Vyhláška o veterinárních požadavcích na živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury, produkty rybolovu a živé mlže a o veterinárních podmínkách jejich dovozu ze třetích zemí

účinné od 1. 5. 2004Diagnostické postupy k potvrzení VHS a IHN při podezření na výskyt nákazyúčinné od 1. 5. 2004ČÁST II

účinné od 1. 5. 2004Pro diagnózu IHN a VHS je nezbytné provést jeden nebo několik z následujících postupů:

1. účinné od 1. 5. 2004- A. konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru,
2. účinné od 1. 5. 2004- B. izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru,
3. účinné od 1. 5. 2004- C. další diagnostické metody (IFAT, ELISA).

účinné od 1. 5. 2004Potvrzení prvního výskytu VHS a/nebo IHN v hospodářstvích ve schválených oblastech nesmí být založeno výhradně na metodě C. Musí být použita též metoda A nebo B.

účinné od 1. 5. 2004K tkáňovému materiálu určenému pro virologické vyšetření může být v některých případech nutné připojit doplňkový materiál pro bakteriologické, parazitologické, histologické nebo jiné vyšetření, aby mohla být provedena diferenciální diagnóza.

1. účinné od 1. 5. 2004A. Konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru
   1. účinné od 1. 5. 2004I.1 Odběr vzorků

      účinné od 1. 5. 2004K vyšetření je nutno vybrat minimálně deset ryb s typickými příznaky onemocnění IHN, popř. VHS.

   1. účinné od 1. 5. 2004I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. I. odst. 3

   1. účinné od 1. 5. 2004I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. I. odst. 4.

   1. účinné od 1. 5. 2004II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. II.

   1. účinné od 1. 5. 2004III. Virologické vyšetření

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. III.

   1. účinné od 1. 5. 2004IV. Identifikace viru

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. IV.

1. účinné od 1. 5. 2004B. Izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru
   1. účinné od 1. 5. 2004I.1 Odběr vzorků

      účinné od 1. 5. 2004Viz část II kap. A. odd. I. odst. 1.

   1. účinné od 1. 5. 2004I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. I. odst. 3.

   1. účinné od 1. 5. 2004I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. I. odst. 4.

   1. účinné od 1. 5. 2004II.1 Homogenizace orgánů

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. II.odst. 2.

   1. účinné od 1. 5. 2004II.2 Odstřeďováníní homogenátu

      účinné od 1. 5. 2004Homogenát se odstřeďuje v odstředivce chlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g po dobu 15 minut. Supernatant se odebírá a ošetřuje čtyři hodiny při 15°C antibiotiky (např. gentamycinem v dávce 1 mg/ml) nebo filtruje na membráně s nízkou schopností vázat proteiny a velikostí pórů 0,45 μm.

   1. účinné od 1. 5. 2004II.3 Ošetření supernatantu diagnostickými antiséry

      účinné od 1. 5. 2004Antibiotiky ošetřená či membránou filtrovaná suspenze orgánů je zředěna médiem buněčné kultury v poměru 1:10 a 1:1000 a inkubována 60 minut při 15°C se stejnými podíly reagencií, jaké jsou vyjmenovány v části I odd. IV. odst. 2.

   1. účinné od 1. 5. 2004III.1 Buněčné kultury a média

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. III. odst. 1.

   1. účinné od 1. 5. 2004III.2 Inokulace buněčných kultur

      účinné od 1. 5. 2004Z každé směsi viru se sérem (připravené podle části II kap. B. odd. II. odst. 3) jsou inokulovány minimálně dvě buněčné kultury od každé buněčné linie dávkami 50 μl.

   1. účinné od 1. 5. 2004III.3 Inkubace buněčných kultur

      účinné od 1. 5. 2004Viz část I odd. III. odst. 1.

   1. účinné od 1. 5. 2004III.4 Mikroskopické vyšetření

      účinné od 1. 5. 2004Inokulované buněčné kultury se denně prohlížejí při zvětšení 40× až 150×, aby byl zjištěn výskyt cytopatického efektu (CPE). Jestliže jedno z použitých antisér zabrání vzniku CPE, může být virus považován za prokázaný.

      účinné od 1. 5. 2004Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.

   1. účinné od 1. 5. 2004III.5 Subkultivace

      účinné od 1. 5. 2004Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.

1. účinné od 1. 5. 2004C. Jiné diagnostické postupy

   účinné od 1. 5. 2004Supernatant připravený podle postupu uvedeného v části I odd. II. odst. 2 může být vyšetřen metodou IFAT podle části I odd. IV. odst. 3 popřípadě metodou ELISA podle části I odd. IV. odst. 4. Tyto rychlé vyšetřovací metody musí být doplněny virologickým vyšetřením podle bodu A nebo B do 48 hodin po odběru vzorku, jestliže

   1. účinné od 1. 5. 2004a) je výsledek vyšetření negativní,
      1. účinné od 1. 5. 2004nebo
   1. účinné od 1. 5. 2004b) je výsledek vyšetření pozitivní u materiálu, představujícího první případ vypuknutí IHN nebo VHS ve schválené oblasti.

   účinné od 1. 5. 2004Tkáňový materiál může být vyšetřen dalšími diagnostickými metodami (např. RT-PCR, IF v kryokatových řezech materiálu nebo imunohistochemickým vyšetřením materiálu fixovaného formalínem). Tyto postupy musí být vždy doplněny inokulací nefixovaného tkáňového materiálu do buněčných kultur.

účinné od 1. 5. 2004Důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN v oblastech či hospodářstvích v neschválených oblastechúčinné od 1. 5. 2004ČÁST III

účinné od 1. 5. 2004Zásady a kritéria pro úřední program veterinární kontroly

1. účinné od 1. 5. 20041. Program veterinární kontroly může být iniciován
   1. účinné od 1. 5. 2004- buď podle úředně uznaného programu eradikace nákaz virem VHS a/nebo IHN včetně odstranění všech ryb v hospodářství, čištění, dezinfekce a uchování v tomto stavu před znovuoživením rybami ze schválených hospodářství, nebo
   2. účinné od 1. 5. 2004- v hospodářstvích s chovem ryb, v nichž se ještě nevyskytla žádná infekce virem VHS nebo IHN.

1. účinné od 1. 5. 20042. Program veterinární kontroly se musí opírat o klinická a laboratorní vyšetření.
2. účinné od 1. 5. 20043. Program musí zahrnovat dvě klinická veterinární vyšetření ročně podle směrnic v části I.
3. účinné od 1. 5. 20044. U minimálně jednoho vyšetření prováděného každoročně je nutno v každém hospodářství odebrat 30 vzorků rybích tkání a/nebo ovariální tekutiny. Vzorky je nutno odebrat, připravit a podrobit laboratornímu vyšetření podle částí I, II a IV.
4. účinné od 1. 5. 20045. Program veterinární kontroly je nezbytné provádět minimálně čtyři roky ve všech hospodářstvích oblasti, která má být schválena, nebo v hospodářství v neschválené oblasti, která má být schválena.
5. účinné od 1. 5. 20046. Aby mohl být na základě tohoto programu hospodářství/oblasti úředně přiznán status schváleného hospodářství / oblasti, nesmějí se vyskytnout ani nesmí být zjištěny žádné případy VHS nebo IHN (nesmí dojít ani ke klinické infekci, ani být izolovány viry).

účinné od 1. 5. 2004Postup titrace pro ověření vnímavosti buněčných kultur k infekcímúčinné od 1. 5. 2004ČÁST IV

účinné od 1. 5. 2004Doporučené postupy pro titraci podle části I odd. III. odst. 3:

účinné od 1. 5. 2004Je nutno použít nejméně dva izoláty viru VHS a jeden izolát viru IHN. Izoláty by měly reprezentovat nejdůležitější skupinu virů v EU. Např. v případě viru VHS je nutno vybrat jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u pstruha duhového žijícího ve sladké vodě a jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u kambaly velké žijící ve slané vodě, a v případě viru IHN je nutno vybrat jeden patogenní evropský kmen viru z pstruha duhového. Měly by být použity definované izoláty pocházející z členských států. Referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb může dát k dispozici referenční izoláty.

účinné od 1. 5. 2004Šarže virů se získávají z několika málo pasáží buněčných kultur (buněčné linie BF-2 nebo RTG-2 v případě viru VHS a buněčné linie EPC nebo FHM v případě viru IHN), které jsou kultivovány v kultivačních lahvích pro buněčné kultury. Je nutno použít médium buněčných kultur s minimálně 10 % séra. Pro inokulaci použijte nízký poměr infekčních virových partikulí k počtu buněk v kultuře (< 1).

účinné od 1. 5. 2004Pokud je CPE úplný, virus se získává odstřeďováním supernatantu buněčné kultury při 2000× g po dobu 15 min., filtruje se na membráně (0,45 μm) za sterilních podmínek a distribuuje se v označených zkumavkách, které je možno použít pro zmrazování. Virus se uchovává při teplotě – 80⁰ C.

účinné od 1. 5. 2004Týden po zmražení se tři zkumavky s každým virem nechají rozmrazit ve studené vodě a suspenze viru se titrují a kontrolují se příslušné buněčné linie. Při podezření na sníženou vnímavost buněčných linií se každý izolát viru nechává roztát a titruje se minimálně každých šest měsíců.

účinné od 1. 5. 2004Postupy titrace je nutno podrobně popsat a pokaždé provést stejným způsobem.

účinné od 1. 5. 2004Titrace se zředěním až do konečného bodu by měla zahrnovat minimálně šest opakování každého kroku ředění. Výsledky dosažené touto titrační metodou se srovnají s titry předtím získanými. Pokud poklesne titr jednoho ze tří izolátů viru o faktor 2 log nebo více ve srovnání s původním titrem, neměla by buněčná linie již být použita pro výzkumné účely.

účinné od 1. 5. 2004Pokud se v laboratoři používají různé buněčné linie, měla by být každá z nich vyšetřována zvlášť.

účinné od 1. 5. 2004Záznamy je nutno archivovat minimálně deset let.

účinné od 1. 5. 2004Akronymy a zkratkyúčinné od 1. 5. 2004ČÁST V