Platné znění

Český lékopis 1997

Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku v zkoušeném roztoku (v miligramech na ml nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku na mililitr), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na štítku.

Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. Jinak se u přípravků, které způsobují inhibici nebo aktivaci, musí interferující faktory odstranit vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorpované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.

Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu jsou přesně stanoveny pro každý zkoušený přípravek.

Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje s přípravkem, ke kterému se přidá referenční přípravek endotoxinu BRP, a použije se jeden ze způsobů na odstranění interferujících faktorů.

Stanovení endotoxinu ve zkoušeném vzorku. Pracuje se ve dvojicích, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití maximálního účinného ředění zkoušeného přípravku, který byl ještě podroben některému ze způsobů odstranění interferujících faktorů. Zároveň se zkouší negativní kontrola složená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční přípravek endotoxinu BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku uvedené citlivosti lyzátu a z toho jedna obsahuj e zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi a ve druhé negativní, zkouška se opakuje: zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.

Následující část je uvedena pro informaci a jako návod; netvoří závaznou součást lékopisu.

Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice

  1. 1. Úvod

    Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami: pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

    Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amébocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

    Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

    1. 1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Má se prokázat nepřítomnost endotoxinů ve vodě pro LAL a v ostatních zkoumadlech a má se ověřit citlivost lyzátu deklarovaná výrobcem.
    2. 1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

    Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů; v případě interference se provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.

    Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce, je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě nebo ředění nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.

    V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

    Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL-testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a vyžaduje proto validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.

    Použití kvantitativní metody pro stanovení koncentrace endotoxinu místo limitní zkoušky rovněž vyžaduje validaci, což bude diskutováno dále.

    Ačkoli ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz "amébocytární lyzát" se v textu používá pro označení validovaného amébocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

  1. 2. Metoda

    Ačkoliv přidání endotoxinů k roztoku amébocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, lékopisná zkouška používá ke zjištění limitu pouze gelovou metodu. Důvod je zčásti historický, zčásti je dán jednoduchostí rozhodnutí, zda zkoušený přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě vzniku nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody založené na stupni zákalu nebo koncentraci barviva uvolněného z chromogenního peptidu se pro zkoušku kvality mohou upravit po validaci, což bude diskutováno dále.

    Endotoxiny se mohou adsorpovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.

    Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxin jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty, a nikoliv zda koncentrace endotoxinu v produktu bude v jednotkách endotoxinu na objem, hmotnost nebo dávku.

    Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.

    Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.

    U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, budou probrány později.

    Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:

    M - maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu. Při stanovování maximální dávky pro dospělé má být použita hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu má být použita jen v případě, je-li vyšší než odpovídající dávka pro dospělé;

    K - maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nevhodných účinků (tabulka 2.6.14-1).

    Předpokládejme ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.

    Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu na mililitr, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:

    1. K - nejvyšší přijatelná dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,
    2. c - koncentrace roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku na mililitr,
    3. M - maximální dávka přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.

    U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření maximální limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.

    Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální limitní koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.

    Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.

    Tab. 2.6.14-1

    Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1
    Zamýšlený způsob podáníK v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
    intravenózní5,0
    intravenózní pro radiofarmaka2,5
    intratékální0,2

    Hodnota ELC ve výluhu jednorázových pomůcek nebo zdravotnických prostředků určených k implantaci závisí nejen na hodnotě K a M, ale též na přípravě výluhu. Pro patřičnou informaci je třeba prohlédnout specifický článek.

    Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detekoval alespoň ELC? Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

    v němž značí:

    1. λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu na mililitr.

    Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředicím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu musí být použito MVD.

    To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.

    Příklad

    Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

    1. M- maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,
    2. c - 50 mg/ml,
    3. K - množství endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,
    4. λ- 0,4 m.j. endotoxinu na mililitr.

    Řešení:

    Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

  1. 3. Referenční materiál

    Referenční přípravek endotoxinu BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

    Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP, a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

    Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí určit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

  1. 4. Voda pro LAL

    Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

    1. - králík není dostatečně citlivý, aby mohl detekovat endotoxin ve vodě pro LAL, určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu;
    2. - relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících;
    3. - termíny "pyrogenní látky" a "endotoxiny" označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.

    Text zkoušky na bakteriální endotoxin ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody LAL. Reverzní osmóza byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelného endotoxinu.

  1. 5. Hodnota pH směsi

    Ve zkoušce na bakteriální endotoxin dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

  1. 6. Validace lyzátu pro použití v limitní gelové metodě

    Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.

    Pozitivní ředicí faktory se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředicích faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.

  1. 7. Předběžná zkouška na interferující faktory

    Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.

    Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v obecné metodě: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného vzorkuje nejméně polovina a nejvýše dvojnásobek citlivosti lyzátu samotného.

    Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředicích faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.

  1. 8. Odstranění interferujících faktorů

    Postup k odstranění interference nesmí ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorpce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu, a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.

    Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových celuloso-triacetátových filtrech. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.

    Polysulfonové filtry, uvedené v dřívějším textu, byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

  1. 9. Poslání kontrol

    Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.

    Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

  1. 10. Hodnocení a interpretace výsledků

    Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amébocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.

    Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

  1. 11. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících předepsané v lékopisném článku

    O použití zkoušky s lyzátem z amébocytů lze uvažovat i u lékopisného přípravku, pro který je předepsána zkouška na pyrogenní látky na králících. Obecné stanovisko k použití alternativní metody namísto lékopisné je uvedeno v Obecných zásadách (1.2).

    "Popsané zkoušky na čistotu a stanovení jsou oficiální metody, na nichž je založena standardnost lékopisu. Se souhlasem příslušné autority lze při kontrole použít alternativní analytické metody za předpokladu, že užitými metodami se dosáhne shodného výsledku jako s ustanoveními v článku, jestliže by byla použita oficiální metoda. V případě pochybnosti nebo sporného výsledku je lékopisná metoda jako jediná rozhodující".

    Jako směrnice jsou doporučeny následující postupy:

    1. 11.1 Postupy, materiály a zkoumadla používané ve zkoušce s lyzátem z amébocytů mají být validovány, jak je popsáno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny.
    2. 11.2 Přítomnost interferujících faktorů (a je-li to třeba, postupy k jejich odstranění) se prověří na vzorkách nejméně ze tří výrobních šarží.
    3. 11.3 Jestliže jsou dostupné vzorky z výrobní šarže, které ve zkoušce na pyrogenní látky na králících byly pozitivní, měly by se také přezkoušet na bakteriální endotoxiny. Nejsou-li tyto vzorky dostupné, pak je rozhodující zkouška na pyrogenní látky a zkouška na bakteriální endotoxiny je zbytečná.
  1. 12. Validace zkoušky pro nové přípravky

    Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

  1. 13. Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu

    Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít zkoušku na bakteriální endotoxiny k důkazu jejich nepřítomnosti. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a . Avšak jsou-li patrny známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

  1. 14. Kvantitativní stanovení endotoxinů

    Stávající text zkoušky na bakteriální endotoxiny se zabývá podmínkami pro limitní zkoušku s tvorbou gelu jako krajním bodem. Kvantitativní stanovení endotoxinů založené na vzniku zákalu nebo na štěpení chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát jsou již dnes dostupná i pro rutinní zkoušení. Rozeznávají se čtyři metody na kvantitativní stanovení:

    1. 1. Zákalová metoda stanovení v konečném bodě: zákal ve vzorku se měří po dosažení vrcholu;
    2. 2. Kinetická zákalová metoda: měří se rychlost vývoje zákalu;
    3. 3. Chromogenní peptidová metoda stanovení v konečném bodě: komplex endotoxin-lyzát štěpí chromogenní peptid a koncentrace uvolněného barviva se měří jako indikátor koncentrace endotoxinu;
    4. 4. Kinetická chromogenní peptidová metoda: měří se rychlost vzniku zbarvení po rozštěpení chromogenního peptidu a to je indikátorem koncentrace endotoxinů.

    Obě metody stanovení v konečném bodě se obvykle provádějí s koncentrací lyzátu, která je ve srovnání s koncentrací endotoxinu vyšší. Jako výsledek lze považovat odpověď, která vyjadřuje koncentraci endotoxinu jako lineární funkci s tím, že tato koncentrace nepřesáhne horní limit. Odpovídajícím matematickým modelem je model poměru sklonů.

    V obou kinetických metodách je možno logaritmus reakčního času považovat za lineární funkci logaritmu koncentrace endotoxinu. Proto je v tomto případě odpovídajícím matematickým modelem model rovnoběžnosti.

    Nyní je limitní gelový test na bakteriální endotoxin oficiální metodou lékopisu. Pracovník, který hodlá použít některou ze čtyř výše uvedených kvantitativních metod, prokáže, že tato alternativní metoda splní požadavky uvedené v úvodu všeobecné části (viz část 11, "Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících předepsané v lékopisném článku).

    Nejprve je nutno prokázat, že metoda splňuje požadavky pro lineární regresi:

    1. - dostatečný sklon,
    2. - nevýznamné odchylky od lineárního průběhu.

    Pro metodu stanovení v konečném bodě je ještě požadavek, aby se rozdíly mezi naměřenými hodnotami blížily nule.

    Dodatek Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek (5.3) obsahuje informace o statistických postupech, jež se mají použít na tyto zkoušky.

    Je nepravděpodobné, že by přesnost kterékoli z kvantitativních metod byla nižší, než je limit pro gelovou zkoušku. Předešlá směrnice FD A "Draft guideline on the validation of the Limulus amoebocyte lysáte test" určuje horní limit 0,3654 v dekadickém logaritmu pro standardní odchylku pro limitní koncentraci v gelovém testu. Pokud reziduální chyba kvantitativní metody tento limit nepřekročí, je nepravděpodobné, že přesnost bude nedostatečná.

    Může nastat pět druhů situací, ve kterých má analytik prokázat platnost kvantitativní metody:

    1. 1. vzrůst teploty způsobený novým přípravkem při jeho vývoji;
    2. 2. průkaz, že použitá zkoumadla a materiály neobsahují endotoxin;
    3. 3. průkaz, že zkoušený přípravek neinterferuje se zkouškou na bakteriální endotoxiny nebo, jestliže interferuje, že kroky použité k odstranění interference jsou dostatečné;
    4. 4. validace citlivosti metody;
    5. 5. rutinní zkoušení šarží přípravku po předchozích typech zkoušky bylo ukončeno jako uspokojivé.

    V prvním případě je postup popsaný v části 12 "Validace zkoušky pro nové přípravky" a 13 "Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu" přijatelný. Avšak, jestliže byl limit pro nový přípravek validován v gelovém limitním testu, pak je nepravděpodobné, že kvantitativní metodou by bylo dosaženo jiného závěru.

    V situacích 2 a 3 je nutno pamatovat na to, že obě metody používající chromogenní peptid vyžadují zkoumadla, která se nepoužívají v gelové limitní zkoušce, a tudíž vyhovuje-li limitní gelová zkouška požadavkům, nelze to vztáhnout na chromogenní peptidovou metodu bez dalšího přezkoušení. Navrhuje se provést zkoušku na interferenci nejméně na třech výrobních šaržích zkoušeného přípravku.

    V situaci 4 se doporučuje, aby analytik ověřil citlivost metody s metodou, kterou hodlá použít, a to obzvlášť v případě, použije-li lyzát, který nebyl přesně vyvinut pro stejný typ kvantitativní zkoušky.

    V situaci 5 se jedná o podobný případ uvedený v části 12 "Validace zkoušky pro nové přípravky".

  1. 2.6.15 Aktivátor prekalikreinu

    Podstata zkoušky. Aktivátor prekalikreinu aktivuje štěpení prekalikreinu na kalikrein. Štěpí též chromofor ze syntetického polypeptidického substrátu a rychlost štěpení je měřitelná spektrofotometricky. Koncentrace zkoušeného přípravku se vypočítá porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

    Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního standardu, který pozůstává z lyofílizovaného aktivátoru prekalikreinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

    Příprava substrátu prekalikreinu. Krev nebo plazma pro přípravu prekalikreinu může přijít do styku pouze s plastem nebo sklem, jehož povrch je silikonovaný, činu se zabrání aktivaci srážení.

    Devět objemových dílů lidské krve se smíchá s 1 objemovým dílem antikoagulačního roztoku (ACD, CPD nebo roztoku citronanu sodného R, 38 g/l), do kterého se přidá 1 mg hexadimethriniumdibromidu A na 1 ml. Po odstředění směsi při 3600 gn po dobu 5 min se oddělí plazma a znovu se 20 min odstřeďuje při 6000 gn, aby sedimentovaly destičky. Po oddělení se plazma chudá na destičky 20 h dialyzuje proti desetinásobnému objemu tlumivého roztoku A. Dialyzovaná plazma se nanese na chromatografickou kolonu obsahující agarosu-DEAE pro výměnnou iontovou chromatografii R. Agarosa se nejprve uvede do rovnováhy s tlumivým roztokem A. Objem nabobtnalého gelu je dvakrát větší než objem plazmy. Eluce z kolony tlumivým roztokem A probíhá rychlostí 20 ml/cm2/h. Eluát se shromažďuje do frakcí a zaznamenává se jejich absorbance při 280 nm (2.2.25). Spojují se a zachycují frakce, které obsahují bílkovinu zobrazenou na záznamu jako první pík. Jejich objem je asi 1,2krát větší než objem plazmy chudé na destičky.

    Spojený objem substrátu se zkouší na nepřítomnost aktivity kalikreinu tak, že se 1 objemový díl smíchá s 20 objemovými díly předehřátého roztoku chromogenního substrátu, jenž se použije při stanovení, a směs se inkubuje 2 min při 37 °C. Substrát je vhodný, jestliže vzrůst absorbance za minutu je menší než 0,001. Ke spojenému objemu substrátu se přidá chlorid sodný R (7 g/l) a filtruje se membránovým filtrem (o velikosti pórů 0,45 μm). Filtrát se rozdělí na části, které se dají zmrznout, a uchovávají při -25 °C. Substrát se může též lyofilizovat.

    Postup od začátku chromatografie po zmrazení v rozdělených částech se provede v průběhu jednoho pracovního dne.

    Postup zkoušky. Stanovení je výhodné provádět na automatickém enzymovém analyzátoru při 37 °C a nastavit objemy, koncentrace substrátů a inkubační doby tak, aby rychlost reakce probíhala lineárně alespoň do 35 m.j./ml. Porovnávací roztoky, zkoušené roztoky a substrát prekalikreinu se, je-li to nutné, mohou ředit tlumivým roztokem B.

    Zředěné porovnávací roztoky nebo zkoušené roztoky se 10 min inkubují se substrátem prekalikreinu. Je nutné, aby objem nezředěného vzorku nebyl vyšší než 1/10 celkového objemu inkubační směsi. Tím se vyloučí chyby způsobené změnami iontové síly a pH inkubační směsi. Směs nebo její část se inkubuje s nejméně stejným objemem roztoku vhodného syntetického chromogenního substrátu, o kterém je známo, že je specifický pro kalikrein (např. N-benzoyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-(4-nitrofenyl)amoniumacetat R nebo D-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid dihyd-rochloridu R), rozpuštěného v tlumivém roztoku B. Zapisuje se rychlost změny absorbance za minutu po dobu 2 min až 10 min při vlnové délce specifické pro použitý substrát. Pro každou směs zkoušeného nebo referenčního přípravku se připraví kontrolní tekutina, která místo substrátu prekalikreinu obsahuje tlumivý roztok B.

    Zjištěné změny absorbance za minutu se korigují odečtením odpovídající změny absorbance za minutu u kontrolní tekutiny. Pro referenční přípravek se vynese kalibrační křivka, která zobrazuje závislost korigovaných výsledků změny absorbance za minutu na koncentracích. Tato křivka se použije pro stanovení účinnosti prekalikreinového aktivátoru ve zkoušeném vzorku.

    Tlumivý roztok A

    Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A
    trometamol R6,055 g
    chlorid sodný R1,17 g
    hexadimethriniumdibromid R50 mg
    azid sodný R0,100 g

    Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.

    Tlumivý roztok B

    Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A Tlumivý roztok B
    trometamol R6,055 g
    chlorid sodný R8,77 g

    Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.

  1. 2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

    Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny, a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce odpovídají požadavkům předepsaným ve stati Chovy kuřat prostých specifikovaných patogenů, která jsou určena pro výrobu a kontrolu jakosti očkovacích látek (5.2.2).

    Virové inokulum

    Vzorky inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než -40 °C.

    Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml inokulačního viru. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

    Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml inokulačního viru. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

    Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml inokulačního viru. Zvířata se sledují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po prvních 24 h uhynou nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Inokulační virus vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulačnímu viru. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

    Inokulační virus a virus sklizený

    Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než -40 °C.

    Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

    Mykoplazmata (2.6.7). 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; pokud nebyl při výrobě použit substrát ptačího původu, provede se pouze zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata.

    Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

    Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než lidském nebo opičím, naočkují se také buňky tohoto druhu z oddělené kultury. Tyto buňky se kultivují při (36 ± 1) °C a prohlížejí se 14 dní. Inokulační virus nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

    Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající buď 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml, inokuluje se skupina oplozených SPF vajec, 9 až 11 dní starých, alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Inokulační virus nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány, makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

    Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

    Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozorovací období přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

    Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou níže popsané zkoušky.

    Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při (5 ± 3) °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při (5 ± 3) °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

    Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než lidském nebo opičím, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z oddělené kultury. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při (36 ± 1) °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

    Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.

    Kontrolní vejce

    Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami a po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže v následujících dvou zkouškách nejsou nalezeny známky přítomnosti hemaglutinačních agens.

    Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

    Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se sledují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže není nalezena přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

    1. 2.6.17 Zkouška antikomplementární účinnosti imunoglobulinu

      Podstata zkoušky. Pro měření antikomplementární účinnosti (ACA) imunoglobulinu se inkubuje definované množství zkoušeného materiálu (10 mg imunoglobulinu) s definovaným množstvím morčecího komplementu, které je 20 CH50 a stanoví se zbývající komplement. Antikomplementární účinnost je vyjádřena jako procenta spotřeby komplementu vzhledem ke kontrole komplementu, která je 100 %.

      Hemolytická jednotka účinnosti komplementu (CH50) je množství komplementu, které za daných podmínek reakce způsobí lýzu 2,5.108 z celkových 5.108 optimálně senzibilizovaných erytrocytů. Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

      Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí ve 4000 ml vody R a upraví se hodnota pH kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Zfiltruje se membránovým filtrem (póry velikosti 0,22 μm) a uchovává se ve skleněných nádobách při 4 °C.

      Roztok želatiny. 12,5 g želatiny R se rozpustí v asi 800 ml vody R a zahřeje se na vodní lázni k varu. Ochladí se na 20 °C a zředí vodou R na 10 l. Filtruje se membránovým fitrem (póry velikosti 0,22 pm). Uchovává se při 4 °C. Používá se jen čirý roztok.

      Citronanový roztok. 8,0 g citronanu sodného R, 4,2 g chloridu sodného R a 20,5 g glukosy R se rozpustí v 750 ml vody R. Roztokem kyseliny citrónové R (100 g/l) se upraví hodnota pH na 6,1 a zředí se vodou R na 1000 ml.

      Tlumivý roztok želatino-barbitalový. Smíchají se 4 objemové díly roztoku želatiny a 1 objemový díl zásobního tlumivého roztoku barbitalového. Je-li to nutné, upraví se hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS pH na hodnotu 7,3. Uchovává se při 4 °C. Denně se připravuje čerstvý roztok.

      Stabilizovaná beraní krev. Odebere se 1 objemový díl beraní krve do 1 objemového dílu citronanového roztoku a promíchá se. Uchovává se při 4 °C nejméně 7 dní a nejvýše 28 dní. (Stabilizovaná beraní krev a beraní erytrocyty jsou dostupné od řady výrobců).

      Hemolyzin. Antisérum proti beraním erytrocytům připravené na králících. (Taková antiséra jsou dostupná od řady výrobců.)

      Morčecí komplement. Připraví se směs sér z krve alespoň deseti morčat. Ze sražené krve se sérum oddělí odstřeďováním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých objemech při teplotě nižší než - 70 °C.

      Metoda

      Příprava standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Erytrocyty se odstřeďováním oddělí z přiměřeného objemu stabilizované beraní krve; buňky se nejméně třikrát promyjí tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a připraví se 5% suspenze (V/V) v tomto roztoku. Měření koncentrace buněk v suspenzi se provádí takto: 0,2 ml se převede do 2,8 ml vody R a lyžovaný roztok se odstřeďuje 5 min při 1000 gn Koncentrace buněk vyhovuje, jestliže absorbance (2.2.25) vrchní vrstvy měřená při 541 nm je 0,62 ± 0,01. Úprava koncentrace buněk se provádí přidáním tlumivého roztoku želatino-barbitalového podle vzorce:

      v němž značí:

      1. Vf - konečný připravovaný objem,
      2. Vi - počáteční objem,
      3. A - absorbanci původní suspenze při 541 nm.

      Upravená suspenze obsahuje asi 1 x 109 buněk v 1 ml.

      Titrace hemolyzinu. Schéma přípravy ředění hemolyzinu je uvedeno v tabulce 2.6.17-1.

      Do každé zkumavky, počínaje ředěním 1 : 75, se dá 1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů a promíchá se. Inkubuje se 30 min při 37 °C. Z každé zkumavky takto inkubované směsi se odeberou 0,2 ml do nové zkumavky, přidá se 1,10 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,2 ml ředěného morčecího komplementu (např. 1 : 150). Provádí se dvojmo.

      Jako nehemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

      Jako plně hemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml vody R a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

      Tab. 2.6.17-1

      Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A Tlumivý roztok B Virové inokulum Inokulační virus a virus sklizený Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky Kontrolní vejce Tab. 2.6.17-1
      Požadované ředění hemolyzinuPřipraveno za použití
      tlumivý roztok
      želatino-barbitalový      		hemolyzin
      objem
      (ml)      		Ředění
      1 :      		objem
      (ml)
      7,50,65neředěno0,1
      100,90neředěno0,1
      751,807,50,2
      1001,80100,2
      1501,00751,0
      2001,001001,0
      3001,001501,0
      4001,002001,0
      6001,003001,0
      8001,004001,0
      12001,006001,0
      16001,008001,0
      24001,0012001,0
      3200*1,0016001,0
      4800*1,0024001,0
    2. * Odstraní se 1 ml směsi.

      3. Všechny zkumavky se inkubují 60 min při 37 °C a odstřeďují se 5 min při 1000 gn. Změří se absorbance (2.2.25) vrchních vrstev při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy v každé zkumavce v procentech ze vzorce:

      v němž značí:

      1. Aa - absorbanci zkumavek s ředěným hemolyzinem,
      2. Ab - průměr absorbanci tří zkumavek s plnou hemolýzou,
      3. A1 - průměr absorbanci tří zkumavek bez hemolýzy.

      Sestrojí se lineární graf: na ordinátu se nanese procentuální stupeň hemolýzy, na abscisu odpovídající převrácená hodnota ředění hemolyzinu. Z grafu se určí optimální ředění hemolyzinu. Vybere se to ředění, kde již další vzestup obsahu hemolyzinu nezpůsobuje patrné změny ve stupni hemolýzy. Toto ředění je 1 minimální hemolytická jednotka (1 MHU) v 1,0 ml. Optimální hemolytické ředění hemolyzinu pro přípravu senzibilizovaných beraních erytrocytů obsahuje 2 MHU v mililitru.

      Titrace hemolyzinu není hodnotitelná, jestliže maximum hemolýzy není mezi 50 % a 70 %. Není-li maximum v tomto rozmezí, je nutno titraci opakovat s více nebo méně ředěným roztokem komplementu.

      Příprava optimálně senzibilizovaných beraních erytrocytů (hemolytický systém). Připraví se vhodný objem ředěného hemolyzinu, který obsahuje 2 MHU v mililitru a stejný objem standardizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Ke standardizované buněčné suspenzi se přidá ředěný hemolyzin a smíchá se.Inkubuje se 15min při 37 °C,uchovává se při 2°C až 8°C a použije se do 6h.

      Titrace komplementu. Připraví se vhodné ředění komplementu (např. 1 : 250) tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a provede se dvojmo titrace podle tabulky 2.6.17-2.

      Tab. 2.6.17-2

      Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A Tlumivý roztok B Virové inokulum Inokulační virus a virus sklizený Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky Kontrolní vejce Tab. 2.6.17-1 Tab. 2.6.17-2
      Číslo zkumavkyObjem ředěného komplementu v ml
      (např. 1 : 250)      		Objem tlumivého roztoku želatino-barbitalového v ml
      10,11,2
      20,21,1
      30,31,0
      40,40,9
      50,50,8
      60,60,7
      70,70,6
      80,80,5
      90,90,4
      101,00,3
      111,10,2
      121,20,1
      3 zkumavky s 0% hemolýzy-1,3
      3 zkumavky se 100% hemolýzou-1,3 ml vody

      Do každé zkumavky se přidá 0,2 ml senzibilizovaných beraních erytrocytů, dobře se promíchá a inkubuje se 60 min při 37 °C. Zkumavky se potom ochladí v ledové lázni a odstřeďují se 5 min při 1000 g. Změří se absorbance vrchní vrstvy při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy (F) ze vzorce:

      v němž značí:

      1. Ac - absorbanci zkumavek 1 až 12,
      2. Ab - průměr absorbanci zkumavek se 100% hemolýzou,
      3. A1 - průměr absorbanci buněčných kontrol s 0% hemolýzou.

      Na logaritmický papír se vynese Y/(1 - Y) jako abscisa proti obsahu ředěného komplementu v mililitru jako ordináta. Body se co nejlépe proloží křivka a určí se ordináta pro 50% hemolytickou dávku komplementu, kde Y/(1 - Y) = 1,0. Vypočítá se účinnost v hemolytických jednotkách (CH50/ml) ze vzorce:

      v němž značí:

      1. Cd - převrácenou hodnotu ředění komplementu,
      2. Ca - objem ředěného komplementu, kde došlo k 50% hemolýze, v mililitrech,
      3. 5 - přepočítací faktor v souvislosti s počtem erytrocytů.

      Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže křivka mezi 15 % a 85 % hemolýzy je přímkou, jejíž sklon je 0,15 až 0,40, přednostně 0,18 až 0,30.

      Zkouška antikomplementární účinnosti. Připraví se ředění komplementu o 100 CH50/ml ředěním vytitrovaného morčecího komplementu tlumivým roztokem želatino-barbitalovým. Je-li to nutné, upraví se pH zkoušeného imunoglobulinu na 7. Pro imunoglobulin o obsahu 50 mg/ml se připraví směs k inkubaci takto:

      Tab. 2.6.17-3

      Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A Tlumivý roztok B Virové inokulum Inokulační virus a virus sklizený Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky Kontrolní vejce Tab. 2.6.17-1 Tab. 2.6.17-2
      Zkoušený imunoglobulinKontrola komplementu (dvojmo)
      imunoglobulin (50 mg/ml)0,2 ml-
      tlumivý roztok želatino-barbitalový0,6 ml0,8 ml
      komplement0,2 ml0,2 ml

      Současně se zkoušeným přípravkem se provede zkouška s lidským imunoglobulinem BRP, jak je doporučeno v původním letáku referenčního přípravku pro negativní a pozitivní kontrolu antikomplementární účinnosti. Jestliže koncentrace zkoušeného imunoglobulinu kolísá kolem 50 mg/ml, přidá se větší nebo menší objem vzorku a tlumivého roztoku želatino-barbitalového, např. 0,47 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového je přidáno k 0,33 ml imunoglobulinu o obsahu 30 mg/ml -do objemu 0,8 ml. Zkumavky se uzavřou a inkubují se 60 min při 37 °C. 0,2 ml z každé inkubované směsi se přidá k 9,8 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového, aby se zředil komplement. Provede se titrace komplementu v každé zkumavce tak, jak je popsáno výše, aby se určila zbytková účinnost komplementu (viz tabulka 2.6.17-2). Antikomplementární účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu ke kontrole komplementu, která je uvažována jako 100%, se vypočítá ze vzorce:

      v němž značí:

      1. a - průměr účinnosti kontrolního komplementu (CH50/ml),
      2. b - účinnost komplementu (CH50/ml) zkoušeného přípravku.

      Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže jsou splněny následující podmínky:

      1. - antikomplementární účinnost nalezená pro negativní a pozitivní kontroluje v limitech stanovených v průvodním letáku referenčního přípravku,
      2. - účinnost u kontroly komplementu (a) je v rozmezí 80 CH50 až 120 CH50 v mililitru.
    1. 2.6.18 Zkouška neurovirulence živých virových vakcín

      Podstata zkoušky. Neurovirulence se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku opicím a jejich sledováním.

      Postup zkoušky. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic séronegativních na zkoušený virus. Každé opici se vstříkne nejvýše 0,5 ml zkoušeného přípravku do talamické oblasti každé hemisféry, pokud není uvedeno jinak.

      Celkové množství viru podaného každé opici není nižší než množství obsažené v jedné doporučené lidské dávce vakcíny. Jako kontrola proti zavlečení divokého neurovirulentního viru je chována skupina nejméně 4 kontrolních opic v druhé části klece nebo v bezprostředním sousedství naočkovaných zvířat. Očkované opice se pozorují 17 dní až 21 dní, sledují se příznaky ochrnutí nebo jiné známky neurologického poškození; kontrolní opice jsou sledovány stejně dlouhou dobu a navíc ještě 10 dní. Zvířata, která uhynou do 48 h po injekci, se vyřadí jako úhyn z nespecifických příčin a mohou být nahrazena.

      Zkouška není platná, jestliže více než 20 % inokulovaných zvířat uhyne z nespecifických příčin nebo jestliže ve vzorcích séra odebraných od kontrolních opic v době očkování zkoušených zvířat a také 10 dní po usmrcení zkoušených zvířat je prokázána infekce divokým virem typu zkoušeného viru nebo viru spalniček. Na závěr pozorování se provede pitva a histopatologické vyšetření odpovídajících oblastí mozku, jež by prokázalo poškození centrálního nervového systému. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže zvířata nevykazují žádné neočekávané klinické příznaky nebo histopatologické důkazy poškození centrálního nervového systému, které by bylo možno přisuzovat inokulovanému viru.

    1. 2.6.19 Zkouška neurovirulence vakcíny proti obrně (per os)

      Opice použité v této zkoušce vyhovují požadavkům uvedeným v článku Vaccinum poliomyelitidis perorale a váží nejméně 1,5 kg. Patogenita se stanoví u opic rodu Macaca nebo Cercopithecus v porovnání s referenčním virem připraveným pro zkoušku neurovirulence inokulací do bederní oblasti centrálního nervového systému po předchozím podání vhodného sedativa, např. ketaminiumchloridu. Vzorky séra odebrané před injekcí prokazatelně neobsahují neutralizační protilátky v ředění 1 : 4 při zkoušení proti nejvýše 1000 CCID 50 každého ze tří typů polioviru.

      Počet opic. Vakcína a vhodný homotypický referenční virus se zkouší současně v téže skupině opic. Stejnému počtu zvířat se vstříkne zkoušená vakcína a referenční přípravek. Zvířata se rozdělí náhodně do ošetřovacích skupin a klecí a jejich totožnost se kóduje při očkování. Zařazení jednotlivých zvířat se před ošetřovatelem a pitvajícím tají. Počet naočkovaných opic je takový, aby při vyhodnocení zkoušené vakcíny a referenčního přípravku bylo nejméně jedenáct pozitivních opic u typů 1 a 2 a nejméně osmnáct pozitivních opic u typu 3 (pozitivní opice jsou takové, které v centrálním nervovém systému mají specifické poliovirové léze neuronu). S týmž homotypickým referenčním přípravkem může být zkoušena více než jedna šarže vakcíny. Je-li to možné, použijí se opice z téže karanténní skupiny. V opačném případě se použijí opice ze dvou skupin a stejná množství z každé skupiny se použijí pro podání vakcíny a referenčního přípravku. Jestliže se zkouška provádí ve dvou pracovních dnech, naočkuje se stejné množství opic z každé skupiny v týž den vakcínou a homotypickým referenčním přípravkem.

      Obsah viru. Obsahy viru ve vakcíně a homotypickém referenčním přípravku se upraví tak, aby byly titry pokud možno stejné a v rozmezí od 105,5 do 106,5 CCID50/0,1 ml.

      Pozorování. Všechny opice se pozorují 17 až 22 dní, aby se zjistily příznaky poliomyelitidy nebo jiné virové infekce. Opice, které přežijí prvních 24 h, ale uhynou před jedenáctým dnem po očkování, se pitvají, aby se určilo, zda byla poliomyelitida příčinou smrti. Zvířata, která uhynula z jiných příčin, než je poliomyelitida, se vyloučí z hodnocení. Umírající nebo těžce paralyzovaná zvířata se usmrtí a pitvají. Všechna zvířata, která přežijí do konce pozorovacího období, se též pitvají. Zkouška není platná, jestliže více než 20 % zvířat vykazuje během pozorovacího období interkurentní infekci.

      Počet vyšetřovaných řezů. Z každé opice se histologicky vyšetří nejméně bederní mícha, krční mícha a nižší i vyšší část prodloužené míchy, střední mozek, talamus a motorická oblast kůry mozkové. Zkoumají se řezy tenčí než 15 μm a barvené gallocyaninem.

      1. Nejnižší počet vyšetřovaných řezů je následující:
        1. a) 12 řezů reprezentujících celou bederní ztluštěninu,
        2. b) 10 řezů reprezentujících celou krční ztluštěninu,
        3. c) 2 řezy z prodloužené míchy,
        4. d) 1 řez z mostu a mozečku,
        5. e) 1 řez ze středního mozku,
        6. f) 1 řez z levé a pravé části thalamu,
        7. g) 1 řez z levé a pravé části motorické oblasti mozkové kůry.

      Určení aktivity viru. Pro hodnocení virové aktivity v řezech ze hřbetní míchy a mozkového kmene se používá hodnotící systém pro stupeň poškození, který rozlišuje buněčnou infiltraci a destrukci neuronů následovně:

      1. 1. pouze buněčná infiltrace (tyto opice se nepovažují za pozitivní),
      2. 2. buněčná infiltrace s minimálním poškozením neuronu,
      3. 3. buněčná infiltrace s rozsáhlým poškozením neuronu,
      4. 4. masivní poškození neuronu s buněčnou infiltrací nebo bez ní.

      Výsledky se zaznamenávají do standardního formuláře. 7)Opice s neuronálními lézemi v řezech, které ale nevykazují stopy po vpichu, jsou počítány jako pozitivní. Opice vykazující stopy po vpichu v řezech, ale nikoli neuronální léze nejsou počítány jako pozitivní. Řezy, které vykazují traumatické poškození, ale nemají žádné specifické virové léze, se nezahrnují do počtu.

      Závažnost nálezu je založena na odečtení výsledků z bederních (L), krčních (C) a mozkových (B) histologických řezů.

      Ohodnocení lézí (LS) pro každou pozitivní opici se vypočítá takto:

      Pro každou skupinu pozitivních opic se vypočítá průměrný počet lézí.

      Hodnocení. Srovnání virové aktivity ve vakcíně a referenčním přípravku je založeno na aktivitě v bederním ztluštění míchy a stupni šíření aktivity z této oblasti do krčního ztluštění a mozku. Vhodnost nebo nevhodnost je založena na celkovém poměru u všech zvířat ve zkoušce. Jednotlivá zvířata vykazující neobvykle vysokou aktivitu jak v bederní oblasti, tak i v důsledku šíření z této oblasti jsou také zavzata do konečného hodnocení. Monovalentní várka vyhovuje ve zkoušce, jestliže je požadovaný počet zvířat pozitivní a žádné z histopatologických a klinických vyšetření nevykazuje významný rozdíl v patogenitě mezi vakcinačním virem a referenčním přípravkem. Podmínky vhodnosti jsou uvedeny níže.

      Požadavky. S každou referenční vakcínou (typ 1,2 a 3) se provede vhodný počet neurovirulenčních kvalifikačních zkoušek (např. čtyři zkoušky) a získaná data o její aktivitě slouží jako základ pro požadavky na zkoušenou vakcínu. Celkový průměrný počet lézí (M) pro opakované zkoušky každého referenčního viru se hodnotí společně se shromážděnými výsledky v testu (s2) jako odhad směrodatné odchylky (s).

      Požadavky na platnost výsledků ve zkoušce referenčního přípravku jsou stanoveny na základě kumulativních dat z kvalifikačních zkoušek. Nejsou stanoveny všeobecně platné podmínky; pro pomoc zkoušejícím laboratořím jsou doporučeny následující empirické metody pro získání přijatelných limitů průměrného počtu lézí pro referenční přípravek (Xref).

      Tab. 2.6.19-1

      Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice Tab. 2.6.14-1 Příklad Tlumivý roztok A Tlumivý roztok B Virové inokulum Inokulační virus a virus sklizený Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky Kontrolní vejce Tab. 2.6.17-1 Tab. 2.6.17-2 Tab. 2.6.19-1
      Spodní limitHorní limit
      Typy 1 a 2
      Typ 3      		M - s
      M - s/2      		M + s
      M + s

      Jestliže je průměrný počet lézí ve vakcíně stanoven Xtesta C1, C2 aC 3 jsou konstanty stanovené postupem uvedeným níže, pak vakcína nevyhovuje, jestliže:

      Vakcína se může zkoušet znovu, jestliže:

      Při opakovaném zkoušení vakcíny se přepočítává průměrný počet lézí ve zkoušené vakcíně a v referenčním přípravku. Přípravek nevyhovuje, jestliže:

      Konstanty C1, C2 a C3 se vypočítají ze vzorců:

      v nichž značí:

      1. N1 - počet pozitivních opic ve zkoušce vakcíny,
      2. N2 - počet pozitivních opic ve dvou zkouškách,
      3. 2,3 - normální odchylku na 1% hladině,
      4. 2,6 - normální odchylku na 0,5% hladině,
      5. 1,6 - normální odchylku na 5% hladině.

      Zkoušku neurovirulence, v které průměrný počet lézí pro referenční přípravek (Xref) není shodný s údaji z předešlých pokusů, nelze použít pro určení vhodnosti vakcíny. Jestliže je zkouška vakcíny platná, průměrný počet lézí pro zkoušenou vakcínu (Xtest) lze počítat a srovnávat s homotypickou referenční vakcínou.

    1. 2.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B (nepřímá metoda)

      Připraví se dvě stejné řady postupně ředěného zkoušeného přípravku roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění první řady se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze erytrocytů krevní skupiny A, předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění druhé řady se přidá stejný objem 5% ( V/V) suspenze erytrocytů skupiny B předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tyto suspenze se inkubují 30 min při 37 °C a pak se erytrocyty třikrát promyjí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Erytrocyty se ponechají 30 min v kontaktu s polyvalentním sérem proti lidským globulinům. Bez dalšího odstředění se mikrosko-

  1. 2.7 Metody stanovení účinnosti
    1. 2.7.1 Imunochemické metody

      Imunochemické metody jsou založeny na selektivní, reverzibilní a nekovalentní vazbě antigenů s protilátkami. Tyto metody se používají k důkazu nebo ke stanovení antigenů nebo protilátek. Vznik komplexu antigen-protilátka lze dokázat a množství vytvořeného komplexu lze stanovit různými metodami. Ustanovení tohoto obecného článku se vztahují na imunochemické metody používající podle potřeby buď značená nebo neznačená zkoumadla.

      Výsledky imunochemických metod závisí na experimentálních podmínkách a povaze a kvalitě použitých zkoumadel. Proto je nezbytné standardizovat složky imunochemických stanovení a použít k tomu, pokud to je možné, mezinárodní referenční přípravky pro ně určené.