Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.

TCO₂: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO₂) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.

TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi.

IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).

TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.

1. Primární biologický rozklad:
2. jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.
3. Úplný biologický rozklad (aerobní):
4. je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).
5. Snadno biologicky rozložitelná:
6. je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.
7. Biologicky rozložitelná:
8. je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.
9. Odstranitelnost:
10. je náklonnost látek k jejich odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.
11. Fáze iniciace:
12. je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
13. Doba rozkladu:
14. je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.
15. 10denní období rozkladu:
16. je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.

1. V. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI – BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.5 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. V.1 METODA
      1. V.1.1 ÚVOD

         Metoda je určena pro měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek.

         Data získaná při této zkoušce platí pro látky rozpustné ve vodě; těkavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vodě lze touto metodou alespoň v zásadě rovněž zkoušet.

         Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají v koncentracích používaných při zkoušce inhibiční účinek na bakterie. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, může být nezbytné použít pro dosažení dobré dispergace zkušebního materiálu zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.

         Informace o toxicitě chemické látky mohou být užitečné při interpretaci nízkých hodnot výsledku zkoušky a při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

      1. V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

         Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého objemu roztoku látky za předepsaných podmínek.

         Výsledky se vyjadřují v gramech spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkušební látky.

      1. V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Je žádoucí použít vhodnou referenční látku pro kontrolu aktivity inokula.

      1. V.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vhodném, dobře provzdušněném médiu se inokuluje mikroorganismy a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty.

         BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku na začátku a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně pět dní a nejdéle 28 dní.

         Souběžně musí být provedena slepá zkouška bez obsahu zkušební látky.

      1. V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

         Stanovení BSK nelze považovat za ověřené stanovení biologické rozložitelnosti látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za screeningovou zkoušku.

      1. V.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

         Připraví se předběžný roztok nebo disperse zkušební látky o koncentraci vhodné pro použitou metodu. Poté se stanoví BSK některou vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní standardizovanou metodou.

   1. V.2 DATA A HODNOCENÍ

      BSK předběžného roztoku se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na BSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

   1. V.3 ZPRÁVY

      Uvede se použitá metoda.

      Biochemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří platných měření.

      Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav, toxické účinky a vlastní složení zkušební látky.

      Použití přísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno.

   1. V.4 LITERATURA
      1. Seznam příkladů standardizovaných metod:
         1. NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.
         2. NBN 407: Biochemical oxygen demand.
         3. NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV).
         4. The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
         5. ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

1. VI. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.6 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. VI.1 METODA
      1. VI.1.1 ÚVOD

         Metoda je určena pro měření chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek prováděné standardním dohodnutým způsobem za pevně stanovených laboratorních podmínek.

         Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků jsou užitečné informace o chemickém vzorci látky (např. zda jde o soli halogenů, železnaté soli organických sloučenin, organické sloučeniny chloru).

      1. VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

         Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, která se vyjadřuje jako ekvivalentní množství kyslíku oxidačního činidla spotřebovaného látkou za pevně stanovených laboratorních podmínek.

         Výsledek se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku (COD) v gramech na 1 g zkušební látky.

      1. VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

      1. VI.1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vodě se za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru oxiduje dichromanem draselným v prostředí koncentrované kyseliny sírové pod zpětným chladičem. Přebytečný dichroman se stanoví titrací odměrným roztokem síranu amonno-železnatého.

         U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý^*.

      1. VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

         Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení organických látek.

         Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněž vliv anorganické redukční a oxidační látky.

         U některých cyklických sloučenin a u řady těkavých sloučenin (např. u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné oxidaci.

      1. VI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

         Připraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l^-1.

         1. Poznámky:

            U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemně rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit přímo do experimentální aparatury s vodou.

         Často je výhodné, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnávačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení konvenční metodou obtížné – např. kyselinu octovou. Metoda však také selhává v případě pyridinu. Zvýší-li se koncentrace dichromanu draselného předepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se přímé navažování 5 – 10 mg látky, což je důležité pro stanovení CHSK látek obtížně rozpustných ve vodě (2).

         Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou.

   1. VI.2 DATA A HODNOCENÍ

      CHSK obsahu experimentální baňky se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na CHSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

   1. VI.3 ZPRÁVY

      Uvede se odkaz na použitou metodu.

      Chemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří měření. Jsou-li známy, musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkušební látky.

      Uvede se použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

   1. VI.4 LITERATURA

      (1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146.

      (2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

      1. Seznam příkladů normovaných metod:

         PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

         NBNT 91-201	Determination of the chemical oxygen demand.
         ISBN O 11 7512494	Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
         NF T 90-101	Determination of the chemical oxygen demand.
         DS 217	Water analysis —Determination of the chemical oxygen demand.
         DIN 38409-H-41	Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
         NEN 3235 5.3	Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik.
         ISO 6060	Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.

1. VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH – metoda C.7 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. VII.1 METODA

      Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

      1. VII.1.1 ÚVOD

         Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.

         Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.

         Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).

         Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku par dané látky.

         Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.

         Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 − 9).

      1. VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
         1. Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výměnou skupiny X za skupinu OH:

            PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

            (1)

         1. Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem:

            PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

            (2)

         1. Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem:

            PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

            (3)

         1. Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu:

            PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

            (4)

            1. kde
               1. t = čas,
               2. C₀ = koncentrace látky v čase 0,
               3. C_t = koncentrace látky v čase t,
               4. 2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem.

         Koncentrace se vyjádří v g·l^-1 nebo v mol·l^-1.

         Konstanta k_pozorov. má rozměr [čas]^-1.

         „Poločas“ t_½ je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %,

         PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

         (5)

         Z rovnic (4) a (5) plyne, že

         PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

         (6)

      1. VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

         1. Jako referenční látky byly použity následující látky (1):
            1. Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
            2. O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).
      1. VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

         Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.

         Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

         Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).

         Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.

      1. VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

         V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

         Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

      1. VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
         1. VII.1.6.1 Reakční činidla
            1. VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky

               Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.

               K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.

               Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.

               Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.

            1. VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky

               Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l^-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

               Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.

               Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.

         1. VII.1.6.2 Aparatura

            Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.

            Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.

         1. VII.1.6.3 Analytická metoda

            Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.

            Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.

         1. VII.1.6.4 Zkušební podmínky

            Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.

            U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).

         1. VII.1.6.5 Zkušební postup
            1. VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška

               U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t_½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.

               V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.

            1. VII.1.6.5.2 Zkouška 1

               Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.

               Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.

               Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.

               Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:

               Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.

               Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.

               Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).

            1. VII.1.6.5.3 Zkouška 2
               1. Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
                  1. — buď při teplotě nižší než 40 °C,
                  2. — nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

               Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.

               Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

               Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t_½).

            1. VII.1.6.5.4 Zkouška 3
               1. Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
                  1. — buď při teplotě nižší než 40 °C,
                  2. — nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

               Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta k_pozorov. a poločas t_½.

   1. VII.2 DATA
      1. Jde-li o reakci pseudoprvního řádu, lze vypočítat hodnoty konstanty k_pozorov. pro každé pH a každou zkušební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice:

         PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

         (7)

      Dále je možné z rovnice (6) vypočítat t_½.

      Podle potřeby se s použitím Arrheniovy rovnice stanoví k_{25 °C}.

      Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního řádu, viz bod 3.1.

   1. VII.3 ZPRÁVA
      1. VII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
         1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
            1. — specifikaci látky;
            2. — všechny výsledky získané s referenčními látkami;
            3. — podstatu a podrobnosti použité analytické metody;
            4. — pro každou zkoušku: teplotu, pH, složení pufračního roztoku, tabulku se všemi údaji o koncentraci a čase;
            5. — u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k_pozorov. a t_½, včetně metody jejich výpočtu;
            6. — u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, graf průběhu závislosti logaritmu koncentrace na čase;
            7. — všechny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků.
      1. VII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

         Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkušebních látek za předpokladu, že pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že lze důvodně očekávat, že aktivační energie zkušební látky je stejného řádu.

   1. VII.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

      (2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383-415.

   DODATEK

   Pufrační roztoky

   1. A. CLARK A LUBS

      Hodnoty pH uvedené v následujících tabulkách byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH jsou o 0,04 vyšší než hodnoty v tabulce.

      PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky

      Složení	pH
      kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	3,8
      kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	4,0
      3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	4,2
      dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	6,8
      29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	7,0
      35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	7,2
      H3BO3 (0,1 mol·l-1) v KCl (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	8,8
      21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	9,0
      26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	9,2

   1. B. KOLTHOFF A VLEESHOUWER

      PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky

      Složení	pH
      Monokalium-citrát(0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 18 °C (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně)
      2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	3,8
      9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,0
      16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,2

   1. C. SÖRENSEN

      Borax (0,05 mol·l^-1) a HCl (0,1 mol·l^-1)

      PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1)

      Složení		pH
      ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
      			10 °C	40 °C	70 °C
      8,0	2,0	8,91	8,96	8,77	8,59
      8,5	1,5	9,01	9,06	8,86	8,67
      9,0	1,0	9,09	9,14	8,94	8,74
      9,5	0,5	9,17	9,22	9,01	8,80
      10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86

      Borax (0,05 mol·l^-1) a NaOH (0,1 mol·l^-1)

      PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1)

      Složení		pH
      ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
      			10 °C	40 °C	70 °C
      10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86
      9,0	1,0	9,36	9,42	9,18	8,94
      8,0	2,0	9,50	9,57	9,30	9,02
      7,0	3,0	9,68	9,76	9,44	9,12

1. VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY – ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PŮDĚ – metoda C.8 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. VIII.1 METODA
      1. VIII.1.1 ÚVOD

         V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.

      1. VIII.1.2 JEDNOTKY A DEFINICE

         LC₅₀: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.

      1. VIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKA

         Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.

         Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.

      1. VIII.1.4 PRINCIP ZKOUŠKY

         Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.

      1. VIII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

         Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.

      1. VIII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
         1. VIII.1.6.1 Látky
            1. VIII.1.6.1.1 Substrát pro zkoušku
               1. Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.

                  (a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):

                  1. - 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),
                  2. - 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,
                  3. - asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,
                  4. - asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO₃), práškového, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 ± 0,5.

                  (b) Substrát pro zkoušku:

                  Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.

                  Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 °C. Klíčovým kritériem je, že mělá půda musí být vlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu. působ uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.

                  (c) Kontrolní substrát:

                  Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního činidla.

            1. VIII.1.6.1.2 Nádoby pro zkoušku

               Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.

         1. VIII.1.6.2 Experimentální podmínky

            Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 ± 2 °C se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.

            Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.

         1. VIII.1.6.3 Pracovní postup

            Zkoušené koncentrace

            Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg^-1).

            Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací

            Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.

            Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg^-1 substrátu pro zkoušku (jako sušina).

            Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.

            Definitivní zkouška

            Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.

            Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC₅₀ a jejích mezí spolehlivosti.

            V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.

            Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8, jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC₅₀.

            Mísení základního substrátu a zkoušené látky

            Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to možné připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašovačem.

            Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).

            K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.

            Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná

            v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině).

            Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.

            Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní.

            Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyšetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.

            Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.

         1. VIII.1.6.4 Organizmy použité ve zkoušce

            Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)

   1. VIII.2 VÝSLEDKY
      1. VIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

         Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.

         Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC₅₀ a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC₅₀ se udává v mg zkoušené lát ky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).

         V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro vý počet LC₅₀ příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

         Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC₅₀.

   1. VIII.3 ZPRÁVA
      1. VIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
         1. Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:
            1. - prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,
            2. - o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),
            3. - přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,
            4. - přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,
            5. - informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),
            6. - metoda použitá ke stanovení LC₅₀,
            7. - výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,
            8. - popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,
            9. - úhyn v kontrolních zkouškách,
            10. - LC₅₀ nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,
            11. - grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,
            12. - výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo dřívějších zkoušek kontroly jakosti.
   1. VIII.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.

      (2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and all, London.

      (3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.

      (4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99

      (5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

      (6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag “Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

   PŘÍLOHA

   Chov žížal před zkouškou

   Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení, když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).

   Podmínky chovu

   Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2 °C, nejlépe s neustálým světlem (intenzita 400 - 800 lux).

   Chovné nádoby: vhodné mělké nádoby o objemu 10 až 20 l.

   Substrát: Eisenia foetida je možné chovat v různých zvířecích exkrementech. Jako chovné médium se doporučuje používat směs 50 % obj. rašeliny a 50 % obj.hovězího nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí).

   Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý.

   Vedle výše uvedené metody je možné používat i jiné úspěšné postupy.

   Poznámka:

   Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.

1. IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZAHN-WELLENSOVA ZKOUŠKA – metoda C.9 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. IX.1 METODA
      1. IX.1.1 ÚVOD

         Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.

         Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.

         Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l^-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l^-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.

         Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.

         Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.

         1. Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
            1. — jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
            2. — mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
            3. — neinhibují bakterie,
            4. — jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
            5. — pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.

         Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.

         Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.

      1. IX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
         1. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:
            1. kde:
               1. D_T = rozklad (%) v čase T,
               2. C_a = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1),
               3. C_T = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l^-1),
               4. C_B = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku, (mg.l^-1),
               5. C_BA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1).

         Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.

         Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.

         Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).

      1. IX.1.3 STANDARDNÍ LÁTKY

         Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.

      1. IX.1.4 PRINCIP METODY

         Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 ° C

         v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.

         V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.

      1. IX.1.5 KRITÉRIA KVALITY

         Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.

         Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.

      1. IX.1.6 POSTUP ZKOUŠENÍ
         1. IX.1.6.1 Příprava
            1. IX.1.6.1.1 Reagencie

               Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l^-1.Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol.l^-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu.

               PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu

               Kyselina sírová p. a.	50 g.l-1
               Hydroxid sodný p.a.	40 g.l-1
               Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:
               Chlorid amonný NH4Cl p.a.	38,5 g
               NaH2PO4 . 2H2O p.a.	33,4 g
               KH2PO4 p.a.	8,5 g
               K2HPO4 p.a.	21,75 g
               Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.

            1. IX.1.6.1.2 Přístroje

               Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.

               Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.

               Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.

               Odstředivka (cca 3 550 g).

               pH-metr.

               Oximetr.

               Papírový filtr.

               Membránový filtrační přístroj.

               Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.

               Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.

            1. IX.1.6.1.3 Příprava inokula

               Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.

               Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).

               Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.

            1. IX.1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky

               Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l^-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l^-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l^-1

               suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l^-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.

               Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.

         1. IX.1.6.2 Pracovní postup

            Kultivační nádoby se inkubují při difusním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l^-1.

            V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.

            Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.

            Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK

            v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.

         2. Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.

         Funkční kontrola aktivovaného kalu

         Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.

         Adaptace

         V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.

         Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:

         Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.

         Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.

         Příprava pro analýzu

         Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).

         Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 μm).

         Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.

         CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.

   1. IX.2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY

      Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.

   2. Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
   1. IX.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. IX.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
         1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
            1. — počáteční koncentrace látky,
            2. — všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
            3. — koncentrace látky po 3 h,
            4. — inhibiční křivka s popisem,
            5. — datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
            6. — vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
      1. IX.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

         Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.

         V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.

         Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.

         Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.

         Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná.

         Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.

         Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených ¹⁴C. Jestliže je použita zkoušená látka s ¹⁴C, je možné stanovením ¹⁴CO₂ prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.

         Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.

         Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.

   1. IX.4 LITERATURA

      (1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final

      (2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).

   PŘÍLOHA

   PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

   PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

   Organická látka:	4 - ethoxybenzoová kyselina
   Teoretická koncentrace ve zkoušce:	600 mg.l-1
   Teoretická DOC:	390 mg.l-1
   Inokulum:	městská čistírna v......
   Koncentrace:	1 g sušiny.l-1
   Adaptace:	bez adaptace
   Analytika:	stanovení DOC
   Množství vzorku:	3 ml
   Referenční látka:	diethylenglykol
   Toxicita zkoušené látky:	žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l-1 Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích

   PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

   Doba zkoušky	Referenční látka				Zkoušená látka
   	sl. p. mg.l-1	DOC mg.l-1	DOCn mg.l-1	Rozklad %	DOC mg-l-1	DOCn mg.l-1	Rozklad %
   0	-	-	300	-	-	390	-
   3 h	4,0	298,0	294,0	2	371,6	367,6	6
   1 den	6,1	288,3	282,3	6	373,3	367,2	6
   2 dny	5,0	281,2	276,2	8	360,0	355,0	9
   5 dnů	6,3	270,5	264,2	12	193,8	187,5	52
   6 dnů	7,4	253,3	245,9	18	143,9	136,5	65
   7 dnů	11,3	212,5	201,2	33	104,5	93,2	76
   8 dnů	7,8	142,5	134,7	55	58,9	51,1	87
   9 dnů	7,0	35,0	28,0	91	18,1	11,1	97
   10 dnů	18,0	37,0	19,0	94	20,0	2,0	99

   Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.

   sl. p. = slepý pokus

   Obrázek 1

   Příklad křivek biologického rozkladu