Český lékopis 1997, 1/1998 Sb., účinné od 1. 2. 1998

Předchozí stránka

Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna v tekutině uvedené na štítku nebo v jiné vhodné tekutině vždy s přísadou antibiotik. Předpisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka ředí tak, aby deset očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,2 ml. Směs se naočkuje devíti až jedenácti denním kuřecím embryím z chovu bez specifikovaných patogenů. Embrya se rozdělí do dvou skupin po deseti:

- 0,2 ml se vstříkne do alantoidního vaku každého vejce z první skupiny,
- 0,2 ml se vstříkne na chorioalantoidní membránu každého vejce z druhé skupiny.

Vejce se po dobu 7 dní denně prosvěcují. Embrya, která uhynula v průběhu prvních 24 h, se vyřadí jako nespecifické úhyny; jestliže v každé skupině nepřežije prvních 24 h po naočkování alespoň šest embryí, je zkouška neplatná. U všech embryí, která uhynou po více než 24 h od naočkování, nebo u těch, která přežijí 7 dní, se hledají změny. Zárověň se hledají změny v chorioalantoidních membránách. Alantoidní tekutiny se zkoušejí na přítomnost hemaglutinačních látek a v buňkách získaných odstředěním alantoidní tekutiny se pomocí fluorescenční protilátky zjišťuje přítomnost viru infekční bronchitidy. Mimoto se provede další pasáž na kuřecích embryích.

Materiál z živých a mrtvých embryí se odděleně shromáždí a každá z takto získaných směsí se vstříkne výše uvedeným postupem do deseti vajec pro oba výše popsané způsoby podání. Směsi z chorioalantoidní membrány se vstříknou na tuto membránu, alantoidní tekutiny do alantoidních vaků. Vejce se pozorují 7 dní a zkoušejí stejným způsobem, jak je uvedeno výše.

Očkovací látka nevyhovuje, jestliže dojde k jakémukoliv úhynu nebo vzniku změn, jež by mohla způsobit očkovací látka.

2.6.4 Zkouška na viry leukózy
Podstata zkoušky. Přítomnost virů leukózy se zjišťuje metodou komplement-fixační reakce po pomnožení v buněčné kultuře kuřecích fibroblastů.
Postup zkoušky. Je-li to předepsáno v článku, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. Na buněčné kultury kuřecích embryonálních fibroblastů, o kterých je známo, že podporují pomnožování virů leukózy podskupin A a B, se naočkuje očkovací látka v množství 10 dávek na jednu kulturu. Kultur má být alespoň pět a každá má mít plochu alespoň 60 cm². Fibroblasty se pasážují v tří- až čtyřdenních intervalech a udržují se alespoň 9 dní. Na konci poslední pasáže se buňky oddělí, resuspendují se na koncentraci 10⁷ buněk v ml a připraví se extrakt. Každý extrakt se komplement-fixační reakcí přezkouší na přítomnost skupinově specifického antigenu ptačí leukózy. Na kontrolní buněčné kultury se naočkují viry leukózy podskupin A a B a zkoušejí se souběžně. Očkovací látka nevyhovuje, jestliže se zjistí jakákoliv známka přítomnosti viru leukózy. Nejsou-li výsledky jednoznačné, provedou se další pasáže fibroblastů a zkouší se až do dosažení jednoznačného výsledku.

2.6.5 Důkaz cizích virů zkouškou na buněčných kulturách
Podstata zkoušky. Přítomnost cizích virů se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku do buněčné kultury a sledováním, zda nedojde ke vzniku cytopatického efektu nebo ke vzniku hemadsorpce.
Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna tekutinou uvedenou na štítku nebo jinou vhodnou tekutinou. Předepisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka zředí tak, aby 10 očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,1 ml. Naočkuje se po 0,5 ml směsi na kultury ledvinných buněk odvozených z kuřat, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, nebo na kultury jaterních buněk z embryí, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, a nechá se 1 h adsorpovat při teplotě 37 °C. Kultur by mělo být alespoň pět a měly by mít celkovou plochu asi 150 cm². V kulturách se nejméně pět dní hledají cytopatické efekty, jejichž příčinou může být očkovací látka. Jestliže se nepozorují žádné specifické efekty, provedou se další pasáže směsí buněk a tekutin odebraných ze všech kultur v intervalech nejméně pětidenních a pozorují se v průběhu dvacetidenního inkubačního období. Zkoušejí se rovněž poslední pasáže kultur na přítomnost původců hemadsorpce, k čemuž se použijí kuřecí erytrocyty. Původci hemadsorpce jsou mikroorganismy nebo viry, které způsobují adsorpci erytrocytů na povrch buněčných kultur, v nichž se pomnožili. Hemadsorpce se zjišťuje tímto způsobem: Na konci období zkoušek se z jednovrstvé buněčné kultury slije tkáňové médium a kultura se promyje. Pak se přidá 0,5% suspenze promytých erytrocytů. Nechá se adsorpovat 20 min při teplotě 4 °C. Buňky se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a pozorují se pod mikroskopem. Došlo-li k hemadsorpci, jsou vidět shluky erytrocytů přichycených na jednovrstvou buněčnou kulturu. Jestliže po každé pasáži nepřežije alespoň 80 % kultur, je zkouška neplatná. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se zjistí jakýkoliv cytopatický efekt nebo přítomnost původců hemadsorpce.

2.6.6 Důkaz cizích antigenů zkouškou na kuřatech

Podstata zkoušky. V séru naočkovaných kuřat se sérologickými metodami zjišťuje přítomnost protilátek proti cizím antigenům.

Postup zkoušky. Pokud není v článku předepsáno jinak, provede se zkouška nejméně na deseti dvoutýdenních kuřatech pocházejících z chovu bez specifikovaných patogenů. Každému kuřeti se intramuskulárně vstříkne 100 dávek a do oka se nakape 10 dávek. Za dva týdny se očkování opakuje. Kuřata se pozorují pět týdnů od prvního očkování. V období sledování se kuřatům nepodávají žádné protimikrobní látky.

Od všech kuřat se před prvním očkováním a na konci zkušebního období odebere sérum. Každý vzorek séra se vhodnou metodou vyzkouší na protilátky proti původcům níže uvedených infekcí s výjimkou protilátek proti původci, z něhož byla vakcína připravena. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se dokáže přítomnost cizího antigenů. Zkouška je neplatná a opakuje se, když byla v sérech před očkováním prokázána nějaká protilátka. Jestliže do konce zkoušky přežije méně než 80 % zvířat, je zkouška rovněž neplatná. Se souhlasem národní autority se mohou použít jiné druhy zkoušek, pokud jsou alespoň tak citlivé, jako uvedené zkoušky a přiměřeně specifické.

Infekce	Druh zkoušky
infekční bronchitida¹)	precipitace v agarovém gelu nebo inhibice hemaglutinace
infekce burzy (choroba Gumboro)	precipitace v agarovém gelu
Markova choroba	precipitace v agarovém gelu
Newcastleská choroba	inhibice hemaglutinace
infekce Salmonella pullorum	aglutinace
infekce adenoviry²)	precipitace v agarovém gelu
infekce virem ptačí encefalomyelitidy	precipitace v agarovém gelu
infekce virem ptačí encefalomyelitidy	nebo enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA)
infekce reoviry²)	precipitace v agarovém gelu
infekce viry leukózy²)	sérová neutralizace
influenza A²)	precipitace v agarovém gelu
infekční laryngotracheitida²)	sérová neutralizace

2.6.7 Zkouška na mykoplazmata

Podstata zkoušky. Kultivací na pevných a v tekutých půdách se zjišťuje přítomnost mykoplazmat.

Zkouška používaná pro aviární vakcíny

Živné půdy. Ke kultivaci většiny známých druhů mykoplazmat se používají pevné a tekuté živné půdy popsané níže. Vybrané půdy se vyzkouší alespoň, zda umožňují růst Mycoplasma gallisepticum (půda I) a Mycoplasma synoviae (půda II). Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží.

Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušené vakcíně a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.

Postup zkoušky

Tekuté půdy. Použijí se alespoň dvě tekuté živné půdy, které jsou vhodné pro kultivaci mykoplazmat (viz níže). Pro každou půdu se rozpustí obsah pěti nádobek lyofilizované očkovací látky (nebo nejvýše 5000 očkovacích dávek) v 12 ml tekutiny uvedené na štítku nebo jiné vhodné tekutiny. U tekutých očkovacích látek se použije odpovídající množství. Do 100 ml půdy se naočkuje 10 ml rozpuštěné očkovací látky. Dojde-li po přidání očkovací látky k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (37 ± 1) °C a denně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den od začátku inkubace se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu (miska o průměru 90 mm obsahující 18 ml půdy). Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje.

Pro každé očkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (37 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se 3 týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem. Když na agarové půdě vyroste kolonie, provede se identifikace.

Pevné půdy. Použijí se alespoň dvě pevné živné půdy, které jsou vhodné na kultivaci mykoplazmat (viz níže). Na šest misek od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml směsi očkovací látky popsané ve zkoušce v tekutých živných půdách. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše.

Hodnocení. Vakcína vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty.

Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata

Živné půdy. Použijí se živné půdy vybrané pro podporu pomnožování širokého rozsahu mykoplazmat. U každé šarže se prokáže, že podporuje pomnožování Mycoplasma hyopneumoniae a Ureaplasma urealyticum. Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží. Zkouška se provede s tekutými a pevnými živnými půdami, jež byly vybrány tak, aby společně poskytovaly nejlepší podmínky k pomnožení všech možných kontaminant. Tekuté půdy obsahují fenolovou červeň.

Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušeném přípravku a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.

Vzorkování. Doporučený počet zkoušených nádobek (viz též 2.6.1) 1 % z množství v šarži, nejméně však 4 a nejvýše 10. Obsah nádobek se po případné rekonstituci smíchá.

Postup zkoušky

Tekuté půdy. 50 ml každé půdy se zvlášť naočkuje 5 ml zkoušeného přípravku. Dojde-li po přidání přípravku k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (36 ± 1) °C a třikrát týdně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu v misce o průměru 60 mm. Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Pro každé vyočkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (36 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se tři týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem.

Pevné půdy. Na čtyři misky (o průměru 60 mm) od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml zkoušeného přípravku. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše. Kdyby po sedmi dnech od naočkování byla nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami či poškozena, může se tato miska vyloučit z odčítání za předpokladu, že nevykazuje růst mykoplazmat. Jestliže by v jakékoliv části zkoušky bylo náhodně kontaminováno bakteriemi nebo houbami či poškozeno více než jedna miska, je zkouška neplatná a opakuje se.

Hodnocení. Přípravek vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty nebo ureaplazmaty.

Následující oddíl se uvádí jako informace a rada; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.

Doporučené živné půdy

Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti i nepřítomnosti zkoušené vakcíny.

I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum

a) Tekutá půda

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
koňské sérum (nezahřáté)	20,0 ml
roztok kvasničného výtažku (250 g/l)	10,0 ml
roztok octanu thallného (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml
roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l)	1,20 ml

pH se upraví na 7,8.

b) Pevná půda
Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.

II. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma synoviae

a) Tekutá půda

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (inaktivované při 56 °C, 30 min)	12,0 ml
roztok ß-nikotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

Smíchají se roztoky ß-nikotinamid-adeninu dinukleotidu a cysteiniumchloridu a za 10 min se přidají k ostatním složkám. Hodnota pH se upraví na 7,8.

b) Pevná půda

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
ionagar (3)	1,4 g

Hodnota pH se upraví tak, aby bylo 7,8; sterilizuje se v autoklávu a pak se přidají:

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (nezahřáté)	12,0 ml
roztok β-nicotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

(1) Infuze z hovězího srdce

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
hovězí srdce (pro přípravu infuze)	500,0 g
pepton	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
destilovaná voda do	1000,0 ml

Sterilizuje se v autoklávu.

(2) Esenciální vitaminy

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
Biotin	100,0 mg
pantotenan vápenatý	100,0 mg
choliniumchlorid	100,0 mg
kyselina listová	100,0 mg
inositol	200,0 mg
nikotinamid	100,0 mg
pyridoxoliumchlorid	100,0 mg
riboflavin	10,0 mg
thiaminiumchlorid	100,0 mg
destilovaná voda do	1000,0 ml

(3) Ionagar

Velmi čistý agar používaný pro mikrobiologii a imunologii, připravený výměnou iontů, čímž vzniká produkt mající vyšší čistotu, čirost a pevnost gelu. Obsahuje přibližně:

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy
voda	12,2 %
popel	1,5 %
popel nerozpustný v kyselině	0,2 %
chloridy	0
fosforečnany (jako P₂O₅)	0,3 %
celkový dusík	0,3 %
měď	8 μg/g
železo	170 μg/g
vápník	0,28 %
hořčík	0,32 %

2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky

Podstata zkoušky. Pyrogenní látky obsažené ve sterilním injekčním roztoku vyvolají u králíka po nitrožilním podání vzestup jeho rektální teploty.

Výběr zvířat. Ke zkoušce se použijí zdraví dospělí králíci³) o hmotnosti nejméně 1,5 kg. Zvířata jsou chována v klidném prostředí v individuálních klecích, krmena standardní vyváženou dietou bez obsahu antibiotik a jejich hmotnost nevykazuje během týdne před zkouškou žádný úbytek. Teplota chovné místnosti je stálá a neliší se o více než 3 °C od teploty zkušební místnosti. U všech králíků, používaných k těmto zkouškám, se vedou záznamy o jejich hmotnosti, podaných přípravcích a teplotních křivkách. Po zkoušce s nepyrogenním výsledkem se může králík vzít do nové zkoušky nejdříve za 3 dny, po zkoušce s pyrogenním přípravkem se tento interval prodlužuje na 3 týdny.

Přístrojové vybavení. Pohyblivost králíka při zkoušce se omezuje vhodným zařízením, které fixuje netraumatizujícím způsobem pouze šíji zvířete a dovolí mu zaujmout normální uvolněnou pozici v sedě. K měření tělesné teploty se použijí rektální teploměry nebo elektrické termometry, které udávají teplotu s přesností 0,1 °C. Po lehkém potření nedráždivou vazelínou jsou zavedeny do konečníku za vnitřní sfinkter, tj. přibližně do hloubky 5 cm. Tato hloubka zavedení teploměru musí být u každého králíka během celé zkoušky konstantní.

Nádoby, injekční stříkačky a jehly, které přicházejí do styku se zkoušeným roztokem, se pečlivě vymyjí vodou pro injekci a sterilizují v horkovzdušném sterilizátoru 30 min při 250 °C nebo 1 h při 200 °C.

Předběžné otestování králíků. U každého králíka, vybraného pro zkoušku na pyrogen, je třeba otestovat jeho citlivost na nepyrogenní roztok chloridu sodného (9 g/l), zahřátý na 38,5 °C a podaný nitrožilně v dávce 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Rektální teplota měřená průběžně od 90 min před injekcí do 3 h po injekci nevykazuje změnu vyšší než 0,6 °C, jinak se zvíře nepoužije k vlastní zkoušce. Tento test citlivosti se též provede u všech králíků, kteří mají být po zkoušce s pyrogenním výsledkem znovu vzati do pokusů.

Provedení zkoušky. Zkouška se provádí v oddělené nerušené místnosti se stálou teplotou kolem 20 °C. Ke zkoušce se použijí tři králíci, kterým je večer předtím odebrána potrava. Po upoutání do fixačního zařízení a zavedení rektálních termometrů se u každého zvířete 90 min sleduje tělesná teplota v 30min intervalech. Za "výchozí teplotu" králíka je považován průměr ze dvou odečtů, naměřených v posledních 40 min před podáním zkoušeného roztoku. "Maximální teplotou" se rozumí nejvyšší teplota naměřená v 30min intervalech v průběhu 3 h po podání zkoušeného roztoku. Reakce králíka je vyjádřena rozdílem mezi jeho výchozí a maximální naměřenou teplotou. Jestliže je tento rozdíl negativní, je výsledek počítán jako nulová odpověď. Ze zkoušky se vyřadí králík, u kterého se při stanovení "výchozí teploty" liší naměřené dvě hodnoty o více než 0,2 °C nebo"výchozí teplota" je vyšší než 39,8 °C nebo nižší než 38,0 °C. U jednotlivých zvířat ve skupině se jejich "výchozí teploty" mezi sebou neliší o více než 1 °C.

Zkoušený roztok, zahřátý na teplotu asi 38,5 °C, se pomalu vstříkne do marginální ušní žíly králíka s dobou podání nejvýše 4 min, není-li v příslušném článku uvedeno jinak. Zkoušená látka se může rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu sodného (9 g/l) nebo jiným předepsaným ředidlem. Množství látky pro provedení zkoušky se liší podle zkoušeného přípravku a je předepsáno v příslušném článku. Objem vstřikovaného roztoku má být nejméně 0,5 ml/kg a nejvýše 10 ml/kg tělesné hmotnosti.

Zhodnocení výsledků. Výsledek zkoušky se posoudí na základě naměřených vzestupů rektální teploty u použité skupiny králíků podle tabulky 2.6.8-1.

Jestliže součet reakcí (tj. vzestupů rektální teploty u jednotlivých králíků ve skupině) je vyšší než hodnoty uvedené v druhé kolonce, ale menší než limity uvedené ve třetí kolonce, zkouška se opakuje na další trojici králíků až do celkového a konečného počtu dvanácti zvířat.

Králíci, u nichž vzestup rektální teploty ve zkoušce na pyrogen přestoupí 1,2 °C,se trvale vyřadí.

Tab. 2.6.8-1

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1
Počet králíků	Přípravek vyhovuje, není-li součet reakcí vyšší než	Přípravek nevyhovuje, je-li součet reakcí vyšší než
3	1,15 °C	2,65 °C
6	2,80 °C	4,30 °C
9	4,45 °C	5,95 °C
12	6,60 °C	6,60 °C

2.6.9 Zkouška na neškodnost
Všeobecná zkouška
Zkouška se provede na skupině pěti zdravých myší, vážících 17 g až 22 g. Množství zkoušené látky, předepsané v příslušném článku, se rozpustí v 0,5 ml vody na injekci R nebo sterilního roztoku chloridu sodného (9 g/l) a vstříkne se myším do ocasní žíly během 15 s až 30 s, není-li předepsáno jinak.
Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádná myš neuhyne během 24 h nebo během doby, která je předepsána v příslušném článku. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu jednoho zvířete ze skupiny se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže z druhé skupiny neuhyne během určené doby pozorování žádná myš.
Imunní séra a vakcíny pro humánní použití
Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se intraperitoneálně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po jedné lidské dávce, nejvýše však po 1,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříkne jedna lidská dávka, nejvýše však 5,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.
Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití
Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se podkožně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříknou nejméně 2 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní.
Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.

2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu

Podstata zkoušky. Přítomnost znečištěnin typu histaminu ve zkoušeném přípravku vyvolá na izolovaném tenkém střevě morčete kontrakce, které se porovnávají s účinkem standardu (histaminiumdichloridu).

Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravé morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích 24 h ponecháno bez krmiva. Po usmrcení vykrvácením se odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se šetrně pomocí stříkačky roztokem B, zahřátým na teplotu 34 °C až 36 °C. Na oba konce střevního segmentu se připevní tenká nit, kterou se prošije střevní stěna tak, aby střevo zůstalo průchodné. Jeden konec střeva se touto nití připevní ke skleněnému nosiči a vloží se na dno orgánové lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který je udržován na stálé teplotě 34 °C až 36 °C a probublává se směsí 95 % (V/V) kyslíku a 5 % (V/V) oxidu uhličitého. Druhý konec střeva se napojí na izotonický snímač kontrakcí, které se registrují pomocí kymografu nebo jiným vhodným kontinuálním zapisovačem při zvětšení přibližně dvacetinásobném. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by být upraveno podle citlivosti orgánu.

Příprava roztoků.

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití
Roztok A:	chlorid sodný	160,0 g
	chlorid draselný	4,0 g
	chlorid vápenatý bezvodý	2,0 g
	chlorid hořečnatý bezvodý	1,0 g
	hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	0,10 g
	voda na injekci do	1000,0 ml
Roztok B:	roztok A	50,0 ml
	atropiniumsulfat	0,0005 g
	hydrogenuhličitan sodný	1,0 g
	glukosa monohydrát	0,5 g
	voda na injekci do	1000,0 ml

Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h.

Porovnávací roztok. Jako porovnávací roztok se používá roztok histaminiumdichloridu R o doporučené koncentraci 0,1 mg/ml. Připraví se vždy čerstvý.

Provedení zkoušky. Orgánová lázeň se vypláchne roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají stahy střeva přidáváním roztoku histaminiumdichloridu R v objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml, aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální kontrakci. Tato dávka se nazývá "dávka vysoká". Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne roztokem B (kontinuálním průtokem bez vyprázdnění lázně). Dávky se aplikují v pravidelných intervalech umožňujících úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).

Po zjištění "vysoké dávky" se určuje dávka zvaná "nízká" tím, že se do lázně přidává roztok histaminiumdichloridu R ve větším zředění (ale ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve srovnání s dávkou "vysokou".

V dalším postupu se pravidelně střídá podávání "vysoké" a "nízké" dávky roztoku histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec pozorovatelná) byla menší než stah po “vysoké dávce“ histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné a velikost stahů po "vysoké" i "nízké" dávce histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.

Zhodnocení výsledků. Ze srovnání velikosti kontrakce střeva po podání zkoušené látky s kontrakcemi dosaženými po "vysoké" a "nízké" dávce histaminu se provede odhad obsahu histaminové účinnosti ve zkoušené látce, vyjádřený v mikrogramech báze histaminu. Tato hodnota nemá přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.

Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem v množství, které představuje povolené maximum pro zkoušenou látku podle lékopisného článku, a pozoruje se, zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li kontrakce, vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná nebo jsou-li následné odpovědi na "vysokou" a "nízkou" dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné a provede se Zkouška na hypotenzivní látky (2.6.11).

2.6.11 Zkouška na hypotenzivní látky
Podstata zkoušky. Nežádoucí příměs látek snižujících krevní tlak ve zkoušeném přípravku se zjišťuje na krevním tlaku anestezované kočky v porovnání s účinkem histaminu.
Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravá kočka o hmotnosti nad 2 kg, která se uvede do celkové anestezie pomocí chloralosy nebo barbiturátu tak, aby se zajistilo udržování stálého krevního tlaku.⁴)
Zvíře se upevní na operačním stole v poloze na zádech a dbá se na to, aby tělesná teplota, měřená rektálním teploměrem, neklesla pod fyziologickou hodnotu. Do průdušnice se zavede dýchací kanyla. Druhá kanyla, naplněná heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l), se zavede do arteria carotis communis a spojí se s vhodným snímačem krevního tlaku a s registračním zařízením, umožňujícím kontinuální záznam. Pro nitrožilní podávání zkoušeného přípravku a referenční látky se zavede do vena femoralis třetí kanyla, naplněná též heparinizovaným roztokem chloridu sodného (9 g/l). Po deseti- až patnáctiminutové stabilizaci krevního tlaku se přistoupí k vlastní zkoušce.
Příprava roztoků. Zkoušená látka se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) nebo v jiném předepsaném rozpouštědle na koncentraci předepsanou v příslušném článku.
Referenční látkou je histaminiumdichlorid R, který se rozpustí v roztoku chloridu sodného (9 g/l) na koncentraci odpovídající 0,1 μg histaminové báze v 1 ml (roztok histaminu).
Provedení zkoušky. Nejdříve je třeba ověřit citlivost zvířete na histamin tím, že se mu vstřikuje v pravidelných intervalech roztok histaminu v dávkách, odpovídajících 0,1 μg a 0,15 μg histaminové báze (tj. 1,0 ml a 1,5 ml roztoku histaminu RS) na kilogram tělesné hmotnosti. Každá následující dávka se vstříkne nejdříve za 1 min po navrácení krevního tlaku k normě. Kočka se použije ke zkoušce pouze tehdy, jestliže po nižší dávce histaminu dojde ke zřetelnému a konstantnímu poklesu krevního tlaku a jestliže vyšší dávka histaminu vyvolá vyšší odpověď.
Při vlastní zkoušce se zvířeti vstříkne 1 ml roztoku histaminu na kilogram, pak dvakrát roztok zkoušeného přípravku v objemu a koncentraci předepsané v příslušném článku a nakonec opět 1 ml roztoku histaminu na kilogram. Tato čtveřice dávek se dvakrát opakuje a celá zkouška se zakončí podáním 1,5 ml roztoku histaminu RS na kilogram. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže pokles krevního tlaku na vyšší dávku histaminu (1,5 ml/kg) je větší než na dávku nižší (1,0 ml/kg).
Zhodnocení výsledků. Zkoušený přípravek nevyhovuje:
1. a) jestliže průměrná hodnota ze série odpovědí na zkoušený přípravek je větší než průměr odpovědí na 1,0 ml roztoku histaminu na kilogram, nebo
2. b) jestliže některá z dávek zkoušeného přípravku vyvolá větší pokles krevního tlaku než závěrečná dávka roztoku histaminu (1,5 ml/kg).
Kočka se nemůže použít ke zkoušení jiného přípravku na obsah hypotenzivních látek, jestliže platí kritérium b) nebo jestliže odpověď na konečnou vyšší dávku histaminu je menší než průměr odpovědí na předchozí nižší dávky histaminu.

2.6.12 Zkouška mikrobiálního znečištění nesterilních výrobků (celkový počet živých aerobů)

Celkový počet živých aerobů se stanoví metodou membránové filtrace, počítáním na agarových půdách nebo za pomoci řady ředění podle předpisu.

Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění. Opatření k vyloučení znečištění nepůsobí na prokazované mikroorganismy.

Pokud není předepsáno jinak, používá se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky, odebrané za výše uvedených podmínek. K získání požadovaného množství se smíchá více vzorků látky náhodně odebraných nebo obsah dostatečného množství nádob. Podle povahy zkoušené látky se ředí, rozpouští, suspenduje nebo emulguje za použití vhodné tekutiny.

Pokud má látka protimikrobní vlastnosti, odstraní se tyto zředěním, neutralizací nebo filtrací.

Použije se vhodný stupeň ředění, aby počet kolonie tvořících jednotek byl v doporučených mezích použité metody.

Doporučené živné půdy jsou uvedeny dále.

Příprava vzorku

Látky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 (viz dále) nebo v jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek, a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.

Látky nerozpustné ve vodě (nelipofilní). 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se suspenduje v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině, která v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek a doplní se jí na 100 ml (povaha některých látek vyžaduje použít větší objem). Zkoušená látka se v případě potřeby rozdrtí a suspenze se mechanicky zhomogenizuje. Je možné přidat vhodnou, povrchově aktivní látku, např. ke špatně smáčivým látkám se může přidat polysorbát 80 v koncentraci 1 g/l k usnadnění tvorby suspenze. Pokud je třeba, upraví se pH na asi 7.

Látky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se zhomogenizuje s 5 g polysorbátu 20 nebo 80, přičemž se, pokud je to třeba, zahřeje na 40 °C (výjimečně lze v nezbytných případech zahřát po krátkou dobu na 45 °C). Při této teplotě se na vodní lázni nebo v sušárně dobře promíchá a přidá se 85 ml tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 zahřátého, pokud je to třeba, na nejvýše 40 °C. Tato teplota se udržuje jen po dobu potřebnou k vytvoření emulze a nesmí překročit 30 min. Pokud je třeba, upraví se pH emulze na asi 7.

Zkoušení vzorku

Membránová filtrace

Používají se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm a jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silně lihové roztoky.

Dále popsaná metoda se vztahuje na použití membránových filtrů o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacích a promývacích roztoků. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil přenesení filtru na povrch živné půdy. Použijí se dva membránové filtry, na každý se přenese 10 ml nebo množství roztoku odpovídající 1 g zkoušeného vzorku a ihned se zfiltruje. Je-li třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby byl očekávaný počet kolonií 10 až 100. Oba filtry se promyjí nejméně třikrát asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0. Pro lipofilní látky může tato tekutina obsahovat vhodnou povrchově aktivní látku, jako je polysorbát 20 nebo 80. Jeden z filtrů, určený pro stanovení počtu bakterií, se přenese na povrch agarové půdy B a druhý, určený pro stanovení počtu hub, na povrch agarové půdy C. Půda B se inkubuje při teplotě 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní a půda C při teplotě 20 °C až 25 °C též po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se počet mikroorganismů na 1 g nebo 1 ml zkoušené látky, pokud je třeba zvlášť bakterie a zvlášť houby.

Počítání na pevných půdách

Pro bakterie. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy B ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 300. Od každého ředění se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 30 °C až 35 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misky s nejvyšším počtem kolonií s přihlédnutím k tomu, že 300 kolonií na plotně je maximum pro správné vyhodnocení.

Pro houby. Používají se Petriho misky o průměru 9 cm až 10 cm; do každé se dá směs 1 ml zkoušeného roztoku a asi 15 ml agarové půdy C ohřáté na nejvýše 45 °C. Alternativně se zkoušený roztok rozetře na povrch ztuhlé půdy v Petriho misce o stejném průměru. Pokud je třeba, zředí se zkoušený roztok tak, aby počet kolonií nepřesahoval 100. S každým ředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky a inkubují se při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud není možný spolehlivější odečet v kratší době. Spočítají se vyrostlé kolonie a vypočítá se výsledek z misek s počtem kolonií menším než 100.

Sériové ředění

Připraví se série dvanácti zkumavek, z nichž každá obsahuje 9 ml až 10 ml živné půdy A. Do každé z prvních tří zkumavek se přidá 1 ml 10krát zředěné, rozpuštěné nebo zhomogenizované látky, jak je popsáno výše. Do dalších tří zkumavek se přidá po 1 ml 100krát zředěné a do následujících tří po 1 ml 1000krát zředěné látky. Do posledních tří zkumavek se přidá po 1 ml rozpustidla. Zkumavky se inkubují při 30 °C až 35 °C nejméně po dobu 5 dnů. V posledních třech zkumavkách nemá dojít k růstu mikroorganismů. Pokud odečítání výsledků je nesnadné nebo nejisté z důvodů přítomnosti zkoušené látky, provede se vyočkování do tekuté půdy nebo na pevnou půdu a výsledky se odečítají až po další inkubační době. Nejpravděpodobnější počet mikrobů v 1 g nebo v 1 ml se stanoví z tabulky 2.6.12-1.

Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů
Počet zkumavek s mikrobiálním růstem pro použité množství zkoušeného přípravku			Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml)
100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce	100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce	100 mg nebo 0,1 ml ve zkumavce
3	3	3	> 1100
3	3	2	1100
3	3	1	500
3	3	0	200
3	2	3	290
3	2	2	210
3	2	1	150
3	2	0	90
3	1	3	160
3	1	2	120
3	1	1	70
3	1	0	40
3	0	3	95
3	0	2	60
3	0	1	40
3	0	0	23

Jestliže v prvním sloupci vykazují mikrobiální růst dvě zkumavky nebo méně, je nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v 1 g (nebo v 1 ml) menší než 100.

Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu

Je-li třeba, postupuje se takto: dále uvedené testovací kmeny se kultivují 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C nebo pro Candida albicans 48 h při 20 °C až 25 °C ve zkumavkách s půdou A.

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu
Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538 P (NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)

nebo	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Bacillus subtilis, např.	ATCC 6633 (NCIB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Candida albicans, např.	ATCC 2091 (CIP 1180.79, CCM 8226, CNCTC 55/79)
nebo	ATCC 10231 (NCPF 3179, CIP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)

Část vyrostlé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 tak, aby vzniklá suspenze obsahovala v 1 ml asi 100 živých zárodků.

Je-li třeba, použije se samostatně suspenze každého mikroorganismu jako kontrola metod na stanovení počtu zárodků za přidání a též za nepřítomnosti zkoušené látky.

Při ověřování metody se počet u každého testovaného mikroorganismu nesmí lišit o více než desetinásobek od vypočteného množství referenční suspenze. K ověření sterility půd, ředicího roztoku a aseptického provedení zkoušky se stanoví celkový počet živých aerobních zárodků za použití sterilního tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 jako zkoušeného přípravku. Nemá v něm být prokázán žádný růst mikroorganismů.

Vyhodnocení výsledků

Je-li v článku uveden limit počtu, interpretuje se takto:
1. 10² mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10²;
2. 10³ mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 . 10³ atd.

Následující část se uvádí pro informaci a jako vodítko; netvoří závaznou součást celkové metody.

Doporučené živné půdy a roztoky

Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0
dihydrogenfosforečnan draselný	3,56 g⁵)
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,23 g²)
chlorid sodný	4,30 g²)
pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
voda	1000 ml

Může se přidat polysorbát 20 nebo 80 (1 g/l až 10 g/l). Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)
pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)
pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
glukosa monohydrát	40,0 g
agar	15,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku nebo e přidá 50mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.

Tekutá půda D (laktosová půda)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda)
masový výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
laktosa	5,0 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)
pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
glukosa mohohydrát	5,0 g
sušená hovězí žluč	20,0 g
dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
brilantní zeleň	15 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení)
kvasničný výtažek	3,0 g
pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
žlučové soli	1,5 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	15,0 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	2 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda)
pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
laktosa	10,0 g
sušená hovězí žluč	5,0 g
bromkresolová červeň	10 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar)
pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
laktosa	10,0 g
chlorid sodný	5,0 g
žlučové soli	1,5 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	30 mg
krystalová violeť	1 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení)
pepton	8,6 g
sušená hovězí žluč	8,0 g
chlorid sodný	6,4 g
uhličitan vápenatý	20,0 g
tetrathionan draselný	20,0 g
brilantní zeleň	70 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)
masový výtažek	10,0 g
pepton z masa	10,0 g
laktosa	10,0 g
citronan sodný	20,0 g
citronan železitý	1,0 g
deoxycholan sodný	5,0 g
agar	13,5 g
neutrální červeň	20 mg
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)
xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
laktosa	7,5 g
sacharosa	7,5 g
chlorid sodný	5,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
fenolová červeň	80 mg
agar	13,5 g
deoxycholan sodný	2,5 g
thiosíran sodný	6,8 g
citronan amonno-železitý	0,8 g
voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou)
pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
agar	20,0 g
fenolová červeň	80 mg
brilantní zeleň	12,5 mg
voda	1000 ml

Povaří se 1 min. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)
masový výtažek	3,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
chlorid sodný	5,0 g
laktosa	10,0 g
sacharosa	10,0 g
glukosa monohydrát	1,0 g
citronan amonno-železitý	0,3 g
thiosíran sodný	0,3 g
fenolová červeň	25 mg
agar	12,0 g
voda	1000 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.

Agarová půda N (cetrimidový agar)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar)
pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
chlorid hořečnatý	1,4 g
síran draselný	10,0 g
cetrimid	0,3 g
agar	13,6 g
voda	1000 ml
glycerol	10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)
pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
masový výtažek	5,0 g
kvasničný výtažek	1,0 g
chlorid lithný	5,0 g
agar	20,0 g
glycin	12,0 g
pyruvan sodný	10,0 g
voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.

Půda P (obohacená půda pro klostridia)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia)
masový výtažek	10,0 g
pepton	10,0 g
kvasničný výtažek	3,0 g
rozpustný škrob	1,0 g
glukosa monohydrát	5,0 g
cysteiniumchlorid	0,5 g
chlorid sodný	5,0 g
octan sodný	3,0 g
agar	0,5 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.

Půda Q (Columbia agar)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia) Půda Q (Columbia agar)
pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
peptický hydrolyzát masa	5,0 g
pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
kvasničný výtažek	5,0 g
kukuřičný škrob	1,0 g
chlorid sodný	5,0 g
agar, podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia) Půda Q (Columbia agar) Půda R (laktoso-siřičitanová půda)
pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
kvasničný výtažek	2,5 g
chlorid sodný	2,5 g
laktosa	10,0 g
cysteiniumchlorid	0,3 g
voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ±0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).

2.6.13 Zkoušky na specifické mikroorganismy

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Důkaz. Zkoušený přípravek se zpracuje postupem uvedeným v části 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije živná půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale ne více než 5 h). Tekutina se protřepe, homogenizát a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušené látky se přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Přípravek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.

Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství živné půdy E se přidají z homogenizátu a nebo roztoku zkoušeného přípravku množství odpovídající 1,0 g, 0,1 g a 0,01 g nebo 1,0 ml, 0,1 ml a 0,01 ml přípravku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného přípravku, které dává pozitivní výsledek, a největší množství zkoušeného přípravku, které dává negativní výsledek.

Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.

Tab. 2.6.13-1

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia) Půda Q (Columbia agar) Půda R (laktoso-siřičitanová půda) Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie Tab. 2.6.13-1
Výsledky pro množství přípravku			Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku
1 g nebo 1 ml	0,1 g nebo 0,1 ml	0,01 g nebo 0,01 ml	Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku
+	+	+	více než 10²
+	+	-	méně než 10² a více než 10
+	-	-	méně než 10 a více než 1
-	-	-	méně než 1

Escherichia coli

Do 100 ml živné půdy G se přidá objem kultury připravený jako pro zkoušku na enterobakterie a jiné vybrané gramnegativní bakterie v živné půdě D, v množství odpovídajícím 1 g nebo 1 ml zkoušené látky. Inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovou půdu H a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Nárůst červených, obvykle nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek, obklopených někdy načervenalou precipitační zónou, indikuje možnou přítomnost E. coli. Tento výsledek je možné potvrdit tvorbou indolu při (44 ± 0,5) °C nebo jinými biochemickými reakcemi. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.

Salmonella

Množství odpovídající 10 g nebo 10 ml zkoušené látky se inkubuje 5 h až 24 h v půdě D při 35 °C až 37 °C, aby se zajistilo optimální obohacení. 10 ml obohacené kultury se přenese do 100 ml živné půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 42 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy, vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

- na půdě J: dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,
- na půdě K: dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,
- na půdě L: malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.

Pseudomonas aeruginosa

Do 100 ml živné půdy A se dá 10 ml upraveného zkoušeného vzorku (viz 2.6.12) nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml přípravku. Promíchá se a inkubuje 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na agarovou půdu N a inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, přípravek vyhovuje. Jestliže vyrostou gramnegativní tyčinky, obvykle se zelenavou fluorescencí, provede se oxidasová zkouška a sleduje se, zda dojde k růstu v půdě A při 42 °C. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se nezjistí kolonie popsaného typu a jestliže je ověřovací biochemická zkouška negativní.

Staphylococcus aureus

Připraví se obohacená kultura, jak je uvedeno u Ps. aeruginosa, a vyočkuje se na vhodnou půdu, např. na agarovou půdu O. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Není-li pozorován žádný růst, přípravek vyhovuje. Černé kolonie grampozitivních koků, často obklopené jasnými zónami, mohou indikovat přítomnost S. aureus. Ty mohou být potvrzeny jako katalasa-pozitivní koky, a dále např. koagulasovou a deoxyribonukleasovou zkouškou. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se neobjeví popsané kultury nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.

Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky na specifické mikroorganismy

Pokud je třeba, postupuje se takto: dále uvedené kmeny se odděleně kultivují 18 h až 24 h ve zkumavkách v uvedených půdách při 30 °C až 35 °C.

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia) Půda Q (Columbia agar) Půda R (laktoso-siřičitanová půda) Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie Tab. 2.6.13-1 Escherichia coli Salmonella Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, např.	ATCC 6538P	půda A
	(NCIB 8625, CIP 53.156, CCM 2022, CNCTC Mau 28/58)
nebo	ATCC 6538	půda A
	(NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Pseudomonas aeruginosa, např.	ATCC 9027	půda A
	(NCIB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65)
Escherichia coli, např.	ATCC 8739	půda D
	(NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Salmonella typhimurium⁶)		půda D

Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých zárodků v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na E. coli, Salmonelly, Ps. aeruginosa a S. aureus, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného přípravku, je-li to nutno.Použitá metoda má umožnit důkaz hledaného mikroorganismu.

Klostridie

Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro přípravky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií, a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto přípravky mají obecně nízký celkový počet zárodků. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.

1. Zkouška na klostridie. Zkoušený přípravek se zpracuje tak, jak je uvedeno v části 2.6.12. Připraví se dvě stejné dávky odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného přípravku. Jedna se zahřívá na 80 °C po dobu 10 min a potom se rychle ochladí. Po protřepání se z ní naočkuje 10 ml do zkumavky (38 mm x 200 mm) nebo do jiné vhodné nádoby obsahující 100 ml živné půdy P. Druhá dávka se nezahřívá a naočkuje se stejným způsobem do druhé zkumavky. Obě zkumavky se inkubují za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na živnou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin, a inkubují se opět 48 h při 35 °C až 37 °C. Přípravek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.

Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na živnou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se za aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

2. Stanovení počtu Clostridium perfringens. Zkoušený přípravek se zpracuje tak, jak je popsáno v části 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0.

Stanoví se nejpravděpodobnější počet mikrobů tak, jak je popsáno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikrobů (2.6.12). Přenese se vždy 1 ml zhomogenizovaného roztok do zkumavky (16 mm x 160 mm) nebo jiné vhodné nádoby obsahující 9 ml živné půdy R a malou Durhamovu zkumavku. Opatrně se promíchá a inkubuje při (45 ± 0,5) °C po dobu 24 h až 48 h.

Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem nejméně v jedné desetině objemu, indikují přítomnost Cl. perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Příprava vzorku Zkoušení vzorku Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu Vyhodnocení výsledků Doporučené živné půdy a roztoky Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0 Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu) Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky) Tekutá půda D (laktosová půda) Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae) Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení) Tekutá půda G (MacConkeyova půda) Agarová půda H (MacConkeyův agar) Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení) Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar) Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem) Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou) Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem) Agarová půda N (cetrimidový agar) Agarová půda O (Baird-Parkerův agar) Půda P (obohacená půda pro klostridia) Půda Q (Columbia agar) Půda R (laktoso-siřičitanová půda) Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie Tab. 2.6.13-1 Escherichia coli Salmonella Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Klostridie
pro 1. metodu Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.03, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79);
pro 2. metodu Clostridium perfringens, např.	ATCC 13124 (NCIB a NCTC 6125, CIP 103.409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Cl. sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.

2.6.14 Bakteriální endotoxiny
Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny (LAL-test) se používá lyzát z amébocytů ostrorepa, Limulus polyphemus. Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinů, hodnotě pH a teplotě.
K reakci je nutná přítomnost některých dvojmocných iontů, pro-enzymatického srážecího komplexu a srážlivého proteinu, které jsou obsaženy v lyzátu.
V článcích jsou uvedeny požadavky na obsah bakteriálních endotoxinů jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže má nejvýše limitní koncentraci endotoxinu. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu. Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.
Před provedením zkoušky na endotoxiny se u zkoušeného vzorku ověří:
1. - zda použité zařízení neadsorpuje endotoxiny;
2. - citlivost lyzátu (λ);
3. - nepřítomnost interferujících faktorů.
Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.
Ve zkoušce se používají tato zkoumadla a referenční přípravek.
Referenční přípravek endotoxinu BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.
Lyzát z amébocytů limula. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ), jak je předepsáno v části Citlivost lyzátu.
Citlivost lyzátu je definována jako nejnižší koncentrace endotoxinu, při které dojde v podmínkách zkoušky ke vzniku pevného gelu, a vyjadřuje se počtem endotoxinových jednotek v mililitru.
Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxin ve zkoušeném přípravku dává negativní výsledek. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.
Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l RS a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l RS. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,5 až 7,5 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek. Postup zkoušky
Pokud není stanoveno jinak, provádí se příprava roztoků pro zkoušku a jejich ředění vodou pro LAL.
Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného roztoku kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l RS, hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l RS nebo vhodným tlumivým roztokem na hodnotu 6,5 - 7,5. Odpovídající objem lyzátu se nakape na vhodný povrch (např. podložní sklo nebo zkumavka) předmětů vyhřátých na teplotu (37 ± 1) °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla zjištěna experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní se hodnotí tvorba pevného gelu, který se nerozpadne při opatrném otočení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.
Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 X, X, 0,5 X a 0,25 X, kde X je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň v posledním ředění každé série musí být negativní výsledek. Zkouší se ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL, postupem uvedeným v části Postup zkoušky. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu v každé sérii ředění, u které došlo k pozitivní reakci. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší o více než o dvojnásobek od hodnoty deklarované, je citlivost ověřena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.
Interferující faktory. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního přípravku endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku neobsahujících už zjistitelný endotoxin. Tyto vzorky se použijí v nejvyšším účinném ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:
Obě hodnoty jsou vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu na mililitr.

Následující stránka

Zkouška používaná pro aviární vakcíny

Postup zkoušky

Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata

Postup zkoušky

Doporučené živné půdy

Tab. 2.6.8-1

Všeobecná zkouška

Imunní séra a vakcíny pro humánní použití

Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití

Příprava vzorku

Zkoušení vzorku

Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů

Růstové vlastností půd a validita metod na stanovení počtu

Vyhodnocení výsledků

Doporučené živné půdy a roztoky

Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

Tekutá půda D (laktosová půda)

Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, krystalovou violetí a neutrální červení)

Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

Agarová půda H (MacConkeyův agar)

Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a brilantní zelení)

Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

Agarová půda K (deoxycholanový agar s xylosou a lysinem)

Agarová půda L (agar s brilantní zelení, fenolovou červení, laktosou a sacharosou)

Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Agarová půda N (cetrimidový agar)

Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Půda P (obohacená půda pro klostridia)

Půda Q (Columbia agar)

Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie

Tab. 2.6.13-1

Escherichia coli

Salmonella

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Klostridie