žádná známka toxicity. Jestliže se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, musí subkultivaci předcházet odstředění 2000 až 4000× g po dobu 15 až 30 minut při 2 až 5°C, a/nebo filtrace supernatantu přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm (membrána s nízkou schopností vázat bílkoviny). Dále jsou postupy subkultivace stejné jako u toxického CPE.

1. IV. Identifikace viru
   1. 1. Testy identifikace viru

      Při zřejmém výskytu cytopatického efektu v buněčné kultuře se živné médium (supernatant) odebere a vyšetří jednou nebo několika z následujících metod: neutralizace, IF, ELISA. Neumožní-li tyto testy definitivní identifikaci viru během jednoho týdne, je nutno předat supernatant národní referenční laboratoři nebo referenční laboratoři EU pro choroby ryb, aby mohl být virus okamžitě identifikován.

   1. 2. Neutralizace

      Z odebraného supernatantu se odstřeďováním (2000–4000× g) nebo membránovou filtrací (0,45 μm) odstraní buňky pomocí membrány s nízkou schopností vázat bílkoviny a supernatant se zředí v médiu buněčné kultury 1:100 a 1:10 000.

      Stejná množství dvou roztoků supernatantu se smíchají se stejnými díly reagencií a odděleně se inkubují 60 minut při 15°C; používají se následující reagencie:

      1. - sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru VHS v ředění 1:50 ²
      2. - sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti viru IHN v ředění 1:50 ⁷
      3. - spojená antiséra proti domácím sérotypům viru IPN v ředění 1:50 ⁷
      4. - pouze médium (pozitivní kontrola)

      Nejméně dvě buněčné kultury se inokulují po 50 μl každé směsi séra a supernatantu s možným výskytem viru a pak se inkubují při 15°C. Vývoj CPE se kontroluje tak, jak je popsáno v části I odd. III. odst. 4.

      Některé kmeny viru VHS v neutralizačních testech nereagují. Takové izoláty musí být identifikovány pomocí IF nebo ELISA.

      Alternativně mohou být provedeny jiné neutralizační testy s prokázanou účinností.

   1. 3. Imunofluorescence (IF)

      Pro každý izolát viru, který je potřeba určit, se buňky nasadí nejméně na osm krycích sklíček v takové hustotě, která umožňuje vznik přibližně 60% až 90% monolayeru po 24 hodinách kultivace. Pro tento účel se doporučují buňky EPC z toho důvodu, že pevně přilnou k povrchu sklíček, ale mohou být použity také jiné buněčné linie, jako např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.

      Jakmile se buňky přichytí k povrchu sklíček, (asi za hodinu po nasazení), nebo maximálně po 24hodinové inkubaci kultur, inokuluje se virus, který má být identifikován. Inokulují se čtyři kultury v objemovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v objemovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20–30 hodin při 15 ⁰C.

      Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagleho MEM bez séra, fixují se 80% ledovým acetonem a barví se metodou IFAT ve dvou stupních. První stupeň sestává z reakce poly- či monoklonálních protilátek referenční kvality. Druhý stupeň je reakce antiséra, konjugovaného s fluorochrómem, proti imunoglobulinu, použitému v prvním stupni. Pro každé z vyšetřovaných antisér je nutno obarvit minimálně jednu kulturu inokulovanou vysokou dávkou a jednu nízkou dávkou. Při vyšetření je rovněž nezbytné provést vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.

      Z obarvených kultur se zhotoví nativní preparáty za použití fyziologického roztoku glycerolu a vyšetřují se v dopadajícím UV světle. K tomu účelu je nutno použít okulár zvětšující 10× a objektiv zvětšujících 25× s numerickou aperturou >0,7 nebo okulár zvětšující 12× a objektiv zvětšující 40× s numerickou aperturou >1,3.

      Výše popsaná metoda IF je uvedena jako příklad. Alternativně (vzhledem k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) mohou být použity jiné metody IF s prokázanou účinností.

   1. 4. ELISA

      Jamky mikrotitračních destiček se přes noc potáhnou doporučenými ředěními vyčištěných imunoglobulinových frakcí protilátek referenční kvality.

      Po opláchnutí jamek pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se do jamek přidá suspenze viru, který má být určen, zředěná 2× nebo 4× a nechá se 60 minut reagovat s vrstvou protilátek při 37°C. Po dalším opláchnutí pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se přidají biotinem označené protilátky stejného druhu jako protilátky ve vrstvě, která je v jamkách, a nechají se reagovat 60 minut při 20°C. Po dalším opláchnutí, jak je popsáno výše, se přidá streptavidin konjugovaný s HRP a nechá se reagovat hodinu při 20°C. Po posledním opláchnutí se vázaný enzym zviditelní pomocí vhodného substrátu ELISA (OPD či jiné).

      Výše popsaný postup ELISA na bázi reakce biotinu s avidinem je uveden pouze jako příklad. Místo toho mohou být také použity jiné varianty testu ELISA s prokázanou účinností.

TABULKA 1A

Plán kontroly a odběru vzorků pro oblasti a hospodářství v neschválených oblastech během dvouletého kontrolního období, které předchází získání statusu schválené oblasti / hospodářství vzhledem k VHS a/nebo IHN

(v souladu s částmi A a B přílohy č. 2 k této vyhlášce /s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS/ a ustanoveními části I této přílohy)