Vyhláška o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků

Příloha č. 12

Metody zkoušení k ověření složení některých cukrů určených k lidské spotřebě

1. 1. Příprava vzorků ke zkoušce

   Vzorek doručený do laboratoře se důkladně promíchá.

   Pro zkoušku se ze vzorku oddělí množství nejméně 200 g a okamžitě přenese do čisté, suché, vodotěsné nádobky opatřené vzduchotěsným uzávěrem.

1. 2. Reakční činidla, přístroje a pomůcky

   Při popisu přístrojů a pomůcek jsou uváděny odkazy pouze pro speciální zařízení a přístrojů, nebo přístroje, které musí odpovídat zvláštním požadavkům.

   Pokud je zmiňována voda, rozumí se destilovaná voda nebo demineralizovaná voda se srovnatelnou čistotou.

   Veškerá činidla musí být analytické čistoty, pokud není stanoveno jinak.

   Pokud je odkazováno na roztok činidla bez dalšího upřesnění, jde o vodný roztok.

1. 3. Vyjádření výsledků

   V protokolu o zkoušce se uvede výsledek získaný jako průměrná hodnota ze dvou stanovení s uspokojivou opakovatelností.

   Pokud není uvedeno jinak, jsou výsledky vyjádřeny v procentech hmotnostních původního laboratorního vzorku tak, jak byl do laboratoře doručen.

   Počet platných číslic v takto vyjádřeném výsledku je určen přesností metody.

Příloha č. 13

Metoda stanovení ztráty hmotnosti sušením pro některé cukry určené k lidské spotřebě

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Metoda slouží ke stanovení ztráty hmotnosti sušením
      1. - v cukru polobílém,
      2. - v cukru nebo v cukru bílém,
      3. - v cukru extra bílém.

1. 2. Definice

   Ztrátou hmotnosti sušením se rozumí hodnota ztráty hmotnosti sušením stanovená popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   Ztráta hmotnosti sušením se stanoví sušením při teplotě (103 ± 2) °C.

1. 4. Přístroje a pomůcky
2. 4.1. Analytické váhy vážící s přesností 0,1 mg.
3. 4.2. Sušárna s vhodnou ventilací, řízená termostatem, umožňující udržovat teplotu (103 ± 2) °C.
4. 4.3. Kovová váženka s plochým dnem, odolná vůči působení vzorku a testovacím podmínkám, s průměrem nejméně 100 mm a s hloubkou nejméně 30 mm.
5. 4.4. Exsikátor s čerstvě aktivovaným silikagelem nebo s rovnocenným sušidlem s indikátorem obsahu vlhkosti.
6. 5. Postup
7. Poznámka:
   1. Operace popsané v bodě 5.1 až 5.7 musí být provedeny okamžitě po otevření nádoby se vzorkem.

1. 5.1. Miska (4.3.) se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně (4.2.) při teplotě (103 ± 2) °C.

   Miska se nechá v exsikátoru (4.4.) vychladnout nejméně po dobu 30 až 35 min a poté se zváží s přesností na 0,1 mg.

   Do misky se naváží přibližně 20 až 30 g vzorku s přesností na 0,1 mg.

   Miska se vloží do sušárny (4.2.) o teplotě (103 ± 2 °C), kde se ponechá 3 h.

   Miska se nechá vychladnout v exsikátoru (4.4.) a zváží se s přesností na 0,1 mg.

   Miska se znovu vloží na 30 minut do sušárny o teplotě (103 ± 2) °C.

   Nechá se vychladnout v exsikátoru (4.4.) a zváží se s přesností na 0,1 mg. Pokud je rozdíl mezi dvěma váženími větší než 1 mg, postup se opakuje. Zvýší-li se hmotnost, použije se k výpočtu nejnižší zaznamenaná hodnota.

   Celkový čas sušení nesmí být delší než čtyři hodiny.

1. 6. Vyjádření výsledků
2. 6.1. Vzorec a postup výpočtu
   1. Ztráta hmotnosti sušením v hmotnostních procentech vzorku je dána vzorcem:
      1. kde:
         1. m₀ je počáteční hmotnost zkušebního vzorku (g),
         2. m₁ je hmotnost zkušebního vzorku po vysušení (g).

1. 6.2. Opakovatelnost

   Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou z téhož vzorku týmž pracovníkem za totožných podmínek nesmí být větší než 0,02 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 14

Metoda stanovení sušiny pro některé cukry určené k lidské spotřebě

1. I. Metoda sušení ve vakuové sušárně
   1. 1. Předmět a oblast použití
      1. Metoda slouží ke stanovení obsahu sušiny
         1. - ve škrobovém sirupu,
         2. - v sušeném škrobovém sirupu,
         3. - v monohydrátu glukosy,
         4. - v glukose bezvodé.
   1. 2. Definice

      Obsahem sušiny se rozumí obsah sušiny stanovený popsanou metodou.

   1. 3. Podstata metody

      Sušina se stanoví při teplotě (70 ± 1) °C ve vakuové sušárně při tlaku nejvýše 3,3 kPa (34 mbar). Zkušební vzorky škrobového sirupu nebo sušeného škrobového sirupu se před sušením upraví smícháním s vodou a s křemelinou.

   1. 4. Reakční činidla
      1. 4.1. Křemelina: přečistí se v Büchnerově nálevce opakovaným promýváním zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (1 ml koncentrované kyseliny o hustotě 1,19 g/ml na litr vody při 20 °C), dokud filtrát nevykazuje zřetelně kyselou reakci. Křemelina na filtru se pak promývá vodou tak dlouho, dokud hodnota pH filtrátu nevystoupí nad 4; pak se křemelina vysuší v sušárně při (103 ± 2) °C a uloží se do vzduchotěsné nádoby.
   1. 5. Přístroje a pomůcky
      1. 5.1. Vakuová sušárna, utěsněná, řízená termostatem, vybavená teploměrem a vakuovým manometrem. Musí být konstruována tak, aby byl zajištěn rychlý přestup tepla do váženek uložených na policích.
      2. 5.2. Aparaturu k vysoušení vzduchu tvoří skleněná kolona naplněná čerstvě aktivovaným silikagelem nebo rovnocenným vysoušedlem, s indikátorem obsahu vlhkosti. Tato kolona obsahující koncentrovanou kyselinu sírovou je sériově propojena s pračkou plynů připojenou na vstup vzduchu do sušárny.
      3. 5.3. Vývěva umožňující udržovat v sušárně tlak 3,3 kPa (34 mbar) nebo nižší.
      4. 5.4. Kovová váženka s plochým dnem odolná vůči působení vzorků a podmínkám zkoušky s průměrem nejméně 100 mm a s hloubkou nejméně 300 mm.
      5. 5.5. Skleněná tyčinka o takové délce, aby nemohla zcela zapadnout do váženky.
      6. 5.6. Exsikátor s čerstvě aktivovaným silikagelem nebo s rovnocenným vysoušedlem s indikátorem obsahu vlhkosti.
      7. 5.7. Analytické váhy vážící s přesností na 0,1 mg.
   1. 6. Postup
      1. 6.1. Do váženky (5.4.) se skleněnou tyčinkou (5.5.) se převede přibližně 30 g křemeliny (4.1.), vše vloží se do sušárny (5.1.) s teplotou (70 ± 1) °C a tlak se sníží nejméně na 3,3 kPa (34 mbar).

         Suší se po dobu nejméně 5 h, přičemž se přes aparaturu pro vysoušení vzduchu do sušárny zavádí pomalý proud vzduchu. Občas se zkontroluje tlak a podle potřeby se upraví.

      1. 6.2. Atmosférický tlak v sušárně se opět dosáhne opatrným zvýšením přívodu suchého vzduchu. Miska i se skleněnou tyčinkou se okamžitě přemístí do exsikátoru (5.6.), kde se nechá vychladnout, a pak se zváží.
      2. 6.3. Do kádinky o obsahu 100 ml se s přesností na 1 mg naváží přibližně 10 g zkoušeného vzorku.
      3. 6.4. Zkušební vzorek se zředí 10 ml teplé vody a roztok se pomocí skleněné tyčinky (5.5.) kvantitativně převede do váženky.
      4. 6.5. Miska se zkušebním vzorkem a skleněnou tyčinkou se vloží do sušárny a tlak se sníží nejméně na 3,3 kPa (34 mbar). Suší se při (70 ± 1) °C, přičemž se sušárnou nechá procházet pomalý proud suchého vzduchu.

         Sušení se provádí po dobu 20 hodin; k největšímu úbytku vlhkosti má dojít ke konci prvního dne. Je nezbytné udržovat vývěvu v chodu při nastaveném tlaku a nechat pomalu proudit do sušárny suchý vzduch tak, aby se během noci tlak udržoval přibližně na hodnotě 3,3 kPa (34 mbar) nebo nižší.

      1. 6.6. Atmosférického tlaku v sušárně se opět dosáhne opatrným zvýšením přívodu suchého vzduchu. Váženka i s obsahem se okamžitě přemístí do exsikátoru, kde se nechá vychladnout, a poté se zváží s přesností na 1 mg.
      2. 6.7. Operace (6.5.) se opakuje po další 4 hodiny. V sušárně se obnoví atmosférický tlak a miska se ihned vloží do exsikátoru. Nechá se vychladnout a vážením se zjistí, zda již bylo dosaženo konstantní hmotnosti. Za konstantní hmotnost se považuje takový výsledek, kdy rozdíl mezi dvěma váženími téže misky není větší než 2 mg. V opačném případě se opakuje operace 6.7.
      3. 6.8. Pro stanovení sušiny ve vzorcích bezvodé glukosy nebo v monohydrátu glukosy není použití křemeliny a vody zapotřebí.
   1. 7. Vyjádření výsledků
      1. 7.1. Vzorec a postup výpočtu
         1. Obsah sušiny vyjádřený v procentech hmotnosti vzorku se vypočítá podle tohoto vzorce:
            1. kde:
               1. m₀ je počáteční hmotnost zkušebního vzorku (g),
               2. m₁ je hmotnost váženky s křemelinou, skleněnou tyčinkou a zbytkem zkušebního vzorku po sušení (g),
               3. m₂ je hmotnost váženky s křemelinou a skleněnou tyčinkou (g).
      1. 7.2. Opakovatelnost

         Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,12 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 15

Metoda stanovení celkové sušiny pro některé cukry určené k lidské spotřebě

(Refraktometrická metoda)

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Metoda stanoví obsah sušiny
      1. - v tekutém cukru,
      2. - v tekutém bílém cukru,
      3. - v tekutém invertním cukru,
      4. - v tekutém bílém invertním cukru,
      5. - v sirupu z invertního cukru,
      6. - v sirupu z bílého invertního cukru.

1. 2. Definice

   Obsahem sušiny se rozumí obsah sušiny stanovený popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   Stanoví se index lomu zkušebního vzorku při 20 °C a podle tabulek v uvedených v příloze č. 39 se převede na obsah sušiny.

1. 4. Přístroje a pomůcky
   1. 4.1 Refraktometr s přesností odečtu na čtyři desetinná místa, vybavený teploměrem a oběhovým vodním čerpadlem spojeným s vodní lázní, která je udržována termostatem na teplotě (20 ± 0,5) °C.
   2. 4.2 Světelný zdroj sestávající ze sodíkové výbojky.

1. 5. Postup
   1. 5.1 Pokud jsou ve vzorku přítomny krystaly, rozpustí se zředěním vzorku v hmotnostním poměru 1:1.
   2. 5.2 Refraktometrem (4.1.) se změří index lomu vzorku při 20 °C.

1. 6. Vyjádření výsledků a jejich výpočet

   Obsah sušiny se vypočte z indexů lomu pro roztoky sacharosy při 20° C podle uvedené tabulky a jako korekce na přítomnost invertního cukru v e zkoušeném vzorku se k výsledku z tabulek přičte na každé 1 % invertního cukru hodnota 0,022.

   Pokud byl vzorek zředěn vodou v hmotnostním poměru 1:1, musí se obsah vypočtené sušiny vynásobit dvěma.

1. 7. Opakovatelnost

   Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,2 g sušiny na 100 g vzorku.

Příloha č. 16

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukry

(Metoda podle výzkumného ústavu Berlin Institut)

1. 1. Předmět a oblast použití

   Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr v cukru polobílém.

1. 2. Definice

   Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   Roztok vzorku s obsahem redukujících cukrů se použije pro redukci roztoku měďnatého komplexu. Vzniklý oxid měďný se pak oxiduje roztokem jódu o známé koncentraci, jehož přebytek se stanoví zpětnou titrací odměrným roztokem thiosíranu sodného o známé koncentraci.

1. 4. Reakční činidla
   1. 4.1. Měďnatý roztok (Müllerův roztok)
      1. 4.1.1. Ve 400 ml vroucí vody se rozpustí 35 g síranu měďnatého pentahydrátu () a nechá se vychladnout.
      2. 4.1.2. V 500 ml vroucí vody se rozpustí 173 g vinanu sodnodraselného tetrahydrátu (Rochellova nebo Seignettova sůl, ) a 68 g bezvodého uhličitanu sodného a nechá se vychladnout.
      3. 4.1.3. Oba roztoky (4.1.1. a 4.1.2.) se převedou do litrové odměrné baňky a doplní se vodou do 1 litru. Po přidání 2 g aktivního uhlí se obsah protřepe, nechá se několik hodin stát a poté se přefiltruje přes hustý papírový nebo membránový filtr.

         Pokud se v průběhu skladování roztoku objeví malá množství oxidu měďného, je třeba roztok znovu přefiltrovat.

   1. 4.2. Kyselina octová, roztok 5 mol/l.
   2. 4.3. Roztok jódu o koncentraci 0,01665 mol/l (4,2258 g/l).
   3. 4.4. Roztok thiosíranu sodného o koncentraci 0,0333 mol/l.
   4. 4.5. Roztok škrobu: do litru vroucí vody se přilije směs 5 g rozpustného škrobu rozmíchaného ve 30 ml vody, povaří se 3 min a nechá vychladnout. V případě potřeby se přidá 10 mg jodidu rtuťnatého jako konzervačního činidla.

1. 5. Přístroje a pomůcky
   1. 5.1. Erlenmeyerova baňka, 300 ml; přesné byrety a pipety.
   2. 5.2. Vodní lázeň, vroucí.

1. 6. Postup
   1. 6.1. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se naváží část vzorku (10 g nebo méně), který neobsahuje více než 30 mg invertního cukru, a rozpustí se v cca 100 ml vody.

      Do baňky s roztokem vzorku se odpipetuje 10 ml měďnatého roztoku (4.1.), obsah se krouživým pohybem zamíchá a baňka se vloží do vroucí vodní lázně (5.2.) na dobu přesně 10 min.

      Hladina roztoku v Erlenmeyerově baňce musí být nejméně 20 mm pod úrovní hladiny ve vodní lázni. Baňka se rychle ochladí proudem studené vody, přičemž se roztok nesmí promíchávat, aby nedošlo k opětovné oxidaci vysráženého oxidu měďného vzdušným kyslíkem.

      Bez protřepávání obsahu se pipetou přidá 5 ml roztoku kyseliny octové (4.2.) o koncentraci 5 mol/l a ihned poté se byretou přidá přebytek (20 až 40 ml) roztoku jódu (4.3.) o koncentraci 0,01665 mol/l.

      Sraženina mědi se mícháním rozpustí a přebytek jódu se titruje roztokem thiosíranu sodného (4.4.) o koncentraci 0,0333 mol/l při použití roztoku škrobu (4.5.) jako indikátoru. Indikátor se přidává ke konci titrace.

   1. 6.2. S vodou se provede slepý pokus, která se opakuje vždy při použití nového měďnatého roztoku (4.4.). Titrační spotřeba nepřekročí 0,1 ml.
   2. 6.3. S cukerným roztokem se za chladu provede kontrolní zkouška. Roztok se nechá stát při laboratorní teplotě po dobu 10 min, aby mohlo dojít k reakci jiných, eventuálně přítomných redukujících látek, jako je například oxid siřičitý.

1. 7. Vyjádření výsledků
   1. 7.1. Vzorec a postup výpočtu

      Objem spotřebovaného roztoku jódu se rovná objemu (ml) přebytku přidaného roztoku jódu (0,01665 mol/l) minus objem (ml) roztoku thiosíranu sodného (0,0333 mol/l) spotřebovaného při titraci.

      1. Objem (ml) spotřebovaného roztoku jódu (0,01665 mol/l) se upraví odečtením:
         1. 7.1.1. počtu ml spotřebovaných při slepém pokusu s vodou (6.2.),
         2. 7.1.2. počtu ml spotřebovaných při kontrolní zkoušce s cukerným roztokem za chladu (6.3.),
         3. 7.1.3. objemu 2,0 ml na každých 10 g sacharosy přítomné v použitém alikvotním podílu nebo úměrného množství, obsahuje-li vzorek méně než 10 g sacharosy (korekce na sacharosu).

            Po provedení těchto korekcí odpovídá spotřeba 1 ml jodového roztoku (4.3.) 1 mg invertního cukru.

            1. Obsah invertního cukru v procentech vzorku se vypočítá podle vzorce:
               1. kde:
                  1. V₁ - počet ml jodového roztoku (4.3.) po korekci,
                  2. m₀ - hmotnost použitého vzorku (g).
   1. 7.2. Opakovatelnost

      Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,02 g na 100 g vzorku.

Příloha č. 17

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

(Metoda podle Knighta a Allena)

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr
      1. - v cukru nebo v cukru bílém,
      2. - v cukru extra bílém.

1. 2. Definice

   Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   K roztoku vzorku se přidá v přebytku činidlo a jeho zredukovaný a nezredukovaný podíl se pak stanoví zpětnou titrací roztokem měďnaté disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctvé.

1. 4. Reakční činidla
   1. 4.1. Disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové, roztok 0,0025 mol/l: rozpustí se 0,930 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové ve vodě a doplní se vodou do jednoho litru.
   2. 4.2. Roztok indikátoru murexidu: 0,25 g murexidu se přidá do 50 ml vody a smíchá se s 20 ml vodného roztoku methylenové modři o koncentraci 0,2 g/100 ml.
   3. 4.3. Měďnaté činidlo: v 600 ml vody obsahující 40 ml hydroxidu sodného o koncentraci 1,0 mol/l se rozpustí 25 g bezvodého uhličitanu sodného a 25 g tetrahydrátu vinanu sodnodraselného. V cca 100 ml vody se rozpustí 6,0 g pentahydrátu síranu měďnatého, vzniklý roztok se přidá k roztoku vinanu a doplní vodou do jednoho litru.
   4. Poznámka: Roztok má omezenou trvanlivost (jeden týden).
   1. 4.4 Standardní roztok invertního cukru: v odměrné baňce o objemu 250 ml se rozpustí 23,750 g čisté sacharosy (4.5.) v cca 120 ml vody. Přidá se 9 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ₂₀ = 1,16) a nechá se stát při laboratorní teplotě po dobu 8 dní. Roztok se doplní do 250 ml a ukončení hydrolýzy se zkontroluje odečtem na polarimetru nebo sacharometru při použití trubice o délce 200 mm. Zjištěná hodnota se má rovnat (11,80 ± 0,05) °S (viz poznámka). 200 ml tohoto roztoku se odpipetuje do odměrné baňky o objemu 2000 ml, zředí se vodou a za stálého protřepávání (aby nedošlo k nadměrnému místnímu zalkalizování roztoku) se přidá 71,4 ml roztoku hydroxidu sodného (1 mol/l), ve kterém jsou rozpuštěny 4 g kyseliny benzoové. Roztok se doplní na 2000 ml, tj. aby obsahoval 1 g invertního cukru ve 100 ml; hodnota pH roztoku se má pohybovat kolem 3.

      Tento stálý zásobní roztok se ředí pouze bezprostředně před použitím.

   1. 4.5. Čistá sacharosa: vzorek čisté sacharosy s obsahem invertního cukru nejvýše 0,001 g/100 g.

1. 5. Přístroje a pomůcky
   1. 5.1 Zkumavky 150 × 20 mm.
   2. 5.2 Bílá porcelánová miska.
   3. 5.3 Analytické váhy vážící s přesností na 0,1 mg.

1. 6. Postup
   1. 6.1 Ve zkumavce (5.1.) se rozpustí 5 g vzorku cukru v 5 ml studené vody, přidají se 2,0 ml měďnatého činidla (4.3.) a obsah se promíchá. Zkumavka se ponoří do lázně s vroucí vodou na dobu 5 min a poté se ve studené vodě ochladí.
   2. 6.2. Roztok se ze zkumavky kvantitativně, s použitím co nejmenšího množství vody, převede do bílé porcelánové misky (5.2.), přidají se tři kapky indikátoru (4.2.) a titruje se roztokem disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (4.1.). Titrační spotřeba v ml se označí jako V_o.

      Těsně před ukončením titrace se barva roztoku změní ze zelené přes šedou na purpurovou v bodě ekvivalence. Purpurová barva pomalu mizí v důsledku oxidace oxidu měďného na oxid měďnatý; rychlost oxidace závisí na koncentraci přítomné zredukované mědi. Proto je při titraci nutné dosáhnout bodu ekvivalence co možná nejrychleji.

   1. 6.3. Sestrojí se kalibrační křivka na základě přídavku známého množství invertního cukru (příslušně zředěný roztok 4.4.) k 5 g čisté sacharosy (4.5.) a odpovídajícího množství studené vody tak, aby celkový objem přidaného roztoku činil 5 ml. Titrační spotřeba (ml) se vynese do grafu proti procentnímu obsahu invertního cukru přidaného k 5 g sacharosy; výslednou křivkou je přímka v rozmezí 0,001 až 0,019 g na 100 g invertního cukru, resp. 100 g vzorku.

1. 7. Vyjádření výsledků
   1. 7.1 Postup výpočtu

      Z kalibrační křivky se odečte obsah invertního cukru (v procentech) odpovídající spotřebě V_o v ml disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové při zkoušení vzorku.

   1. 7.2. Pokud se předpokládá vyšší koncentrace než 0,017 g invertního cukru ve 100 g zkoušeného vzorku, musí se příslušně snížit množství vzorku v bodě 6.1., zkoušený vzorek se však musí doplnit do 5 g čistou sacharosou (4.5.).
   2. 7.3. Opakovatelnost

      Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,005 g na 100 g vzorku.

1. 8. Poznámka

   Při převodu hodnoty ve °S na polarimetrické úhlové stupně se hodnota uvedená v °S dělí 2,889 (polarimetrická trubice o délce 200 mm; sodíková výbojka jako světelný zdroj; přístroj umístěný v místnosti, ve které je možné udržovat teplotu kolem 20 °C).

Příloha č. 18

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr nebo glukosový ekvivalent

(Metoda podle Luffa a Schoorla)

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Metoda slouží ke stanovení
      1. 1.1. obsahu redukujících cukrů vyjádřený jako invertní cukr
         1. - v tekutém cukru,
         2. - v tekutém bílém cukru,
         3. - v tekutém invertním cukru,
         4. - v tekutém bílém invertním cukru,
         5. - v sirupu z invertního cukru,
         6. - v sirupu z invertního cukru bílého.
      1. 1.2. obsahu redukujících cukrů vyjádřeného a vypočteného (vztaženo na sušinu) jako glukosový ekvivalent
         1. - ve škrobovém sirupu,
         2. - v sušeném škrobovém sirupu.
      1. 1.3. obsahu redukujících cukrů vyjádřeného jako D-glukosa
         1. - v glukosy monohydrátu,
         2. - v bezvodé glukose.

1. 2. Definice

   Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukry, D-glukosa nebo jako glukosový ekvivalent se rozumí obsah redukujících cukrů vyjádřený nebo vypočtený jako invertní cukr, D-glukosa nebo glukosový ekvivalent stanovený popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   Vzorek s redukujícími cukry se zahřeje (a v případě potřeby vyčeří) za standardních podmínek k bodu varu s měďnatým roztokem, která se částečně redukuje na Cu (I). Přebytek Cu (II) se poté stanoví jodometricky.

1. 4. Reakční činidla
   1. 4.1. Carrezův roztok I: 21,95 g dihydrátu octanu zinečnatého, nebo 24 g trihydrátu octanu zinečnatého, se spolu s přidanými 3 ml ledové kyseliny octové rozpustí ve vodě a doplní vodou do 100 ml.
   2. 4.2. Carrezův roztok II: 10,6 g trihydrátu hexakyanoželeznatanu draselného se rozpustí ve vodě a doplní vodou do 100 ml.
   3. 4.3. Luff-Schoorlovo činidlo: připraví se tyto roztoky:
      1. 4.3.1. Roztok síranu měďnatého: 25 g pentahydrátu síranu měďnatého neobsahujícího železo se rozpustí ve 100 ml vody.
      2. 4.3.2. Roztok kyseliny citronové: 50 g monohydrátu kyseliny citronové se rozpustí v 50 ml vody.
      3. 4.3.3. Roztok uhličitanu sodného: 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného se rozpustí v cca 300 ml horké vody a nechá se vychladnout.
      4. 4.3.4. K roztoku uhličitanu sodného (4.3.3.) v litrové odměrné baňce se za mírného promíchávání krouživým pohybem přidává roztok kyseliny citronové (4.3.2.). Obsah se míchá, dokud se nepřestane vyvíjet plyn, pak se přidá roztok síranu měďnatého (4.3.1.) a vodou se doplní do 1000 ml. Roztok se nechá stát přes noc, v případě potřeby se potom přefiltruje. Provede se kontrola koncentrace roztoku činidla podle metody popsané v bodě 6.1. (Cu 0,1 mol/l; uhličitan sodný 1 mol/l).
   1. 4.4. Roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l.
   2. 4.5. Roztok škrobu: do jednoho litru vroucí vody se přilije 5 g rozpustného škrobu rozmíchaného ve 30 ml vody. Povaří se 3 minuty a nechá se vychladnout; je-li třeba, přidá se 10 mg jodidu rtuťnatého jako konzervační činidlo.
   3. 4.6. Kyselina sírová, 3 mol/l.
   4. 4.7. Roztok jodidu draselného, 30 % hmot.
   5. 4.8. Úlomky pemzy, vyvařené v kyselině chlorovodíkové, promyté vodou do vymizení kyselé reakce a vysušené.
   6. 4.9. Isopentylalkohol.
   7. 4.10. Hydroxid sodný, 0,1 mol/l.
   8. 4.11. Kyselina chlorovodíková, 0,1 mol/l.
   9. 4.12. Fenolftalein, 1%ní roztok v ethanolu.

1. 5. Přístroje a pomůcky
   1. 5.1. Erlenmeyerova baňka o objemu 300 ml se zpětným chladičem.
   2. 5.2. Stopky.

1. 6. Postup
   1. 6.1. Stanovení titru Luff-Schoorlova činidla (4.3.):
      1. 6.1.1. Ke 25 ml Luff-Schoorlova činidla (4.3.) se přidají 3 g jodidu draselného a 25 ml kyseliny sírové o koncentraci 3 mol/l (4.6.).

         Titruje se roztokem thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.4.) za použití škrobového roztoku (4.5.) jako indikátoru, který se přidá až ke konci titrace. Pokud není spotřeba roztoku thiosíranu o koncentraci 0,1 mol/l rovna 25 ml, musí být činidlo připraveno znovu.

      1. 6.1.2. Odpipetuje se 10 ml činidla do 100 ml odměrné baňky a doplní se vodou po rysku.

         10 ml takto zředěného činidla se odpipetuje do Erlenmeyerovy baňky obsahující 25 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l (4.11.) a zahřívá se po dobu jedné hodiny na vroucí vodní lázni. Pak se roztok ochladí, doplní se na původní objem čerstvě převařenou vodou a titruje roztokem hydroxidu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.10.) za použití fenolftaleinu (4.12.) jako indikátoru.

         Spotřeba roztoku hydroxidu sodného, 0,1 mol/l (4.10.) musí být mezi 5,5 a 6,5 ml.

      1. 6.1.3. 10 ml zředěného činidla (6.1.2.) se titruje kyselinou chlorovodíkovou, 0,1 mol/l (4.11.) za použití fenolftaleinu (4.12.) jako indikátoru. Bod ekvivalence při titraci je charakterizován ztrátou fialového zbarvení.

         Spotřeba roztoku kyseliny chlorovodíkové, 0,1 mol/l (4.11.) musí být mezi 6,0 a 7,5 ml.

      1. 6.1.4. Hodnota pH Luff-Schoorlova činidla musí být mezi 9,3 a 9,4 při 20 °C.
   1. 6.2. Příprava roztoku
      1. 6.2.1. Naváží se 5 g vzorku s přesností na 1 mg a kvantitativně se převede do odměrné baňky o objemu 250 ml obsahující 200 ml vody. V případě potřeby se vyčeří přidáním 5 ml Carrezova roztoku I (4.1.), pak se přidá 5 ml Carrezova roztoku II (4.2.). Po přídavku každého roztoku se obsah zamíchá. Roztok se doplní vodou do 250 ml a dobře promíchá. V případě potřeby se roztok přefiltruje.
      2. 6.2.2. Roztok (6.2.1.) se zředí v takovém poměru, aby obsah redukujících cukrů vyjádřených jako glukosa se v 25 ml roztoku pohyboval v rozmezí 15 až 60 mg.
   1. 6.3. Titrace podle Luff-Schoorlovy metody

      Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky (5.1.) se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (4.3.), do baňky se pak pipetou odměří 25 ml roztoku cukru (6.2.2.) a vloží se dva úlomky pemzy (4.8.). K baňce (5.1.) se připojí zpětný chladič a aparatura se ihned umístí na drátěnou azbestovou síťku nad plamen Bunsenova kahanu. Síťka má v azbestové části vyříznutý kruhový otvor o stejném průměru, jako je dno baňky. Kapalina se přibližně během dvou minut uvede do varu a nechá se mírně vařit po dobu 10 min. Pak se ihned ochladí ve studené vodě a po 5 min se titruje podle tohoto postupu:

      Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného (4.7.), bezprostředně poté se přidá opatrně (s ohledem na bouřlivý vývoj plynu) 25 ml kyseliny sírové o koncentraci 3 mol/l (4.6.). Titruje se roztokem thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l (4.4.), dokud se roztok téměř neodbarví, pak se přidá jako indikátor několik ml roztoku škrobu (4.5.) a pokračuje se v titraci až do vymizení modrého zbarvení.

      Provede se slepý pokus s 25 ml vody místo 25 ml roztoku cukru (6.2.2.).

1. 7. Vyjádření výsledků
   1. 7.1. Vzorec a postup výpočtu

      Z níže uvedené tabulky se odečte nebo se stanoví interpolací hmotnost glukosy nebo invertního cukru v mg, odpovídající rozdílu mezi oběma titračními spotřebami, vyjádřenými v ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l.

      Výsledek se vyjádří v hmotnostních procentech invertního cukru nebo D-glukosy, vztažených na sušinu.

   1. 7.2. Opakovatelnost

      Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 0,2 ml.

1. 8. Poznámka

   Před okyselením kyselinou sírovou se může přidat malé množství isopentylalkoholu (4.9.), aby se omezila tvorba pěny.

   Tabulka hodnot pro Luff-Schoorlovo činidlo

   Příloha č. 18 Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr nebo glukosový ekvivalent Tabulka hodnot pro Luff-Schoorlovo činidlo

   0,1 mol/l thiosíranu sodného	Glukosa, fruktosa, invertní cukr C6H12O6
   ml	mg	rozdíl
   1	2,4
   2	4,8	2,4
   3	7,2	2,4
   4	9,7	2,5
   5	12,2	2,5
   6	14,7	2,5
   7	17,2	2,5
   8	19,8	2,6
   9	22,4	2,6
   10	25,0	2,6
   11	27,6	2,6
   12	30,3	2,7
   13	33,0	2,7
   14	35,7	2,7
   15	38,5	2,8
   16	41,3	2,8
   17	44,2	2,9
   18	47,1	2,9
   19	50,0	2,9
   20	53,0	3,0
   21	56,0	3,0
   22	59,1	3,1
   23	62,2	3,1

Příloha č. 19

Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

(Metoda podle Lanea a Eynona – modifikace s konstantním objemem)

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Metoda slouží ke stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr
      1. - v tekutém cukru,
      2. - v tekutém cukru bílém,
      3. - v tekutém invertním cukru,
      4. - v tekutém bílém invertním cukru,
      5. - v sirupu z invertního cukru,
      6. - v sirupu z invertního cukru bílého.

1. 2. Definice

   Redukujícími cukry vyjádřenými jako invertní cukr se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou.

1. 3. Podstata metody

   Roztokem zkušebního vzorku se titruje za bodu varu určité množství Fehlingova roztoku s použitím methylenové modři jako indikátoru.

1. 4. Reakční činidla
   1. 4.1. Fehlingův roztok:
      1. 4.1.1. Roztok A:

         69,3 g pentahydrátu síranu měďnatého se rozpustí ve vodě a doplní se na 1 000 ml.

      1. 4.1.2. Roztok B:

         346,0 g tetrahydrátu vinanu sodnodraselného a 100 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě a doplní na 1 000 ml. Čirý roztok se oddělí dekantací od usazeniny, která se může někdy vytvořit.

      2. Poznámka:
         Tyto dva roztoky je třeba skladovat v hnědých nebo jantarově žlutě zbarvených lahvích.
   1. 4.2. Roztok hydroxidu sodného, 1 mol/l.
   2. 4.3. Standardní roztok invertního cukru: 23,750 g čisté sacharosy se rozpustí v cca 120 ml vody v 250 ml odměrné baňce, přidá se 9 ml kyseliny chlorovodíkové (hustota 1,16 g/ml) a nechá se stát při laboratorní teplotě po dobu 8 dní. Roztok se doplní do 250 ml a ukončení hydrolýzy se zkontroluje polarimetrem nebo sacharometrem s délkou trubice 200 mm. Odečtená hodnota se má rovnat (11,80 ± 0,05) °S (viz poznámka 8). 200 ml tohoto roztoku se odpipetuje do 2000 ml odměrné baňky, zředí se vodou a za stálého protřepávání (aby nedošlo k nadměrné místní alkalizaci roztoku) se přidá 71,4 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol/l (4.2.), ve kterém jsou rozpuštěny 4 g kyseliny benzoové. Baňka se doplní do 2000 ml, aby výsledný roztok obsahoval 1 g invertního cukru ve 100 ml. Hodnota pH roztoku má být přibližně rovna 3.

      Tento stabilní zásobní roztok by se měl ředit až těsně před použitím.

      Při přípravě roztoku invertního cukru o koncentraci 0,25 g/100 ml se 250 ml odměrná baňka naplní po rysku zásobním roztokem o koncentraci 1 g/100 ml při 20 °C. Obsah se kvantitativně převede do 1000 ml odměrné baňky a doplní se vodou po rysku při 20 °C.

   1. 4.4. Roztok methylenové modři, 1 g/100 ml.

1. 5. Přístroje a pomůcky
   1. 5.1. Varné baňky s úzkým hrdlem o objemu 500 ml.
   2. 5.2. Byreta o objemu 50 ml, dělená po 0,05 ml, s postranním kohoutem.
   3. 5.3. Pipety s ryskami na 20, 25 a 50 ml.
   4. 5.4. Odměrné baňky o objemu 250, 1 000 a 2 000 ml.
   5. 5.5. Zařízení k ohřevu, vhodné pro udržování varu za podmínek uvedených v bodě 6.1. a umožňující sledovat barevnou změnu v bodě ekvivalence, aniž se varná baňka (5.1.) musí přemísťovat.
   6. 5.6. Stopky ukazující s přesností nejméně na 1 s.

1. 6. Postup
   1. 6.1. Stanovení titru Fehlingova roztoku
      1. 6.1.1. Do čisté a suché kádinky se odpipetuje 50 ml roztoku B (4.1.2.), poté 50 ml roztoku A (4.1.1.) a dobře se promíchá.
      2. 6.1.2. Byreta se propláchne a naplní 0,25 % (0,25 g/100 ml) standardním roztokem invertního cukru (4.3.).
      3. 6.1.3. Do 500 ml varné baňky (5.1.) se odpipetuje alikvotní podíl 20 ml směsného roztoku A a B (6.1.1.) a přilije se 15 ml vody. Z byrety se do baňky odměří 39 ml roztoku invertního cukru, přidá se několik varných kamínků a obsah se jemným krouživým pohybem promíchá.
      4. 6.1.4. Obsah baňky se zahřeje k varu a nechá se vařit po dobu přesně 2 min. Během dalšího postupu se baňka nesmí sejmout ze zdroje tepla a přerušit var.

         Na konci dvouminutového varu se přidají tři nebo čtyři kapky roztoku methylenové modři (4.4.). Barva roztoku musí být výrazně modrá.

      1. 6.1.5. Pokračuje se v přidávání standardního roztoku invertního cukru z byrety, zpočátku po 0,2 ml, pak po 0,1 ml a nakonec po kapkách, až se dosáhne bodu ekvivalence. Ten je indikován vymizením modrého zbarvení přítomné methylenové modři. Barva roztoku je načervenalá následkem přítomnosti suspenze oxidu měďného.
      2. 6.1.6. Bodu ekvivalence při titraci by mělo být dosaženo do tří minut od začátku varu roztoku. Konečná spotřeba V₀ se musí pohybovat v rozmezí 39,0 až 41,0 ml. Je-li hodnota V₀ mimo hranice toto rozmezí, upraví se koncentrace mědi ve Fehlingově roztoku A (4.1.1.) a stanovení titru se opakuje.
   1. 6.2. Příprava roztoku vzorku

      Koncentrace roztoku zkušebního vzorku se má pohybovat v rozmezí 250 až 400 mg invertního cukru ve 100 ml.

   1. 6.3. Orientační zkouška
      1. 6.3.1. Je nutné provést orientační zkoušku ke zjištění potřebného přídavku vody k 20 ml směsného roztoku A a B, který zajistí, že konečný objem po titraci bude činit 75 ml.

         Postupuje se shodně s návodem v bodě 6.1.4., pouze místo standardního roztoku invertního cukru se použije roztok vzorku, tj. do baňky se byretou odměří 25 ml roztoku vzorku, přidá se 15 ml vody, nechá se 2 min povařit a roztok se pak titruje až do dosažení bodu ekvivalence, jak je popsáno v bodě 6.1.5.

      1. 6.3.2. Pokud po přídavku roztoku methylenové modři přetrvává načervenalé zbarvení, je použitý roztok vzorku příliš koncentrovaný. V tomto případě se zkouška přeruší a provede se opakované stanovení s nižší koncentrací roztoku vzorku.

         Je-li k dosažení načervenalého zbarvení zapotřebí více než 50 ml roztoku vzorku, musí se použít roztok vzorku s vyšší koncentrací.

         Množství vody, které se má přidat, se vypočítá odečtením objemu směsného Fehlingova roztoku (20 ml) a objemu roztoku vzorku od 75 ml.

   1. 6.4. Konečná zkouška roztoku vzorku
      1. 6.4.1. Do varné baňky se odpipetuje 20 ml směsného Fehlingova roztoku a množství vody stanovené podle bodu 6.3.
      2. 6.4.2. Z byrety se odměří roztok vzorku v množství stanoveném podle bodu 6.3., sníženém o 1 ml. Přidá se několik varných kamínků, obsah baňky se krouživým pohybem promíchá, povaří a titruje jako v předchozím stupni (6.3.). Bodu ekvivalence při titraci musí být dosaženo během 1 min od přidání roztoku methylenové modři. Spotřeba při konečné titraci se rovná V₁.

1. 7. Vyjádření výsledků
   1. 7.1. Vzorec a postup výpočtu
      1. Obsah redukujících cukrů ve vzorku vyjádřený jako invertní cukr se vypočítá podle vzorce:
         1. % redukujících cukrů (jako invertní cukr):
            1. kde:
               1. C - koncentrace roztoku zkušebního vzorku (g/100 ml),
               2. V₀ - spotřeba standardního roztoku invertního cukru (ml) při stanovení titru,
               3. V₁ - spotřeba roztoku zkušebního vzorku (ml) při přesné zkoušce (6.4.2.),
               4. f - korekční faktor zohledňující koncentraci sacharosy přítomné v roztoku zkušebního vzorku; hodnoty jsou uvedeny v níže uvedené tabulce:

                  Příloha č. 19 Metoda stanovení redukujících cukrů vyjádřených jako invertní cukr

                  Sacharosa (g ve směsi)	Korekční faktor f
                  0,0	1,000
                  0,5	0,982
                  1,0	0,971
                  1,5	0,962
                  2,0	0,954
                  2,5	0,946
                  3,0	0,939
                  3,5	0,932
                  4,0	0,926
                  4,5	0,920
                  5,0	0,915
                  5,5	0,910
                  6,0	0,904
                  6,5	0,898
                  7,0	0,893
                  7,5	0,888
                  8,0	0,883
                  8,5	0,878
                  9,0	0,874
                  9,5	0,869
                  10,0	0,864

                  Korekce pro jiná množství sacharosy v roztoku zkušebního vzorku se mohou vypočítat z tabulkových hodnot interpolací.

               5. Poznámka:
                  Přibližná koncentrace sacharosy se může stanovit odečtením koncentrace rozpuštěných tuhých látek z invertního cukru (pro tento výpočet je použitá hodnota f rovna 1,0) od koncentrace veškerých rozpuštěných látek vyjádřených jako sacharosa a stanovených na základě indexu lomu podle přílohy č. 15 k této vyhlášce.
   1. 7.2. Opakovatelnost

      Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených zároveň nebo rychle za sebou ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 1,0 % jejich aritmetického průměru.

1. 8. Poznámka

   Při převodu hodnoty ve °S na polarimetrické úhlové stupně se tato hodnota udaná v °S dělí faktorem 2,889 (polarimetrická trubice o délce 200 mm; sodíková výbojka jako zdroj světla; přístroj umístěný v místnosti, ve které je možno udržovat teplotu blízkou 20 °C).

Příloha č. 20

Metoda stanovení glukosového ekvivalentu pro některé cukry určené k lidské spotřebě

(Metoda podle Lanea a Eynona s konstantním titrem)

1. 1. Předmět a oblast použití
   1. Tato metoda slouží ke stanovení glukosového ekvivalentu
      1. - ve škrobovém sirupu,
      2. - v sušeném škrobovém sirupu,
      3. - v monohydrátu glukocsy,
      4. - v glukose bezvodé.

1. 2. Definice
   1. 2.1. Redukční sílou se rozumí obsah redukujících cukrů stanovený popsanou metodou, vyjádřených jako bezvodá D-glukosa a udávaný v procentech hmotnosti vzorku.
   2. 2.2. Glukosovým ekvivalentem se rozumí redukční síla vypočtená v procentech hmotnosti sušiny vzorku.

1. 3. Podstata metody

   Roztokem zkušebního vzorku se za přesně určených podmínek titruje za bodu varu určitý objem směsného Fehlingova roztoku s použitím methylenové modři jako indikátoru.

1. 4. Reakční činidla
   1. 4.1. Fehlingův roztok:
      1. 4.1.1. Roztok A:

         Ve vodě se rozpustí 69,3 g pentahydrátu síranu měďnatého a v odměrné baňce o objemu 1 000 ml se doplní po rysku.

      1. 4.1.2. Roztok B:

         Ve vodě se rozpustí 346,0 g tetrahydrátu vinanu sodno-draselného a 100 g hydroxidu sodného a v odměrné baňce o objemu 1000 ml doplní vodou po rysku. Čirý roztok se dekantací oddělí od usazeniny, který se někdy může vytvořit.

      2. Poznámka: Tyto dva roztoky (4.1.1. a 4.1.2.) je třeba skladovat v hnědých nebo jantarově žlutě zbarvených lahvích.
      1. 4.1.3. Příprava směsného Fehlingova roztoku

         Do čisté kádinky se odpipetuje 50 ml roztoku B (4.1.2.) a poté 50 ml roztoku A (4.1.1.) a dobře se promíchají.

      2. Poznámka: Směsný Fehlingův roztok se nesmí uchovávat, nýbrž se musí každý den připravovat čerstvý a standardizovaný (6.1.).
   1. 4.2. Bezvodá D-glukosa (C₆H₁₂O₆)

      Tento materiál je nutno před použitím 4 h sušit ve vakuové sušárně při teplotě 100 ± 1 °C nebo nižší a při tlaku asi 10 kPa (103 mbar).

   1. 4.3. Standardní roztok glukosy, 0,600 g/100 ml

      S přesností na 0,1 mg se naváží 0,6 g bezvodé glukosy (4.2.), rozpustí se ve vodě, kvantitativně převede do odměrné baňky o objemu 100 ml (5.4.), doplní vodou po rysku a promíchá.

      Tento roztok je nutno připravit čerstvý každý den, kdy bude používán.

   1. 4.4. Roztok methylenové modři, 0,1 g/100 ml vody

      Rozpustí se 0,1 g methylenové modři ve 100 ml vody.

1. 5. Přístroje a pomůcky
   1. 5.1. Varné baňky s úzkým hrdlem o objemu 250 ml.
   2. 5.2. Byreta o objemu 50 ml, s postranním kohoutem a dělená po 0,05 ml.
   3. 5.3. Pipety nedělené s ryskami 25 ml a 50 ml.
   4. 5.4. Odměrné baňky o objemu 100 a 500 ml.
   5. 5.5. Zařízení k ohřevu, vhodné pro udržování varu v souladu s podmínkami popsanými v bodě 6.1. a umožňující sledovat barevnou změnu v bodě ekvivalence, aniž se varná baňka (5.1.) odstraní ze zdroje tepla (viz bodě 6.1. poznámka 1).
   6. 5.6. Stopky ukazující s přesností nejméně na 1 s.

1. 6. Postup
   1. 6.1. Standardizace Fehlingova roztoku
      1. 6.1.1. Do čisté suché varné baňky (5.1.) se odpipetuje 25 ml Fehlingova roztoku (4.1.3.).
      2. 6.1.2. Byreta (5.2.) se naplní standardním roztokem glukosy (4.3.) a meniskus se nastaví na nulovou rysku.
      3. 6.1.3. Do varné baňky (5.1.) se z byrety napustí 18 ml standardního roztoku glukosy (4.3.) a obsah se krouživým pohybem promíchá.
      4. 6.1.4. Varná baňka se umístí na zařízení k ohřevu (5.5.), předem nastavené tak, aby var nastal za (120 ± 15) s.

         V celém průběhu titrace nesmí být zařízení k ohřevu nastavováno jinak (viz poznámka 1)

      1. 6.1.5. Jakmile se roztok začne vařit, spustí se stopky.
      2. 6.1.6. Obsah baňky se povaří 120 sekund (podle stopek). Ke konci se přidá 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).
      3. 6.1.7. Po 120 s, měřeno stopkami, od začátku varu se začne z byrety (6.1.2.) do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy po 0,5 ml dávkách, dokud se methylenová modř neodbarví (viz poznámky 2 a 3).

         Zaznamená se celkový objem přidaného standardního roztoku glukosy (X ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

      1. 6.1.8. Stupně v bodech 6.1.1. a 6.1.2. se zopakují.
      2. 6.1.9. Z byrety se do varné baňky (5.1.) napustí (X - 0,3) ml standardního roztoku glukosy.
      3. 6.1.10. Stupně v bodech 6.1.4., 6.1.5. a 6.1.6. se zopakují.
      4. 6.1.11. Po 120 s, měřeno stopkami, od počátku varu se začne z byrety do varné baňky (5.1.) přidávat standardní roztok glukosy, zpočátku po 0,2 ml dávkách a nakonec po kapkách, dokud se methylenová modř právě neodbarví.

         Ke konci tohoto postupu musí být doba mezi dvěma po sobě následujícími přídavky standardního roztoku glukosy 10 až 15 s.

         Toto přidávání musí být provedeno během 60 s a celková doba varu tedy nesmí překročit 180 s.

         K tomuto účelu může být zapotřebí provést třetí titraci s poněkud větší, příslušně upravenou počáteční dávkou standardního roztoku glukosy (6.1.9.).

      1. 6.1.12. Zaznamená se celková spotřeba (V₀ ml) standardního roztoku při závěrečné titraci (viz poznámka 4).
      2. 6.1.13. Hodnota V₀ musí být v rozmezí 19,0 - 21,0 ml standardního roztoku glukosy (4.3.).

         Pokud se hodnota V₀ nachází mimo toto rozmezí, příslušně se upraví koncentrace Fehlingova roztoku A (4.1.1.) a standardizační proces se zopakuje.

      1. 6.1.14. Vzhledem k tomu, že hodnota V₀ je přesně známa, je třeba pro každodenní standardizaci provést jednu titraci s počátečním přídavkem standardního roztoku glukosy V₀ – 0,5.
      2. Poznámka 1: Tímto je zajištěno, že jakmile nastane var, je vývin páry rychlý a nepřerušovaný během celé titrační procedury a v co nejvíc se zabrání vniknutí vzduchu do titrační baňky a opětovné oxidaci jejího obsahu.
      3. Poznámka 2: Odbarvení roztoku methylenové modři je nejlépe pozorovatelné v horních vrstvách obsahu titrační baňky a v oblasti menisku, tj. v místech, které v podstatě neobsahují sražený červený oxid měďnatý. Odbarvení je snadněji pozorovatelné za nepřímého osvětlení. Je výhodné použít stínítko za titrační baňkou.
      4. Poznámka 3: Byreta by měla být během stanovení co nejlépe chráněna před zdrojem tepla.
      5. Poznámka 4: Vzhledem k tomu, že nelze zcela vyloučit subjektivní faktor, musí každý pracovník provádět svou vlastní standardizační titraci a při výpočtu musí použít svou vlastní hodnotu V₀ (7.1.).
   1. 6.2. Orientační zkouška připraveného vzorku
      1. 6.2.1. Pokud není známa přibližná hodnota redukční síly (2.1.) připraveného vzorku, je nutno provést předběžnou zkoušku, aby se získala tato přibližná hodnota, a mohla tak být vypočtena hmotnost zkušebního vzorku (6.3.).
         1. Tato zkouška se provádí takto:
            1. 6.2.2. Připraví se Z % (m/V) roztok vzorku, „Z” má přibližnou hodnotu.
            2. 6.2.3. Postupuje se jako v bodě 6.1.2. s použitím roztoku vzorku (6.2.2.) namísto standardního roztoku glukosy.
            3. 6.2.4. Postupuje se jako v bodě 6.1.1.
            4. 6.2.5. Postupuje se jako v bodě 6.1.3. s použitím 10 ml roztoku vzorku namísto 18,0 ml standardního roztoku glukosy.
            5. 6.2.6. Postupuje se jako v bodě 6.1.4.
            6. 6.2.7. Obsah baňky se zahřeje k varu. Přidá se 1 ml roztoku methylenové modři (4.4.).
            7. 6.2.8. Jakmile začne var, spustí se stopky (5.6.) a začne se přidávat roztok vzorku z byrety do baňky po 1,0 ml dávkách s odstupem asi 10 sekund, a to až do odbarvení methylenové modři.

               Zaznamená se celková spotřeba standardního roztoku glukosy (Y ml) včetně předposlední 0,5 ml dávky.

            1. 6.2.9. Hodnota Y nesmí přesáhnout 50 ml. Pokud se to stane, je třeba zvýšit koncentraci roztoku vzorku a titraci zopakovat.
            2. 6.2.10. Přibližná hodnota redukční síly připraveného vzorku v % je přibližně dána výrazem:
   1. 6.3 Zkušební vzorek

      S přesností na 0,1 mg se odváží takové množství připraveného vzorku (mg), které obsahuje 2,85 až 3,15 g redukujících cukrů vyjádřených jako bezvodá dextrosa (D-glukosa). Při výpočtu se použije buď známá přibližná hodnota redukční síly (2.1.), nebo přibližná hodnota získaná v bodě 6.2.10.

   1. 6.4 Zkušební roztok

      Zkušební vzorek se v odměrné baňce o objemu 500 ml rozpustí ve vodě a vodou doplní po rysku.

   1. 6.5 Stanovení
      1. 6.5.1 Postupuje se jako v bodě 6.1.1.
      2. 6.5.2 Byreta (5.2.) se naplní zkušebním roztokem (6.4.) a meniskus se nastaví na nulu.
      3. 6.5.3 Z byrety se do varné baňky napustí 18,5 ml roztoku zkušebního roztoku. Kroužením se obsah baňky zamíchá.
      4. 6.5.4 Postupuje se jako v bodě 6.1.4.
      5. 6.5.5 Postupuje se jako v bodě 6.1.5.
      6. 6.5.6 Postupuje se jako v bodě 6.1.6.
      7. 6.5.7 Postupuje se jako v bodě 6.1.7., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.
      8. 6.5.8 Postupuje se jako v bodě 6.1.8.
      9. 6.5.9 Postupuje se jako v bodě 6.1.9., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.
      10. 6.5.10 Postupuje se jako v bodě 6.1.10.
      11. 6.5.11 Postupuje se jako v bodě 6.1.11., s použitím zkušebního roztoku namísto standardního roztoku glukosy.
      12. 6.5.12 Zaznamená se objem (V₁) spotřebovaného zkušebního roztoku při závěrečné titraci.
      13. 6.5.13 Hodnota V₁ musí být v rozmezí 19,0 až 21,0 ml zkušebního roztoku.

          Pokud se hodnota V₁ nachází mimo toto rozmezí, upraví se koncentrace zkušebního roztoku a stupně 6.5.1. až 6.5.12. se zopakují.