Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

vyhlášené znění

  1. 5. Kromě toho je při stanovování experimentálních podmínek při oddělování fází půda/roztok důležité počítat s možnou přítomností třetí „pseudofáze“, koloidu. Koloidní částice s velikostí menší než 0,2 µm mohou mít značný vliv na celý mechanismus adsorpce látky v půdní suspenzi. Při centrifugaci, jak je popsána výše, zůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se společně s vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí.

Má-li laboratoř, která studii provádí, zařízení pro ultracentrifugaci nebo ultrafiltraci, mohla by být adsorpce/desorpce studována hlouběji včetně informací o adsorpci látky na koloidních částicích. V takovém případě se k oddělení tří fází – půdy, koloidních částic a roztoku, použije ultracentrifugace při 60 000 ot./min nebo ultrafiltrace na filtru zachycujícím částice o velikosti 100 000 daltonů. Protokol o zkoušce by měl být také odpovídajícím způsobem pozměněn, mají-li být analyzovány všechny tři fáze.

Obrázek

Obrázek 1a Změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé hustoty půdy (ρp). Rt = 10 cm, Rb − Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10-3 g·s-1 cm-1 a ρvod = 1,0 g·cm-3 při 25 °C.

Obrázek

Obrázek 1b Změna centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé výšky sloupce směsi v centrifugační kyvetě (Rb − Rt) = L; Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10-3 g·s-1·cm-1, ρvod = 1,0 g·cm-3 při 25 °C a ρp = 2,0 g·cm-3.

DODATEK 5

VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)

  1. Časové schéma průběhu experimentu je následující:
    Obrázek

U všech výpočtů se předpokládá, že zkoušená látka je stálá a že se významně neadsorbuje na stěnách nádoby.

ADSORPCE (A%)

  1. a) Paralelní metoda
    1. Procento adsorpce se vypočte pro každou zkušební nádobu (i) pro každý čas (ti) podle následující rovnice:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (1) 3
    1. Veličiny v této rovnici lze vyčíslit takto:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (2)
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (3)
      1. kde:
        1. Ati = procento adsorpce (%) v čase ti
        2. = množství zkoušené látky na půdě v čase ti, kdy je prováděna analýza (µg)
        3. m0 = množství zkoušené látky v nádobě na začátku zkoušky (µg)
        4. C0 = počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (µg·cm-3)
        5. = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýza, (µg·cm-3); Tato koncentrace se stanoví analyticky a koriguje se na hodnoty ze slepých pokusů
        6. V0 = počáteční objem zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (cm3).

    Hodnoty adsorpčního procenta Ati nebo se vynesou proti času a zjistí se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha. Příklady takových křivek jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.

    Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy

    Obrázek

    Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase

    Obrázek
  1. b) Sériová metoda

    V následujících rovnicích je zohledněno, že se při studii adsorpce provádějí měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze v určitých časových intervalech.

    1. — Pro každý časový interval se množství látky adsorbované na půdě vypočte takto:
      1. — pro první časový interval
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (4)
      1. — pro druhý časový interval
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (5)
      1. — pro třetí časový interval
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (6)
      1. — pro n-tý časový interval
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (7)
    1. — Procento adsorpce v každém časové intervalu A∆ti se vypočte z následující rovnice:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (8) 4
      1. zatímco procento adsorpce (Ati) v čase ti je dáno rovnicí:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (9) 4

    Hodnoty procenta adsorpce Ati nebo A∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha.

    1. — V čase ustavení rovnováhy teq:
      1. — je množství zkoušené látky adsorbované na půdě:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (10) 4
      1. — množství zkoušené látky v roztoku:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (11) 4
      1. — a procento adsorpce v rovnováze:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (12) 4
    1. Výše uvedené veličiny jsou definovány takto:
      1. , ,..., = množství látky adsorbované na půdě za časový interval ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      2. , ,..., = množství látky naměřené v podílu (vaA) v okamžiku t1, t2, ...,tn, (µg)
      3. = množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze, (µg)
      4. = množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)
      5. = objem podílu, ve kterém je látka stanovována, (cm3)
      6. = procento adsorpce odpovídající časovému intervalu ∆ti, (%)
      7. = procento adsorpce v adsorpční rovnováze

DESORPCE (%)

Časem t0, v němž se zahájí experiment pro studium desorpční kinetiky, je okamžik, kdy je co největší objem roztoku zkoušené látky (po dosažení adsorpční rovnováhy) nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2.

  1. a) Paralelní metoda
    1. V čase ti se změří množství zkoušené látky ve vodné fázi odebrané ze zkušební nádoby i a desorbované množství se vypočte z rovnice:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (13)

    V desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy = .

    1. Množství zkušební látky desorbované během časového intervalu (∆ti) je dáno rovnicí:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (14)
    1. Procento desorpce se vypočte takto:
      1. — v čase ti z rovnice:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (15)
      1. — a během časového intervalu (∆ti) z rovnice:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (16)
        1. kde:
          1. Dti = procento desorpce v čase ti, (%)
          2. D∆ti = procento desorpce za časový interval ∆ti, (%)
          3. = množství zkoušené látky desorbované v čase ti, (µg)
          4. = množství zkoušené látky desorbované během časového intervalu ∆ti, (µg)
          5. = množství zkoušené látky analyticky změřené v čase ti v roztoku o objemu Vri, který byl odebrán k analýze, (µg)
          6. = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze, (µg)
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (17)
          1. = množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)
          2. VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm3)
          3. = objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (cm3).

    Hodnoty procenta desorpce Dti nebo D∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila desorpční rovnováha.

  1. b) Sériová metoda
    1. V následujících rovnicích je zohledněno, že byla při předcházející studii adsorpce prováděna měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze (sériová metoda v bodě 1.9 Provedení zkoušky) Předpokládá se, že a) objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po experimentu pro studium adsorpční kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (VR) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (VT) během experimentu pro studium desorpční kinetiky zůstává konstantní a je dán rovnicí:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (18)
    1. V čase ti:
      1. — množství zkoušené látky se měří v malých podílech a desorbované množství se vypočte z následující rovnice:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (19)
      1. — v desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy =
      2. — procento desorpce Dti se vypočte z následující rovnice:
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (20)
    1. Za časový interval (∆ti):
      1. Pro každý časový interval se. desorbované množství látky vypočte takto:
        1. — pro první časový interval
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (21)
        1. — pro druhý časový interval

          1. a
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (22)
          1. pro n-tý časový interval

          1. a
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (23)
    1. Procento desorpce za každý časový interval D∆ti se nakonec vypočte z následující rovnice:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (24)
    1. zatímco procento desorpce (Dti) v čase ti je dáno rovnicí:
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (25)
    1. přičemž jsou výše použité veličiny definovány takto:
      1. ,,..., = množství látky, která zůstala adsorbovaná na půdě po časových intervalech ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      2. , ,..., = množství látky desorbované za časové intervaly ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      3. , ,..., = množství látky naměřené v podílu vaD v okamžicích t1, t2, ...., tn (µg)
      4. VT = celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou (cm3)
      5. = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze,(µg)
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (26)
      1. VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0;01M roztoku CaCl2 (cm3)
      2. = objem alikvotu odebraného k analýze ze zkušební nádoby (i) během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (27)

DODATEK 6

ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT

Obrázek
  1. XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC) – metoda C.19 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
    1. XIX.1 METODA

      Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000).

      1. XIX.1.1 ÚVOD

        Sorpční chování látek v půdách a v čistírenských kalech může být popsáno parametry experimentálně stanovenými zkušební metodou C.18. Důležitým parametrem je adsorpční koeficient, který je definován jako poměr koncentrace látky v půdě nebo kalu a koncentrace látky ve vodné fázi v rovnováze. Adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku v půdě Kou je užitečným ukazatelem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v půdě a v čistírenském kalu a umožňuje porovnat různé chemické látky. Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vodě a s rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

        Experimentální metoda popsaná v této zkoušce používá k odhadu adsorpčního koeficientu Kou v půdě a v čistírenských kalech vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehlivější než odhady z výpočtů pomocí metodiky QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) (9). Jako metoda založená na odhadu nemůže plně nahradit násadové experimenty stanovení adsorpční/desorpční rovnováhy podle metody C.18. Odhady Kou však mohou být užitečné pro volbu vhodných parametrů pro adsorpční/desorpční studie podle zkušební metody C.18, a to vypočtením Kd (distribučního koeficientu) nebo KF (Freundlichova adsorpčního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2).

      1. XIX.1.2 DEFINICE

        Kd: Distribuční koeficient je definován jako poměr rovnovážných koncentrací C rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému skládajícím se ze sorbentu (půda nebo čistírenský kal) a vodné fáze; je bezrozměrný, jsou-li koncentrace v obou fázích vyjádřeny jako hmotnostní podíly. Je-li koncentrace ve vodné fázi vyjádřena v jednotce hmotnosti na jednotku objemu, je jednotkou ml·g-1. Kd se může měnit s vlastnostmi sorbentu a může záviset na koncentraci.

        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        nebo(1)
        1. kde:
          1. Cpůda = koncentrace zkoušené látky v půdě v rovnováze (µg·g-1)
          2. Ckal = koncentrace zkoušené látky v kalu v rovnováze (µg·g-1)
          3. Cvod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·g-1, µg·ml-1).

        KF: Freundlichův adsorpční koeficient je definován jako koncentrace zkoušené látky v půdě nebo v čistírenském kalu (x/m), je-li rovnovážná koncentrace Cvod ve vodné fázi rovna jedné; vyjadřuje se v µg na gram sorbentu. Hodnota se může měnit s vlastnostmi sorbentu.

        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (2)
        1. kde:
          1. x/m = množství zkoušené látky x (µg) adsorbované v rovnováze na určitém množství sorbentu m (g)
          2. 1/n = směrnice Freundlichovy adsorpční isothermy
          3. Cvod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·ml-1)

        Kou: Distribuční koeficient (Kd) nebo Freundlichův adsorpční koeficient (KF) normalizovaný na obsah organického uhlíku (fou) v sorbentu; zejména u nedisociujících chemických látek je přibližným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umožňuje provést porovnání různých chemických látek. V závislosti na rozměru Kd a KF může být Kou bezrozměrný nebo může být jeho jednotkou ml . g-1 nebo µg . g-1 organického materiálu.

        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (3)

        Vztah mezi Kou a Kd není vždy lineární, hodnoty Kou se mohou pro jednotlivé půdy měnit, avšak jejich kolísání je ve srovnání s hodnotami Kd nebo KF silně omezeno.

        Adsorpční koeficient (Kou) lze odečíst pomocí kapacitního faktoru (k´) z kalibrační křivky log k´ versus log Kou pro vybrané referenční sloučeniny.

        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (4)
        1. kde:
          1. tR: retenční časy zkoušené a referenční látky pro HPLC (min)
          2. t0: mrtvá doba HPLC (min) (viz bod 1.8.2).

        Pov: Rozdělovací koeficient oktanol/voda je definován jako poměr koncentrací rozpuštěné látky v n-oktanolu a ve vodě; je bezrozměrný.

        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (5)
      1. XIX.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Pře použitím metody by měly být známy strukturní vzorec, čistota a disociační konstanta (podle potřeby). Užitečné jsou informace o rozpustnosti ve vodě a v organických rozpouštědlech, o rozdělovacím koeficientu oktanol-voda a o chování při hydrolýze.

        Mají-li být uvedena do korelace naměřená retenční data z HPLC pro zkoušenou látku a její adsorpční koeficient, musí být vytvořen kalibrační graf log Kou versus log k´. Použije se minimálně šest referenční bodů, alespoň po jednom nad a pod očekávanou hodnotou pro zkoušenou látku. Správnost metody se významně zlepší, budou-li použity referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou. Nejsou-li taková data známa, ponechává se na experimentátorovi, aby vybral vhodné kalibrační látky. V takovém případě by měla být vybrána obecnější sada strukturně heterogenních látek. Látky a hodnoty Kou, které mohou být použity, jsou uvedeny v dodatku, a to v tabulce 1 pro čistírenský kal a v tabulce 3 pro půdu. Volba jiných kalibračních látek by měla být zdůvodněna.

      1. XIX.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
        1. HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupným kyanopropylem jako pevnou fází, obsahujícím lipofilní a polární složky. Použije se mírně polární stacionární fáze na silikagelové matrici:
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
          − O − Si − CH2 − CH2 − CH2 − CN
          silikagel nepolární spacer polární složka

        Podstata zkušební metody je obdobná jako ve zkušební metodě A.8 (rozdělovací koeficient, metoda HPLC). Při průchodu kolonou v mobilní fázi zkoušená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku rozdělování mezi mobilní a stacionární fází se postup zkoušené látky zpomaluje. Dvojí složení stacionární fáze s polárními a nepolárními skupinami umožňuje, aby polární a nepolární skupiny molekuly interagovaly podobným způsobem, jako je tomu u organického materiálu v půdě nebo čistírenském kalu. To umožňuje stanovit vztah mezi retenčním časem na koloně a adsorpčním koeficientem na organickém materiálu.

        Na sorpční chování zejména u polárních látek má významný vliv pH. V případě zemědělských půd nebo nádrží s čistírenskými kaly se pH normálně pohybuje od pH 5,5 do 7,5. U disociujících látek se ve vhodném pufračním roztoku provedenou dvě zkoušky, a to jak s disociovanou formou, tak s nedisociovanou formou, avšak pouze v případě, že v rozmezí pH 5,5 až 7,5 disociuje alespoň 10 % zkoušené sloučeniny.

        Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použije pouze vztah mezi retencí na koloně HPLC a adsorpčním koeficientem, není nutná žádná kvantitativní metoda, nýbrž pouze stanovení retenčního času. Je-li k dispozici vhodná sada referenčních látek a lze-li realizovat standardní experimentální podmínky, je metoda rychlým a účinným způsobem odhadu adsorpčního koeficientu Kou.

      1. XIX.1.5 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

        Metoda HPLC je použitelná pro chemické látky (radioizotopově značené i neznačené), pro něž je k dispozici vhodný detekční systém (např. spektrofotometr, detektor radioaktivního záření) a jež jsou po dobu experimentu dostatečně stabilní. Může být zvláště užitečná pro chemické látky, jejichž studium je v jiných experimentálních systémech obtížné (tj. pro těkavé látky, které nejsou rozpustné ve vodě v koncentraci, kterou lze analyticky měřit, pro látky s vysokou afinitou k povrchu inkubačních systémů). Metoda může být použita pro směsi, které dávají nerozlišitelný eluční pás. V takovém případě se stanoví horní a dolní meze hodnot log Kou pro sloučeniny přítomné ve směsi.

        Při interpretaci výsledků HPLC mohou někdy působit problémy nečistoty. Jejich vliv je však malý, neboť zkoušené látky lze jasně analyticky identifikovat a od nečistot oddělit.

        1. Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla rovněž použita u řady jiných chemických látek z následujících chemických tříd:
          1. — aromatické aminy (např. trifluralin (1-(dipropylamino)-2,6-dinitro-4-(trifluormethyl)benzen), 4-chloranilin, 3,5-dinitroanilin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-nafylamin),
          2. — estery aromatických karoxylových kyselin (např. methyl-benzoát, ethyl-3,5-dinitrobenzoát),
          3. — aromatické uhlovodíky (např. toluen, xylen, ethylbenzen, nitrobenzen),
          4. — estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (např. diklofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl),
          5. — benzimidazolové a imidazolové fungicidy (např. karbendazim, fuberidazol, triazoxid),
          6. — amidy karboxylových kyselin (např. 2-chlorbenzamid, N,N-dimethylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid),
          7. — chlorované uhlovodíky (např. endosulfan, DDT, hexachlorbenzen, kvintozen, 1,2,3-trichlorbenzen),
          8. — organofosforové insekticidy (např. azinfos-methyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos),
          9. — fenoly (např. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,6-trichlorfenol, 1-naftol),
          10. — deriváty fenylmočoviny (např. isoproturon, monolinuron, pencykuron),
          11. — pigmentová barviva (např. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),
          12. — polyaromatické uhlovodíky (např. acenaften, naftalen),
          13. — 1,3,5-triazinové herbicidy (např. prometryn, propazin, simazin, terbutryn),
          14. — triazolové deriváty (např. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).

        Metoda není použitelná u látek, které reagují s eluentem nebo stacionární fází. Není rovněž použitelná u látek, které interagují specifickým způsobem s anorganickými složkami (např. tvoří klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí být použitelná u povrchově aktivních látek, anorganických látek a mírných nebo silných organických kyselina a zásad. Lze stanovit Kou s hodnotami log Kou od 1,5 do 5,0. Disociující látky musí být měřeny s pufrovanou mobilní fázi, avšak je třeba dbát na to aby nedošlo ke srážení složek pufru nebo zkoušené látky.

      1. XIX.1.6 KRITÉRIA JAKOSTI
        1. XIX.1.6.1 Správnost

          Obvykle lze adsorpční koeficient zkoušené látky stanovit v rozmezí ±0,5 řádu hodnoty stanovené násadovou rovnovážnou metodou (viz tabulka 1 v dodatku). Vyšší míry správnosti lze dosáhnout, jsou-li použité referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou.

        1. XIX.1.6.2 Opakovatelnost

          Stanovení se provedou alespoň dvojmo. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

        1. XIX.1.6.3 Reprodukovatelnost

          Dosud získané zkušenosti s použitím metody svědčí o její validitě. Ověřování metody HPLC za použití 48 látek (převážně pesticidů), u nichž byla k dispozici spolehlivá data o Kou v půdě, vedlo ke korelačnímu koeficientu R = 0,95 (10, 11).

          Pro zlepšení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní test za účasti 11 laboratoří (12). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v dodatku.

      1. XIX.1.7 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. XIX.1.7.1 Předběžný odhad adsorpčního koeficientu

          Rozdělovací poměr oktanol-voda Pov (= Kow) a do určité míry i rozpustnost ve vodě mohou být použity jako indikátory rozsahu adsorpce zejména u nedisociujících látek a mohou tedy být použity pro jeho předběžné nalezení. Pro různé skupiny chemických látek byla publikována řada užitečných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

        1. XIX.1.7.2 Přístroje a pomůcky

          Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulsním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovací smyčkou. Použije se komerční kyanopropylové chemicky vázané pryskyřice na silikagelu (např. Hypersil a Zorbax CN). Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona ze stejného materiálu. Kolony od různých dodavatelů se mohou podstatně lišit, pokud jde o účinnost. Pro orientaci by měly být dosaženy následující kapacitní faktory: log k´ > 0,0 pro log Kou = 3,0 a log k´> 0,4 pro log Kou = 2,0 při použití směsi methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze.

        1. XIX.1.7.3 Mobilní fáze
          1. Bylo testováno několik mobilních fází a doporučují se následující dvě mobilní fáze:
            1. — methanol/voda (55/45 % obj.),
            2. — methanol/0,01M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.).

          K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol a voda nebo citrátový pufr čistoty pro HPLC. Směs se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li směs methanol/voda, lze vyzkoušet směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol/voda nebo acetonitril/voda. U disociujících sloučenin se doporučuje použití pufračního roztoku ke stabilizaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Nesmí být použity žádné přísady, jako jsou iontově párová činidla, neboť mohou ovlivnit sorpční vlastnosti stacionární fáze. Takové změny stacionární fáze mohou být nevratné. Z tohoto důvodu musí být experimenty s použitím přísad prováděny na zvláštních kolonách.

        1. XIX.1.7.4 Rozpouštěné látky

          Zkušební a referenční látky se rozpustí v mobilní fázi.

      1. XIX.1.8 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
        1. XIX.1.8.1 Zkušební podmínky

          Během měření se zaznamenává teplota. Pro zajištění konstantních podmínek během kalibrace a předběžných měření a během měření zkoušené látky se velmi doporučuje použití kolony s regulací teploty.

        1. XIX.1.8.2 Stanovení mrtvé doby t0

          Pro stanovení mrtvé doby lze použít dvě různé metody (viz také bod 1.2).

          1. XIX.1.8.2.1 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí homologické řady

            Je ověřeno, že tato metoda poskytuje spolehlivé a standardisované hodnoty t0. Podrobnosti viz zkušební metoda A.8: Rozdělovací koeficient (n-oktanol/voda) metodou za použití HPLC.

          1. XIX.1.8.2.2 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí inertních látek, které nejsou kolonou zadržovány

            Tato technika je založena na nástřiku roztoků formamidu, močoviny nebo dusičnanu sodného. Měření se provedou alespoň dvojmo.

        1. XIX.1.8.3 Stanovení retenčních časů tR

          Referenční látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodě 1.3. Pro stanovení jejich retenčních časů mohou být nastříknuty jako směsný standard za předpokladu, že je ověřeno, že retenční čas žádného referenčního standardu není ovlivňován přítomností jiných referenčních standardů. Kalibrace by měla být prováděna pravidelně, alespoň dvakrát denně, aby se zachytily nečekané změny účinnosti kolony. Nástřiky pro kalibraci by měly být prováděny nejlépe před nástřikem zkoušené látky a po něm, aby se ověřilo, že nedošlo ke změně retenčních časů. Zkoušené látky se nastříknou odděleně v co nejmenších množstvích (aby se kolona nezahltila) a stanoví se jejich retenční časy.

          S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena alespoň opakovaná stanovení. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,25.

        1. XIX.1.8.4 Hodnocení

          Kapacitní faktory k´ se vypočtou z mrtvé doby t0 a retenčních časů tR vybraných referenčních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). Hodnoty log k´referenčních látek se poté vynesou proti jejich hodnotám log Kou z násadových rovnovážných experimentů uvedených v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z této křivky se poté pomocí hodnoty log k´ zkoušené látky odečte její hodnota log Kou. Je-li z aktuálních výsledků zřejmé, že hodnota log Kou leží mimo obor kalibrační křivky, zkouška se opakuje s vhodnějšími referenčními látkami.

    1. XIX.2 DATA A ZPRÁVY
      1. Zpráva musí obsahovat následující informace:
        1. — identita zkoušené látky a referenčních látek, jejich čistota a podle potřeby hodnoty pKa,
        2. — popis zařízení a pracovních podmínek, např. typ a velikost analytické (a ochranné) kolony, detekční zařízení, mobilní fáze (poměr složek a pH), rozpětí teploty během měření,
        3. — mrtvá doba a použité metody jejího stanovení,
        4. — množství zkoušené látky a referenčních látek zavedených do kolony,
        5. — retenční časy referenčních sloučenin použitých ke kalibraci,
        6. — charakteristiky proložené regresní křivky (log k´ versus log Kou) a graf regresní křivky,
        7. — průměrná retenční data a odhad hodnoty log Kou zkoušené sloučeniny.
        8. — chromatogramy.
    1. XIX.3 LITERATURA

      (1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed.). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, kap. 4, McGraw-Hill, New York.

      (2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Kou) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

      (3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.

      (4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227 – 231.

      (5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297 – 312.

      (6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, str. 831 – 832.

      (7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833 – 846.

      (8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121 – 128.

      (9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.

      (10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), str. 2341 – 2352.

      (11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285 – 304.

      (12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373 – 1384.

    DODATEK

    TABULKA 1

    Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2

    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2
    LátkaČíslo CASLog Kou pro
    čistírenské
    kaly    		Log Kou
    pomocí
    HPLC    		∆Log Kou pro půdyLog Kou
    pomocí HPLC    		∆
    Atrazin1912-24-91,662,140,481,812,200,39
    Linuron330-55-22,432,960,532,592,890,30
    Fenthion55-38-93,753,580,173,313,400,09
    Monuron150-68-51,462,210,751,992,260,27
    Fenanthren85-01-84,353,720,634,093,520,57
    Fenyl-benzoát93-99-23,263,030,232,872,940,07
    Benzamid55-21-01,601,000,601,261,250,01
    4-Nitrobenzamid619-80-71,521,490,031,931,660,27
    Acetanilid103-84-41,521,530,011,261,690,08
    Anilin62-53-31,741,470,272,071,640,43
    2,5-Dichloranilin95-82-92,452,590,142,552,580,03
  2. 1 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128.
  3. 2 W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), str. 107-119.

    4. TABULKA 2

    Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1

    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2 TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1
    LátkaČíslo CASLog Kou
    (OECD 106)    		KouLog Kou
    Metoda založená na HPLC
    Atrazin1912-24-91,8178 ± 161,89
    Monuron150-68-51,99100 ± 82,00
    Triapenthenol77608-88-32,37292 ± 582,47
    Linuron330-55-22,59465 ± 622,67
    Fenthion55-38-93,312062 ± 6483,31
  4. 1 W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384.

    5. TABULKA 3

    Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu

    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2 TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1 TABULKA 3 Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu
    Referenční látkaČíslo CASLogaritmy
    středních
    hodnot
    z násadové
    rovnovážné
    metody    		Počet
    hodnot Kou    		Logaritmus
    směrodatné
    odchylky    		Zdroj
    Acetanilid103-84-41,2540,48a)
    Fenol108-95-21,3240,70a)
    2-Nitrobenzamid610-15-11,4530,90b)
    N,N-Dimethylbenzamid611-74-51,5220,45a)
    4-Methylbenzamid619-55-61,7831,76a)
    Methylbenzoát93-58-31,8041,08a)
    Atrazin1912-24-91,8131,08c)
    Isoproturon34123-59-61,8651,53c)
    3-Nitrobenzamid645-09-01,9531,31b)
    Anilin62-53-32,0741,73a)
    3,5-Dinitrobenzamid121-81-32,3131,27b)
    Karbendazim10605-21-72,3531,37c)
    Triadimenol55219-65-32,4031,85c)
    Triazoxide72459-58-62,4431,66c)
    Triazofos24017-47-82,5531,78c)
    Linuron330-55-22,5931,97c)
    Naftalen91-20-32,7542,20a)
    Endosulfan-diol2157-19-93,0252,29c)
    Methiokarb2032-65-73,1042,39c)
    Acid Yellow 21963405-85-63,1642,83a)
    1,2,3-Trichlorbenzen87-61-63,1641,40a)
    γ-HCH (lindan)58-89-93,2352,94a)
    Fenthion55-38-93,3132,49c)
    Direct Red 812610-11-93,4342,68a)
    Pyrazofos13457-18-63,6532,70c)
    a-Endosulfan959-98-84,0953,74c)
    Diklofop-methyl51338-27-34,2033,77c)
    Fenanthren85-01-84,0943,83a)
    Basic Blue 41 (směs)26850-47-54,8944,46a)
    12270-13-2
    DDT50-29-35,631—b)
  5. a) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R&D Report No 106 01 044 (1994).
  6. b) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, str. 285-304.
  7. c) Data poskytnutá průmyslem.
  1. XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
    1. XX.1 METODA

      Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998).

      1. XX.1.1 ÚVOD

        Hlavním cílem zkoušky je posoudit účinky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna.

      1. XX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        Matečné organismy: dafnie samičího pohlaví, které jsou přítomné na začátku zkoušky a jejich reprodukční schopnost je předmětem studie.

        Potomstvo: mladé dafnie pocházející z matečných organismů v průběhu zkoušky.

        Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průběhu stanovené expoziční doby. Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí podrobně vysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.

        Koncentrace bez pozorovaných účinků (no observed effect concentration, NOEC): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC, která při srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný účinek (p < 0,05).

        ECx: je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve vodě, která pro danou expoziční dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna.

        Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v níž je zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stáří (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je zřejmé, že při záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí.

        Mez detekovatelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku detekovat, nikoli však stanovit.

        Mez stanovitelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantitativně naměřit.

        Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, tj. není-li schopen plavat nebo není-li u končetin (přívěsků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádobou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena společně s literární odkazem.)

      1. XX.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        Mladé samičí dafnie (matečné organismy) na začátku zkoušky mladší než 24 h se exponují zkoušené látce přidané do vody v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci zkoušky se odhadne celkový počet vylíhnutých živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. To znamená, že nedospělé dafnie pocházející z dospělých dafnií, které v průběhu zkoušky uhynuly, se z odhadů vyloučí. Reprodukční schopnost matečných organismů lze vyjádřit jiným způsobem (např. jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede doplňkově vedle celkového počtu nedospělých dafnií pocházejících z jedné matečné dafnie živé na konci zkoušky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC). Kromě toho se data pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% snížení reprodukční schopnosti, (tj. EC50, EC20 nebo EC10).

        Musí být rovněž uvedeno přežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné účinky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např. vliv na délku) a případně imanentní růst populace.

      1. XX.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

        Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.2, část I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být užitečné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výtěžkem a mezí stanovitelnosti.

        Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Pov a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

      1. XX.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
        1. Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splněna následující kriteria reprodukční schopnosti:
          1. — mortalita matečných organismů (dafnií samičího pohlaví) nesmí na konci zkoušky překročit 20 %,
          2. — střední hodnota počtu živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu živého na konci zkoušky je ≥ 60.
      1. XX.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. XX.1.6.1 Přístroje a pomůcky

          Zkušební nádoby nebo jiné přístroje a pomůcky, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být skleněné nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.

          1. Kromě toho bude nezbytné některé nebo veškeré následující zařízení:
            1. — přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
            2. — vhodný přístroj pro regulaci teploty,
            3. — pH-metr,
            4. — vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
            5. — zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zařízení pro stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK),
            6. — vhodné zařízení pro ovládání režimu osvětlení a pro měření intenzity světla.
        1. XX.1.6.2 Testovací organismy

          Ke zkoušce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují případná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se jiné druhy dafnií, musí být jasně identifikovány a jejich použití musí být zdůvodněno.

          Klon by měl být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), že reprodukční schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilně splňuje kriterium validity, jímž je ≥ 60 potomků na přeživší matečný organismus při kultivaci za podmínek popsaných v této metodě. Splňuje-li kultura dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku jsou přijatelné i jiné klony.

          Na začátku zkoušky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, přítomnost jedinců samčího pohlaví a epifií, zpoždění produkce prvních potomků, přítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných těm, které mají být použity při zkoušce (osvětlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liší-li se kultivační médium pro dafnie, které má být použito při zkoušce, od média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporučuje se zařadit před zkouškou obvykle třítýdenní aklimatizační období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u matečných organismů ke stresu.

        1. XX.1.6.3 Zkušební médium

          Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito přesně definované médium. Tím se lze vyhnout použití přísad, které je obtížné charakterizovat (např. mořských řas, půdy, extraktu atd.) a zvýšit vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento účel byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Přijatelná jsou však i jiná média (např. (5, 6)), splňuje-li při jejich použití reprodukční schopnost kultury dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku.

          Použije-li se médium, které obsahuje nedostatečně charakterizovatelné přísady, měly by být tyto přísady jasně specifikovány a v protokolu o zkoušce se uvedou informace o jejich složení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboť může přispívat k dodávané stravě. Doporučuje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické přísady a aby byl odhadnut výsledný příspěvek k TOC nebo CHSK ve zkušebním médiu. Doporučuje se, aby byly úrovně TOC v médiu (tj. před přidáním řas) nižší než 2 mg·l-1 (7).

          Při zkoušení látek obsahujících kovy je důležité si uvědomit, že vlastnosti zkušebního média (např. tvrdost, chelatační schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby bylo médium přesně definováno. V současnosti jsou však jedinými přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Obě média obsahují chelatační činidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí-li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporučují pro zkoušení látek obsahujících kovy a neměla by se používat ani jiná média obsahující činidla známá svojí chelatační schopností. V případě látek obsahujících kovy se doporučuje používat jiné médium, například rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je přidán extrakt z řas (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkoušení na tomto druhu, přestože vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami přidaného extraktu z řas.

          Na začátku zkoušky a v jejím průběhu by měla být koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg·l-1. pH by mělo být v rozmezí 6 až 9 a zpravidla by se nemělo v žádné zkoušce měnit o více než 1,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg·l-1 (jako CaCO3). Ve zkouškách při této a vyšší tvrdosti reprodukční schopnost prokazatelně vyhovovala kritériím validity (9, 10).

        1. XX.1.6.4 Zkušební roztoky

          Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle připraví ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se připraví nejlépe rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.

          Pro přípravu vhodně koncentrovaného zásobního roztoku může být někdy nezbytné použití organických rozpouštědel nebo dispergátorů, měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V žádném případě by však neměl být obsah zkušební látky ve zkušebních roztocích vyšší než je její rozpustnost ve zkušebním médiu.

          K přípravě zásobního roztoku, který lze přesně dávkovat do vody, se použijí rozpouštědla. Při doporučené koncentraci rozpouštědla v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l-1) nejsou výše uvedená rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

          Dispersanty mohou usnadnit přesné dávkování a dispergaci. Při doporučené koncentraci v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l-1) nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

      1. XX.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY

        Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškeré další obsluhování zkušebních nádob se provádí náhodně. Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které může být považováno za účinek koncentrace. Jsou-li například experimentální jednotky obsluhovány v pořadí zahájení expozice nebo v pořadí koncentrací, mohl by nějaký časově podmíněný efekt, např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším účinkům při vyšších koncentracích. Mohou-li být dále výsledky ovlivněny počátečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je např. umístění v laboratoři, mělo by být zváženo blokové uspořádání zkoušky.

      1. XX.1.8 POSTUP
        1. XX.1.8.1 Podmínky expozice
          1. XX.1.8.1.1 Délka expozice

            Zkouška trvá 21 dní.

          1. XX.1.8.1.2 Nasazování

            Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.

            Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou-li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.

          1. XX.1.8.1.3 Počet organismů

            U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.

            U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.

          1. XX.1.8.1.4 Krmení

            U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.

            Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.

            Použije-li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).

            Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.

          1. XX.1.8.1.5 Osvětlení

            16 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m-2·s-1.

          1. XX.1.8.1.6 Teplota

            Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 °C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 °C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 °C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.

          1. XX.1.8.1.7 Provzdušňování

            Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.

        1. XX.1.8.2 Zkušební koncentrace

          Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.

          1. Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:
            1. i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební koncentrace dostatečně nízká, aby nebyla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se sníženou nejnižší koncentrací;
            2. ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;
            3. iii) má-li být pro účinky na reprodukci odhadnuta ECx, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit ECx s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC50 pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC50. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC50, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
            4. iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.

          Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

          Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml·l-1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.

        1. XX.1.8.3 Kontrolní skupiny

          Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije-li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).

          V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.

        1. XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média

          Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.

          Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.

        1. XX.1.8.5 Pozorování