Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

Pro tyto účely zahrnují metody B.15,¹) B.16,¹) B.17,⁵) B.18,¹) B.19,¹) B.20,¹) B.21,¹) B.22,¹) B.23,⁵) B.24¹) a B.25¹) jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.

Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.

Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.

Některé všeobecné zásady pro strategii testování jsou stanoveny směrnicí 93/67/EHS.

Metody pro další výzkum jsou seřazeny níže podle jimi sledovaného hlavního genetického účinku:

Studie detekující genové (bodové) mutace

1. a) Studie forward nebo reversních mutací s využitím eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15).¹)
2. b) In vitro test forward mutací v savčích buňkách (metoda B.17).⁵)
3. c) Test na pohlaví vázané recesivní letální mutace u Drosophila melanogaster (metoda B.20).¹)
4. d) In vivo test mutací na somatických buňkách, spot test na myších (metoda B.24).¹)

Studie detekující chromozómové aberace

1. a) Cytogenetický test na savcích in vivo. Provedení in vivo analýzy metafáze chromózomů buněk kostní dřeně by mělo být zváženo, pokud nebylo zahrnuto do základního vyšetření (metoda B.11).⁵) Další možnost je cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B.23).⁵)
2. b) Cytogenetický test na savčích buňkách in vitro, pokud nebyl zařazen do základního vyšetření (B.10).⁵)
3. c) Dominantní letální test na hlodavcích (metoda B.22).¹)
4. d) Test na dědičnou translokaci u myší (metoda B.25).¹)

Genotoxické účinky – účinky na DNA

Genotoxicita je obecný pojem pro potenciálně škodlivé účinky na genetický materiál, které nejsou nezbytně spojeny s mutagenitou. Indikátorem genotoxicity může být vyvolané poškození DNA bez přímého důkazu mutace.

1. Následující metody využívající eukaryotické mikroorganismy nebo savčí buňky jsou vhodné pro takové studie:
   1. a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16).¹)
   2. b) Poškození DNA reparace – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B.18).¹)
   3. c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B.19).¹)

Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu

K dispozici jsou testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).¹) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

Posuzování rizika dědičných účinků u savců

K dispozici jsou metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25).¹) Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.

Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.

1. 4 KARCINOGENITA

   Chemické látky mohou být charakterizovány jako genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny, v závislosti na předpokládaném mechanismu působení.

   Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky se čerpají ze studií mutagenity/genotoxicity. Další informace poskytují testy toxicity při opakované aplikaci a testy subchronické nebo chronické toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci, metoda B.7,⁴) a dlouhodobější studie s opakovaným podáváním zahrnují posouzení takových histopatologických změn, např. hyperplazie v určitých tkáních, které by mohly být také významné. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci identifikovat chemické látky s karcinogenním potenciálem, které vyžadují další, podrobnější zkoumání tohoto aspektu pomocí testu karcinogenity (metoda B.32)¹) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B.33).¹)

   K dispozici jsou rovněž testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).¹) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

1. 5 REPRODUKČNÍ TOXICITA

   Reprodukční toxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle zhoršení reprodukčních funkcí nebo schopností samců a samic (vliv na plodnost) nebo podle nedědičných škodlivých účinků na potomstvo (vývojová toxicita) zahrnující také teratogenitu a účinky v průběhu laktace.

   Testovací metoda (metoda B.31)¹) pro studie zaměřené na teratogenitu jako součást vývojové toxicity počítá hlavně s orálním podáváním. Alternativně mohou být použity jiné způsoby aplikace v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podle pravděpodobného způsobu expozice člověka. V takových případech je třeba testovací metodu vhodně upravit s ohledem na příslušné body 28-denní testovací metody.

   Pokud je vyžadován třígenerační reprodukční test je možno popisovanou metodu pro dvougenerační reprodukční test (metoda B.35)¹) rozšířit tak, aby pokryl třetí generaci.

1. 6 NEUROTOXICITA

   Neurotoxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle funkčních změn nebo strukturních a biochemických změn v centrálním nebo periferním nervovém systému. Předběžné upozornění na neurotoxicitu může vzejít z testů akutní toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7)⁴) zahrnuje také posouzení neurotoxického účinku: u této metody se zdůrazňuje nutnost pečlivého klinického pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, které vyžadují další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu. Navíc je důležité vzít v úvahu specifické neurotoxické účinky, které nemohou být odhaleny v jiných studiích toxicity. Bylo například zjištěno, že jisté organické sloučeniny fosforu způsobují pozdní neurotoxicitu, která je posuzována metodami B.37⁴) a B.38⁴) po jednorázovém nebo opakovaném podání látky.

1. 7 IMUNOTOXICITA

   Imunotoxicita se zjišťuje různými způsoby, například podle imunosuprese anebo podle zvětšení odpovědi imunitního systému, které má za následek buď hypersenzitivitu nebo navozenou autoimunitu. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7),⁴) zahrnuje stanovení imunotoxických účinků. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s imunotoxickým potenciálem, vyžadující další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu.

1. 8 TOXIKOKINETIKA

   Toxikokinetické studie pomáhají při interpretaci a vyhodnocení údajů o toxicitě, objasňují specifické aspekty toxicity testované chemické látky a výsledky mohou pomoci při návrhu dalších studií toxicity. Nepředpokládá se, že bude v každém případě zapotřebí stanovit všechny parametry. Pouze v ojedinělých případech bude nezbytná celá posloupnost toxikokinetických studií (studie absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece). U některých sloučenin mohou být vhodné změny v této sekvenci nebo se může ukázat jako dostatečná studie s jednorázovým podáním (metoda B.36).¹)

   Informace o chemické struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech mohou také poskytnout údaje, umožňující odhad charakteristik absorpce při plánovaném způsobu aplikace, metabolismu a distribuce do tkání. Přispět mohou také informace o toxikokinetických parametrech z předcházejících toxikologických a toxikokinetických studií.

1. 10 CHARAKTERISTIKY TESTOVANÉ LÁTKY

   Složení testované látky, včetně významných nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti včetně stability je třeba znát před zahájením jakékoli toxikologické studie.

   Fyzikálně-chemické vlastnosti testované látky poskytují informace důležité pro výběr způsobu podávání, pro návrh konkrétní studie a pro manipulaci s látkou a její skladování.

   Vypracování analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení testované látky (a také pokud možno významných nečistot) v dávkovacím médiu a biologickém materiálu předchází zahájení studie.

   Všechny informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování testované látky se zahrnují v závěrečné zprávě o testu.

1. 11 PÉČE O ZVÍŘATA

   Pro toxikologické testy je přísná kontrola podmínek prostředí, ve kterém jsou pokusná zvířata chována, a správná péče o zvířata podstatnou podmínkou. Podmínky ochrany, chovu, využití včetně krmení zvířat jsou stanoveny zvláštními právními předpisy, které upravují ochranu zvířat.⁹)

   1. 11.1 Podmínky chovu

      Životní podmínky v prostorech pro pokusná zvířata je třeba přizpůsobit jednotlivým druhům. Pro potkany, myši a morčata je vhodná teplota místnosti 22°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %; pro králíky má být teplota 20°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %.

      Některé experimentální techniky výzkumu jsou zvláště citlivé na teplotu. Pro tyto případy jsou podrobnosti o příslušných podmínkách uvedeny v popisu testované metody. Při všech studiích toxických účinků je třeba zaznamenávat teplotu a vlhkost vzduchu a uvést je v závěrečné zprávě o průběhu pokusu.

      Osvětlení má být umělé se střídáním světla a tmy po dvanácti hodinách. Podrobnosti týkající se osvětlení je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě o průběhu pokusu.

      Pokud metoda nevyžaduje jiný způsob, mohou být zvířata chována jednotlivě nebo v malých skupinách jedinců stejného pohlaví, ne více než 5 zvířat v jedné kleci.

      Podstatnou součástí zprávy o pokusech na zvířatech jsou údaje o způsobu chovu v klecích a počtu zvířat chovaných v jedné kleci jak během expozice sledované látce, tak během následující doby pozorování.

   1. 11.2 Podmínky krmení

      Krmení musí vyhovovat všem požadavkům výživy pro příslušný použitý živočišný druh. Podávají-li se zvířatům studované látky v potravě, může se výživová hodnota snížit vzájemným působením studované látky a některé složky potravy. Možnost takové reakce je nutno vzít v úvahu při interpretaci výsledků. Používají se konvenční laboratorní diety s neomezeným přístupem k pitné vodě. Pokud je testovaná látka podávána v potravě, je třeba tomu přizpůsobit výběr diety.

      Příměsi v potravě, které mají prokazatelně vliv na toxicitu, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se tento vliv projevil.

1. 12 OCHRANA ZVÍŘAT

   Při vypracování testovacích metod musí být věnována potřebná pozornost ochraně zvířat v souladu s právními předpisy upravujícími ochranu zvířat.⁹) Níže jsou stručně uvedeny některé příklady, tento seznam není vyčerpávající. Pro stanovení akutní orální toxicity je třeba vzít v úvahu alternativní metody: postup s fixní dávkou a metoda stanovení třídy akutní toxicity. Postup s fixní dávkou nevyužívá uhynutí jako specifického kritéria a vyžaduje menší počet zvířat. Metoda stanovení třídy akutní toxicity vyžaduje v průměru o 70 % zvířat méně než metoda B.1²) pro akutní orální toxicitu. Tyto a alternativní metody mají za následek méně bolesti a stresu než klasická metodologie.

1. 13 ALTERNATIVNÍ TESTY

   Je nutno neustále vyvíjet a ověřovat alternativní metody, které mohou poskytovat stejnou úroveň informací jako současné testy na zvířatech a budou přitom využívat menšího počtu zvířat, způsobí méně utrpení nebo se úplně obejdou bez používání zvířat.

   V souladu s příslušnými právními předpisy, které upravují ochranu zvířat⁹), je nutno ověřovat v registrech mezinárodně ověřených a uznaných alternativních metod, zda k plánovanému pokusu existuje alternativní metoda, při které nemusí být použito zvíře.

   Pokud budou takové metody k dispozici, musí být jejich použití pro charakterizaci rizika, následnou klasifikaci a označování látky podle nebezpečnosti bráno v úvahu všude tam, kde je to možné.

1. 14 HODNOCENÍ A INTERPRETACE

   Při hodnocení a interpretaci pokusů na zvířatech a testů in vitro je nutno mít na zřeteli, že přímá extrapolace na člověka je možná jen v omezené míře; doklady o nepříznivých účincích u lidí, pokud jsou k dispozici, mohou sloužit k ověření výsledků testování.

   Výsledky testování mohou být použity pro klasifikaci a označování nových i existujících látek podle účinků na zdraví člověka na základě vlastností zjištěných a kvantifikovaných těmito metodami. Tyto výsledky mohou být také použity pro studie, zaměřené na posuzování rizika nových i existujících látek.

B.1 bis AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (PER OS)

METODA FIXNÍ DÁVKY