Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.

  1. 1.2.1 Experimentální zvířata

    Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i jiné druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Expozice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl v hmotnosti zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

  1. 1.2.2 Počet a pohlaví

    Pro hlodavce se použije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) na každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty se zvýší o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.

    Exponovaná satelitní skupina (skupiny) pro hodnocení patologie jiné než jsou tumory by každá měla obsahovat 20 zvířat pro každé pohlaví, zatímco satelitní skupina kontrol by měla obsahovat 10 zvířat každého pohlaví.

  1. 1.2.3 Dávkové úrovně a frekvence expozic

    Pro test karcinogenity se zvolí přinejmenším 3 dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory. Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.

    Při volbě dávkových úrovní by se měly vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.

    Pro účely testování chronické toxicity jsou v testu zahrnuty satelitní exponované skupiny a souběžná kontrolní satelitní skupina. Vysoká dávka pro exponovaná satelitní zvířata by měla vyvolat zřetelné příznaky toxicity.

    Expozice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.

  1. 1.2.4 Kontroly

    Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma expozice testované látce.

    Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

  1. 1.2.5 Způsob aplikace

    Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobnému způsobu expozice u člověka.

    1. 1.2.5.1 Orální studie

      Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

      Ideálně by se měla látka podávat 7 dnů v týdnu, protože dávkování 5 dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat „abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.

    1. 1.2.5.2 Dermální studie

      Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.

    1. 1.2.5.3 Inhalační studie

      Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

      Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace 6 hodin denně po 5 dnů v týdnu (přerušovaná expozice), nebo v návaznosti na možnou expozici v prostředí, 22-24 hodin denně po 7 dnů v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

      Volba přerušované nebo kontinuální expozice závisí na cílech studie a na lidské expozici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální expozice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během expozice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

      Expoziční komory

      Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísunu kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma expozice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.

      1. Měření nebo monitorování zahrnuje:

        (a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně,

        (b) koncentrace: během denní expozice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty,

        (c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně,

        (d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během expozic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.

  1. 1.2.6 Trvání studie

    Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života, respektive s nízkým spontánním výskytem tumorů, by doba ukončení experimentu měla být za 24 měsíců pro myši a křečky a za 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.

    Satelitní skupiny 20 dávkovaných zvířat pro každé pohlaví a 10 připojených kontrolních zvířat každého pohlaví použitých pro testování chronické toxicity by měly být v pokusu aspoň 12 měsíců. U těchto zvířat by mělo být plánováno utracení tak, aby umožnilo odlišení patologie, která má vztah k testované látce, od komplikujících projevů stárnutí.

  1. 1.3 Popis postupu
    1. 1.3.1 Pozorování

      Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.

      U zvířat exponované satelitní skupiny (skupin) se provádí v přiměřených intervalech klinické vyšetření.

      Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Zvířata v agónii by měla být utracena a pitvána.

      Klinické příznaky včetně neurologických a očních nálezů a mortalita se zaznamenávají u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.

      Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

      Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.

    1. 1.3.2 Klinická vyšetření
      1. 1.3.2.1 Hematologie

        Hematologická vyšetření (např.obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erytrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo další měření srážlivosti) by měla být prováděna za 3 měsíce, 6 měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od týchž potkanů.

        Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.

        Diferenciální obraz bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.

      1. 1.3.2.2 Analýza moči
        1. Vzorky moči od 10 potkanů od každého pohlaví se sbírají pro analýzu od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
          1. - vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
          2. - proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
          3. - mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
      1. 1.3.2.3 Biochemické vyšetření
        1. V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
          1. - celková koncentrace proteinů,
          2. - koncentrace albuminu,
          3. - testy na funkci jater (např. aktivita bazické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminázy (nyní známá jako sérová alanin aminotransferáza), glutamát acetát transaminázy (nyní známá jako sérová aspartát aminotransferáza), gama glutamyl transpeptidázy, ornithin dekarboxylázy,
          4. - metabolismus cukrů, např. krevní glukosa nalačno,
          5. - test na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
      1. 1.3.2.4 Makroskopické patologické vyšetření

        Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v agónii. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné léze, tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

        Orgány a tkáně se uchovávají pro histopatologické vyšetření. Obvykle se jedná o následující orgány a tkáně: mozek (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítnou žlázu a příštítná tělíska, thymus, trachea a plíce, srdce, aortu, slinnou žlázu, jatra, slezinu, ledviny, nadledviny, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, slinivku, gonády, akcesorní pohlavních orgány, samičí mléčné žlázy, kůži, svalovinu, periferní nervy, míchu (krční, hrudní a bederní), sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubů, a oči. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích, jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.

      2. Poznámka: štítná žláza s příštitnými tělísky ze všech nehlodavců musí být zvážena stejně jako mozek, játra, ledviny, nadledviny a gonády z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců.

        3. Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.

      1. 1.3.2.5 Histopatologie
        1. Pro testování chronické toxicity:

          Podrobné vyšetření se provede ve všech uchovaných orgánech všech zvířat satelitní skupiny s vysokou dávkou a satelitní kontrolní skupiny. Pokud se v satelitní skupině exponované nejvyšší dávce najdou patologické změny způsobené látkou, vyšetří se histologicky cílové orgány všech ostatních zvířat z ostatních exponovaných satelitních skupin i ze všech exponovaných skupin části studie věnované karcinogenitě při jejím ukončení.

        1. Pro testování karcinogenity:

          (a) úplná histopatologie se provede v orgánech a tkáních všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během testu a u všech zvířat skupiny kontrolní a s nejvyšší dávkou;

          (b) všechny tumory viditelné okem a léze, které jsou podezřelé jako tumory, se vyšetří mikroskopicky u všech skupin;

          (c) je-li významný rozdíl v incidenci neoplastických lézí mezi skupinou s vysokou dávkou a kontrolní skupinou, histopatologické vyšetření se provede v daném orgánu či tkáni i v dalších skupinách;

          (d) je-li přežití ve skupině s vysokou dávkou podstatně nižší než u kontrol, měla by být kompletně zkoumána i skupina s nejbližší nižší dávkou;

          (e) je-li ve skupině s vysokou dávkou doklad o vyvolání toxických nebo jiných účinků, které by mohly ovlivnit neoplastickou odpověď, je třeba kompletně vyšetřit nejblíže nižší dávkovou úroveň.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat ukazujících tumory zjištěné během testu, dobu jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o testu musí obsahovat následující informace:
      1. - živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
      2. - podmínky testu:
        1. popis expozičního zařízení:
          1. včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu.
        1. Údaje o expozici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. směrodatná odchylka) by měly zahrnovat:

          (a) rychlost proudu vzduchu v inhalačním zařízení,

          (b) teplotu a vlhkost vzduchu,

          (c) nominální koncentraci (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu),

          (e) povahu vehikula, je-li použito,

          (f) skutečné koncentrace v dýchací zóně,

          (g) medián velikosti částic (tam kde relevantní),

        1. - dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
        2. - data incidence tumorů podle pohlaví, dávky a typu tumoru,
        3. - doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce, včetně satelitních skupin,
        4. - výskyt toxických účinků podle pohlaví a dávky
        5. - popis toxických a jiných účinků,
        6. - doba, kdy byl pozorován jakýkoliv abnormální příznak a jeho další vývoj,
        7. - data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
        8. - oftalmologické nálezy,
        9. - použité hematologické testy a výsledky,
        10. - testy klinické biochemie a všechny výsledky (včetně výsledků analýzy moči),
        11. - nálezy patologicko-anatomické,
        12. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
        13. - statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.34 REPRODUKČNÍ TOXICITA - JEDNOGENERAČNÍ TEST

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.

      Samci dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho úplného spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.

      Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň 2 estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus. Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví, v době gravidity a kojení pouze samicím.

      Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.

    1. 1.2 Popis testovací metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před zahájením testu se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně rozdělí do kontrolní a exponovaných skupin.

        Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také přijatelné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dnů v týdnu.

      1. 1.2.2 Pokusná zvířata
        1. 1.2.2.1 Výběr druhu

          Dává se přednost potkanům nebo myším. Používají se zdravá zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a hmotnosti a/nebo věku. Plodnost musí být ověřena vhodným způsobem u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.

        1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

          Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování v P generaci, kojení, růst a vývoj potomstva generace F1 od početí do odstavu.

      1. 1.2.3 Podmínky testu

        Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.

      1. 1.2.4 Dávkování

        Použijí se alespoň 3 exponované skupiny a 1 kontrolní. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v nejvyšším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a využití potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.

        Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě - pokud to není omezeno jejími fyzikálně-chemickými vlastnostmi nebo povahou biologického účinku - vyvolávat toxicitu, ale žádná uhynutí v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky, ani u rodičů ani u potomstva.

        Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví individuálně na základě hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny váhy. V případě těhotných samic dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v nultém nebo šestém dnu od začátku těhotenství.

      1. 1.2.5 Limitní test

        V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající u matek jasné příznaky toxicity, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.

    1. 1.3 Popis postupu
      1. 1.3.1 Plán pokusu

        Denní aplikace samcům rodičovské generace (P) začne ve věku 5 až 9 týdnů, po nejméně pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje 10 týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění, nebo se pokračuje v aplikaci a mohou být použiti pro produkci dalších vrhů a jsou pak utraceni a vyšetřeni někdy před koncem pokusu.

        Denní aplikace samicím rodičovské generace (P) začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň 2 týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé 3 týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F1 generace. Je přípustná změna dávkovacího plánu podle znalostí o vlastnostech studované látky, např. o indukci metabolismu a/nebo bioakumulaci.

      1. 1.3.2 Postup při připouštění

        Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).

        V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.

        Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních orgánů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.

      1. 1.3.3 Velikost vrhů

        Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, například 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat.

      1. 1.3.4 Pozorování

        Každé zvíře musí být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu, a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří denně jak před tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy (a vody, pokud se látka podává v pitné vodě) ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.

        Doba gestace se počítá od dne 0 těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomálií.

        Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření na možné defekty. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve čtvrtém a sedmém dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.

      1. 1.3.5 Patologie
        1. 1.3.5.1 Pitva

          Po utracení nebo úmrtí se všechna zvířata generace P makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality anebo patologické změny, se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mláďata zemřelá nebo umírající se vyšetří na defekty.

        1. 1.3.5.2 Histopatologická vyšetření

          Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagína, varlata, epididymis, semenné váčky, koagulační žláza, prostata, hypofysa a cílové orgány všech zvířat generace P se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu.

          Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u P zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analýze.

  1. 2 ÚDAJE

    Data se sumarizují v tabulkách, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet plodných samců, počet těhotných samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.

    Numerické výsledky se být statisticky zpracovávají příslušnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o experimentu by měla pokud možno obsahovat následující údaje:
      1. - druh /kmen použitých zvířat,
      2. - údaje o toxické odezvě v závislosti na dávce a pohlaví, včetně ukazatelů plodností, gestace a životaschopnosti,
      3. - dobu uhynutí v průběhu studie nebo zda zvířata přežila do ukončení pokusu,
      4. - tabulka uvádějící hmotnost každého vrhu, průměrnou hmotnost jednotlivých mláďat a konečnou individuální hmotnost potomků,
      5. - toxické a další účinky na reprodukci, potomstvo a postnatální růst,
      6. - den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
      7. - tělesná hmotnost zvířat P generace,
      8. - pitevní nálezy,
      9. - detailní popis všech mikroskopických nálezů,
      10. - statistické zpracování všech údajů, pokud je možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.35 REPRODUKČNÍ TOXICITA - DVOUGENERAČNÍ TEST

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody.

      Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.

      Samci rodičovské (P) generace dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.

      Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň dvou estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus.

      Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví a potom, v době gravidity a kojení, pouze samicím. Po odstavení je látka podávána zvířatům filiální generace F1 v průběhu růstu do dospělosti, v době páření a až do doby odstavení F2 generace.

      Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.

    1. 1.2 Popis testovací metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        Před zahájením testu jsou zdravá zvířata náhodně rozdělena do kontrolní a exponovaných skupin. Rodičovská zvířata (P) jsou chována nejméně 5 dnů před zahájením pokusu v těch podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také možné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dní v týdnu.

      1. 1.2.2 Pokusná zvířata

        V pokuse se přednostně používají potkani nebo myši. Používají se zdravá P zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Zvířata musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a hmotnosti nebo věku. Plodnost musí být ověřena u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.

      1. 1.2.3 Počet a pohlaví

        Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva a tak zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování, kojení, růst a vývoj potomstva generace F1 od početí do dospělosti a vývoj jejich potomstva generace F2 až do odstavení.

      1. 1.2.4 Podmínky testu

        Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.

      1. 1.2.5 Dávkování

        Použijí se alespoň 3 exponované a 1 kontrolní skupina zvířat. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v největším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a utilizaci potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.

        Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě, pokud to dovolí fyzikálně-chemické vlastnosti látky a její biologické účinky, vyvolávat toxicitu a nikoli mortalitu v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky ani u rodičů ani u potomstva.

        Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví na základě individuální hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny hmotnosti. V případě těhotných samic, dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6.dni od začátku těhotenství.

      1. 1.2.6 Limitní test

        V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající jasnou mateřskou toxicitu, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.

    1. 1.3 Popis postupu
      1. 1.3.1 Plán pokusu

        Denní aplikace samcům rodičovské generace P začne ve věku pěti až devíti týdnů, aspoň po pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje deset týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění nebo se pokračuje v aplikaci a jsou použiti pro případnou produkci dalších vrhů a jsou utraceni a vyšetřeni před koncem pokusu.

        Denní aplikace samicím rodičovské generace P začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň dva týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé tři týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F1 potomstva.

        Změna dávkovacího plánu je na základě znalostí o vlastnostech studované látky, například o indukci metabolismu respektive o bioakumulaci, přípustná.

        Aplikace zvířatům generace F1 začíná po odstavu a končí jejich utracením.

      1. 1.3.2 Postup při připouštění

        Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).

        V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.

        Vzhledem k vývoji spermiogenese, se zvířata generace F1 nepoužívají pro připouštění do věku 11 týdnů u myší a 13 týdnů u potkanů. Pro připouštění zvířat generace F1 se náhodně vyberou páry z různých vrhů téže dávkové skupiny. Nepoužitá zvířata se utratí po odstavu.

        Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních orgánů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.

      1. 1.3.3 Velikost vrhů

        Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, např. 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat. Standardizace vrhů generace F2 se provede obdobně.

      1. 1.3.4 Pozorování

        Každé zvíře musí být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří týdně jak před, tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P a F1 zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.

        Doba gestace se počítá od nultého dne těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomálií.

        Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření možných defektů. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve čtvrtém a sedmém dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.

      1. 1.3.5 Patologie
        1. 1.3.5.1 Pitva

          Všechna dospělá zvířata generací P a F1 se utrácejí, jakmile není nutné je déle uchovávat pro posouzení účinků látky na reprodukci. Zvířata generace F1 nevybraná pro připouštění a všechna zvířata generace F2 se utratí po odstavení.

          Po utracení nebo úmrtí se u všech rodičovských zvířat P a F1 makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality a patologické změny se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mláďata uhynulá nebo v agónii se vyšetří na defekty.

        1. 1.3.5.2 Histopatologické vyšetření

          Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagína, varlata, epididymis, semenné kanálky, koagulační žlázka, prostata, hypofysa a další cílové orgány všech zvířat generací P a F1 se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech P a F1 zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku, která byla vybrána pro připouštění, a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu. Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analýze.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se zapisují do tabulek, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet těhotných samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.

    Numerické výsledky se zpracovávají vhodnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    Zpráva o experimentu obsahuje následující údaje:

    1. - druh /kmen použitých zvířat,
    2. - údaje o toxické odezvě v závislosti na dávce a pohlaví, včetně ukazatelů plodností, gestace a životaschopnosti,
    3. - dobu uhynutí v průběhu studie nebo zda zvířata přežila do ukončení pokusu,
    4. - tabulka uvádějící hmotnost u každého vrhu, průměrnou hmotnost jednotlivých mláďat a individuální hmotnost potomků před utracením,
    5. - toxické a další účinky na reprodukci, potomstvo a postnatální růst,
    6. - den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
    7. - tělesná hmotnost zvířat P a F1 generace, vybraných pro připouštění,
    8. - pitevní nálezy,
    9. - detailní popis všech mikroskopických nálezů, statistické zpracování všech údajů, pokud je možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.36 TOXIKOKINETIKA

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se podává vhodnou cestou. V závislosti na zaměření studie může být látka podávána jednorázově nebo opakovaně v průběhu stanovené doby jedné nebo několika skupinám experimentálních zvířat. Látka, respektive její metabolity, jsou pak podle účelu studie stanovovány v tělních tekutinách, tkáních anebo v exkretech.

      Studie mohou být prováděny s „neznačenou“ či „značenou“ formou testované látky. Jestliže je použito značení, umístí se tak, aby poskytlo co nejvíce informací o osudu testované látky v organismu.

    1. 1.2 Popis testovací metody
    2. 1.3 Přípravy

      Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před zahájením testování jsou zvířata náhodně rozdělena do skupin. Pro řešení specielních otázek se může použít velmi mladých, březích či premedikovaných zvířat.

      1. 1.3.1 Experimentální podmínky
        1. 1.3.1.1 Pokusná zvířata

          Toxikokinetické studie se provádějí na jednom či více vhodných živočišných druzích, užívaných nebo uvažovaných pro užití v jiných toxikologických studiích zabývajících se testovanou látkou. Jestliže jsou pro testování používáni hlodavci, neměla by být variabilita hmotnosti vyšší než ± 20 % průměrné hodnoty.

        1. 1.3.1.2 Počet a pohlaví

          Při studiu absorpce a vylučování se užije nejprve 4 zvířat pro každou jednotlivou dávku. Pro testování není dávána přednost určitému pohlaví, ale za určitých podmínek může vzniknout potřeba provádět studie na obou pohlavích. Jestliže jsou nalezeny rozdílné odpovědi u různých pohlaví, potom je třeba testovat 4 zvířata každého pohlaví. V případě ostatních druhů zvířat (jiných než hlodavců) je možné použít menší počet zvířat.

          Je-li studována tkáňová distribuce, pak je při určení počáteční velikosti skupiny zvířat třeba brát v úvahu jak počet zvířat, která budou utracena v každém časovém bodu, tak počet časových bodů, v nichž bude testování prováděno.

          Je-li studován metabolismus, pak je velikost skupiny zvířat úměrná potřebám studie.

          Zahrnuje-li studie větší počet dávek a sledovaných časových intervalů, pak je potřeba, aby bylo ve skupině tolik zvířat, aby v každém časovém intervalu při plánovaném utrácení zvířat byla ve skupině minimálně 2 zvířata. Velikost skupiny musí být dostatečná, aby pro látku respektive její metabolity její metabolity poskytla přijatelné charakteristiky ve fázi retence, rovnovážného stavu a deplece.

        1. 1.3.1.3 Dávky

          V případě jednorázového podání se použijí nejméně 2 různé dávky testované látky, a to nízká dávka, po která nemá žádné toxické účinky a vysoká dávka, po které mohou být nalezeny změny v toxikokinetických parametrech nebo která vyvolává toxické účinky.

          V případě opakovaného podávání je většinou dostatečné podání nízkých dávek látky. Za určitých podmínek může být nezbytné i podávání vysoké dávky.

        1. 1.3.1.4 Způsob aplikace

          Toxikokinetické studie se provádí stejným způsobem aplikace a je-li to vhodné i se stejným vehikulem tak, jak jsou používány v ostatních toxikologických studiích. Testovaná látka je buď podávána orálně sondou nebo v potravě, nebo se aplikuje na kůži, nebo inhalačně vždy po určenou dobu skupině experimentálních zvířat. Intravenosní podání testované látky může být užitečné pro stanovení relativního vstřebávání při jiných způsobech aplikace. Navíc, krátce po intravenosní aplikaci látky mohou být získány důležité informace o distribuci látky v organismu.

          Vždy je nutno pamatovat na možnou interferenci vehikula s testovanou látkou. Pozornost je potřeba věnovat i rozdílům ve vstřebávání v případě, je-li testovaná látka podána sondou nebo v potravě, a přesnému stanovení dávky, zvláště je-li testovaná látka podávána v potravě.

        1. 1.3.1.5 Doba sledování

          Všechna zvířata se sledují denně a zaznamenávají se příznaky toxicity i další významné klinické údaje spolu s údaji o jejich počátku, velikosti a trvání.

        1. 1.3.1.6 Popis postupu

          Po zvážení pokusných zvířat je testovaná látka podána způsobem přiměřeným účelu. Ve zdůvodněných případech je možno nechat zvířata před podáním testované látky vyhladovět.

        1. 1.3.1.7 Absorpce
          1. Ke sledování rychlosti a rozsahu absorpce podávané látky mohou být použity různé metody s nebo bez referenční skupiny (referenční skupinou se rozumí ta skupina, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost látky), a to např.:
            1. - stanovení množství testované látky a ev. jejích metabolitů v exkretech např. v moči, žluči, stolici, vydechovaném vzduchu a také jejích zbytků v karkasu,
            2. - porovnání biologické odpovědi (např. studie akutní toxicity) mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
            3. - porovnání množství látky resp. jejích metabolitů vylučovaných ledvinami mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
            4. - stanovení plochy pod křivkou závislosti koncentrací testované látky a ev. jejích metabolitů v plazmě na čase a porovnání s daty získanými v referenční skupině.
      1. 1.3.2 Distribuce
        1. V současné době jsou dostupné 2 přístupy, z nichž pro analýzu distribučního schématu mohou být použity jeden či oba:
          1. - při použití celotělové autoradiografie lze získat užitečné kvalitativní informace;
          2. - kvantitativní informace poskytuje stanovení koncentrací a množství testované látky a jejích případných metabolitů v tkáních a orgánech, získaných ze zvířat v různých časových intervalech po zahájení expozice.
      1. 1.3.3 Vylučování

        Při studiu vylučování se sbírá moč, stolice, vydechovaný vzduch a v určitých případech žluč. Množství testované látky a jejích případných metabolitů se v těchto exkretech stanovuje několikrát po podání látky, a to buď do vyloučení 95 % z podaného množství nebo nejvýše 7 dnů od počátku vylučování.

        Ve specielních případech se sleduje vylučování testované látky v mléce v době laktace testovaných zvířat.

      1. 1.3.4 Metabolismus

        K určení rozsahu a schématu metabolismu látky se biologické vzorky analyzují vhodnými technikami. Měla by být objasněna struktura metabolitů a navrženo odpovídající metabolické schéma tam, kde je třeba odpovědět na otázky z předcházejících toxikologických studií. Pro získání informací o metabolismu může být prospěšné provedení in vitro studií.

        Další informace o vztahu mezi metabolismem a toxicitou látky lze získat z biochemických studií např. studiem účinků látky na enzymy metabolického systému, sledováním poklesu endogenních neproteinových sloučenin obsahujících - SH skupiny a nebo vazby látky na makromolekuly.

  1. 2 ÚDAJE

    Získané údaje se podle typu prováděné studie sumarizují v tabulkách, pokud možno doplněných grafickým znázorněním.

    Pro každou testovanou skupinu se uvedou průměry a charakteristiky variability ve vztahu k času, dávce, tkáni a orgánům (pokud je to důležité). Míra vstřebání i množství a rychlost vylučování se stanoví vhodnými metodami. V případě metabolických studií by měla být identifikována struktura metabolitů a navrženy metabolické cesty studované látky.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Podle typu prováděné studie obsahuje zpráva o testu následující údaje:
      1. - živočišný druh, kmen, zdroj, životní podmínky, výživa,
      2. - charakteristika značeného materiálu, jestliže byl použit,
      3. - velikost dávky a intervaly podání,
      4. - způsob(y) podání a všechna použitá vehikula,
      5. - toxické a i ostatní pozorované účinky,
      6. - metody stanovení testované látky a ev. jejích metabolitů v biologickém materiálu včetně vydechovaného vzduchu,
      7. - tabulky výsledků rozdělené podle pohlaví, dávky, režimu, času, tkání a orgánů,
      8. - uvedení rozsahu vstřebávání a vylučování v závislosti na čase,
      9. - metody užité pro charakterizaci a identifikaci metabolitů v biologickém materiálu,
      10. - metody užité pro biochemická stanovení týkající se metabolismu,
      11. - navrhované schéma pro metabolismus.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
    1. 1.1 Úvod

      Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

      Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

    1. 1.2 Definice

      Do skupiny látek označených v názvu této metody jako „organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

      Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků, a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

    1. 1.3 Referenční látky

      Referenční látka může být testována na pozitivní kontrolní skupině k průkazu, že v laboratorních podmínkách se reakce testovaných druhů podstatně nezměnila.

      Příkladem široce používané referenční látky s pozdním neurotoxickým účinkem je tri-o-tolylfosfát (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, chemický název:

      tris(2-metylfenyl) ester kyseliny fosforečné, syn: tri-o-kresylfosfát (TOCP).

    1. 1.4 Princip testovací metody

      Testovaná látka se podává orálně v jediné dávce slepicím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se pozorují po dobu 21 dnů, zaznamenává se jejich abnormální chování, ataxie a parézy. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. 21 dnů po podání látky jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

    1. 1.5 Popis metody testování
      1. 1.5.1 Příprava

        Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

        Testovaná látka se podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je například kukuřičný olej. Pevné látky je vhodné rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

      1. 1.5.2 Experimentální podmínky
        1. 1.5.2.1 Pokusná zvířata

          Doporučují se mladé nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

        1. 1.5.2.2 Počet a pohlaví

          Kromě testovací skupiny se použije jak kontrolní skupina s vehikulem, tak pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

          V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby alespoň 6 z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (3 první a 3 druhý den po podání) a aby 6 z nich přežilo pozorování trvající 21 dnů.

          Pozitivní kontrolní skupina se může testovat souběžně nebo se může použít kontrolní skupina z nedávné historie. Má mít alespoň 6 slepic, kterým se podává látka vyvolávající pozdní neurotoxicitu, 3 slepice jsou určeny pro biochemii a 3 slepice pro histologii. Doporučuje se periodicky doplňovat historické údaje, když se v provádějící laboratoři změní některý ze základních prvků testu (např. plemeno, potrava, podmínky chovu).

        1. 1.5.2.3 Volba dávek

          Má být provedena předběžná studie s využitím příslušného počtu slepic a skupin v různých úrovních dávek, aby se dala stanovit úroveň, která bude použita v hlavní studii. Určitá úmrtnost je v této předběžné studii nezbytná pro stanovení přiměřené dávky v hlavní studii. Aby se zabránilo úmrtí pro akutní cholinergní účinky, používá se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky. K odhadu maximální neletální dávky testovaných látek může být použito různých typů testovacích metod (viz metoda B.1 bis). Historické údaje pro slepice nebo jiné toxikologické informace mohou být také nápomocné při výběru dávky.

          Úroveň dávky testované látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší s přihlédnutím k výsledkům předběžné studie výběru dávky a hornímu limitu dávky 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Případné úhyny by neměly ovlivnit přežití dostatečného počtu zvířat, to je šesti pro biochemii a po 21 dnech šesti pro histologii. Atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky, se má použit jako ochrana před akutními cholinergními účinky.

          Jestliže test s dávkou nejméně 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice, vyskytující se u lidí, naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

          Doba pozorování je 21 dnů.

      1. 1.5.3 Popis postupu

        Po aplikaci prostředku, ochraňujícího před úmrtím na následky akutního cholinergního účinku, je testovaná látka podána v jediné dávce.

        1. 1.5.3.1 Všeobecné pozorování

          Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují několikrát v průběhu prvních 2 dnů a pak aspoň jednou denně po dobu 21 dní nebo dokud nebudou utraceny podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání abnormálního chování. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vykazující patologické změny vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata a zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba vyřadit, humánním způsobem utratit a pitvat.

        1. 1.5.3.2 Tělesná hmotnost

          Všechny slepice se zváží těsně před podáním testované látky a pak aspoň jednou týdně.

        1. 1.5.3.3 Biochemie

          6 slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem a 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny (je-li skupina použita) se usmrtí v prvních dnech po aplikaci látky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Běžně se usmrcují 3 slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrcují pouze po 24 hodinách. Jestliže pozorování klinických příznaků naznačuje, že toxická látka se v organismu pohybuje velmi pomalu (hodnotí se nástup cholinergních příznaků), pak je výhodnější odebrat vzorky tkáně dvakrát ze 3 zvířat, a to mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.

          U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

        1. 1.5.3.4 Pitva

          Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celkový stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

        1. 1.5.3.5 Histopatologické vyšetření

          Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha - řezy míchy se provádějí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální, z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

  1. 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

    Negativní výsledky o účincích sledovaných touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) běžně nevyžadují další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

    Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

    Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelace mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

    Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Testovaná zvířata:
      1. - použité plemeno;
      2. - počet a stáří zvířat;
      3. - zdroj, podmínky ustájení atd.;
      4. - hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku studie.
    1. Podmínky testování:
      1. - podrobné údaje o přípravě, stabilitě a homogenitě testované látky;
      2. - zdůvodnění výběru vehikula;
      3. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
      4. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody;
      5. - zdůvodnění vybrané úrovně dávek;
      6. - specifikace podávaných dávek, včetně podrobných údajů o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikované látky;
      7. - podrobné údaje o podání ochranného přípravku.
    1. Výsledky:
      1. - údaje o tělesné hmotnosti;
      2. - údaje o toxických odpovědích podle dávkových skupin, včetně úmrtnosti;
      3. - charakter, stupeň a trvání klinických příznaků (ať vratných nebo nevratných);
      4. - podrobný popis biochemických vyšetření a jejich výsledky;
      5. - pitevní nálezy;