Vyhláška Ministerstva zemědělství, kterou se provádí zákon č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění zákona č. 244/2000 Sb.

Příloha č. 21

ZKOUŠENÍ KONZERVAČNÍ ÚČINNOSTI

1. 1. Zkoušení konzervační účinnosti
   1. 1.1. Kontrolní a pokusná zkouška konzervační účinnosti se zakládají současně.
   2. 1.2. Při zahájení konzervačních zkoušek se krmiva, na kterých se zkouška provádí a konzervační látky, ověřují analyticky.
   3. 1.3. Pro kontrolní a pokusnou zkoušku konzervační účinnosti u statkových objemných krmiv se používá stejné krmivo, tj. shodný druh, shodné vegetační stádium, shodná mechanická úprava (délka řezanky, uložení, dusání, zatížení, uzavření atd.).
   4. 1.4. Aplikace zkoušené konzervační látky se provádí podle návodu, uvedeného žadatelem o registraci. Dávkuje se rovnoměrně.
   5. 1.5. Krmivo, použité ke konzervační zkoušce, se váží.
   6. 1.6. Doba zakládání kontrolní a pokusné konzervační zkoušky u statkových objemných krmiv trvá nejvýše 24 hodin.
   7. 1.7. Konzervační zkoušky, s výjimkou konzervačních zkoušek u statkových objemných krmiv, se zakládají na dobu, která je stanovena jako maximální doba účinnosti zkoušené konzervační látky.
   8. 1.8. V průběhu kontrolní a pokusné konzervační zkoušky a v poslední den zkoušky se krmiva ověřují analyticky.
   9. 1.9. V průběhu konzervační zkoušky se sleduje a zaznamenává teplota, podle povahy zkoušené konzervační látky i vlhkost vnějšího prostředí. V průběhu konzervační zkoušky objemných krmiv se sleduje a zaznamenává pH.
   10. 1.10. V průběhu konzervační zkoušky u objemných statkových krmiv se zjišťují ztráty vzniklé odtokem silážních šťáv.
   11. 1.11. Po skončení konzervační zkoušky u objemných statkových krmiv se stanoví analyticky obsah živin, pH a obsah kyselin, vzniklých fermentačním procesem. Krmivo se hodnotí senzoricky.
   12. 1.12. O průběhu konzervačních zkoušek se vede evidence. Veškeré dílčí výsledky se zpracovávají do souhrnné dokumentace o zkoušení konzervační účinnosti.

Příloha č. 22

ZKOUŠENÍ JAKOSTI ŽIVOČIŠNÝCH PRODUKTŮ

1. 1. Zkoušení jakosti masa
   1. 1.1. Senzorické hodnocení jakosti masa

      Podstata senzorického hodnocení spočívá v subjektivním posouzení vzhledu, vůně, chuti, šťavnatosti, křehkosti, jemnosti eventuálně dalších vlastností zkoušených vzorků masa, získaných od zvířat kontrolních a pokusných skupin.

      1. 1.1.1. Odborné znalecké posouzení provádí nejméně 5 posuzovatelů, z toho 3 stálí, otestovaní jako způsobilí, a dva další. Za optimální se považuje hodnocení 5 vzorků. Vzorky jsou anonymní.
      2. 1.1.2. Vzorky se doporučuje odebírat z míst, odkud se odebírá i vzorek k fyzikálně-chemickému zkoušení, a to v čisté svalovině a v množství:
         1. - u skotu mezi 9. a 12.žebrem - roštěnka (500-700 g)
         2. - u prasat od posledního žebra kaudálním směrem - pečeně (400-600 g)
         3. - u ovcí hřbetní partie (400-600 g)
         4. - u telat mezi 9. a 12.žebrem - pečeně (400-600 g)
         5. - u drůbeže prsní a stehenní svalovina (celý kus)
         6. - u ryb celé kusy (nejméně 500 g).

         Při senzorickém hodnocení lze dle potřeby použít i jiné svaly,tukovou tkáň, další části jatečného zvířete nebo jeho orgány, např. játra a jiné.

      1. 1.1.3. K balení vzorků se používají obaly, které zajistí původní vlastnosti vzorků.
      2. 1.1.4. Vzorky se skladují při teplotě masa v rozmezí 1 - 3°C; pokud není dodržena doporučená doba pro senzorické hodnocení od poražení zvířete, uvedená v bodě 1.1.5., vzorky se zamrazují a uchovávají při teplotě nižší než -18°C nejdéle do 2 měsíců.
      3. 1.1.5. Doporučená doba pro senzorické hodnocení od poražení zvířete:
         1. - u hovězího masa 6. - 8.den,
         2. - u vepřového masa 3. - 6.den,
         3. - u telecího 4. - 6.den,
         4. - u skopového 3. - 7.den,
         5. - u drůbežího 3. - 7.den.
      1. 1.1.6.Senzorické hodnocení syrového masa

         Provádí se posuzování:

         1. - barvy a vzhledu,
         2. - zastoupení mezisvalového tuku - mramorování,
         3. - vláknitosti,
         4. - textury - konzistence,
         5. - schopnosti masa vázat vlastní šťávu,
         6. - pachu.

         Výsledek se vyjadřuje buď slovně nebo bodovým hodnocením. Obvykle se boduje celková jakost. Doporučuje se užití 5 bodového systému.

      1. 1.1.7. Senzorické hodnocení masa tepelně upraveného

         Hodnotí se základní kriteria:

         1. - vůně,
         2. - chuť,
         3. - šťavnatost,
         4. - křehkost a jemnost.

         Posuzuje se bodovým systémem a slovně.

         1. 1.1.7.1. Tepelná úprava masa dušením v uzavřeném obalu

            Zkoušené vzorky masa se dusí v uzavřených masových sklenicích v prostředí páry po stanovenou dobu. Bodové hodnocení pak slouží ke vzájemnému porovnání vzorků a ke statistickému zpracování. Celkové vyhodnocení stanoví, zda se jedná o maso bez závad nebo o maso s odchylkami. Nedílnou součástí hodnocení je protokol, který se přikládá k celkovému hodnocení posuzovaných vzorků.

         1. 1.1.7.2. Hodnocení uvolněné šťávy (vývaru)

            U vývaru se posuzuje barva a čirost, vůně, chuť, eventuálně podíl tuku ve vývaru.

         1. 1.1.7.3. Tepelná úprava masa vařením

            Zkoušené vzorky se vaří ve vodě bez přísad po stanovenou dobu.

         1. 1.1.7.4. Tepelná úprava masa pečením

            Vzorky zkoušené svaloviny se pečou ve skleněných nádobách z varného skla v elektrické troubě při stanovené teplotě a době.

         1. 1.1.7.5. Úprava masa grilováním

            Vzorky masa se grilují na grilovacím automatu při stanovené teplotě a době.

         1. 1.1.7.6. Zkouška škvařením

            Vzorek tukové tkáně se rozkrájí na kousky o hraně 2 cm a škvaří se při stanovené teplotě až do uvolnění tuku.

         1. 1.1.7.7. Stanovení ztrát masa vařením

            Rozdíl mezi hmotností syrového a vařeného masa slouží k výpočtu ztrát vařením. Vyjadřuje se v procentech.

         1. 1.1.7.8.Stanovení ztrát masa grilováním

            Rozdíl mezi hmotností syrového a grilovaného masa slouží k výpočtu ztrát grilováním. Vyjadřuje se v procentech.

   1. 1.2.Chemické hodnocení jakosti masa

      Odběr vzorků je stejný jako v bodě 1.1.2. této přílohy.

      1. 1.2.1. Stanovení obsahu vody

         Vzorek se suší s pískem při 100 - 105°C do konstantní hmotnosti, obsah vody se vyjadřuje v procentech. Rozdíl mezi souběžnými stanoveními nepřesahuje 0,3%.

      1. 1.2.2. Stanovení celkového dusíku metodou podle Kjeldahla

         Dusík bílkovin se převede mineralizací na amoniak, který se stanoví destilací titračně. Obsah dusíkatých látek se vypočte násobením koeficientem 6,25.

      1. 1.2.3. Stanovení tuku přímou extrakcí

         Tuk po odstranění obsahu vody sušením se extrahuje rozpouštědlem, které se odpaří a tuk se zváží.

      1. 1.2.4. Stanovení obsahu popela - minerálií

         Spalováním zhomogenizovaného vzorku při teplotě max. 600°C do bílé až bílo-šedé barvy popele.

      1. 1.2.5. Stanovení hydroxyprolinu

         Stanoví se po hydrolýze bílkovin na základě barevné reakce jeho oxidačního produktu p-dimethylaminobenzaldehydem.

      1. 1.2.6. Stanovení tryptofanu

         Spočívá v alkalické hydrolýze vzorku hydroxidem barnatým a v kolorimetrickém stanovení.

      1. 1.2.7. Stanovení obsahu vazivových bílkovin výpočtem (x)

         x = a.f [g/100 g]

         1. a = obsah hydroxyprolinu v g/100 g
         2. f = 8,877 - přepočítávací faktor

         svalové bílkoviny = bílkoviny celkem - vazivové bílkoviny.

      1. 1.2.8. Stanovení nutriční hodnoty masa - výpočtem

         NP (%) = nutriční hodnota masa je procentuální podíl energie čistých, plně hodnotných bílkovin z hodnoty celkové energie masa.

         1. x = log hodnoty obsahu hydroxyprolinu/g ve 100g celkových bílkovin masa (g na 16 g N)
         2. B = obsah bílkovin v mase (%)
         3. T = obsahu tuku v mase (%).
      1. 1.2.9. Stanovení obsahu cholesterolu

         Stanoví se spektrofotometricky po reakci s kyselinou sulfosalicylovou a anhydridem kyseliny octové v prostředí kyseliny sírové.

   1. 1.3. Technologické hodnocení masa
      1. 1.3.1. Stanovení schopnosti masa vázat přidanou vodou. Zjišťuje se schopnost zhomogenizovaného masa udržet si v přítomnosti soli přidanou vodu i po tepelném zpracování.
      2. 1.3.2.Stanovení pH masa

         Obvykle se stanovuje u hovězího a vepřového masa jeho pH_1hod 1 hodinu po porážce a pH_24hod 24 hodin po porážce.

         Na základě posouzení těchto dvou hodnot se definuje výskyt specifických vad masa.

   1. 1.4. Stanovení inbibičních látek v mase

      Provádí se mikrobiologické stanovení reziduí inhibičních látek.

   1. 1.5. Jatečné hodnocení cílových zvířat

      Provádí se minimálně u 6 ks z kontrolní i pokusné skupiny (poměr pohlaví 1 : 1), u kterých se živá hmotnost nejvíce přibližuje průměru skupiny (± 5 %).

      U ryb se hodnotí 10 ks ryb z každé skupiny.

      Posuzuje se stupeň zmasilosti a protučnění, popř. stupeň nežádoucího přetučnění. Posuzuje se zrakem (hmatem).

      Dále se zjišťuje:

      1. - hmotnost při odběru, tj. celková hmotnost zvířete zjištěná vážením,
      2. - čistá hmotnost, tj. hmotnost při odběru snížená o srážku na nakrmenost nebo zvýšená o přirážku na lačnost,
      3. - hmotnost jatečně opracovaného těla, tj. hmotnost zjištěná vážením v tepelném stavu po ukončení porážky nejpozději do 30 min.,
      4. - výtěžnost, tj. % podíl hmotnosti jatečně opracovaného těla k čisté hmotnosti.
      1. 1.5.1. Jatečné hodnocení skotu a ovcí

         Do jatečně opracovaného těla se počítá hmotnost 2 půlek nebo 4 čtvrtí bez kůže, bez hlavy oddělené od trupu před 1. krčním obratlem, bez noh oddělených v dolním kloubu zápěstním nebo zánártním, bez orgánů dutiny hrudní, břišní a pánevní, vyňatých s přirostlým tukem, bez pohlavních orgánů, bez ledvin, ledvinového a pánevního loje.

      1. 1.5.2. Jatečné hodnocení prasat

         Do jatečně opracovaného těla se počítá hmotnost 2 půlek s hlavou bez mozku a míchy, včetně kruponu a kruponového sádla, s ledvinovým sádlem (plstním), bez ledvin a ostatních orgánů dutiny hrudní, břišní a pánevní, vyňatých s přirostlým tukem.

      1. 1.5.3. Jatečné hodnocení drůbeže

         Při jatečném rozboru se sleduje a vyhodnocuje:

         1. - živá hmotnost zvířat po 12 hodinovém lačnění,
         2. - hmotnost vykuchané drůbeže (čistý trup bez drůbků, ale s kůží krku),
         3. - hmotnost prsní svaloviny,
         4. - hmotnost stehenní svaloviny,
         5. - hmotnost jater,
         6. - hmotnost hodnotných částí,
         7. - hmotnost prázdného žaludku, jater a srdce.

         Výtěžnost je % podíl hmotnosti vykuchané drůbeže včetně hmotnosti hodnotných částí z hmotnosti před zabitím.

      1. 1.5.4.Jatečné hodnocení králíků

         Při bourání se oddělí hlava a za posledním žebrem přední část, která obsahuje krk, žebra s břišními svaly a přední nohy.

         Hmotnost zadní části je součet hmotností hřbetu a stehen.

         Jatečná výtěžnost se vypočte jako podíl součtu hmotností jatečného trupu s hlavou, srdce, jater, ledvin s ledvinovým tukem k živé hmotnosti.

      1. 1.5.5. Stanovení stolní hodnoty ryb

         Stolní hodnota je soubor smyslově posuzovaných vlastností a výtěžnosti.

         Hmotnost ryby je hmotnost mokré ryby po okapání přebytečné vody.

         Hmotnost masa je hmotnost ryby bez částí těla, které se nezapočítávají do výtěžnosti a představuje u kapra celé tělo bez hlavy, vnitřních orgánů, ploutví a šupin, včetně jiker nebo mlíčí,u pstruhů celé tělo bez vnitřních orgánů.

         Výtěžnost se stanoví jako % podíl hmotnosti masa z hmotnosti ryby.

1. 2. Zkoušení mléka
   1. 2.1. Odběr vzorků mléka pro potřeby zkoušení

      Dojnice zařazené do srovnávacího biologického zkoušení se dojí individuálně. Vzorky se odebírají ihned po provedeném nádoji od každé dojnice samostatně.

      Po promíchání se zajistí odběr určitého reprezentativního množství mléka, které má veškeré vlastnosti celku.

      Vzorky určené k chemickému rozboru se uloží tak, aby byla uchována jejich nezměněná jakost až do doby potřebné k provedení rozboru.

   1. 2.2. Smyslové vlastnosti mléka

      Stanovují se senzorickým hodnocením, a to:

      1. - barva,
      2. - konzistence a vzhled,
      3. - chuť a vůně.
   1. 2.3. Fyzikální a chemické jakostní znaky mléka
      1. - stanovení obsahu tuku acidobutyrometrickou metodou,
      2. - stanovení sušiny mléka jako podíl po vysušení při teplotě 105°C ± 2°C,
      3. - stanovení tukuprosté sušiny výpočtem z obsahu sušiny mléka a obsahu tuku v mléce,
      4. - stanovení specifické hmotnosti mléka mléčným hustoměrem,
      5. - stanovení titrační kyselosti dle Soxhlet-Henckela,
      6. - stanovení obsahu celkového dusíku dle Kjeldahla,
      7. - stanovení bílkovin na základě celkového dusíku dle Kjeldahla vynásobením konvenčním faktorem pro mléčné bílkoviny 6,38,
      8. - stanovení mléčného cukru (laktózy) polarimetricky,
      9. - stanovení čísla kyselosti mléčného tuku neutralizací KOH volných mastných kyselin,
      10. - stanovení jodového čísla jako procentového množství jódu, vázaného zkoušenou látkou. Slouží pro zjištění nenasycených mastných kyselin a jakosti mléčného tuku,
      11. - stanovení kysací schopnosti mléka s použitím jogurtové kultury,
      12. - stanovení počtu somatických buněk v 1 ml mléka,
      13. - stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPH) v 1 ml mléka v tisících,
      14. - stanovení inhibičních látek.
   1. 2.4. Doplňkové jakostní znaky mléka
      1. - mikrobiologické jakostní znaky,
      2. - obsah volných mastných kyselin u mléčného tuku,
      3. - obsah nutričně významných složek,
      4. - mechanické nečistoty.

1. 3. Zkoušení vajec

   Odběr vzorků se provádí namátkovým výběrem reprezentativního počtu kusů vajec z každé skupiny.

   Jakost konzumních vajec se zjišťuje smyslově, fyzikálně, chemicky a mikrobiologicky. Veškeré kvantitativní vlastnosti se statisticky vyhodnocují.

   1. 3.1. Zjišťování smyslových vlastností vajec

      Zjišťuje se čistota, neporušenost a tvar skořápky, povrchový pach a vůně, velikost a nepohyblivost vzduchové bubliny, průhlednost a tuhost bílku, viditelnost a nepohyblivost žloutku, vývoj zárodku, vzhled bílku, vzhled žloutku, vůně a chuť obsahu po rozbití, zjištění chuti vaječného obsahu po uvaření.

   1. 3.2. Zjišťování fyzikálních vlastností vajec
      1. 3.2.1. Hmotnost vajec se zjišťuje vážením jednotlivých kusů
      2. 3.2.2. Index tvaru vajec je dán rozměry ve směru os
      3. 3.2.3. Pevnost skořápky se zjišťuje působením zesilujícího tlaku na celé vejce nebo upravenou skořápku.
      4. 3.2.4. Tloušťka skořápky se měří za konstantních podmínek na přesně zvolených místech, ostrém a tupém konci vejce.
      5. 3.2.5. Barva žloutku je intenzita zbarvení žloutku a posuzuje se podle 15 stupňového barevného vějíře.
      6. 3.2.6. Index tuhého bílku je dán poměrem plochy, kterou zaujímá bílek po vytlučení na podložku k jeho výšce. Plocha je charakterizována průměrem délky a šířky.
      7. 3.2.7. Haughovy jednotky vyjadřují jakost vejce na základě vztahu mezi výškou tuhého bílku a hmotností vejce. Vypočtou se dle vzorce:
         1. kde V je výška bílku v mm a H hmotnost vejce v g.
      1. 3.2.8. Index žloutku a zploštění je dán poměrem plochy, kterou zaujímá žloutek po vytlučení na podložku k jeho výšce. Plocha je charakterizovaná průměrem délky a šířky.

Příloha č. 23

BIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ DOPLŇKOVÝCH LÁTEK

BIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ DOPLŇKOVÝCH LÁTEK JINÝCH NEŽ MIKROORGANIZMY A ENZYMYČást I. A

Biologické zkoušení doplňkových látek jiných než mikroorganizmů a enzymů se řídí postupy uvedenými v části I.A. Mohou být požadovány všechny dále uváděné zkoušky a testy a je-li nutno i další informace.

Provedené zkoušky jsou podkladem pro zpracování dokumentace (tzv. dossier) o látkách a přípravcích, u kterých je nutno žádat o povolení jejich použití jakožto doplňkových látek do krmiv nebo o nové užití povolené doplňkové látky. V této části přílohy se termín „doplňková látka“ týká účinných chemicky definovaných látek nebo přípravků obsahujících účinné látky ve stavu, v jakém budou zapracovány do premixů a krmiv. Dokumentace musí umožnit vyhodnocení doplňkových látek na základě současného stavu znalostí, které jsou předpokladem, že jejich povolení bude odpovídat stanoveným zásadám.

Pokud se dokumentace týká doplňkové látky pocházející nebo obsahující geneticky modifikované organismy ve smyslu Čl. 2 odst. 1 a 2 směrnice Rady 2001/18/ES, musí být v dokumentaci uvedeny vedle informací požadovaných v této příloze též informace vyjmenované v Čl. 7a v prvním pododstavci směrnice Rady 70/524/EHS.

Dokument musí obsahovat podrobné zprávy o všech provedených zkouškách, předložené v pořadí a podle číslování uvedeného v této příloze. Musí obsahovat odkazy a kopie všech zveřejněných vědeckých údajů, týkajících se hodnocení doplňkové látky. Musí být dodána elektronická verze dokumentace. Závěrem zkoušek je objasnit, zda je užití doplňkové látky bezpečné:

1. a) vzhledem k cílovým druhům zvířat v koncentracích navrhovaných v krmivech;
2. b) vůči osobám, které mohou být vystaveny doplňkové látce vdechnutím, jiným kontaktem sliznic, očí nebo kůže při manipulaci s doplňkovou látkou jako takovou nebo zapracovanou do premixů nebo krmiv;
3. c) vůči spotřebitelům, kteří jedí potraviny získané ze zvířat, jimž byla doplňková látka podána a která by mohla obsahovat rezidua doplňkové látky nebo její metabolity; bezpečnost použití bude obecně zajištěna tak, že se stanoví maximální limity reziduí (MLR) a ochranné lhůty;
4. d) vůči zvířatům a lidem, vzhledem k selekci a rozšíření genů rezistentních vůči antimikrobiálním látkám;
5. e) vůči životnímu prostředí, s ohledem na nebezpečí vyplývající z doplňkové látky samotné, nebo z jejích produktů přímo anebo vylučovaných zvířaty.

V zásadě musí být provedeny zkoušky, které stanoví identitu, podmínky užití, fyzikálně chemické vlastnosti, metody stanovení a účinnosti doplňkové látky, jejího metabolismu a reziduí, fyziologické a toxikologické účinky na cílový druh. Je-li doplňková látka určená pro kategorii zvířat náležejících k určitému druhu, musí být zkoušky týkající se účinnosti a reziduí vypracovány na této cílové kategorii. Zkoušky nezbytné pro posouzení rizika pro lidské zdraví a pro životní prostředí budou v zásadě záviset na povaze doplňkové látky a okolnostech jejího užití. V tomto ohledu není stanoveno žádné striktní pravidlo.

V případě potřeby mohou být požadovány dodatečné informace. Nebudou-li do dokumentace dodány jakékoliv v pokynech stanovené údaje, musí to být odůvodněno. Zejména zkoušky týkající se mutagenity, karcinogenity a reprodukční toxicity je možné opomenout pouze v případě, že chemické složení, praktické výsledky nebo jiné podklady odůvodněně vyloučí tyto účinky.

Musí být vypracovány odborné znalecké posudky o kvalitě, účinnosti a bezpečnosti doplňkové látky. Autoři těchto posudků musí mít odbornou způsobilost na základě vysokoškolského vzdělání získaného studiem v akreditovaném studijním programu v příslušné oblasti studia, musí být uznávanými odborníky v dotyčné oblasti a nesmějí být osobně zainteresováni na vedení pokusů začleněných do dokumentace. Posudky musí obsahovat kritické zhodnocení dokumentace, kterou dodal žadatel; pouhý souhrn fakt není dostačující.

Určení fyzikálně chemických, toxikologických a ekotoxikologických vlastností se uskuteční pomocí úředních metod nebo aktualizovaných metod, uznaných mezinárodními vědeckými institucemi. Užití jiných metod musí být odůvodněno.

Každá dokumentace musí obsahovat patřičný souhrn zkoušek a návrh přílohy a může obsahovat monografii. Dokumentace týkající se antibiotik, kokcidiostatik a léčebných substancí a růstových stimulátorů musí být doplněna monografií v souladu s přílohou č. 25 této vyhlášky a musí umožnit, aby dotyčná doplňková látka mohla být identifikována a charakterizována. Identifikační záznam musí být předložen pro všechny doplňkové látky.

U doplňkových látek určených výhradně do krmiv pro domácí zvířata není vždy nutné tyto doplňkové látky podrobovat vyčerpávajícímu počtu pokusů na chronickou toxicitu, mutagenitu, reprodukční toxicitu a karcinogenitu, tak jako se požaduje pro doplňkové látky určené ke krmení hospodářských zvířat, jejichž produkty jsou určené k lidské spotřebě. Zkoušky reziduí obsažených v domácích zvířatech nejsou požadovány.

Zkouška metabolismu doplňkových látek u cílových zvířat určených k produkci potravin a u laboratorních druhů užívaných pro testování toxicity se provádí podle zvláštních právních předpisů¹) a je nezbytná z toho důvodu, aby:

1. a) se zajistilo, že existují adekvátní údaje o toxicitě výchozí doplňkové látky a jakéhokoliv metabolitu produkovaného u cílového druhu, jimž by mohl být spotřebitel vystaven. Za tím účelem je důležité srovnání metabolismu doplňkové látky u cílového druhu a u laboratorních druhů zvířat použitých pro testování toxicity;
2. b) se identifikoval a kvantifikoval vhodný marker reziduí použitelný pro stanovení MLR pro značení reziduí a délky doby ochranných lhůt u finálního produktu.

1. 1. Souhrn údajů

   Souhrn musí být uspořádán v pořadí podle přílohy a obsahovat všechny složky ve stejném pořadí jako příloha s odkazem na příslušné stránky v dokumentaci.

1. 2. Identita, vlastnosti a podmínky užití doplňkové látky; kontrolní metody
   1. 2.1. Identita
      1. 2.1.1. Navrhovaný chráněný název
      2. 2.1.2. Typ podle jejího hlavního účinku. Pokud možno je vhodné dodat informace o způsobu působení. Jakékoliv jiné aktivní látky se musí specifikovat.
      3. 2.1.3. Kvalitativní a kvantitativní složení (aktivní látka, jiné složky, nečistoty,variabilita jednotlivých šarží). Je-li aktivní látka směsí aktivních složek, z nichž každá je jasně definovatelná, hlavní složky musí být popsány odděleně s uvedením jejich poměru ve směsi.
      4. 2.1.4. Fyzikální stav, rozdělení podle velikosti částic, forma částic, hustota, objemová hustota; pro kapaliny: viskozita, povrchové napětí.
      5. 2.1.5. Způsob výroby, včetně jakéhokoliv případného zvláštního zpracování.
   1. 2.2. Vlastnosti aktivní(ch) látky (látek)
      1. 2.2.1. Generický název, chemický název podle názvosloví IUPAC (Mezinárodní svaz pro čistou a aplikovanou chemii), jiné generické mezinárodní názvy a zkratky. Číslo CAS (Chemical abstracts service number).
      2. 2.2.2. Strukturální vzorec, molekulární vzorec a molekulární hmotnost

         Pro aktivní látky z fermentačních výrob: mikrobiální původ (název a místo sbírky kultur, uznávané jako mezinárodní depositum přednostně v Evropské unii, kde je kmen uložen, číslo uložení a veškeré morfologické, fyziologické, genetické a molekulární vlastnosti důležité pro jeho identifikaci). U geneticky modifikovaných kmenů musí být uvedeny informace o genetické modifikaci.

      1. 2.2.3. Čistota

         Identifikace a kvalifikace případných chemických a mikrobiálních nečistot a toxických látek, potvrzení neexistence produkce organismů.

      1. 2.2.4. Důležité vlastnosti

         Fyzikální vlastnosti chemicky definovaných látek: konstanta rozkladu, pKa, elektrostatické vlastnosti, bod tání, bod varu, hustota, tlak páry, rozpustnost ve vodě a organických rozpouštědlech, K_ow a K_oc, hmotové a absorpční spektrum, údaje NMR, případné izomery a jakákoliv jiné důležité vlastnosti

      1. 2.2.5. Způsob výroby, čistící procesy, užitá media a u výrobků z fermentace variabilita jednotlivých šarží.
   1. 2.3. Vlastnosti doplňkové látky: fyzikálně chemické a technologické vlastnosti
      1. 2.3.1. Stabilita každé formy doplňkové látky při vystavení vlivu vnějších podmínek jako je světlo, teplota, pH, vlhkost, kyslík a obalové materiály. Předpokládaná trvanlivost doplňkové látky v obchodovatelné formě.
      2. 2.3.2. Stabilita každé formy doplňkové látky při přípravě a skladování premixů a krmiv zejména stabilita za předpokládaných podmínek výroby nebo skladování (vlhkost, teplota, tlak, střih, doba a obalový materiál). Možné zhoršení jakosti nebo rozklad výrobků. Předpokládaná trvanlivost doplňkové látky.
      3. 2.3.3. Jiné patřičné fyzikálně chemické nebo technologické vlastnosti pro vytváření a zachování homogenních směsí v premixech a krmivech, protiprašné a elektrostatické vlastnosti, rozpustnost v kapalinách.
      4. 2.3.4. Neslučitelnost nebo interakce k nimž by mohlo dojít ve styku s krmivy, nosiči, jinými povolenými doplňkovými látkami nebo léčebnými substancemi.
   1. 2.4. Podmínky užití doplňkové látky.
      1. 2.4.1. Má-li doplňková látka technologicky a zootechnicky významné účinky, musí splňovat požadavky jak pro technologické, tak i zootechnické hledisko. Požadavky týkající se každé doplňkové látky musí být označeny a odůvodněny.
      2. 2.4.2. Navrhované technologické užití při výrobě krmiva nebo případně krmných surovin.
      3. 2.4.3. Navrhovaný způsob použití ve výživě zvířat (například: druhy nebo kategorie zvířat, věkové skupiny, produkční stadium zvířat, typ krmiva a kontraindikace).
      4. 2.4.4. Navrhovaný způsob a hladina zapracování do premixů a krmiv nebo popřípadě do krmných surovin a množství, vyjádřené jako podíl doplňkové látky a chemicky definovaných látek pro premixy krmiva, nebo případně krmné suroviny s navrhovaným dávkováním do konečného krmiva a navrhovanou dobu podání a v případě potřeby délka ochranné lhůty.
      5. 2.4.5. Je nutno uvádět údaje týkající se jiného známého užití aktivní látky např. v potravinách, humánní nebo veterinární medicíně, v zemědělství a v průmyslu.
      6. 2.4.6. Seznam údajů o bezpečnosti materiálu a v případě potřeby i opatření navrhovaná pro předcházení profesním rizikům a ochranné prostředky při výrobě, manipulaci, užití a disponování s materiálem.
   1. 2.5. Kontrolní metody
      1. 2.5.1 Popis metod použitých pro určení kriterií vyjmenovaných v bodech 2.1.3., 2.1.4., 2.2.3., 2.3.1., 2.3.2., 2.3.3. a 2.3.4.
      2. 2.5.2. Popis kvalitativních a kvantitativních analytických metod určených k rutinní kontrole aktivní látky v premixech a krmivech. Tyto metody musí být validovány kruhovým testem zahrnujícím minimálně čtyři laboratoře nebo musí být validovány na místě podle mezinárodních sladěných pokynů pro interní validaci metod analýzy podle těchto parametrů: použitelnost, selektivnost, kalibrace, správnost, přesnost, rozsah, limity detekce, měřitelný limit citlivosti, mohutnost a proveditelnost. Je potřeba podat důkaz, že tyto vlastnosti se skutečně posuzovaly (2.5.4.).
      3. 2.5.3. Popis kvalitativních a kvantitativních analytických metod ke stanovení značených reziduí aktivní látky v tkáních cílových zvířat a živočišných produktech.
      4. 2.5.4. Metody uvedené v bodech 2.5.2. a 2.5.3. musí být doplněny o informace týkající se použité metody odběru vzorků, procentické výsledky, specifičnost, správnost, přesnost, hranice detekce, hranice kvantifikace a použitý postup validace. Musí být k dispozici referenční standardy aktivní látky, nebo značených reziduí, stejně jako informace o optimálních skladovacích podmínkách těchto referenčních standardů. Při navrhování metod se musí brát v úvahu skutečnost, že jejich limity množství musí být nižší než MLR. Dále se musí počítat s tím, zda je tato metoda vhodná pro rutinní analýzu.

1. 3. Zkoušky týkající se účinnosti doplňkové látky
   1. 3.1. Tyto studie se týkají technologických doplňkových látek, jako antioxidantů, konzervačních látek, pojiv, stabilizátorů, emulgátorů, želírovacích látek, látek na regulování pH atd., které jsou určeny ke zlepšení nebo stabilizování vlastností premixů a krmiv, avšak nemají přímé biologické účinky na živočišnou produkci. Všechny požadované vlivy nebo účinky musí být podloženy vědeckými údaji.

      Účinnost doplňkové látky musí být prokázána pomocí vhodných kritérií, uvedených v metodách uznaných za přijatelné, za předpokládaných podmínek užití ve srovnání s vhodnými kontrolními krmivy. Tyto výzkumy musí být koncipovány a prováděny takovým způsobem, aby je bylo možno statisticky vyhodnocovat.

      Musí být předloženy úplné informace o aktivních látkách, přípravcích, premixech a testovaných krmivech, referenční číslo šarže, podrobné zpracování a testovací podmínky. U každého pokusu se musí popsat příznivé i nepříznivé účinky, a to jak v rovině technologické, tak i biologické.

   1. 3.2. Zkoušky o účincích na zvířatech

      Zkoušky týkající se zootechnických doplňkových látek musí být provedeny na cílových druzích /kategoriích zvířat, jimž je doplňková látka určena, ve srovnání s negativními kontrolními skupinami (to znamená skupinami, které nepřijímají antibiotika ani stimulátory růstu ani žádné jiné léčebné látky) a případně se skupinami zvířat, která přijímají krmiva obsahující doplňkové látky povolené, jejichž účinnost je známa a jež jsou užívány v doporučených dávkách (pozitivní kontrola).

      Zvířata musí být zdravá a přednostně pocházet z homogenní skupiny.

      Zkoušky musí umožnit posouzení účinnosti doplňkové látky v souladu se zemědělskou praxí. Pokud možno by se měly použít podobné vzory protokolů pro všechny pokusy, aby pak údaje mohly být ověřeny celistvě a souhrnně (pokud to testy vyžadují) pro statistické posouzení.

      Nedoporučuje se žádný jednotný vzor, jistá pružnost je přitom ponechána pro vědecký názor na vzor a provádění studií. Použitý experimentální protokol musí být odůvodněn vzhledem k předpokládanému použití doplňkové látky a musí zahrnovat úvahu o odpovídající statistické průkaznosti.

      1. 3.2.1. U kokcidiostatik a jiných léčebných látek

         Musí se především upozornit na existenci zvláštních účinků (například kontrolované druhy, dotyčné stádium nebo dotyčná stádia vývojového životním cyklu), a zejména na profylaktické vlastnosti například na patologické jevy, úmrtnost, počet oocyst, počet lézí.

         Musí se sdělit informace týkající se vlivu na produkční účinnost a na přírůstek živé hmotnosti.

         Požadované údaje o účinnosti se týkají tří etap na pokusech s cílovými zvířaty:

         1. a) kontrolované pokusy v klecích (jednotlivé a smíšené infekce);
         2. b) kontrolované pokusy při volném ustájení (simulované podmínky užití);
         3. c) kontrolované pokusy v terénu (skutečné podmínky užití)

         Současně a v případě potřeby se musí v rámci pokusů týkajících se produkční účinnosti zapisovat doplňující údaje, aby bylo možno posoudit vzájemné působení růstu a konverze krmiva, nebo účinky na oplodněnost a líhnutí vajec (plemenná drůbež).

      1. 3.2.2. U jiných zootechnických doplňkových látek

         Musí se dodat informace o účincích na příjem krmiva, tělesnou hmotnost, produkční účinnost (přednostně v sušině), jakost a výtěžnost produktů a jakýkoliv jiný parametr, který má kladný účinek na zvíře, životní prostředí, výrobce nebo spotřebitele. Případně by studie měly zahrnovat údaj o vztahu dávky a reakci na ni.

      1. 3.2.3. Experimentální podmínky

         Pokusy se musí provádět minimálně na dvou různých místech. Musí být vypracovány dvě samostatné zprávy, v nichž se přesně uvedou výsledky kontrol a každého experimentálního zákroku. Protokol o pokusu musí být vypracován pečlivě a musí obsahovat níže popsané základní údaje:

         1. 3.2.3.1. Stádo nebo hejno: místo a počet, podmínky krmení a chovu, způsob krmení; u vodních druhů: velikost a počet nádrží nebo klecí na farmách a kvalita vody.
         2. 3.2.3.2. Zvířata: druh (u vodních druhů určených k lidské spotřebě se uvede jméno obecné a po něm v uvozovkách latinské jméno nebo název dle Linné-a), plemeno, věk, pohlaví, způsob označení, fyziologické stádium a celkový zdravotní stav.
         3. 3.2.3.3. Počet pokusných a kontrolních skupin, počet zvířat v každé skupině. Počet zvířat použitých pro pokusy musí umožnit statistickou analýzu. Musí se uvést použité statistické hodnotící metody. U každé kategorie zvířat, u které se mají projevit účinky, musí být provedeny nejméně tři nezávislé srovnávací pokusy na hladině pravděpodobnosti p < 0,05 u každé sledované kategorie zvířat, aby bylo vidět předpokládaný účinek. V případě přežvýkavců lze přijmout nižší hladinu pravděpodobnosti p<0,10. Ve zprávě musí být zahrnuta všechna zvířata nebo experimentální celky, s nimiž se pokusy prováděly. Případy, které není možné zařadit z důvodu nedostatků nebo ztráty údajů, musí být uvedeny ve zprávě a jejich přítomnost ve skupinách zvířat musí být hodnocena.
         4. 3.2.3.4. Diety: popis výroby a kvantitativní složení diety (diet) s uvedením použitých složek, příslušných živin (analyzované hodnoty) a energetické hodnoty. Údaje o příjmu krmiva.
         5. 3.2.3.5. Koncentrace aktivní látky (a v daném případě látek) použitých pro srovnávací účely v krmivech musí být stanovena kontrolní analýzou podle příslušné uznané metody. Referenční čísla šarží.
         6. 3.2.3.6. Data a přesná doba trvání pokusů. Data a povaha provedených zkoušek.
         7. 3.2.3.7. Studie o určení dávky: účelem těchto studií je vysvětlit důvody vedoucí k výběru dávky nebo stupnici dávkování, která vykazuje optimální účinek. Určení dávky se zakládá na kontrole (bez antibiotik, stimulátorů růstu nebo jiných léčebných látek) a na minimálně třech nenulových úrovních u cílových zvířat.
         8. 3.2.3.8. Okamžik a výskyt jakéhokoliv nežádoucího účinku pokusů u jedinců nebo skupin musí být zaznamenán včetně veškerých podrobností o programu pozorování použitém při zkoušce.
         9. 3.2.3.9. Všechny doplňkové látky zkoušené za podmínek v terénních podmínkách musí mít dobré vědecké záznamy zaměřené na bezpečnost pro uživatele, spotřebitele, zvíře a životní prostředí. Neuspokojuje-li doplňková látka požadavky týkající se bezpečnosti spotřebitele, pak jakákoli prováděná studie musí být koncipována tak, aby zabránila vstupu živočišných produktů vzešlých z pokusných zvířat do lidského potravního řetězce.
   1. 3.3. Studie o jakosti produktů živočišného původu

      Produkty živočišného původu musí být přezkoušeny z hlediska jejich organoleptických, nutričních, hygienických a technologických vlastností.

   1. 3.4. Studie o účincích na vlastnosti živočišných odpadů

      Je-li doplňková látka určena k tomu, aby změnila některé vlastnosti živočišných odpadů (například dusík, fosfor, zápach, objem) požadují se studie demonstrující tyto vlastnosti.

1. 4. Zkoušky týkající se bezpečnosti užití doplňkové látky

   Zkoušky uvedené v tomto oddílu jsou určeny k vyhodnocení

   1. - bezpečnosti užití doplňkové látky pro cílové druhy,
   2. - jakéhokoliv rizika souvisejícího se selekcí, nebo přenosem rezistence vůči antibiotikům a se zvyšující se persistencí a množením enteropatogenů,
   3. - rizik pro spotřebitele, která by mohla být způsobena konzumací potravin obsahujících rezidua doplňkové látky nebo jejich metabolitů,
   4. - rizik při vdechnutí, jiného kontaktu sliznic, očí nebo kůže u osob zabývajících se manipulací s doplňkovou látkou v původním stavu nebo zapracované do premixů nebo krmiv,
   5. - rizik z nežádoucích účinků na životní prostředí z doplňkové látky jako takové nebo produktů odvozených z doplňkové látky přímo, nebo vyloučených zvířaty.

   Je třeba vzít v úvahu známé inkompatibility, nebo interakce mezi doplňkovou látkou a veterinárními léčivy, anebo složkami diety určené pro daný druh.

   Tyto zkoušky se budou obvykle požadovat jako celek pro každou doplňkovou látku, pokud není uvedena zvláštní výjimka nebo změna.

   Pro návrh na rozšíření povoleného užití pro druh, který je z fyziologického a metabolického hlediska blízký druhu, pro který již bylo užití doplňkové látky povoleno, se obvykle souhlasí s méně obsáhlou žádostí. Takový soubor redukovaných údajů musí ukázat bezpečnost pro nový druh a absenci výrazných rozdílů v základním metabolismu a reziduí v poživatelných tkáních. Navržená MLR a ochranná lhůta pro daný druh musí být odůvodněny.

   Pro posouzení rizik pro spotřebitele a následné určení MLR a ochranné lhůty, je třeba dodat tyto informace:

   1. - chemickou strukturu aktivní látky,
   2. - metabolismus u navrhovaných cílových druhů,
   3. - skladbu reziduí u těchto cílových druhů,
   4. - zkoušku o odbourávání reziduí z tkání,
   5. - údaje o biologických účincích aktivní látky a jejích metabolitů.

   Znalost biologické využitelnosti reziduí (vázaných a volných) může být také užitečná, zejména pokud dochází k tvorbě mnoha metabolitů a žádný marker reziduí není doložen (viz 4.1.3.3.)

   Dále se požaduje znalost složení a fyzikálně chemické a biologické vlastnosti hlavních vyloučených produktů pocházejících z doplňkové látky pro stanovení rozsahu zkoušek nezbytných k posouzení rizik nežádoucích účinků na životní prostředí nebo jejich přetrvávání v životním prostředí (viz odstavec 4.5.).

   1. 4.1. Zkoušky na cílových druzích zvířat
      1. 4.1.1. Testy tolerance na cílových druzích/ kategoriích zvířat

         Účelem je určit limit bezpečnosti (tj. hranici mezi maximální navrhovanou dávkou v krmivech a minimální dávkou způsobující nežádoucí účinky). Limit bezpečnosti jednoho faktoru nejméně z deseti se však považuje za dostatečný, aby se již nežádaly doplňující testy. Takový test tolerance musí být proveden u cílových druhů /kategorií zvířat, přednostně po celé produkční období, i když normálně je přijatelný test trvající jeden měsíc. To vyžaduje minimálně posouzení klinických příznaků a jiných parametrů pro stanovení účinků na zdraví cílových zvířat. Musí být zařazena negativní kontrolní skupina (bez antibiotik, růstových stimulátorů nebo jiných léčebných látek). Mohou být také požadovány dodatečné parametry podle toxikologického profilu. Jakýkoliv nežádoucí účinek odhalený během pokusů na stanovení účinnosti se musí uvést také v tomto oddílu.

         Pokud je produkt určen k použití na zvířatech, která by mohla být použita k chovu, musí být studie prováděny takovým způsobem, aby se zjistilo případné zhoršení rozmnožovací funkce samce nebo samice nebo škodlivé účinky na potomstvo, způsobené podáváním zkoušené doplňkové látky.

      1. 4.1.2. Mikrobiologická bezpečnost doplňkové látky
         1. 4.1.2.1. Všechny zkoušky musí být prováděny s nejvyšší navrhovanou dávkou.
         2. 4.1.2.2. Vykazuje-li aktivní látka antimikrobiální aktivitu při koncentraci, ve které je obsažena v krmivu, musí být určena minimální inhibiční koncentrace - MIK (minimum inhibitory concentration - MIC) vůči vhodným patogenním i nepatogenním, endogenním i exogenním bakteriím v souladu se standardizovanými postupy.
         3. 4.1.2.3. Testy určující schopnost doplňkové látky
            1. - způsobit křížovou rezistenci na odpovídající antibiotika,
            2. - selektovat rezistentní bakteriální kmeny za provozních podmínek užití u cílových druhů, a pokud tomu tak je, provést studie genetických mechanismů pro přenos rezistentních genů.
         1. 4.1.2.4. Testy určující účinnost doplňkové látky na
            1. - určitý počet oportunních patogenů přítomných v zažívacím traktu (například enterobakterie, enterokoky a klostridie),
            2. - pomnožování nebo vylučování odpovídajících zoonotických mikroorganismů, například Salmonella spp., Campylobacter spp.
         1. 4.1.2.5. V případech, že aktivní látka vykazuje antimikrobiální aktivitu, musí být provedeny provozní zkoušky monitorování rezistence bakterií na doplňkovou látku.
      1. 4.1.3. Zkoušky metabolismu a reziduí
         1. 4.1.3.1. Účelem zkoušek je
            1. - stanovení metabolických cest aktivní látky, jako základu pro její toxikologické vyhodnocení,
            2. - identifikace reziduí a stanovení jejich kinetiky v poživatelných tkáních a produktech (mléko, vejce),
            3. - identifikace vyloučených látek, jako první požadavek pro posouzení jejich dopadu na životní prostředí.

               V určitých případech, například u doplňkových látek získaných fermentací se může ukázat, že je nutné tyto zkoušky rozšířit na jiné, během fermentace přidané nebo odvozené látky. Zjištění průkazné toxicity vzhledem k toxicitě aktivní složky nebo aktivních složek doplňkové látky by tuto okolnost vysvětlila.

         1. 4.1.3.2. Farmakokinetika

            Návrh a experimentální schema zkoušek musí vzít v úvahu specifika cílové populace z hlediska anatomie, fyziologie (věk, druh, pohlaví), zootechnické kategorie i životního prostředí. Je-li třeba, musí být přihlédnuto k vlivu na střevní mikrofloru a na mikrofloru, předžaludků, enterohepatický cyklus a činnost slepého střeva. Testované dávkování musí být dávkování, s jakým se počítá pro užití a případně, je-li to odůvodněno, násobek této dávky. Aktivní látka (včetně značené látky) musí být zapracována do krmiva, kromě případu, kdy je odůvodněno, že se tak nestane.

            Požadují se tyto studie:

            1. - metabolická bilance a kinetika v plazmě/krvi po podání jediné dávky, aby se mohla posoudit rychlost a rozsah absorpce, distribuce a vylučování (moč, výkaly, žluč, vydechovaný vzduch, mléko nebo vejce),
            2. - identifikace majoritních metabolitů (>10%) v exkrementech, kromě případu, kdy se zdá, že minoritní metabolit (<10%) by mohl být toxikologicky významný,
            3. - rozložení značeného materiálu v tkáních a produktech po podání jediné dávky zvířatům, která již jsou ve vyrovnaném stavu, jehož bylo dosaženo neznačenou doplňkovou látkou.

            Zkoušky uvedené v bodech 4.1.3.1 a 4.1.3.2. musí obsahovat i metody s použitím izotopů nebo jiné odpovídající metody.

         1. 4.1.3.3. Zkoušky reziduí
            1. - identifikace takových reziduí (původní sloučenina, metabolity, produkty rozpadu, vázaná rezidua,²) která představují více než 10% všech reziduí (kromě toho, kdy by mohl být minoritní metabolit toxikologicky významný) v poživatelných tkáních a produktech (mléko, vejce) za metabolické rovnováhy, tj. po podání násobků dávek značené látky; poměr značeného rezidua ke všem reziduím,
            2. - kinetická studie reziduí v tkáních (včetně mléka a v daném případě vajec) během období jejich vylučování po dosažení stabilního stavu a za použití nejvyšší navrhované dávky profilující do metabolizmu, identifikace cílové tkáně³) a značeného rezidua,
            3. - vylučovací zkouška značeného rezidua z cílových tkání (včetně mléka a v daném případě vajec) po vysazení doplňkové látky, které následuje po jeho opakovaném podávání, v souladu s navrhovanými podmínkami užití a které stačí k docílení stabilního stavu, aby bylo možno stanovit ochrannou lhůtu na základě stanoveného maximálního limitu reziduí MLR,
            4. - ochranná lhůta pro doplňkovou láku nesmí být kratší než doba nutná pro to, aby koncentrace značeného rezidua stanovená v cílové tkáni klesla pod hodnotu MLR (95% hranice spolehlivosti). Body měření, časově určené, vybrané vhodným způsobem ve vazbě na fázi vylučování aktivní látky a jejich metabolitů, a minimálně čtyři zvířata na každý bod podle druhů (velikost, genetická variabilita) musí být považovány za požadované minimum.⁴)
   1. 4.2. Zkoušky na laboratorních zvířatech

      Tyto zkoušky musí být prováděny s aktivní látkou za použití mezinárodně uznávaných standardních pokusných metod, jak jsou popsány v pokynech OECD pro metodologické ukazatele a v souladu se zásadami správné laboratorní praxe. Mohou být nezbytné i doplňující zkoušky o zvláštních metabolitech, produkovaných u cílových druhů, pokud se tyto nevytvořily v testu laboratorních druhů ve významném rozsahu. Stejně tak, pokud jde o údaje u člověka, se kterými se musí počítat, je třeba rozhodnout, které doplňující zkoušky se provedou.

      1. 4.2.1. Akutní toxicita

         Akutní orální toxicita musí být provedena nejméně na dvou druzích savců. Jeden laboratorní druh může být v případě potřeby nahrazen cílovým druhem. Nebude nutné označovat přesně LD50; přibližné určení minimální smrtelné dávky obvykle stačí. Aby se snížil počet testovaných zvířat a jejich utrpení, nesmí maximální dávkování překročit 2 000 mg/kg živé hmotnosti a doporučuje se použití náhradních metod (limitní test, metoda fixní dávky, metoda třídy akutní toxicity).

         Nebezpečí pro pracovníky musí být posuzováno v sérii zkoušek, v nichž se produkt (aktivní látka a nosič ve formě, v níž bude uvedena do oběhu) použije. Zkoušky dráždivosti pokožky se musí také provést a pokud jsou jejich výsledky pozitivní, je třeba posoudit dráždivost sliznic (například očí). Také se musí posoudit alergické účinky - kožní senzibilizace. Zkoušky akutní toxicity při vdechnutí se musí provádět, jestliže produkt může tvořit prach nebo lze vdechovat jeho výpary.

      1. 4.2.2. Zkoušky genotoxicity, včetně mutagenity

         Za účelem identifikace aktivních látek a případně jejich metabolitů a produktů degradace, které mají mutagenní a genotoxické vlastnosti, musí být provedena výběrová kombinace nejméně tří různých testů na genotoxicitu. Testovaný soubor musí obvykle obsahovat testy v prokaryotickém i eukaryotickém systému, včetně systémů testů in vitro a in vivo na savcích. V případě potřeby se testy musí provádět bez i s metabolickou aktivací u savců.

         Je třeba uvést důvody, které vedly k výběru testů vzhledem k jejich spolehlivosti pro posouzení genotoxických účinků na různá genetická zakončení na úrovni genu, chromozomu a genomu. Mohou se uvádět doplňující testy podle získaných výsledků a na základě celého toxikologického profilu látky a užití, k němuž je určena. Pokusy se musí provádět v souladu se schválenými a v současnosti validovanými postupy. Pokud je pokus zaměřen na kostní dřeň, je případě negativního výsledku nutný důkaz o tom, že buňky byly vystaveny působení testované látky.

      1. 4.2.3. Zkoušky subchronické orální toxicity (90 dní)

         Doba testů musí být minimálně 90 dní. U doplňkových látek určených k použití u živočišných druhů, z nichž se vyrábějí potraviny, musí se zkoušky provádět na dvou živočišných druzích, z čehož jeden nesmí patřit k řádu hlodavců, ale může být cílovým druhem. U doplňkových látek určených pro použití u zvířat, která nejsou určena k lidské spotřebě, stačí zkoušky na cílovém druhu: aktivní látka musí být podávána orálně minimálně ve třech úrovních jako doplněk podávání kontrolní skupině, aby se získala odpověď na dávku.

         Maximální dávka musí za normálních okolností odhalit přítomnost škodlivých účinků. Nejnižší úroveň dávkování nemusí vykázat žádnou známku toxicity.

      1. 4.2.4. Zkoušky chronické orální toxicity (včetně zkoušek karcinogenity).

         Zkoušky karcerogenity nemusí být nezbytné, pokud aktivní látka a její metabolity:

         1. - dávají stále negativní výsledky ve vhodné sérii testů na genotoxicitu,
         2. - nejsou strukturálně propojeny se známými kancerogeny a
         3. - nevyvolávají žádný účinek ukazující na případnou (pre)neoplazii při zkouškách chronické toxicity.
      1. 4.2.5. Zkoušky reprodukční toxicity včetně teratogenity
         1. 4.2.5.1. Dvougenerační zkouška reprodukční toxicity
            1. - zkoušky na reprodukční funkci musí být prováděny v rozsahu nejméně dvou filiálních generací (F1, F2) a mohou být kombinovány se zkouškou teratogenity. Zkoušená látka musí být podávána samcům a samicím ve vhodnou dobu před pářením. V podávání se musí pokračovat až do odstavu zvířat generace F2.
            2. - Všechny relevantní parametry týkající se oplození, březosti, porodu, mateřského chování, kojení, růstu a vývoje potomstva generace F1 od početí do dospělosti a vývoj potomstva generace F2 až do odstavu se musí pečlivě sledovat a zaznamenat.
         1. 4.2.5.2. Zkoušky teratogenity

            Zkoušky teranogenity zahrnují embryotoxicitu a foetotoxicitu. Musí se provádět nejméně na dvou druzích.

      1. 4.2.6. Zkoušky metabolismu a ukládání

         Musí být provedeny zkoušky absorpce, ukládání (rozložení) v tělních tekutinách a tkáních a ve vylučovacích cestách. Zkouška metabolismu zahrnující metabolickou bilanci a identifikaci hlavních metabolitů v moči a výkalech se musí provést na zvířatech obou pohlaví a stejných druhů, jaké byly použity v toxikologických zkouškách. Jedna dávka značené molekuly (bod 4.1.3) se musí podat v ustáleném stavu rovnováhy, jehož bylo dosaženo s neznačenou sloučeninou v dávce podobné nejvyšší úrovni navržené pro použití u cílového druhu.

      1. 4.2.7. Biologická využitelnost reziduí

         Při posuzování rizika pro spotřebitele, spojeného s určitými rezidui obsaženými v živočišných produktech, zejména vázanými rezidui, je třeba brát v úvahu dodatečný faktor bezpečnosti založený na určení jejich biologické využitelnosti za použití vhodných laboratorních zvířat a uznaných metod.

      1. 4.2.8. Jiné specifické toxikologické a farmakologické zkoušky

         Musí se provést další zkoušky poskytující doplňující informace použitelné pro posouzení bezpečnosti aktivní látky a jejích reziduí, pokud pro to existuje jakýkoliv závažný důvod.

      1. 4.2.9. Určení koncentrace bez pozorovaného účinku (NOEL-KBPÚ)

         Všechny výše uvedené výsledky a veškeré důležité publikované údaje (včetně jakékoliv vhodné informace o účincích aktivní látky na člověka) a případně informace o úzce souvisejících chemických strukturách se musí brát v úvahu pro určování koncentrace bez pozorovaného účinku (NOEL-KBPÚ), vyjádřené v mg/kg tělesné hmotnosti na den. Musí být vybrána nejnižší KBPÚ.

         KBPÚ, která se má použít pro výpočet přijatelné denní dávky (ADI) však musí být podle okolností vybrána na základě toxikologických nebo farmakologických účinků. U některých doplňkových látek, například antibakteriálních látek, může být vhodnější určovat ADI na základě účinků na lidskou střevní mikroflóru. Neexistují-li mezinárodní přijaté a validované metody pro popis střevní flóry, pak mohou být vhodnější účinky na vybrané a citlivé bakteriální kmeny lidského střeva.

   1. 4.3. Vyhodnocení bezpečnosti pro člověka
      1. 4.3.1. Návrh přijatelné denní dávky (ADI) pro doplňkovou látku

         V případě potřeby by se měla navrhnout přijatelná denní dávka ADI.

         ADI (vyjádřená v mg doplňkové látky nebo materiálu vztahujícímu se k doplňkové látce na osobu a den) se odvodí tak, že se vydělí koncentrace bez pozorovatelného účinku (KBPÚ mg/kg tělesné hmotnosti) vhodným faktorem bezpečnosti a vynásobí průměrnou hmotností lidského těla, tj. 60 kg. Tato KBPÚ, vyjádřená v mg na kg tělesné hmotnosti na den může být vybrána s použitím toxikologických nebo farmakologických výsledků. V některých případech může být ADI, stanovená na doplňkových látkách s mikrobiologickými vlastnostmi, vhodnější. Výběr bude záležet na tom, která vlastnost je nejdůležitější z hlediska zdravotního rizika pro spotřebitele.

         Faktor bezpečnosti užitý pro stanovení ADI jednotlivé doplňkové látky musí být vybrán s ohledem na následující:

         1. - na povahu biologického účinku užitého pro určení KBPÚ,
         2. - na důležitost tohoto účinku pro člověka a reverzibilitu účinku,
         3. - na rozsah a kvalitu údajů pro určení KBPÚ,
         4. - na jakoukoliv informaci o účinku nebo účincích složek reziduí.

         Obvykle se použije pro výpočet ADI faktor bezpečnosti nejméně 100 (to znamená faktor 10 pro umožnění potenciální mezidruhové variace a další faktor 10 pro umožnění možných rozdílů v reakcí u různých lidí. Pokud jsou pro aktivní látku k dispozici údaje pro lidi, může se přijmout nižší faktor bezpečnosti.

      1. 4.3.2. Návrh maximálních limitů reziduí (MLR) pro doplňkovou látku

         Pro výpočet MLR se předpokládá, že příjem poživatelných tkání, mléka a vajec představuje jediný zdroj, jemuž je člověk potenciálně vystaven. Pokud tomu tak není, musí být vzaty v úvahu jiné zdroje.

         Řada takových substancí se používala jako doplňkové látky v krmivech i pro jiné aplikace. V těchto případech by měly být vypočítané MLR totožné. Mohou zde být také příklady, kdy se na základě přísných vědeckých úvah vypočítávají různé MLR pro každé užití jestliže způsob, množství, četnost dávkování a doba trvání podávání jsou dostatečně odlišné od těch, které jsou obvykle používány pro doplňkovou látku v krmivech, a že jsou zde důkazy ukazující, že kinetika, nebo metabolismus může vyústit v odlišné profily reziduí. Pro tyto případy se předem stanovilo, že se použijí nejpřísnější MLR.