Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

zrušený předpis

  1. - pitevní nálezy,
  2. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
  3. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné.

Diskuse výsledků.

Závěry.

B.29 SUBCHRONICKÁ TOXICITA - INHALAČNÍ (90 denní opakovaná inhalační expozice, studie na hlodavcích)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 90 dnů. Použije-li se pro dosažení potřebné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

          V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický inhalační test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný druh a kmen.

        1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

          Pro každou úroveň koncentrace je třeba použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat další skupinu (satelitní skupinu) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší koncentraci a během následujících 28 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

        1. 1.2.2.3 Expoziční koncentrace

          Použijí se nejméně 3 skupiny s různou úrovní koncentrace a 1 kontrolní skupina (případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se použije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky). S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

        1. 1.2.2.4 Trvání expozice

          Zvířata se exponují po dobu 6 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. V případě specifických požadavků je možné použít i jiných dob expozice.

        1. 1.2.2.5 Expoziční zařízení

          Pro expozici zvířat se používá dynamické inhalační zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12 krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby co nejvíce bránil stísněnosti zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

        1. 1.2.2.6 Doba pozorování

          Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozic i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

      1. 1.2.3 Popis postupu

        Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 90 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Během expozice se nepodává potrava ani voda.

        Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

        1. Měření nebo monitorování podmínek expozice:
          1. a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
          2. b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ±15%.

            U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Při vývoji generátoru aerosolu je třeba analyzovat velikosti částic tak, aby byla získána představa o stabilitě. Během expozic se měří tak často, jak je to potřeba pro posouzení stálosti distribuce velikosti částic.

          1. c) Teplota a vlhkost vzduchu
          2. d) Během expozice a po ní se zvířata systematicky pozorují a zjištění se zaznamenávají; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich nástup, stupeň a trvání. Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat i spotřeba potravy se zaznamenávají týdně. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, pitvají. Umírající zvířata je třeba vyřadit a pitvat.
        1. U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

          (a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale přinejmenším u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

          (b) Na konci pokusu se provede hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.

          (c) Na konci pokusu se provede biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu nalačno (trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninamino transferáza (dříve glutamát- pyruvát transamináza) a aspartátamino transferáza séra (dříve glutamát-oxalacetát transamináza), ornithin dekarboxyláza, gama-glutamyl transpeptidáza, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro rozšíření spektra pozorovaných účinků.

          (d) Analýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.

        Pokud nejsou přiměřená dřívější kontrolní data, zváží se stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem expozic.

        1. 1.2.3.1 Pitva

          U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

          Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, plíce ( mají se vyjmout neporušeny, zvážit a fixovat vhodným médiem, tak aby se zachovala struktura plic - perfuzní fixace se považuje za vhodnou), tkáň nasofaryngu, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, hypofýza, štítná žláza/příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

        1. 1.2.3.2 Histopatologická vyšetření

          (a) Úplné histopatologické vyšetření respiračního systému a ostatních orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, která byla exponována nejvyšší koncentraci, a u zvířat kontrolní skupiny.

          (b) Je třeba vyšetřit všechny makroskopické léze.

          (c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.

          (d) Plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední koncentrací se mají histopatologicky vyšetřovat, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou koncentrací.

          (e) Používají-li se satelitní skupiny, provede se histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi, typ leze a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
      1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
      2. - podmínky pokusu:
      3. - popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis likvidace odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v experimentálním boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu.
      4. - údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají obsahovat tyto údaje:
        1. a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením,
        2. b) teplota a vlhkost vzduchu,
        3. c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu),
        4. d) povaha vehikula, pokud bylo užito,
        5. e) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
        6. f) medián velikostí částic (podle možnosti),
      1. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
      2. - úroveň bez účinku, pokud je možné ji stanovit,
      3. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
      4. - popis toxických nebo jiných účinků,
      5. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
      6. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
      7. - oftalmologické nálezy,
      8. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
      9. - biochemická vyšetření a jejich výsledky, (včetně výsledků případných analýz moči)
      10. - pitevní nálezy,
      11. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
      12. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné:

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.30 TESTOVÁNÍ CHRONICKÉ TOXICITY

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka je podávána obvykle 7 dnů v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po expozici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity.

    1. 1.2 Popis testovací metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Zvířata jsou chována při podmínkách chovu a krmení v jakých budou během pokusu a aspoň 5 dní před započetím testu. Před testem jsou zdravá, mladá zvířata náhodně rozdělena do exponovaných a kontrolních skupin.

      1. 1.2.2 Testovací podmínky
        1. 1.2.2.1 Experimentální zvířata

          Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce nebo jiné). Je třeba použít zdravé a mladé jedince běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Expozice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

        1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

          Pro každou úroveň dávky je třeba použít nejméně 40 zvířat (20 samic a 20 samců), stejně i pro kontrolní skupinu. Samice by měly být nullipary a neměly by být březí. Pokud je záměrem utratit některá zvířata před dokončením testu, je třeba použít přiměřeně vyšší počet zvířat.

          V případě jiných druhů zvířat (nehlodavců) je možné použít menší počet zvířat, ale ne méně než 4 od každého pohlaví ve skupině.

        1. 1.2.2.3 Dávky a frekvence expozic

          Je třeba použít aspoň 3 dávky a 1 kontrolní skupinu. Nejvyšší dávka by měla vyvolat jasné projevy toxicity bez nadměrné úmrtnosti. Nejnižší dávka by neměla vyvolat prokazatelné projevy toxicity. Střední dávky by měly být voleny ve středním pásmu mezi vysokými a nízkými dávkami. Výběr dávek by měl vzít v úvahu výsledky předchozích studií.

          Obvykle jsou zvířata exponována denně. V případě, že testovaná látka je podávána v pitné vodě nebo v potravě, je třeba zajistit, aby k ní měla zvířata stálý přístup.

        1. 1.2.2.4 Kontroly

          Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu k exponované skupině, vyjma expozice testované látce.

          Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

        1. 1.2.2.5 Způsob aplikace

          Dva hlavní způsoby aplikace jsou orální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu expozice člověka.

          Použití dermální aplikace vyvolává značné technické problémy. Chronická systémová toxicita v důsledku kožního vstřebání může být normálně odvozena z výsledku orálního testu a znalosti rozsahu kožního vstřebávání, odvozené z předchozích testů kožní toxicity.

          Orální studie

          Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jednou z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

          Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování 5 dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování 5 krát týdně je považováno za přijatelné.

          Inhalační studie

          Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

          Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace 6 hodin denně po 5 dnů v týdnu (přerušovaná expozice), nebo v návaznosti na možnou expozici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně 1 hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v prvním případě má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

          Volba přerušované nebo kontinuální expozice závisí na cílech studie a na lidské expozici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Například, výhody kontinuální expozice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností napájení a krmení během expozice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

          Expoziční komory

          Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma expozice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat stísněnost testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.

          1. Měření nebo monitorování zahrnuje:

            (a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně;

            (b) koncentrace: během denní expozice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15 % střední hodnoty;

            (c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2°C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně;

            (d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být reprezentativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během expozic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.

        1. 1.2.2.6 Trvání studie

          Expozice látce by měla trvat nejméně 12 měsíců.

      1. 1.2.3 Popis postupu
        1. 1.2.3.1 Pozorování

          Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Měla by být prováděna i dodatečná pozorování s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztrát. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.

          Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.

          Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za 4 týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

        1. 1.2.3.2 Hematologická vyšetření

          Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erytrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za 3 měsíce, 6 měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci ve vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců, respektive od 10 potkanů, na pohlaví z každé skupiny. Tam, kde je to možné, by měly být vzorky ve všech intervalech od stejných potkanů. Navíc je potřeba odebrat vzorek před testem od všech nehlodavců.

          Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.

          Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.

        1. 1.2.3.3 Analýza moči
          1. Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
            1. - vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
            2. - proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semikvantitativně),
            3. - mikroskopické vyšetření sedimentu (semikvantitativně).
        1. 1.2.3.4 Biochemické vyšetření
          1. V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno od týchž potkanů ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
            1. - celková koncentrace proteinů,
            2. - koncentrace albuminu,
            3. - testy na funkci jater (např. aktivita bazické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminázy (nyní známá jako sérová alanin aminotransferáza), glutamát acetát transaminázy (nyní známá jako sérová aspartát aminotransferáza), gama glutamyl transpeptidázy, ornitin dekarboxylázy,
            4. - metabolismus glycidů, např. krevní glukosa nalačno,
            5. - testy na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
        1. 1.2.3.5 Pitva

          Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v agónii stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Provádí se porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

          Orgány a tkáně se uchovávají pro histopatologické vyšetření. Obvykle se jedná o následující orgány a tkáně: mozek (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítnou žlázu a příštítná tělíska, thymus, trachea a plíce, srdce, aortu, slinnou žlázu, jatra, slezinu, ledviny, nadledviny, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, slinivku, gonády, akcesorní pohlavních orgány, samičí mléčné žlázy, kůži, svalovinu, periferní nervy, míchu (krční, hrudní a bederní), sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubů, a oči. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.

        2. Poznámka: štítná žláza s příštitnými tělísky ze všech nehlodavců musí být zvážena stejně jako mozek, játra, ledviny, nadledviny a gonády z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců.

          3. Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k dispozici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.

        1. 1.2.3.6 Histopatologie
          1. Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, se zkoumají mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:

            (a) mikroskopické vyšetření všech uchovaných orgánů a tkání s kompletním popisem všech lézí nalezených:

            1. 1. u všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během studie,
            2. 2. u všech zvířat ze skupiny s vysokou dávkou a kontrolní skupiny

            (b) orgány či tkáně ukazující abnormity způsobené nebo pravděpodobně způsobené testovanou látkou jsou zkoumány také ve skupinách s nižšími dávkami,

            (c) tam, kde výsledky svědčí pro významné zkrácení normální délky života zvířat nebo vyvolání účinků, které by mohly ovlivnit toxickou odpověď, skupina s nejblíže nižší dávkou se vyšetří popsaným způsobem,

            (d) informace o incidenci lézí, které se normálně vyskytují v použitém kmeni zvířat, ve stejných laboratorních podmínkách, tj. historické kontrolní údaje, jsou nezbytné pro správné posouzení významnosti změn pozorovaných u zvířat s aplikovanou látkou.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se sumarizují v formě tabulkách, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujících léze a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy lézí. Výsledky by měly být vyhodnoceny odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o testu bude obsahovat následující informace:
      1. - živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
      2. - podmínky testu,
        1. popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu,
      1. - údaje o expozici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. standardní odchylka) a měly by zahrnovat:

        (a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením

        (b) teplotu a vlhkost vzduchu

        (c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu)

        (d) povahu vehikula, je-li použito

        (e) skutečné koncentrace v dýchací zóně

        (f) mediány velikosti částic (je-li to relevantní)

      1. - dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
      2. - údaje o toxické odpovědi podle pohlaví a dávky,
      3. - neúčinná (dávková) úroveň,
      4. - doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce,
      5. - popis toxických a jiných účinků,
      6. - doba, kdy byl pozorován každý abnormální příznak a jeho další vývoj,
      7. - data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
      8. - oftalmologické nálezy,
      9. - použité hematologické testy a výsledky,
      10. - testy klinické biochemie a všechny výsledky (včetně výsledků analýzy moči),
      11. - pitevní nálezy,
      12. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
      13. - statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.31 STUDIE PRENATÁLNÍ VÝVOJOVÉ TOXICITY

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a).
    1. 1.1 ÚVOD

      Tato metoda zkoušení vývojové toxicity je určena k získání všeobecných informací týkajících se účinku prenatální expozice na březí pokusné zvíře a na organismus vyvíjející se v děloze; tyto informace mohou zahrnovat jak hodnocení účinku na matku, tak i vliv na uhynutí, strukturální odchylky nebo změněný růst plodu. I když funkční poruchy tvoří významnou část vývoje, nejsou součástí této metody. Zkoušky na tyto poruchy mohou být prováděny v samostatné studii nebo jako doplněk této studie pomocí zkušební metody pro studii vývojové neurotoxicity. Informace o zkoušení funkčních poruch a jiných postnatálních účinků lze v případě potřeby získat z dvougenerační zkoušky toxicity pro reprodukci a zkoušky vývojové neurotoxicity.

      Tato zkušební metoda může ve specifických případech vyžadovat určitou úpravu na základě specifických znalostí např. fyzikálně-chemických nebo toxikologických vlastností zkoušené látky. Tato úprava je přijatelná, jestliže přesvědčivé vědecké důkazy svědčí o tom, díky této úpravě bude mít zkouška vyšší vypovídací hodnotou. V takovém případě je třeba tyto vědecké důkazy pečlivě zdokumentovat ve zprávě o studii.

    1. 1.2 DEFINICE

      Vývojová toxikologie: studie nepříznivých účinků na vyvíjející se organismus, které mohou vyplývat z expozice před početím, během prenatálního vývoje nebo v postnatálním období až do doby pohlavní zralosti. Hlavní projevy vývojové toxicity zahrnují 1)úhyn organismu, 2) strukturální odchylky, 3) změněný růst a 4) funkční poruchu. Vývojová toxikologie se původně nazývala teratologie.

      Nepříznivý účinek: jakákoliv odchylka od normálního stavu spojená s aplikací, která snižuje schopnost organismu přežít, rozmnožovat se nebo se přizpůsobit prostředí. Pokud jde o vývojovou toxikologii v nejširším slova smyslu, zahrnuje tento pojem jakýkoliv účinek, který brání normálnímu vývoji plodu, a to jak před narozením, tak i po něm.

      Změněný růst: změna hmotnosti nebo velikosti orgánu nebo těla u potomstva.

      Odchylky (anomálie): strukturální změny ve vývoji, které zahrnují jak malformace, tak i odchylky7a).

      Malformace/velká odchylka: strukturální změna považovaná za škodlivou pro pokusné zvíře (může být i letální); obvykle je vzácná.

      Odchylka/malá odchylka: strukturální změna, která nemá žádný nebo má jen malý škodlivý účinek na pokusné zvíře; může být přechodná a u kontrolní populace se může vyskytovat poměrně často.

      Zárodek: celkové množství derivátů oplodněného vajíčka v jakékoliv fázi vývoje od oplodnění až do narození, včetně dalších zárodečných membrán, embrya nebo plodu.

      Implantace (nidace): přichycení blastocysty k epitelové výstelce dělohy, včetně její penetrace do děložního epitelu a zahnízdění v děložní sliznici.

      Embryo: raná nebo vývojová fáze organismu, a to zvláště plod vyvíjející se po oplodnění vajíčka poté, co se objeví dlouhá osa, a dokud nejsou přítomné všechny hlavní struktury.

      Embryotoxicita: toxicita škodlivá pro normální strukturu, vývoj, růst nebo životaschopnost embrya.

      Fétus: nenarozený potomek v post-embryonálním období.

      Fetotoxicita: toxicita škodlivá pro normální strukturu, vývoj, růst nebo životaschopnost plodu.

      Potrat: předčasné vyloučení produktů oplodnění – embrya nebo plodu neschopného života – z dělohy.

      Resorpce: zárodek, který po implantaci do dělohy později odumřel a vstřebává se nebo se již vstřebal.

      Raná resorpce: důkaz o zahnízdění (implantaci) bez rozeznatelného embrya/plodu.

      Pozdní resorpce: mrtvé embryo nebo plod se zevními degenerativními změnami.

    1. 1.3 REFERENČNÍ LÁTKA

      Žádná.

    1. 1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

      Obvykle se zkušební látka podává březím pokusným zvířatům od implantace až do dne před plánovaným usmrcením, který by se měl co nejvíce přiblížit očekávanému dni vrhu, aniž se riskuje ztráta údajů v důsledku předčasného vrhu. Zkušební metoda není určena výhradně ke zkoumání období organogeneze (např. 5. – 15. den u hlodavce a 6. – 18. den u králíka), ale popřípadě rovněž ke zkoumání účinků před implantací, pro celé období gestace a až do dne před císařským řezem. Krátce před císařským řezem se samice usmrtí, prozkoumá se děložní obsah a u plodů se vyhodnotí zevní viditelné anomálie, změny měkkých tkání a skeletu.

    1. 1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
      1. 1.5.1 Výběr živočišných druhů

        Doporučuje se provádět zkoušení s nejvhodnějšími druhy a využívat laboratorní druhy a kmeny, které se běžně používají při zkoušení prenatální vývojové toxicity. Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan a upřednostňovaným druhem nehlodavce je králík. Použití jiného druhu je třeba odůvodnit.

      1. 1.5.2 Podmínky chovu a krmení

        Teplota ve zkušební místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C pro hlodavce a (18 ± 3)°C pro králíky. Relativní vlhkost by měla být alespoň 30 %, neměla by však překročit 70 % během čištění místnosti a cílem je hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody.

        Páření by mělo probíhat v klecích vhodných k tomuto účelu v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak. I když se dává přednost individuálnímu chovu spářených pokusných zvířat, přípustný je rovněž chov v malých skupinkách.

      1. 1.5.3 Příprava pokusných zvířat

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). Pokusná zvířata by měla být charakterizována podle druhu, kmenu, původu, pohlaví, hmotnosti nebo stáří. Je-li to možné, měla by mít pokusná zvířata ze všech testovaných skupin stejnou hmotnost a věk. Pro každou úroveň dávek se použijí mladé dospělé samice, které by měly být nullipary. Samice se spáří se samci stejného druhu a kmene a nemělo by docházet k páření sourozenců. U hlodavců je nultým dnem gestace den, kdy se pozoruje vaginální zátka nebo sperma; u králíků je dnem 0 obvykle den páření nebo umělé inseminace, pokud se tato metoda používá. Oplodněné samice se náhodným výběrem rozdělí do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Každému pokusnému zvířeti se přiřadí jednoznačné identifikační číslo. Náhodným výběrem se oplodněné samice rozdělí do kontrolních a experimentálních skupin, a jsou-li samice pářené v sadách, rozdělí se pokusná zvířata z jednotlivých sad rovnoměrně do všech skupin. Stejně tak se do všech skupin rozdělí samice oplodněné stejným samcem.

    1. 1.6 POSTUP
      1. 1.6.1 Počet a pohlaví pokusných zvířat

        Každá experimentální a kontrolní skupina by měla obsahovat dostatečný počet samic, abychom při pitvě získali přibližně 20 samic s implantací plodu. Skupiny s méně než 16 pokusnými zvířaty s implantací plodu nejsou vhodné. Mortalita samic nemusí nutně znamenat znehodnocení studie za předpokladu, že nepřekročí přibližně 10 %.

      1. 1.6.2 Příprava dávek

        Pokud se pro usnadnění dávkování používá vehikulum nebo jiná přísada, je třeba vzít v úvahu následující typické znaky: vliv na absorpci, distribuci, metabolismus a retenci nebo vylučování zkoušené látky; vliv na chemické vlastnosti zkoušené látky, která může pozměnit svoje toxické znaky, a vliv na spotřebu krmiva nebo vody anebo nutričního stavu pokusných zvířat. Vehikulum by nemělo být ani vývojově toxické, ani by nemělo mít vliv na rozmnožování.

      1. 1.6.3 Dávkování

        Zkoušená látka se obvykle podává denně od implantace (např. pátý den po spáření) až do dne před plánovaným císařským řezem. Pokud z případných předběžných studií nevyplývá vysoký potenciál předimplantační ztráty, lze aplikaci prodloužit tak, aby zahrnovala celé období gestace, od spáření až do dne před plánovaným usmrcením. Je známo, že nevhodné zacházení nebo stres během březosti může vést k prenatální ztrátě. S cílem zabránit prenatálním ztrátám z důvodů, které nejsou spojeny s expozicí, je nutné zamezit jak nadbytečné manipulaci s pokusnými zvířaty, tak i stresu způsobenému zevními faktory, jako je např. hluk.

        Použijí se alespoň tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Zdravá pokusná zvířata se náhodným výběrem rozdělí do kontrolních a experimentálních skupin. Úrovně dávek se rozloží tak, aby byly toxické účinky odstupňovány. Pokud neexistuje žádné omezení fyzikální/chemickou podstatou nebo biologickými vlastnostmi zkoušené látky, zvolí se nejvyšší dávka s cílem vyvolat určitou vývojovou toxicitu nebo toxicitu pro matku (klinické znaky nebo snížení tělesné hmotnosti), ale nikoliv uhynutí nebo silné bolesti. Alespoň jedna střední úroveň dávky by měla vyvolat minimální zjistitelné toxické účinky. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádnou prokazatelnou toxicitu pro matku ani vývojovou toxicitu. S ohledem na prokázání jakékoli reakce související s dávkováním a s úrovní dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL) by se měla zvolit sestupná posloupnost úrovní dávek. Pro nastavení sestupných úrovní dávek jsou obvykle optimální dvoj- až čtyřnásobné intervaly a často je vhodnější přidání čtvrté exponované skupiny než používání velkých intervalů mezi dávkami (např. lišících se faktorem 10). Ačkoliv je cílem stanovit hodnotu NOAEL pro samici, přijatelné jsou rovněž studie, které tuto hodnotu nestanoví.7a)

        Při výběru úrovní dávek je třeba brát v úvahu jakékoliv existující údaje o toxicitě a také jako další informace o metabolismu a toxikokinetice zkoušené látky nebo látek příbuzných. Tyto informace pomohou rovněž při prokazování přiměřenosti dávkovacího režimu.

        Použije se souběžná kontrolní skupina. Tato skupina by měla tvořit zdánlivě léčenou kontrolní skupinu nebo kontrolní skupinu s vehikulem, pokud se vehikulum při podávání zkoušené látky používá. Všem skupinám se podává stejné množství zkoušené látky nebo vehikula. S pokusnými zvířaty v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) se zachází stejně jako s pokusnými zvířaty v experimentální skupině. Kontrolní skupina s vehikulem by měla dostat vehikulum v nejvyšším používaném množství (jako u experimentální skupiny s nejnižší dávkou).

      1. 1.6.4 Limitní zkouška

        Pokud zkouška na jedné úrovni dávky v množství alespoň 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti na den při orálním podávání nevyvolá při použití postupů předepsaných pro tuto studii žádnou zjistitelnou toxicitu ani u březích pokusných zvířat ani u jejich plodů, a pokud se neočekává účinek ani na základě existujících údajů (např. o sloučeninách s podobnou strukturou nebo metabolismem), není nezbytné uvažovat o kompletní studii využívající tří úrovní dávek. Je možné, že předpokládaná expozice u člověka si vyžádá použití vyšší orální dávky v limitní zkoušce. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná úroveň expozice dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušené látky (např. kožní aplikace by neměla způsobit závažnou lokální toxicitu).

      1. 1.6.5 Aplikace dávek

        Zkoušená látka nebo vehikulum se obvykle podává orálně intubací. Pokud se používá jiný způsob aplikace látky, měl by experimentátor volbu zdůvodnit a objasnit, přičemž může být nezbytné provést odpovídající změny7a). Zkoušená látka se podává každý den přibližně ve stejnou dobu.

        Obvykle by dávka pro jednotlivá pokusná zvířata měla vycházet z aktuální zjištěné tělesné hmotnosti. Je však nutné věnovat velkou pozornost úpravě dávky během posledního trimestru březosti. Dávka by se měla zvolit na základě existujících údajů, aby se zabránilo nadměrné toxicitě u samic. Pokud je však u ošetřovaných samic zaznamenána nadměrná toxicita, tato pokusná zvířata se humánním způsobem usmrtí. Pokud několik březích pokusných zvířat vykazuje známky nadměrné toxicity, mělo by se zvážit usmrcení této skupiny. Je-li látka podávána prostřednictvím žaludeční sondy, měla by se pokusným zvířatům podávat ve formě jediné dávky pomocí hadičky k výplachu žaludku nebo vhodné intubační kanyly. Maximální množství tekutiny, které lze jednorázově podávat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by nemělo překročit 1 ml/ 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Pokud se jako vehikulum používá kukuřičný olej, nemělo by množství překročit 0,4 ml/100 g tělesné hmotnosti. Kolísání v množství zkoušené látky by se měla omezit nastavením koncentrací tak, aby se zajistilo konstantní množství na všech úrovních dávek.

      1. 1.6.6 Sledování samic

        Klinická pozorování se provádějí a zaznamenávají minimálně jednou denně, a to každý den nejlépe ve stejnou dobu, a přihlédne se k době vrcholícího předpokládaného účinku po dávkování. Zaznamená se stav pokusných zvířat včetně mortality, agónie, relevantních změn chování a všech příznaků zjevné toxicity.

      1. 1.6.7 Tělesná hmotnost a spotřeba krmiva

        Pokusná zvířata se zváží během nultého dne gestace anebo nejpozději 3. dne gestace, pokud externí chovatel dodává pokusná zvířata spářená ve stejnou dobu a dále během prvního dne podávání látky, minimálně každý 3. den v období podávání látky a v den plánovaného usmrcení.

        Spotřeba krmiva se zaznamená v třídenním intervalu a měla by se shodovat se dny zjišťování tělesné hmotnosti.

      1. 1.6.8 Pitva

        Samice se usmrtí jeden den před očekávaným dnem vrhu. Samice vykazující známky potratu nebo předčasného vrhu předcházejícího plánovanému usmrcení se usmrtí a podrobí důkladnému makroskopickému vyšetření.

        Samice se v okamžiku usmrcení nebo úhynu během studie makroskopicky vyšetří na strukturní odchylky nebo patologické změny. S cílem minimalizovat neobjektivnost se vyhodnocení samic během císařského řezu a následná fetální analýza provedou pokud možno bez znalosti experimentální skupiny.

      1. 1.6.9 Vyšetření děložního obsahu

        Okamžitě po usmrcení nebo co nejdříve po uhynutí se samicím vyjme děloha a zjistí se stav březosti. Dělohy, které nesvědčí o graviditě, se dále vyšetří (např. pomocí barvení sulfidem amonným u hlodavců a pomocí Salewského barvení nebo vhodnou alternativní metodou u králíků) a potvrdí se negravidní stav7a).

        Gravidní děloha včetně děložního hrdla se zváží. Hmotnost gravidní dělohy by se neměla zjišťovat u pokusných zvířat, která během studie uhynula.

        U březích pokusných zvířat se zjistí počet žlutých tělísek.

        U děložního obsahu se vyšetří počet úhynů embrya nebo plodu a počet životaschopných plodů. Popíše se stupeň resorpce, aby bylo možné odhadnout relativní dobu uhynutí zárodku (viz část 1.2).

      1. 1.6.10 Vyšetření plodů

        Zjistí se pohlaví a tělesná hmotnost každého plodu.

        U každého plodu se vyšetří zevní odchylky7a).

        U plodů se vyšetří změny kostry a měkkých tkání (např. odchylky a malformace nebo anomálie)7a). Kategorizace fetálních změn je vhodná, ale nikoli nezbytná. Pokud se kategorizace provede, měla by se jasně stanovit kritéria definování jednotlivých kategorií. Zvláštní pozornost je třeba věnovat rozmnožovací soustavě, která se vyšetří na přítomnost známek změněného vývoje.

        U hlodavců se připraví přibližně polovina každého vrhu, u něhož se vyšetří změny skeletu. Zbytek se připraví a vyšetří na přítomnost změn měkkých tkání pomocí uznaných nebo vhodných metod postupného krájení histologických řezů nebo důkladné pitvy.

        U nehlodavců, např. králíků, se prozkoumají jak změny měkkých tkání, tak změny skeletu všech plodů. Opatrným oddělením tkání se u těchto plodů vyšetří změny měkkých tkání, přičemž pitva může zahrnovat i postupy pro další vyhodnocení vnitřní stavby srdce7a). Hlavy poloviny plodů zkoumaných tímto způsobem se oddělí a použijí se k vyhodnocení změn měkkých tkání (včetně očí, mozku, nosních dutin a jazyka), a to pomocí standardních metod postupného segmentování7a) nebo stejně citlivých metod. Těla těchto i zbývajících neporušených plodů se připraví a vyšetří na přítomnost změn skeletu za použití stejných metod popsaných pro hlodavce.

  1. 2 DATA
    1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

      Výsledky se zaznamenají do tabulky samostatně pro samice a pro jejich potomky a u každé pokusné skupiny a každé generace se uvede počet pokusných zvířat na začátku zkoušky, počet pokusných zvířat uhynulých během zkoušky nebo usmrcených z humánních důvodů, doba úhynu nebo humánního usmrcení, počet březích samic, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis příznaků zjištěné toxicity včetně nástupu, trvání a závažnosti případných toxických účinků, typy pozorování embryí/plodů a všechny důležité údaje o vrhu.

      Numerické výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou, přičemž jako jednotka analýzy dat se použije vrh. Použije se všeobecně uznávaná statistická metoda; zvolí se jako součást návrhu studie a musí být zdůvodněna. Rovněž se uvedou údaje získané u pokusných zvířat, která nepřežila až do plánovaného usmrcení. Tyto údaje lze v případě potřeby zahrnout do skupinového průměru. Význam údajů získaných od těchto pokusných zvířat i jejich zahrnutí nebo nezahrnutí do průměru skupiny by měly být odůvodněny a individuálně posouzeny.

    1. 2.2 HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
      1. Výsledky studie prenatální vývojové toxicity se vyhodnotí na základě zjištěných účinků. Vyhodnocení musí zahrnovat následující informace:
        1. — výsledky zkoušky u samic a embrya/plodu, včetně hodnocení vazeb nebo jejich absence mezi expozicí pokusných zvířat zkoušené látce a výskytem a závažností všech nálezů,
        2. — kritéria používaná pro kategorizaci zevních změn, změn měkkých tkání a skeletu u plodu, pokud byla tato kategorizace provedena,
        3. — popřípadě předchozí kontrolní údaje k snazšímu objasnění výsledků studie,
        4. — číselné hodnoty používané při výpočtu všech procentuálních hodnot nebo koeficient,
        5. — případně odpovídající statistickou analýzu výsledků studie, která by měla zahrnovat dostatečné informace o metodě analýzy, aby nezávislý posuzovatel mohl tuto analýzu přehodnotit a zrekonstruovat.

        V jakékoliv studii, která prokazuje nepřítomnost toxických účinků, je třeba zvážit další zkoušky pro zjištění absorpce a biologické dostupnosti zkoušené látky.

    1. 2.3 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      Studie prenatální vývojové toxicity poskytne informace o účinku opakované expozice látce na březí samice a na nitroděložní vývoj jejich potomstva. Výsledky studie by měly být objasněny v souvislosti s výsledky ze subchronických, reprodukčních, toxikokinetických a dalších studií. Vzhledem k tomu, že se klade důraz jak na výslednou všeobecnou toxicitu z hlediska matky, tak i na vývojovou toxicitu, umožní výsledky této studie do určité míry rozlišit mezi vývojovými účinky vyskytujícími se v nepřítomnosti všeobecné toxicity a mezi účinky vyvolanými pouze na úrovních, které jsou toxické i pro březí pokusná zvířata7a).

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9),10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace.
      1. Zkoušená látka:
        1. — fyzikální povaha, a je-li to důležité, fyzikálně-chemické vlastnosti,
        2. — identifikace včetně čísla CAS, je-li známo nebo přiděleno,
        3. — čistota.
      1. Vehikulum (pokud bylo použito):
        1. — zdůvodnění výběru jiného vehikula, pokud není použita voda.
      1. Pokusná zvířata:
        1. — použité druhy a kmeny,
        2. — počet a stáří pokusných zvířat,
        3. — původ, podmínky chovu, krmivo atd.,
        4. — individuální hmotnosti pokusných zvířat na začátku zkoušky.
      1. Zkušební podmínky:
        1. — zdůvodnění výběru úrovně dávky,
        2. — podrobnosti o přípravě složení zkoušené látky/krmiva, dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
        3. — podrobné údaje o podávání zkoušené látky,
        4. — v případě potřeby přepočet koncentrace zkoušené látky (ppm) v krmivu/pitné vodě na skutečnou dávku (mg/kg tělesné hmotnosti na den), je-li to možné,
        5. — podmínky prostředí,
        6. — podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.
      1. Výsledky:
        1. Údaje o příznacích toxicity u matky podle dávky, např.:
          1. — počet pokusných zvířat na začátku zkoušky, počet pokusných zvířat, která přežila, počet březích pokusných zvířat, počet pokusných zvířat, která potratila, a počet pokusných zvířat, která předčasně vrhla,
          2. — den úhynu během studie anebo zda pokusná zvířata přežila až do dne usmrcení,
          3. — uvedou se údaje o pokusných zvířatech, která nepřežila do plánovaného usmrcení, nezahrnou se však do statistických srovnání dat pro skupiny,
          4. — den zjištění každého abnormálního klinického příznaku a jeho následný průběh,
          5. — tělesná hmotnost, změna tělesné hmotnosti a hmotnosti gravidní dělohy, včetně případných údajů o změně tělesné hmotnosti korigované o hmotnost gravidní dělohy,
          6. — spotřeba krmiva, měří-li se, spotřeba vody,
          7. — pitevní nálezy včetně děložní hmotnosti,
          8. — zaznamenají se hodnoty NOAEL pro účinky na matku a vývojové účinky.
        1. Ukazatele vývojové toxicity podle dávky pro vrhy s implantáty, včetně
          1. — počtu žlutých tělísek,
          2. — počtu zahnízdění, počtu a procenta živých a mrtvých plodů a resorpce,
          3. — počtu procentuálního podílu pre- a post-implantačních ztrát.
        1. Ukazatele vývojové toxicity podle dávky pro vrhy s živými plody, včetně
          1. — počtu a procentuálního podílu živých potomků,
          2. — poměru pohlaví,
          3. — fetální tělesné hmotnosti, pokud možno podle pohlaví a pro obě pohlaví dohromady,
          4. — zevních malformací, malformací měkkých tkání a skeletu a jiných významných odchylek,
          5. — případně kritérií kategorizace,
          6. — celkového počtu a procentuálního podílu plodů a vrhů s jakýmikoli zevními a kosterními odchylkami, odchylkami měkkých tkání a rovněž typů a výskytů individuálních anomálií a jiných významných odchylek.

    Diskuse a interpretace výsledků.

    Závěry.

B.32 TEST KARCINOGENITY