Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

zrušený předpis

Zaznamenají se rovněž nezvyklé projevy, pokud jde o polohu těla, úroveň aktivity (např. snížené nebo zvýšené zkoumání standardního pozorovacího prostoru) a koordinaci pohybu. Zaznamenají se také změny chůze (např. kolébání, ataxie), polohy (nahrbení hřbetu) a reakce na manipulaci, umístění a další stimuly související s prostředím, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, křečí nebo třesu, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění, nezvyklých pohybů hlavy nebo opakovaného kroužení) nebo zvláštního chování (např. kousání nebo nadměrného olizování, sebepoškozování, pohybu pozpátku, vydávání zvuků) anebo agresivity.

  1. 1.6.1.3 Funkční zkoušky

    Podobně jako podrobná klinická pozorování se u jednotlivých pokusných zvířat vybraných k těmto účelům provedou i funkční zkoušky - nejprve před expozicí a potom vícekrát po jejím provedení (viz tabulka 12). Četnost funkčního testování závisí rovněž na trvání studie (viz tabulka 13). Mimo dobu pozorování stanovenou v tabulce 13 se provede také funkční pozorování satelitní zotavovací skupiny, a to těsně před plánovaným utracením. Funkční zkoušky zahrnují reakce na různé smyslové podněty [např. sluchové, zrakové a dotykové (případně taktilní) podněty7a)], hodnocení síly stisku7a) a hodnocení motorické aktivity7a). Motorická aktivita se měří pomocí automatického přístroje schopného odhalit jak snížení, tak i zvýšení této aktivity. Pokud se použije jiný systém, měl by být kvantitativní a je třeba prokázat jeho citlivost a spolehlivost. Každý přístroj je nutné otestovat, aby se zajistila jeho spolehlivost po celé časové období a homogenita s ostatními přístroji. Další podrobnosti o postupech, kterými se lze řídit, jsou uvedeny v příslušných odkazech. Pokud neexistují žádné údaje (např. údaje o vztahu mezi strukturou a biologickou aktivitou, epidemiologické údaje, jiné toxikologické studie), které by ukazovaly na potenciální neurotoxické účinky, je nutné za účelem podrobnějšího vyšetření těchto možných účinků zvážit začlenění specializovanějších zkoušek smyslových a motorických funkcí nebo učení a paměti. Další informace o specializovanějších zkouškách a jejich používání je uvedeno v literatuře.7a)

    Ve výjimečných případech lze pokusná zvířata vykazující známky toxicity v takové míře, která by významně narušila provedení funkční zkoušky, z této zkoušky vyřadit. Vyřazení těchto pokusných zvířat z funkčních zkoušek je nutné zdůvodnit.

  1. 1.6.2 Tělesná hmotnost a spotřeba krmiva a vody

    U studií s délkou trvání do 90 dnů se všechna pokusná zvířata váží alespoň jednou týdně a každý týden se rovněž provádí měření spotřeby krmiva (měření spotřeby vody se provádí tehdy, je-li zkoušená látka aplikována prostřednictvím tohoto média). U dlouhodobých studií se všechna pokusná zvířata váží alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou za 4 týdny. Během prvních 13 týdnů se měří spotřeba krmiva (měření spotřeby vody se provádí tehdy, je-li zkoušená látka aplikována prostřednictvím tohoto média) a poté přibližně v tříměsíčních intervalech, pokud si změny zdravotního stavu nebo změny tělesné hmotnosti nevyžádají jiný interval.

  1. 1.6.3 Oftalmologické vyšetření

    U studií delších než 28 dnů se před aplikací zkoušené látky a před ukončením studie provede oftalmologické vyšetření pomocí oftalmoskopu nebo jiného vhodného nástroje, a to nejlépe u všech pokusných zvířat, alespoň však u všech pokusných zvířat ze skupin s vysokou dávkou a z kontrolních skupin. Pokud se zjistí změny na očích nebo pokud klinické příznaky ukazují na nutnost vyšetření očí, vyšetří se všechna pokusná zvířata. U dlouhodobých studií se oftalmologické vyšetření provede ve 13. týdnu stáří pokusných zvířat. Oftalmologická vyšetření není nutné provádět tehdy, jsou-li již k dispozici údaje z jiných podobně dlouhých studií s podobnými úrovněmi dávek.

  1. 1.6.4 Hematologické a biochemické vyšetření

    Pokud se studie neurotoxicity provádí v kombinaci se studií systémové toxicity po opakované dávce, provede se hematologické vyšetření a stanovení klinických biochemických parametrů tak, jak je uvedeno v příslušné metodě studie systémové toxicity. Odebírání vzorků se provede tak, aby se minimalizovaly jakékoliv účinky na nervový systém a chování.

  1. 1.6.5 Histopatologie

    Neuropatologické vyšetření se navrhne tak, aby doplnilo a rozšířilo pozorování provedená v rámci této studie během fáze in vivo. Tkáně alespoň 5 pokusných zvířat každého pohlaví z každé skupiny (viz tabulka 12 a další odstavec) se fixují in situ za použití obecně uznávaných perfuzních a fixačních technik.7a) Zaznamenají se jakékoliv výrazné změny. Pokud se studie provádí jako samostatná studie neurotoxicity nebo studie charakterizující neurotoxické účinky, lze použít zbytek pokusných zvířat buď ke specifickým neurobehaviorálním,7a) neuropatologickým,7a) neurochemickým,7a) nebo elektrofyziologickým7a) postupům, které mohou doplnit zde popsané postupy a vyšetření, anebo zvýšit počet subjektů vyšetřovaných k histopatologickým účelům. Tyto doplňkové postupy jsou zvláště užitečné tehdy, pokud empirická pozorování nebo očekávané účinky ukazují na specifický typ nebo cílovou strukturu neurotoxicity.7a) Je také možné zbytek pokusných zvířat použít k běžným patologickým hodnocením, která jsou popsána v metodě studie po opakované dávce.

    U všech tkáňových vzorků zalitých parafínem se provede běžný postup barvení, např. pomocí hematoxylinu a eosinu (H&E), a mikroskopické vyšetření. Jsou-li pozorovány nebo existuje-li podezření na příznaky periferní neuropatie, vyšetří se vzorky periferních nervů zalitých do pryskyřic (vosků). Klinické příznaky mohou rovněž poukázat na další místa, která je nutné vyšetřit, nebo na nutnost použít speciální postupy barvení. Pokyny k určení dalších míst, která je třeba vyšetřit, lze nalézt v literatuře7a). K prokázání charakteristických typů patologické změny může přispět i odpovídající speciální barvení7a).

    U reprezentativních řezů centrálního a periferního nervového systému se provede histologické vyšetření.7a) Mezi vyšetřované oblasti obvykle patří: přední mozek, střední část mozku, včetně řezu hippocampem, střední mozek, mozeček, Varolův most, prodloužená mícha, oko se zrakovým nervem a sítnicí, mícha v oblasti cervikálního a lumbálního zesílení, dorsální kořenová ganglia, dorsální a ventrální kořenová vlákna, proximální část n. ischiadicus a proximální část n. tibialis (v oblasti kolena) a n tibialis z oblasti lýtkového svalu. Řezy míchy a periferních nervů by měly zahrnovat jak příčné, tak i podélné řezy. Pozornost je nutné věnovat uspořádání cév v oblasti nervového systému. Rovněž se vyšetří vzorky z kosterního svalstva, a to zvláště z lýtkového svalu. Zvláštní pozornost je nutné věnovat místům s buněčnou a vláknitou strukturou a těm strukturám v oblasti CNS a PNS, o nichž je známo, že na ně mají neurotoxické látky velký vliv.

    Informace o neuropatologických změnách, které obvyklé vyplývají z expozice toxickým látkám, lze nalézt v literatuře.7a) Doporučuje se postupné vyšetření tkáňových vzorků, při kterém se porovnají nejprve vzorky řezů ze skupiny s vysokou dávkou se vzorky řezů z kontrolní skupiny. Nejsou-li ve vzorcích z těchto skupin zjištěny žádné neuropatologické změny, není třeba provádět další analýzu. Jsou-li zjištěny ve skupině s vysokou dávkou neuropatologické změny, je třeba následně okódovat a vyšetřit vzorky ze všech potenciálně zasažených tkání ze skupin se střední a nízkou dávkou.

    Pokud je během kvalitativního vyšetření zjištěna přítomnost neuropatologických změn, provede se druhé vyšetření všech oblastí nervového systému, které vykazují tyto změny. Okódují se řezy ze všech dávkových skupin ze všech potenciálně zasažených oblastí a vyšetří v náhodném pořadí bez znalostí kódu. Zaznamená se četnost a závažnost všech lézí. Po zhodnocení všech oblastí ze všech dávkových skupin se kód odkryje a provede se statistická analýza za účelem vyhodnocení vztahu dávka-odezva. U každé leze se popíší příklady různých stupňů závažnosti.

    Neuropatologické výsledky se vyhodnotí v kontextu s pozorováním a měřením chování a rovněž spolu s dalšími údaji z předchozích a souběžných studií systémové toxicity zkoušené látky.

  1. 2 DATA
    1. 2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

      Uvedou se jednotlivá data. Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou experimentální nebo kontrolní skupinu uvede počet pokusných zvířat na začátku zkoušky, počet pokusných zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo počet pokusných zvířat utracených z humánních důvodů a doba uhynutí nebo humánního utracení, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis zjištěných příznaků toxicity, včetně doby nástupu, trvání, typu a závažnosti jakýchkoliv příznaků toxicity, počet pokusných zvířat vykazujících léze, včetně typu a závažnosti léze (lézí).

    1. 2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      Výsledky studie je třeba vyhodnotit z hlediska výskytu, závažnosti a korelace neurobehaviorálních a neuropatologických účinků (rovněž i neurochemických nebo elektrofyziologických účinků, jsou-li provedena doplňující vyšetření) a z hlediska dalších zjištěných nepříznivých účinků. Je-li to možné, je třeba vyhodnotit číselné výsledky vhodnými a obecně uznávanými statistickými metodami. Statistické metody je třeba zvolit během plánování studie.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu s příslušnými právními předpisy9),10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
      1. Zkoušená látka:
        1. — fyzikální vlastnosti (včetně isomerie, čistoty a fyzikálně-chemických vlastností),
        2. — údaje o identitě.
      1. Vehikulum (pokud bylo použito):
        1. — zdůvodnění volby vehikula.
      1. Pokusná zvířata:
        1. — použité druhy a kmen,
        2. — počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat,
        3. — původ, podmínky chovu, aklimatizace, krmivo atd.,
        4. — hmotnost jednotlivých pokusných zvířat na začátku zkoušky.
      1. Zkušební podmínky:
        1. — podrobnosti o úpravě směsi zkoušené látky či přípravě krmiva, dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
        2. — specifikace aplikovaných dávek, včetně podrobností o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikovaného materiálu,
        3. — podrobnosti o způsobu aplikace zkoušené látky,
        4. — zdůvodnění výběru úrovní dávek,
        5. — zdůvodnění způsobu aplikace a trvání expozice,
        6. — přepočet koncentrace zkoušené látky v krmivu nebo pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg/kg tělesné hmotnosti,
        7. — podrobnosti o krmivu a kvalitě vody.
      1. Pozorovací a zkušební postupy:
        1. — podrobnosti o přiřazení pokusných zvířat z jednotlivých skupin do podskupin s perfuzí,
        2. — podrobnosti o systémech posuzování, včetně kritérií a posuzovacích stupnic pro jednotlivá měření v rámci podrobných klinických pozorování,
        3. — podrobnosti o funkčních testech pro měření reakce různých smyslových orgánů na smyslové podněty (např. sluchové, zrakové a dotykové), pro hodnocení síly úchopu, motorické aktivity (včetně podrobností o automatických zařízeních pro zjišťování aktivity) a další použité postupy,
        4. — podrobnosti oftalmologických vyšetření, hematologických a biochemických vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
        5. — podrobnosti o specifických neurobehaviorálních, neuropatologických, neurochemických nebo elektrofyziologických postupech.
      1. Výsledky:
        1. — tělesná hmotnost a její změny, včetně tělesné hmotnosti v době utracení,
        2. — spotřeba krmiva a případně vody,
        3. — údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávek, včetně popisu příznaků toxicity nebo mortality,
        4. — povaha, závažnost a trvání (doba nástupu a následný průběh) podrobných klinických nálezů (zda jsou vratné nebo nevratné),
        5. — podrobný popis všech výsledků funkčních testů,
        6. — pitevní nálezy,
        7. — podrobný popis všech neurobehaviorálních, neuropatologických a neurochemických nebo elektrofyziologických výsledků, jsou-li k dispozici,
        8. — údaje o absorpci a metabolismu, jsou-li k dispozici,
        9. — statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné.
      1. Diskuse a interpretace výsledků.
        1. — informace o závislosti účinku na dávce,
        2. — význam jakýchkoliv dalších toxických účinků pro závěry týkající se neurotoxického potenciálu zkoušené chemické látky,
        3. — dávková úroveň bez pozorovatelných nepříznivých účinků (NOAEL),
        4. — je žádoucí uvést konkrétní vyjádření o celkové neurotoxicitě zkoušené chemické látky.

    Závěry.

    Tabulka 12:
    Minimální počet pokusných zvířat na skupinu, provádí-li se studie neurotoxicity samostatně nebo v kombinaci s dalšími studiemi

    Tabulka 12: Minimální počet pokusných zvířat na skupinu, provádí-li se studie neurotoxicity samostatně nebo v kombinaci s dalšími studiemi
    TYP PROVEDENÉ STUDIE NEUROTOXICITY:
    Samostatná studieKombinovaná studie s 28 denní studiíKombinovaná studie s 90 denní studiíKombinovaná studie se studií chronické toxicity
    Počet pokusných zvířat na skupinu10 samců a 10 samic10 samců a 10 samic15 samců a 15 samic25 samců a 25 samic
    Počet pokusných zvířat vybraných k funkčnímu testování, včetně podrobných klinických pozorování10 samců a 10 samic10 samců a 10 samic10 samců a 10 samic10 samců a 10 samic
    Počet pokusných zvířat vybraných k perfuzi in situ a neurohistopatologickému vyšetření5 samců a 5 samic5 samců a 5 samic5 samců a 5 samic5 samců a 5 samic
    Počet pokusných zvířat vybraných k pozorování toxicity po opakované dávce subchronické/chronické, k hematologickému vyšetření, klinickému biochemickému vyšetření, k histopatologickému vyšetření atd., jak je uvedeno v příslušných Doporučeních5 samců a 5 samic10 samců† a 10 samic†20 samců† a 20 samic†
    Případná doplňující pozorování5 samců a 5 samic
    † Zahrnuto je pět pokusných zvířat vybraných k funkčnímu testování a podrobnému klinickému pozorování jako součást studie neurotoxicity.

    Tabulka 13:
    Četnost klinických pozorování a funkčních testů

    Tabulka 12: Minimální počet pokusných zvířat na skupinu, provádí-li se studie neurotoxicity samostatně nebo v kombinaci s dalšími studiemi Tabulka 13: Četnost klinických pozorování a funkčních testů
    Typ pozorováníDélka studie
    akutní28 denní90 denníchronická
    U všech pokusných zvířatCelkový zdravotní stavDenněDenněDenněDenně
    Mortalita/morbiditaDvakrát denněDvakrát denněDvakrát denněDvakrát denně
    U všech pokusných zvířat vybraných k funkčním pozorovánímPodrobná klinická pozorování- před první expozicí
    - v průběhu 8 h po podání dávky v době odhadovaného nejvyššího účinku
    - 7. a 14. den po skončení dávkování    		- před první expozicí
    - poté jednou týdně    		- před první expozicí
    - jednou během prvního nebo druhého týdne expozice
    - poté měsíčně    		- před první expozicí
    - jednou na konci prvního měsíce expozice
    - poté každé tři měsíce
    Funkční testy- před první expozicí
    - v průběhu 8 h po podání dávky v době odhadovaného nejvyššího účinku
    - 7. a 14. den po skončení dávkování    		- před první expozicí
    - během čtvrtého týdne aplikace co nejblíže ke konci období expozice    		- před první expozicí
    - jednou během prvního nebo druhého týdne expozice
    - poté měsíčně    		- před první expozicí
    - jednou na konci prvního měsíce expozice
    - poté každé tři měsíce
  1. 1) Směrnice Komise 88/302/EHS, kterou se po deváté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 133 1988).
  2. 2) Směrnice Komise 92/69/EHS, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 383 A 1992, metoda B.1 zrušena směrnicí 2001/59/ES).
  3. 3) Směrnice Komise 93/21/EHS, kterou se po osmnácté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 110 1993).
  4. 4) Směrnice Komise 96/54/ES, kterou se po dvacáté druhé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 248 1996).
  5. 5) Směrnice Komise 2000/32/ES, kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000, metoda B13/14, B.39 a B.41 jsou upraveny směrnicí Rady 2001/59/ES).
  6. 6) Směrnice Komise 2000/33/ES, kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000).
  7. 7) Směrnice Komise 2001/59/ES, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 225 2001).
  8. 7a) Směrnice Komise 2004/73/ES, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 152 2004).
  9. 8) § 2 zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů.
  10. 9) Zákon č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání, ve znění zákona č. 162/1993 Sb., zákona č. 193/1994 Sb., zákona č. 243/1997 Sb., zákona č. 30/1998 Sb. a zákona č. 77/2004 Sb.
  11. 10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.