Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína neobsahuje více než jeden saprofytický mikroorganismus v dávce a je prosta patogenních mikroorganismů. Vakcíny určené pro parenterální podání a tekutiny s nimi dodávané vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.
Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.
Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dnů. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.
Stanovení účinnosti
Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání se podá takový objem rekonstituované vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Pro kontrolu se použije deset kuřat. Po 14 až 21 dnech se každé kuře čelenžuje intramuskulárně 105 LD50 virulentního kmene viru pseudomoru ptáků. Zvířata se pozorují 10 dnů. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže na konci doby pozorování nejméně 90 % vakcinovaných kuřat přežívá a nejeví příznaky onemocnění a všechna kontrolní kuřata uhynula do 6 dnů po inokulaci virulentním čelenžním kmenem.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
V označení na obalu se uvede stáří zvířat, jež se mají vakcinovat.
Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum 
Humánní vakcína proti vzteklině připravená v buněčných kulturách
Je to lyofilizovaný přípravek vhodného stabilního kmene viru vztekliny pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou.
Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím podle návodu, vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.
Vakcína vyhovuje požadavkům článku Vaccina ad usum humanum.
Výroba
Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu. Jestliže není stanoveno oprávněnou autoritou jinak, virus v konečné vakcíně neprojde více pasážemi od matečného inokula než virus vakcíny, která vyhověla v klinické zkoušce na neškodnost a účinnost: dokonce podle autorizované výjimky počet pasáží pro klinickou studii nepřesáhne pět.
Výrobní metoda se validuje, aby se dokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).
Substrát pro pomnožení viru
Virus se pomnoží v buňkách lidské diploidní linie (5.2.3), v kontinuální linii schválené oprávněnou autoritou nebo v buňkách kuřecích embryí odvozených z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).
Inokula
Použitý kmen viru je identifikován záznamy, včetně informace o původu kmene a následné manipulaci s ním.
Pracovní inokulum se připraví nejvýše pěti pasážemi od matečného inokula. Jen takové pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro pomnožování viru.
Totožnost. Každé pracovní inokulum se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.
Virová koncentrace. Aby se zajistila stejnorodost výroby, stanoví se virová koncentrace v každém pracovním inokulu metodou buněčné kultury za použití imunofluorescence.
Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na virová inokula. Je-li virus pasážován na myších mozcích, provedou se specifické zkoušky na myší viry.
Pomnožování a sklizeň viru
Všechny činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami probíhají za aseptických podmínek v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do médií se může použít schválené sérum živočišného, nikoli humánního původu, ale konečné udržovací médium pro buněčný růst při pomnožování viru neobsahuje živočišné sérum: média mohou obsahovat lidský albumin vyhovující článku Albumini humani solutio. Sérum a trypsin použité pro přípravu buněčné suspenze a médií prokazatelně neobsahují infekční cizí agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinům. Média pro buněčnou kulturu mohou obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Virová suspenze se sklízí jednou nebo vícekrát během inkubace. Více sklizní z téže produkční buněčné kultury se může spojit a považovat za jednu sklizeň. Jen taková jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované virové sklizně.
Totožnost. Jednotlivá sklizeň obsahuje virus, který se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.
Virová koncentrace. Infekční virus se stanoví na buněčných kulturách: titrem se sleduje stejnoměrnost výroby.
Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z produkční buněčné kultury, z níž se odvozují jednotlivé sklizně, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).
Purifikace a inaktivace
Virová sklizeň se může koncentrovat a případně též purifikovat vhodnými metodami: virová sklizeň se inaktivuje validovanou metodou v pevně definovaném stadiu výroby, které může být před, během nebo po koncentraci nebo purifikaci. Metoda je prokazatelně schopna inaktivovat rabický virus bez zničení imunogenní aktivity. Při použití betapropiolaktonu nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli 1 : 3500.
Pro přípravu konečné várky vakcíny se použije jen taková inaktivovaná virová suspenze, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na zbytkový infekční rabický virus buďto ihned po inaktivaci, nebo se použije vzorek zmražený bezprostředně po inaktivaci a uchovávaný při -70 °C. Naočkuje se takové množství inaktivované virové suspenze, které odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny na buněčnou kulturu téhož typu, jaký byl použit pro výrobu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.
Zbytková DNK hostitelských buněk. Jestliže se pro pomnožování viru použije kontinuální buněčná linie, stanoví se obsah zbytkové DNK hostitelských buněk vhodnou metodou, jak je uvedeno v článku Producta ab ADN recombinante, a není větší než 100 pg v jedné lidské dávce.
Konečná várka vakcíny
Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných virových suspenzí. Může se přidat schválený stabilizátor k uchování účinnosti přípravku při lyofilizaci a po ní.
K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Obsah glykoproteinu. Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se stanoví obsah glykoproteinu, např. jednoduchou radiální imunodifuzí, metodou ELISA nebo Zkouškou vazby protilátek. Obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.
Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.
Šarže
Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje až do obsahu vlhkosti, který zaručuje optimální stabilitu přípravku. Obaly se uzavírají tak, aby se vyloučila kontaminace a pronikání vlhkosti.
K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti. Za předpokladu, že zkouška na inaktivaci byla provedena v inaktivované virové suspenzi s vyhovujícím výsledkem a zkouška na bovinní sérumalbumin v konečné várce s vyhovujícím výsledkem, mohou být tyto zkoušky vynechány u šarže.
Zkouška totožnosti
Přítomnost antigenu rabického viru se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití protilátek, nejlépe mnonoklonálních. Vedle toho také stanovení účinnosti slouží jako zkouška totožnosti.
Zkoušky na čistotu
Inaktivace. Množství odpovídající nejméně dvaceti pěti lidským dávkám vakcíny se naočkuje na buněčnou kulturu téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.
Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Obsah se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. v jedné lidské dávce.
Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se, pokud není stanoveno jinak, vstříkne každému králíkovi jedna lidská dávka desetkrát zředěná.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.
Stanovení účinnosti
Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti účinku letální dávky rabického viru intracerebrálně podané s množstvím referenčního přípravku nezbytným k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je zapotřebí referenční vakcína kalibrovaná v mezinárodních jednotkách a vhodný rabický virus používaný jako čelenžní přípravek.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Dále uvedená zkouška používá rovnoběžný model s nejméně třemi body pro zkoušený přípravek i pro referenční přípravek. Pouze pracovník se zkušenostmi s touto metodou podání je oprávněn provádět zjednodušenou zkoušku s jedním ředěním zkoušeného přípravku. Taková zkouška dovoluje pracovníkovi určit, že vakcína má účinnost signifikantně vyšší, než je požadované minimum, ale nedává plnou informaci o validitě každého jednotlivého stanovení účinnosti. Užití jednoho ředění dovoluje značnou redukci počtu zvířat předepsaných pro zkoušku a je zvažováno každou laboratoří ve vztahu k ustanovením Evropské konvence pro ochranu obratlovců používaných pro vědecké a jiné experimentální účely.
Výběr a rozložení zkušebních zvířat. Používají se zdravé samičky myší staré asi 4 týdny hmotnosti 11 g až 15 g a pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí do šesti skupin o tolika zvířatech, aby byly splněny požadavky na validitu zkoušky. Pro titraci čelenžní suspenze se rozdělí do čtyř skupin po pěti.
Příprava čelenžní suspenze. Myším se intracerebrálně vstříkne kmen CVS rabického viru, a když myši vykazují známky onemocnění, ale před jejich úhynem, se usmrtí, vyjmou se mozky a připraví se homogenát mozkové tkáně ve vhodném ředidle. Větší částice se oddělí odstředěním a supernatant se použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se suspenzí se rozmrazí, vhodným ředidlem se připraví sériová ředění. Každé ředění se intracerebrálně vstříkne skupině pěti myší po 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují po dobu 14 dnů. Hodnota LD50 neředěné suspenze se vypočítá z počtu zvířat v každé skupině, která vykazují známky onemocnění nebo uhynula mezi pátým a čtrnáctým dnem.
Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Připraví se tři pětinásobná sériová ředění zkoušeného přípravku a tři pětinásobná sériová ředění referenčního přípravku. Připraví se ředění tak, že u nejkoncentrovanějšího ředění lze očekávat, že ochrání více než 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a u nejméně koncentrovaných ředění lze očekávat ochranu nižší než 50 % u zvířat, kterým bylo toto ředění podáno. Každé ze šesti ředění se podá jedné ze šesti šestnáctičlenných skupin zvířat a každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml toho ředění, které bylo přiděleno skupině. Po sedmi dnech se připraví tři identická ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku a injekce se opakuje. Sedm dní po druhé injekci se připraví na základě předchozí titrace taková suspenze čelenžního viru, aby 0,03 ml obsahovalo 50 LD50. Intracerebrálně se každé vakcinované myši vstříkne 0,03 ml této suspenze. Připraví se tři vhodná sériová ředění čelenžní suspenze a suspenze a ředění se přičlení ke čtyřem skupinám po deseti zvířatech. Čelenžní suspenze a tři ředění se intracerebrálně vstříknou čtyřem skupinám myší po 0,03 ml. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní a zaznamenávají se počty zvířat vykazujících známky onemocnění vzteklinou nebo uhynulých v období od pátého do čtrnáctého dne po čelenži.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže 50% ochranná dávka referenčního přípravku i zkoušeného přípravku leží mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myši; jestliže titrace čelenžní suspenze prokáže, že 0,03 ml čelenžní suspenze obsahuje nejméně 10 LD50 jestliže statistická analýza vykazuje signifikantní sklon a nesignifikantní odchylku linearity nebo rovnoběžnosti v závislosti dávka - odpověď; jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti.
Vakcína vyhovuje, jestliže stanovená účinnost je nejméně 2,5 m.j. v lidské dávce.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
V označení na obalu se uvede biologický původ buněk použitých k přípravě vakcíny.
Vaccinum rabiei inactivatum ad usum veterinarium
Inaktivovaná vakcína proti vzteklině pro veterinární použití
Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek z fixního viru vztekliny inaktivovaný vhodným způsobem. Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře nebo v jiných vhodných substrátech a může se purifikovat a koncentrovat. Vakcína může obsahovat adjuvans a vhodnou protimikrobní konzervační látku.
Výroba
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Vakcíny z tkáňových kultur se připravují pomnožením viru v primárních buněčných kulturách ze zdravých zvířat nebo ve vhodných buněčných liniích (5.2.4). Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 28 dní po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virus vztekliny se inaktivuje vhodnou metodou.
U vakcín z buněčných kultur se na buněčných kulturách stejného druhu, jaké byly použity při výrobě vakcíny, provede zkouška na zbytkový infekční virus vztekliny, aby se potvrdila účinná inaktivace viru vztekliny. Množství inaktivovaného viru pro tuto zkoušku odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus.
Účinnost reprezentativní šarže vakcíny se prokazuje přímou čelenží a nepřímou metodou prokazující tvorbu neutralizačních protilátek na každém druhu zvířat, pro který je vakcína určena.
Následující požadavky platí pro tekuté přípravky a pro lyofilizované přípravky rekonstituované podle údajů v označení.
Zkouška totožnosti
Vakcína po podání zvířatům podporuje tvorbu specifických neutralizačních protilátek.
Zkouška na čistotu
Bezpečnost. Jestliže je vakcína určena pro více než jeden druh zvířat, včetně psa, provede se zkouška na psech. Jinak se použije jeden z druhů zvířat, pro který je vakcína určena. Dvěma vnímavým zvířatům se vstříkne způsobem uvedeným v označení dvojnásobek nejmenší dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nevzniknou významné místní nebo systémové reakce.
Inaktivace. Nejméně deseti myším hmotnosti 11 g až 15 g se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml ředění, které odpovídá nejméně pětinásobku udané nejmenší dávky. Pokud vakcína obsahuje protimikrobní konzervační látku nebo adjuvans, rozředí se před aplikací nejvýše desetkrát. V tomto případě, a nebo když vakcinační kmen je patogenní jen pro sající myšky, provede se zkouška na jednodenních až čtyřdenních myškách. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže více než dvě zvířata uhynou v průběhu prvních 48 h, zkouška se opakuje. Zvířata nemají od 3. do 21. dne po podání žádné příznaky vztekliny nebo jiné anomálie, které by bylo možno přičítat vakcíně.
Místo této zkoušky je možno použít u tkáňových vakcín, které neobsahují žádné adjuvans, vhodnější pomnožovací zkoušky na přítomnost zbytkového infekčního viru, pro kterou se použije stejný druh tkáňových kultur, jaký byl použit pro výrobu vakcíny.
Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.
Stanovení účinnosti
Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší před klinickými účinky dále definované dávky vzteklinového viru intracerebrálně podaného v porovnáním s množstvím referenčního přípravku inaktivované vakcíny proti vzteklině pro veterinární použití BRP kalibrované v mezinárodních jednotkách nezbytným k dosažení stejné ochrany.
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se používají zdravé myši ve stáří asi 4 týdnů a hmotnosti 11 g až 15 g z jednoho chovu. Myši se rozdělí do nejméně deseti skupin po nejméně deseti zvířatech. Všechny myši jsou stejného pohlaví.
Příprava suspenze k čelenži. Jedné skupině myší se intracerebrálně vstříkne kmen CVS viru vztekliny. Při vzniku příznaků vztekliny ještě před jejich uhynutím se myši usmrtí, odeberou se mozky a z mozkové tkáně se připraví ve vhodném rozpouštědle homogenní suspenze. Po oddělení hrubých částic odstředěním se supernatant použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se rozmrazí a ve vhodném rozpouštědle se připraví sériové ředění. Každé ředění se použije pro jednu skupinu deseti myší. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 14 dní a v každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se mezi 5. až 14. dnem vyvinuly příznaky vztekliny. Potom se vypočte ID50 neředěné suspenze.
Postup zkoušky. Připraví se nejméně tři sériová ředění zkoušeného přípravku a tři podobné řady ředění porovnávacího přípravku.
Ředění se vyberou tak, aby ředění s nejvyšší koncentrací vakcíny chránilo nejméně 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a ředění s nejnižší koncentrací vakcíny chránilo méně než 50 % zvířat, jimž bylo podáno. Každé ředění se použije u jedné skupiny myší. Každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml příslušného ředění. Za 14 dní po podání vakcíny se připraví suspenze čelenžního viru tak, aby na podkladě předtitrace obsahovala každá čelenžní dávka 50 ID 50 v 0,03 ml. Všem vakcinovaným myším se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml čelenžní suspenze. Mimo to se připraví tři další sériová ředění použitého čelenžního viru. Ředění použité k čelenži a připravená tři další ředění se intracerebrálně vstříknou v dávce 0,03 ml na myš dalším čtyřem skupinám po deseti nevakcinovaných myších. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní. V každé skupině mohou do 4 dní po čelenži uhynout nejvýše dvě myši. V každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se v době od 5 do 14 dní po čelenži vyskytly příznaky vztekliny.
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:
- - 50% ochranná dávka zkoušeného i referenčního přípravku je mezi největší a nejmenší dávkou vakcíny podanou myším,
- - kontrolní titrace čelenžní suspenze prokáže, že v dávce 0,03 ml bylo dosaženo nejméně 10 ID 50,
- - interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti,
- - statistická analýza ukazuje signifikantní vzestup a žádné signifikantní odchylky od linearity a rovnoběžnosti přímek závislosti odpovědi na dávce.
Vakcína vyhovuje zkoušce, když stanovená účinnost je nejméně 1 m.j. v nejmenší předepsané dávce.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
- V označení na obalu se uvede:
- - druh tkáně nebo buněčné kultury, které byly použity pro přípravu vakcíny, a druh původu,
- - nejmenší počet mezinárodních jednotek v dávce.
Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem
Živá vakcína proti vzteklině perorální pro lišky
Je to přípravek z imunogenního kmene oslabeného viru vztekliny. Vakcína se vloží do návnady tak, že se mohou asepticky provést dále popsané zkoušky.
Výroba
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Oslabený kmen viru se pomnožuje ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4); v případě, že buněčné kultury jsou savčího původu, jsou prokazatelně prosté viru vztekliny. Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 14 dnů po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virová suspenze se může smíchat s vhodným stabilizátorem. Vakcína může být tekutá nebo lyofilizovaná. Lyofilizovaná vakcína se před použitím rekonstituuje.
Výběr vakcinačního kmene
Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska imunogenity (viz Stanovení účinnosti) a následujících charakteristik:
- - při perorálním podání v doporučené dávce a doporučenou metodou nevzniknou u čtyřiceti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,
- - při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti lišek v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,
- - při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti psů v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,
- - při perorálním podání desetinásobné doporučené dávky nevzniknou u deseti koček v průběhu 180 dnů od podání žádné příznaky onemocnění vzteklinou,
- - v přirozených a experimentálních podmínkách nedojde u divoce žijících hlodavců k rozšíření virového kmene z jednoho zvířete na druhé,
- - virový kmen má jeden nebo více stabilních genetických markerů, kterými může být rozlišen od jiných virových kmenů vztekliny.
Zkoušení šarže
Pokud byla zkouška účinnosti provedena s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška vypustit při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula.
Zkoušky totožnosti
- A. Po smíchání s monospecifíckým vzteklinovým antisérem vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je naočkována.
- B. Provede se zkouška na prokázání genetických markerů.
Zkoušky na čistotu
Cizí viry.
- a) Po smíchání se specifickým neutralizačním vzteklinovým antisérem nevyvolá vakcína po vyočkování na vnímavou buněčnou kulturu cytopatický efekt. Neprokážou se známky hemaglutinačních nebo hemadsorpčních agens.
- b) Vnímavá buněčná kultura se naočkuje ředěními vakcíny 1 : 10 a 1 : 1000 a inkubuje se při 37 °C. Po 2,4 a 6 dnech se buňky obarví různými typy monoklonálních protilátek, které nereagují s vakcinačním kmenem, ale reagují s jinými kmeny viru vztekliny (např. uliční virus, Pasteurův kmen). Vakcína nevykazuje známky znečištění jinými vzteklinovými viry.
Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.
Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.
Titr viru. Vakcína se titruje ve vhodných buněčných kulturách. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající nejmenšímu titru uvedenému v označení.
Stanovení účinnosti
Použije se nejméně třicet pět lišek nejméně 3 měsíce starých prostých protilátek neutralizujících vzteklinu. Každému z nejméně dvaceti pěti zvířat se podá perorálně návnada uvedená v označení s vakcínou v množství odpovídajícím minimálnímu titru uvedenému v označení. Nejméně deset zvířat zůstává jako kontrolní. Všechna zvířata se pozorují po dobu 180 dnů. Žádné ze zvířat nevykazuje známky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že pozorovací dobu přežije nejméně dvacet pět vakcinovaných zvířat. Po 180 dnech po vakcinaci se všechny lišky intramuskulárně čelenžují virulentním kmenem viru vztekliny schváleným oprávněnou autoritou. Zvířata se pozorují 90 dnů po infekci. Zvířata, jež uhynula z důvodů, které nelze přisoudit vzteklině, se vyloučí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že se počet vakcinovaných zvířat ve zkoušce nesníží na méně než dvacet pět. Vakcína vyhovuje zkoušce, když nejvýše dvě z dvaceti pěti vakcinovaných zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, když více než dvacet pět vakcinovaných zvířat bylo čelenžováno) vykazují příznaky onemocnění vzteklinou. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejméně devět kontrolních zvířat (nebo statisticky odpovídající počet, pokud více než deset kontrolních zvířat bylo čelenžováno) vykazuje příznaky vztekliny a v mozku těchto zvířat se metodou fluorescenčních protilátek nebo jinou spolehlivou metodou prokáže přítomnost viru vztekliny.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
V označení na obalu se uvede podstata genetického markeru virového kmene.
Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae vivum cryodesiccatum
Živá vakcína proti infekční bovinní rinotracheitidě lyofilizovaná
Je to přípravek z jednoho nebo více oslabených kmenů viru infekční bovinní rinotracheitidy (bovinní herpesvirus 1).
Výroba
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře (5.2.4). Virová suspenze se shromáždí a smíchá s vhodným stabilizačním roztokem. Tato směs se potom lyofilizuje.
Výběr vakcinačního kmene
Pro výrobu vakcíny se může použít jen takový kmen viru, který je prokazatelně uspokojivý z hlediska následujících charakteristik: bezpečnost (včetně toho, že nevyvolává potraty a neprochází placentou), nevratnost virulence a imunogenita. Kmen může mít markery. K prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.
Bezpečnost. Pěti telatům ve stáří 3 měsíců nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než 3 měsíce, která nemají protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě, se určeným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Telata se pozorují 21 dní. Telata zůstávají zcela zdravá a neobjeví se významné místní nebo systémové reakce.
Schopnost vyvolat potrat a průchod placentou. Pro zkoušku se použije dvacet čtyři březích krav prostých protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Z toho je osm krav ve čtvrtém měsíci březosti, osm krav v pátém měsíci březosti, osm krav v šestém či sedmém měsíci březosti. Každé krávě se zamýšleným způsobem podá množství viru odpovídající deseti dávkám vakcíny. Krávy se pozorují až do konce březosti. Jestliže během pozorování dojde k abortu, provede se zkouška na přítomnost viru infekční bovinní rinotracheitidy. V plodu ani v placentě se nezjistí přítomnost viru ani virových antigenů. U narozených telat ještě před napitím kolostra se provede zkouška na protilátky proti infekční bovinní rinotracheitidě; nezjistí se žádné takové protilátky.
Nevratnost virulence. Od pěti telat použitých ve zkoušce na bezpečnost vakcíny se v době, kdy vakcinační virus může být snadno detekován, odeberou vhodné vzorky. Ověří se přítomnost a titr viru ve vzorcích. Vzorky se potom smíchají a podají intranazálně dvěma vnímavým telatům stejného stáří. V pěti dalších po sobě jdoucích pasážích se v každé pasáži provádí průkaz přítomnosti viru. Telata zůstanou zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové reakce.
Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná pro průkaz imunogenity.
Zkoušení šarže
Pokud se provede stanovení účinnosti s uspokojivými výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může se tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypustit, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.
Zkoušky totožnosti
- A. Vakcína se rekonstituuje podle údajů v označení. Když se smíchá s vhodným množstvím monospecifického antiséra, rekonstituovaná vakcína již není schopna infikovat vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.
- B. Ověří se markery kmene.
Zkoušky na čistotu
Bezpečnost. Dvěma vnímavým telatům ve stáří tři měsíce nebo v nejnižším věku doporučeném pro vakcinaci, pokud je tento věk méně než tři měsíce, se podá po deseti dávkách rekonstituované vakcíny způsobem uvedeným v označení. Telata se pozorují 21 dní. Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud zvířata zůstávají zcela zdravá a nezjistí se významné místní nebo systémové změny.
Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článek Vaccina ad usum veterinarium.
Mykoplazmata (2.6.7). Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.
Cizí viry. Vakcína se neutralizuje monospecifickým antisérem a inokuluje se do vnímavých buněčných kultur. Kultura se udržují 14 dní a za 7 dní se provede pasáž. Buněčné kultury nejeví známky virové kontaminace.
Titr viru. Titr rekonstituované vakcíny se stanoví na vnímavých buněčných kulturách při teplotě podporující replikaci viru. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně množství viru odpovídající minimálnímu titru viru uvedenému v označení.
Stanovení účinnosti
Použijí se vnímavá telata 2 až 3 měsíce stará a prostá neutralizačních protilátek proti infekční bovinní rinotracheitidě. Pěti telatům se způsobem uvedeným v označení podá množství rekonstituované vakcíny obsahující množství viru, které odpovídá minimálnímu titru viru uvedenému v označení. Dvě telata jsou jako kontrola. Po 21 dnech se podá sedmi telatům intranazálně množství viru infekční bovinní rinotracheitidy, které u vnímavých telat vyvolá vznik typických příznaků onemocnění, jako je teplota, výtok z očí a nosu a ulcerace na nosní sliznici. Zvířata se pozorují 21 dní. Vakcinovaná telata mají jen mírné příznaky, kontrolní mají typické příznaky. Nejméně u čtyř z pěti vakcinovaných telat se v nazální mukóze zjistí maximální titr viru, který je stokrát nižší než průměr maximálního titru viru zjištěný u kontrolních telat. Průměrný počet dní, kdy je virus vylučován, je nejméně o tři dny kratší u telat vakcinovaných než u telat kontrolních.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.
Vaccinum rubellae vivum
Živá vakcína proti zarděnkám
Synonymum. Živá očkovací látka proti zarděnkám
Je to lyofilizovaná suspenze schváleného oslabeného kmene zarděnkového viru. Vakcína se ředí podle návodu bezprostředně před použitím. Vznikne čirá tekutina, jež může být zbarvena přítomným indikátorem pH.
Výroba
Výroba je založena na systému jednotné inokulace a buněčné banky. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu přiměřené imunogenity a bezpečnosti pro člověka. Pokud není prokázáno a schváleno jinak, neprochází virus v hotovém přípravku od základní kultury do přípravy vakcíny více pasážemi, než bylo použito u vakcíny, jejíž bezpečnost a účinnost byla prokázána v klinické studii.
Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že výrobek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).
Substrát pro pomnožení viru
Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3).
Výchozí kultura viru
Kmen použitého zarděnkového viru má průkaznou dokumentaci, která obsahuje informace o jeho původu a následném zacházení. Aby se předešlo nezbytnému použití opic na zkoušku neurovirulence, připraví se výchozí kultura viru ve velkém množství a uchovává se při teplotách pod -20 °C, pokud je lyofilizována, anebo při teplotě pod60 °C, pokud lyofilizována není. Pro pomnožení viru se použije jenom ta výchozí kultura, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Totožnost. Matečné a pracovní inokulum se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.
Koncentrace viru. Koncentrace viru v matečném a pracovním inokulu se stanovuje k zajištění stejnorodosti výroby.
Cizí antigeny (2.6.16). Pracovní výchozí kultura vyhovuje požadavkům na výchozí kulturu viru.
Neurovirulence (2.6.18). Pracovní výchozí kultura vyhovuje zkoušce na neurovirulenci živých virových vakcín. Pro zkoušku jsou vhodné opice Macaca a Cercopithecus.
Pomnožení viru a jeho sklizeň
Všechny pracovní postupy v buněčné bance a se získanými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí (nikoliv lidské) sérum, ale konečné médium pro udržování růstu buněk při pomnožování viru neobsahuje žádné zvířecí sérum. Sérum a trypsin, použité při přípravě buněčné suspenze a při přípravě médií, se zkouší na nepřítomnost cizích antigenů. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a vhodné antibiotikum v nejnižší účinné koncentraci. Je však výhodnější mít po dobu výroby substrát bez antibiotik. Nejméně 500 ml výrobní buněčné kultury se odloží jako neinfikovaná buněčná kultura (kontrolní buňky). V průběhu pomnožování viru se kontroluje teplota inkubace a za 28 dní od naočkování nebo dříve se odebírá virus, a to najednou nebo opakovaně. Opakované odběry z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednu sklizeň viru.
K přípravě konečné várky vakcíny se použije jenom ta sklizeň viru, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Totožnost. Sklizeň viru obsahuje viry, které se prokáží jako zarděnkový virus v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.
Koncentrace viru. Koncentrace viru ve sklizni viru se stanoví ke sledování stejnorodosti výroby a k výpočtu ředění pro konečnou vakcínu. Postupuje se tak, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti.
Cizí antigeny (2.6.16).
Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z přípravy buněčné kultury, z níž se získává virus, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na nepřítomnost cizích antigenů (2.6.16).
Konečná várka vakcíny
Virové sklizně, které vyhověly výše uvedeným zkouškám, se spojí a vyčeří, aby se odstranily buňky. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se naředí, jak je zapotřebí.
K přípravě konečné šarže se použije jenom ta konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícímu požadavku.
Bakterie a houby. Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml zkoušené konečné várky vakcíny.
Šarže
Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených nádobek a lyofilizuje se, až obsah vlhkosti dosáhne hodnoty příznivé pro stabilitu vakcíny. Nádobky se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a přístupu vlhkosti.
K použití se propustí jenom ta šarže, která vyhovuje požadavku na tepelnou stabilitu a požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Jestliže u konečné várky vakcíny byla s vyhovujícím výsledkem provedena zkouška na hovězí sérový albumin, může být tato zkouška u šarže vypuštěna.
Následující stránka