Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí, 222/2004 Sb., vyhlášené znění

Předchozí stránka

Výsledky pozorování prováděných během zkoušky se zaznamenávají do přehledu dat (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li požadována další měření (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět další pozorování.

XX.1.8.6 Potomstvo
Potomstvo pocházející z každého matečného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denně vybírá a počítá, aby nespotřebovávalo potravu určenou pro dospělého jedince. Pro účely této metody je třeba započítat pouze živé potomstvo, avšak zaznamenává se i přítomnost potracených vajíček nebo mrtvého potomstva.

XX.1.8.7 Mortalita
Mortalita matečných organismů se zaznamenává nejlépe denně, alespoň současně s počítáním potomstva.

XX.1.8.8 Další parametry
Třebaže je tato metoda navržena hlavně k posouzení účinků na reprodukci, je možné, aby byly v míře dostatečné pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné účinky. Užitečné je zvláště měření růstu, neboť poskytuje informaci o možných subletálních účincích. Tato pozorování mohou být užitečnější než samotné měření reprodukce. Doporučuje se změřit na konci zkoušky délku matečných organismů (tj. délku těla bez zadečkového hrotu). K parametrům, které lze měřit nebo vypočítávat patří dále doba do narození prvních plůdků (a následně dalších potomků), počet a velikost potomků na jeden organismus, počet potracených plůdků, přítomnost jedinců samčího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace.

XX.1.8.9 Častost analytických stanovení a měření
Alespoň jednou týdně se měří koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH v čerstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Během zkoušky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkoušené látky stanovují
U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporučuje analyzovat alespoň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a při obnovování, a to jednou během prvního týdne zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – při jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoň v týdenních intervalech.
U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu ±20 % nominální koncentrace, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % počátečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby.
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Doporučuje se však zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé. V těchto typech zkoušky se průtok ředicí vody a zkoušené látky kontroluje denně.
Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ±20 %, vyjádří se výsledky jako časově vážené průměry (viz dodatek 5).

XX.2 DATA A ZPRÁVY
1. XX.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
  Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené látky na celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. Celkový počet potomků na matečný organismus se vypočte pro každou zkušební nádobu (tj. pro každou paralelní nádobu). Jestliže v kterékoli paralelní nádobě matečný organismus během zkoušky uhyne nebo se zjistí, že jde o samečka, vyloučí se nádoba z experimentu. Analýza se poté provede se zmenšeným počtem paralelních nádob.
  Pro odhad LOEC a tedy i NOEC vztahujících se k účinkům chemické látky na reprodukční schopnosti je nezbytné vypočíst střední hodnotu reprodukční schopnosti přes všechny paralelní nádoby pro každou koncentraci a spojený residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou mnohonásobného porovnání. Užitečnými mohou být Dunnettův nebo Williamsův test (14, 15, 16, 17). Je nezbytné ověřit, že je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporučuje se provést ověření raději graficky než formálním testem významnosti (18); vhodnou alternativou je Bartlettův test. Není-li tento předpoklad splněn, měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylu, nebo by měla být provedena vážená ANOVA. Vypočte a uvede se velikost účinku zjistitelná pomocí ANOVA (tj. nejmenší významný rozdíl).
  Pro odhad koncentrace, která způsobuje 50% snížení reprodukční schopnosti (tj. EC₅₀), se daty proloží vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka by měla být tak parametrizována, aby bylo možné přímo odhadnout EC₅₀ a její směrodatnou odchylku. To značně usnadní výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnotu EC₅₀. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. To lze provést graficky nebo rozdělením residuálního součtu čtverců na složku „chyby v proložení“ a „náhodné chyby“ a provedením testu významnosti chyby v proložení. Vzhledem k tomu, že u expozic, jejichž důsledkem je vyšší reprodukční schopnost, je větší rozptyl počtu vylíhnutých potomků než u expozic vedoucích k nejnižší reprodukční schopnosti, je třeba promyslet vážení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit různé rozptyly u různě exponovaných skupin (viz výchozí informace (18)).
  1. Při analýze dat z rozhodujícího okružního testu (2) byl použit následující model prokládající logaritmickou křivku; lze však použít i jiné modely:
    1. kde:
      1. Y: celkový počet živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (vypočteno pro každou nádobu)
      2. x: koncentrace látky
      3. c: očekávaný počet potomků při x = 0
      4. x₀: EC₅₀ v populaci
      5. b: směrnice.
  Tento model bude pravděpodobně vhodný pro velký počet situací, budou však existovat zkoušky, pro něž bude nevhodný. Jak je uvedeno výše, je třeba ověřit validitu modelu. V některých případech může být vhodnější model předpokládající rozmezí, u něhož vedou nižší koncentrace k pozitivním účinkům (19).
  Lze rovněž odhadnout další koncentrace s určitým účinkem, např. EC₁₀ nebo EC₂₀, může být však dobré použít jinou parametrizaci modelu, než je použita pro odhad EC₅₀.
1. XX.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
  1. Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
    1. XX.2.2.1 Zkoušená látka:
      1. — fyzikální povaha a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
      2. — údaje o chemické identitě včetně údaje o čistotě.
    1. XX.2.2.2 Testovací druhy:
      1. — klon (byl-li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je-li znám) a použité kultivační podmínky. Byl-li použit jiný druh než Daphnia magna, musí to být uvedeno a zdůvodněno.
    1. XX.2.2.3 Zkušební podmínky:
      1. — použitý zkušební postup (např. semistatická nebo průtoková metoda, objem, velikost obsádky v počtu dafnií na litr),
      2. — fotoperioda a intenzita světla,
      3. — uspořádání zkoušky (např. počet paralelních nádob, počet matečných organismů na jednu paralelní nádobu),
      4. — podrobnosti o použitém kultivačním médiu,
      5. — byly-li použity, přídavky organických látek včetně jejich složení, zdroje, metody přípravy, TOC/CHSK výchozích preparátů, odhad výsledného TOC/CHSK ve zkušebním médiu,
      6. — podrobné informace o krmení, včetně množství (v mg C na dafnii za den) a plánu (např. typ krmiva, včetně specifického názvu (druhu) u řas a kmene, je-li znám, kultivační podmínky),
      7. — metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jsou-li použity, uvedou se rozpouštědlo nebo dispergátor a jejich koncentrace),
    1. XX.2.2.4 Výsledky:
      1. — výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
      2. — nominální zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 4); uvede se také výtěžek metody a mez stanovitelnosti,
      3. — kvalita vody ve zkušebních nádobách (tj. pH, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a TOC a/nebo CHSK a dále podle potřeby tvrdost) (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
      4. — celkový počet živých potomků na každý matečný organismus (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
      5. — počet uhynulých matečných organismů a den, kdy k úhynu došlo (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
      6. — variační koeficient kontrolní reprodukční schopnosti (založený na celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky),
      7. — křivka závislosti celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (pro každou paralelní nádobu), na koncentraci zkoušené látky
      8. — nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na reprodukci včetně popisu použitých statistických metod a údaje o velikosti účinku, který by mohl být detekován, a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) na reprodukci; je-li k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu matečných organismů,
      9. — je-li k dispozici, EC_x pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále graf křivky modelu použitého pro její výpočet, směrnice křivky závislosti dávka-reakce a její směrodatná odchylka,
      10. — jiné pozorované biologické účinky a jiná měření: uvedou se jakékoli jiné biologické účinky, které byly pozorovány nebo změřeny (např. růst matečných organismů) včetně přiměřeného zdůvodnění,
      11. — vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.

XX.3 LITERATURA
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20. – 21. březen 1993.
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring. Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paříž 1997.
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M., Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicol Environ. Safety, 21, str. 257 – 265.
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25 – 33.
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 47, str. 775 – 782.
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 str.
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C., Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), str. 144 – 148.
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L., Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 26, str. 1 – 8.
(10) Cowgill U. M., Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185 –196.
(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
(12) Sims I. R., Watson S., Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. Chem., 12, str. 2053 – 2058.
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, str. 459 – 466.
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096 – 1121.
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, str. 482 – 491.
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103 – 117.
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510 – 531.
(18) Draper N. R., Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
(19) Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, str. 93 – 96.
(20) Wilson E. O., Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, str. 532.
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L., Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156 – 1166.

DODATEK 1

PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4

Aklimatizace na Elendtova média M7 M4

Některé laboratoře narazily na obtíže při přímém přenosu dafnií do médií M4 (1) a M7. Určitého úspěchu však bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. přenesením z vlastního média do 30% Elendtova média, poté do 60% Elendtova média a nakonec do 100% Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být až jeden měsíc.

PŘÍPRAVA

Stopové prvky

Ve vodě vhodné čistoty, např. v deionisované nebo destilované vodě nebo ve vodě přečištěné reverzní osmosou, se nejprve připraví samostatné zásobní roztoky (I) jednotlivých stopových prvků (I). Z těchto oddělených zásobních roztoků (I) se připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (směsný roztok), tj.:

DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Stopové prvky
Zásobní roztoky I (jednotlivá látka)	Množství přidané do vody (mg·l^-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	Kombinovaný zásobní roztok II se připraví přidáním následujícího množství zásobního roztoku I do vody (ml·l^-1)
Zásobní roztoky I (jednotlivá látka)	Množství přidané do vody (mg·l^-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	M 4	M 7
H₃BO₃	57 190	20 000	1,0	0,25
MnCl₂·4H₂O	7 210	20 000	1,0	0,25
LiCl	6 120	20 000	1,0	0,25
RbCl	1 420	20 000	1,0	0,25
SrCl₂·6H₂O	3 040	20 000	1,0	0,25
NaBr	320	20 000	1,0	0,25
Na₂MoO₄·2H₂O	1 260	20 000	1,0	0,25
CuCl₂·2H₂O	335	20 000	1,0	0,25
ZnCl₂	260	20 000	1,0	1,0
CoCl₂·6H₂O	200	20 000	1,0	1,0
KI	65	20 000	1,0	1,0
Na₂SeO₃	43,8	20 000	1,0	1,0
NH₄VO₃	11,5	20 000	1,0	1,0
Na₂EDTA·2H₂O	5 000	2 000	—	—
FeSO₄·7H₂O	1 991	2 000 n	—	—
Jak roztok Na₂EDTA, tak roztok FeSO₄ se připraví samostatně, spojí se a ihned se autoklávují. Získají se:
2 litry roztoku Fe-EDTA		1 000	20,0	5,0

Média M4 a M7

Média M4 a M7 se připraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitaminů následujícím způsobem:

DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Stopové prvky Média M4 a M7
	Množství přidané do vody (mg·l^-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	Množství zásobního roztoku přidané za účelem přípravy média (ml·l^-1)
	Množství přidané do vody (mg·l^-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	M 4	M 7
Zásobní roztok II obsahující kombinaci stopových prvků		20	50	50
Zásobní roztok makroživin (jednotlivá látka)
CaCl₂·2H₂O	293 800	1 000	1,0	1,0
MgSO₄·7H₂O	246 600	2 000	0,5	0,5
KCl	58 000	10 000	0,1	0,1
NaHCO₃	64 800	1 000	1,0	1,0
Na₂SiO₃·9H₂O	50 000	5 000	0,2	0,2
NaNO₃	2 740	10 000	0,1	0,1
KH₂PO₄	1 430	10 000	0,1	0,1
K₂HPO₄	1 840	10 000	0,1	0,1
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok	—	10 000	0,1	0,1
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se připraví přidáním 3 vitaminů do 1 litru vody takto:
Thiamin-hydrochlorid	750	10 000	—	—
Kyanokobalamin (B₁₂)	10	10 000	—	—
Biotin	7,5	10 000	—	—

Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých hluboce zmrazených podílech. Vitaminy se přidají do média krátce před použitím.

Poznámky: Aby nedošlo při přípravě kompletního média k vysrážení solí, přidají se podíly zásobních roztoků do asi 500 – 800 ml deionisované vody a objem se poté doplní na 1 litr.

Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.

DODATEK 2

ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS

Je pochopitelné, že obsah uhlíku v krmivu na bázi řas se nebude normálně měřit přímo, ale stanoví se z korelací (tj. z nomogramů) se zástupnými ukazateli, jako jsou počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle.

TOC by měl být stanoven spíše vysokoteplotní oxidací než pomocí UV nebo persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Pro účely vytvoření nomogramu se řasy oddělí od růstového média centrifugací a poté se resuspendují v destilované vodě. Zástupný ukazatel a koncentrace TOC se měří v každém vzorku trojmo.

Provede se analýza slepého pokusu s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se odečte od koncentrace TOC ve vzorku s řasami.

Nomogram by měl být lineární v požadovaném rozsahu koncentrací uhlíku. Příklady jsou uvedeny níže.

Upozornění: Tyto příklady nelze pro účely přepočtu použít; je důležité, aby si laboratoře připravily vlastní nomogramy.

DODATEK 3

PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ

DODATEK 4

PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY

a) Naměřené koncentrace

DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Stopové prvky Média M4 a M7 DODATEK 2 ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS DODATEK 3 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ DODATEK 4 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY
Nominální koncentrace	Vzorek z týdne 1		Vzorek z týdne 2		Vzorek z týdne 3
Nominální koncentrace	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium

b) Naměřené koncentrace vyjádřené v procentech nominální koncentrace

DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Stopové prvky Média M4 a M7 DODATEK 2 ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS DODATEK 3 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ DODATEK 4 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY
Nominální koncentrace	Vzorek z týdne 1		Vzorek z týdne 2		Vzorek z týdne 3
Nominální koncentrace	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium

DODATEK 5

VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY

Časově vážená střední hodnota

Vzhledem k tomu, že mezi výměnami média může koncentrace zkoušené látky klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní pro rozsah koncentrací, jimž byly dospělé dafnie vystaveny. Výběr by měl být založen na biologických i statistických úvahách. Vychází-li se například z toho, že reprodukce je ovlivňována hlavně maximální koncentrací, jíž byl organismus vystaven, měla by být tedy použita maximální koncentrace. Považuje-li se však za významnější akumulované nebo dlouhodobé působení toxické látky, má větší opodstatnění průměrná koncentrace. V takovém případě je vhodným průměrem časově vážená střední koncentrace, neboť zohledňuje časové změny okamžité koncentrace.

Obrázek 1: Příklad časově vážené střední hodnoty

Na obrázku 1 je znázorněn příklad (zjednodušené) zkoušky trvající sedm dní s obnovou média v den 0, 2 a 4.

— Tenká klikatá čára znázorňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu buněk.
— Šest vyznačených bodů představuje koncentrace naměřené na začátku a na konci období mezi obnoveními média.
— Silná plná čára vyznačuje hodnotu časově vážené střední hodnoty.

Časově vážená střední hodnota je vypočtena tak, aby se plocha pod čarou pro časově váženou střední hodnotu rovnala ploše pod čarou průběhu koncentrace. Výpočet pro výše uvedený příklad je ilustrován v tabulce 1.

Tabulka 1: Výpočet časově vážené střední hodnoty

DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Stopové prvky Média M4 a M7 DODATEK 2 ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS DODATEK 3 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ DODATEK 4 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY DODATEK 5 VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY Časově vážená střední hodnota Obrázek 1: Příklad časově vážené střední hodnoty Tabulka 1: Výpočet časově vážené střední hodnoty
Obnovení média č.	Dny	Konc₀	Konc₁	ln(Konc₀)	ln(Konc₁)	Plocha
1	2	10 000	4,493	2,303	1,503	13,767
2	2	11 000	6,037	2,398	1,798	16,544
3	3	10 000	4,066	2,303	1,403	19,781
Celkový počet dnů: 7					Celková plocha	50,091
Celkový počet dnů: 7					ČV střední hodnota	7,156

„Dny“ se rozumí počet dnů mezi obnoveními média.
„Konc₀“ je naměřená koncentrace na začátku období mezi obnoveními média.
„Konc₁“ je naměřená koncentrace na konci období mezi obnoveními média.
„ln (Konc₀)“ je přirozený logaritmus Konc₀.
„ln (Konc₁)“ je přirozený logaritmus Konc₁.
„Plocha“ je plocha pod exponenciální křivkou pro každé období mezi obnoveními média.

Vypočte se z rovnice:

Časově vážená střední hodnota („ČV střední hodnota“) se vypočte jako podíl „celkové plochy“ a „celkového počtu dnů“.

Pro zkoušku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopitelně rozšíří tak, aby pokrývala 21 dnů.

Je zřejmé, že provádí-li se měření pouze na začátku a na konci období mezi obnoveními média, není možné potvrdit, že proces rozkladu je skutečně exponenciální. Jiná křivka by vedla k jinému způsobu výpočtu „Plochy“. Exponenciální rozklad však není nepřijatelný a jemu odpovídající křivka je pravděpodobně nejideálnější, chybí-li jiné informace.

Je však nezbytné postupovat opatrně, není-li v médiu na konci období mezi jeho obnoveními zjištěno žádné množství zkušební látky. Není-li možné odhadnout, jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod křivkou a není tedy možné získat rozumnou časově váženou střední hodnotu.

Následující stránka