Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

vyhlášené znění

Obrázek

Obrázek 2

Příklad adaptace kalu

Obrázek
  1. X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM – metoda C.10 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. X.1 METODA
      1. X.1.1 ÚVOD
        1. X.1.1.1 Obecné poznámky
          1. Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
            1. — jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
            2. — mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
            3. — neinhibují bakterie.

          Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.

        1. X.1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)

          Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg/l.

          Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.

        1. X.1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)

          Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky. (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).

          Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.

          Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

      1. X.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. X.1.2.1 Analýza DOC/CHSK
          1. Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1a)
            1. DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
            2. T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK,
            3. E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l-1,
            4. Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1.

          Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.

        1. X.1.2.2 Specifická analýza
          1. Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1b)
            1. C1 = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou,
            2. C0 = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou.
      1. X.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

      1. X.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

        Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.

        Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.

        DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.

        Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.

        Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).

        Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

      1. X.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

      1. X.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. X.1.6.1 Příprava
          1. X.1.6.1.1 Přístroje
            1. Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:

              Potvrzující zkouška OECD

              Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).

              Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.

              Zařízení s porézní nádobkou

              Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.

              Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.

              Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.

              K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.

          1. X.1.6.1.2 Filtrace

            Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 μm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.

          1. X.1.6.1.3 Odpadní voda

            Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.

            1. Příklad syntetického média:
              1. V 1 l pitné vody se rozpustí:
                Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
                pepton160 mg,
                masový extrakt110 mg,
                močovina30 mg,
                NaCl7 mg,
                CaCl2 . 2 H2O4 mg,
                MgSO4 . 7 H2O2 mg,
                K2HPO428 mg.
            1. Komunální odpadní vody:
              1. Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.
          1. X.1.6.1.4 Zásobní roztok zkoušené látky

            Připraví se např. 1% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.

          1. X.1.6.1.5 Inokulum
          2. Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.

            3. Mohou se používat inokula z různých zdrojů.

            1. Příklady vhodného inokula:
              1. a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod

                Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.

              1. b) Směsné inokulum
                1. Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
                  1. Viz předchozí popis.
                1. Inokulum z půdy:
                  1. 100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                1. Inokulum z povrchové vody:
                  1. Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                  2. Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
            1. c) Inokulum z aktivovaného kalu

              Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.

        1. X.1.6.2 Postup

          Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.

          Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 ° C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.

          1. X.1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu

            Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky

            Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.

            Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.

            Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.

            Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.

            Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h-1 nebo 1/2 l.h-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.

            Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1.

            Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.

            Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.

            Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.

            1. Spřažená zařízení
              1. Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
          1. X.1.6.2.3 Analytika
            1. Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
              1. DOC a CHSK.
                1. Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
              1. Specifická analýza
                1. Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.
    1. X.2 DATA A VYHODNOCENÍ
      1. X.2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ

        Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.

        Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Drc, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.

        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (2)
        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (3)

        Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)

        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (4)
        1. kde:
          1. sDRc = standardní odchylka,
          2. = průměr hodnot DRc,
          3. n = počet stanovení.
        1. Odlehlé hodnoty DRc se eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehlých hodnot Drc:
          1. Výsledek se vyjádří dle (5):
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (5)
            1. kde
              1. tn-1; α = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P(P=1-α), kde P = 95% (1).

        Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

        1. Např.
          1. DRc = 98,6 ± 2,3% úbytku DOC,
          2. s = 4,65% úbytku DOC,
          3. n = 18,
          4. x = počet odlehlých hodnot.
      1. X.2.2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
        1. Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:

        Vynášením denně naměřených úbytků do grafu se zdůrazní všechny trendy, např. adaptace.

        1. X.2.2.1 Využití stanovení CHSK/DOC

          Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypočítá procentuální úbytek DR.

          1. Z řady hodnot DR se spočítá jejich průměr a podle rovnice (6) standardní odchylka:
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (6)
            1. kde
              1. sDR = standardní odchylka hodnot Dri,
              2. = průměr hodnot Dri,
              3. n = počet stanovení.

          Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR.

          Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7)

          Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
          (7)
          1. kde
            1. tn-1; α - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95 % (l).

          Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

          1. Např.:
            1. Dr = (98,6 ± 2,3%) úbytku DOC,
            2. s = 4,65% úbytku DOC,
            3. n = 18,
            4. x = počet odlehlých hodnot.
        1. X.2.2.2 Použití výsledků specifické analýzy

          Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) v % se počítá podle 1. 2. 2.

    1. X.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. X.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:
          1. — provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;
          2. — druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);
          3. — způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;
          4. — druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;
          5. — druh inokula, datum a místo odběru;
          6. — popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;
          7. — grafické vyjádření závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozběhové a vyhodnocovací;
          8. — výsledek stanovení obsahu zkoušené látky prostřednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku;
          9. — při provádění specifické analýzy: grafické vyjádření procentuálního úbytku zkoušené látky z kapalné fáze během rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na čase;
          10. — střední úbytek DOC nebo CHSK zkoušené látky a standardní odchylka výsledků získaných během vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkoušené látky je konstantní;
          11. — grafické vyjádření koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na čase;
          12. — poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování přebytečného kalu ze zařízení, tvorba shluků, použití chloridu železitého atd.);
          13. — proměřované koncentrace zkoušené látky;
          14. — výsledky analýz kalu;
          15. — všechny informace o zkoušené látce a o referenční látce, pokud byla použita;
          16. — vědecké zdůvodnění všech odchylek a změn metody.
      1. X.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.

        Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně-chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.

        K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.

        Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce).

        Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):

        Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.

    1. X.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.

      (2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).

      (3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.

      (4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.

      (5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.

      (6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.

    PŘÍLOHA 1

    Obrázek 1

    Obrázek
  2. A = zásobník
  3. B = dávkovací zařízení
  4. C = aerační komora (objem 3 litry)
  5. D = sedimentační nádoba
  6. E = mamutka
  7. F = zásobník na výtok
  8. G = aerátor
  9. H = průtokoměr (nepovinně)

    10. Obrázek 2

    Obrázek

    PŘÍLOHA 2

    Obrázek 1

    Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

    Obrázek
  10. A = zásobník
  11. B = dávkovací čerpadlo
  12. C = porézní aerační nádobka
  13. D = vnější nepropustná nádoba
  14. E = zásobník na výtok
  15. F = vzduchovací kámen
  16. G = rotametr

    17. Obrázek 2

    Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

    Obrázek

    PŘÍLOHA 3

    Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

    Obrázek
  1. XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU – metoda C.11 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. XI.1 METODA
      1. XI.1.1 ÚVOD

        Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.

        Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.

        Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.

        Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.

        Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.

        U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC50.

        Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,

        1. Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
          1. — rozpustnost ve vodě,
          2. — tlak par,
          3. — strukturní vzorec,
          4. — čistota zkoušené látky.
        1. Doporučení:
          1. Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.
      1. XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O2 na 1 mg kalu za hodinu.

        1. Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:

          1. kde:
            1. Rs = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,
            2. Rc1 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1,
            3. Rc2 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.
            4. EC50 v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.
      1. XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC50 u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

      1. XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

        Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC50 se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

      1. XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY
        1. Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
          1. — respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
          2. — EC50 (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l-1.
      1. XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. XI.1.6.1 Činidla
          1. XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky

            Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l-1.

          1. XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky

            Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H2SO4 do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H2SO4) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

          1. XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
            1. Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
              1. — 16 g peptonu,
              2. — 11 g masového extraktu,
              3. — 3 g močoviny,
              4. — 0,7 g NaCl,
              5. — 0,4 g CaCl2.2H2O,
              6. — 0,2 g MgSO4.7H2O,
              7. — 2,8 g K2HPO4.
          2. Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
          3. Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat

            4. v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

        1. XI.1.6.2 Aparatura

          Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.

          1. Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
            1. — měřicí přístroje,
            2. — provzdušňovací zařízení,
            3. — měřič pH a monitorovací zařízení,
            4. — kyslíková elektroda.
        1. XI.1.6.3 Příprava inokula

          Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.

          Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.

          Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).

          Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal

          v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l-1.

          Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.

          Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

        1. XI.1.6.4 Provedení zkoušky
          PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
          Trvání/doba kontaktu: 30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
          Voda: Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
          Přívod vzduchu: Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
          Měřicí aparatura: Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
          Měřič obsahu kyslíku: Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
          Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výše).
          Zkoušená látka: Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
          Referenční látka: např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
          Kontrolní zkouška: Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
          Teplota: 20 ± 2 °C
          1. Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:

            Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).

            Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.

            V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C1).

            Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l-1.

            V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.

            Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.

            Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.

            Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.

            Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).

            Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

    1. XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

      Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l-1 a 2,5 mg.l-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.

      Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC50 (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.

      Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC50.

      Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC50 95% meze spolehlivosti.

    1. XI.3 ZPRÁVA
      1. XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
          1. — zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
          2. — systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
          3. — experimentální podmínky:
            1. – pH reakční směsi před měřením respirace,
            2. – teplota při zkoušce,
            3. – ba trvání zkoušky,
            4. – referenční látka a její změřená EC50,
            5. – abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
          1. — výsledky:
            1. – veškeré naměřené hodnoty,
            2. – křivka inhibice a metoda výpočtu EC50,
            3. – EC50 a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC20 a EC80,
            4. – veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.
      1. XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Hodnotu EC50 je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

    1. XI.4 LITERATURA

      (1) International Standard ISO 8192-1986.

      (2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

      (3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

      (4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

      (5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

      (6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

      (7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

  1. XII. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI -– MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS – metoda C.12 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. XII.1 METODA
      1. XII.1.1 ÚVOD

        Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 °C. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)

        Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.

        V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.

        Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)

        V této metodě se používá k hodnocení výsledné biologické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl Ccelk. - Canorg.

        Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury).

        1. Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:
          1. — jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),
          2. — mají zanedbatelnou tenzi par,
          3. — nepůsobí inhibičně na bakterie,
          4. — významně se neadsorbují ve zkušebním systému,
          5. — neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.

        Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.

        Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku

        Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.

      1. XII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        CT = koncentrace zkoušené látky na začátku provzdušňovací periody, vyjádřená jako množství organického uhlíku přítomného nebo přidaného k usazené odpadní vodě (mg.l-1),

        Ct = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1),

        Cc= koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1).

        Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku.

        1. Biologický rozklad je možné vyjádřit jako:
          1. 1. Procentický úbytek Dda množství denně přidávané látky:
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (1)
            1. kde Dds = rozklad/denní přídavek
          1. 2. Procentický úbytek Dssd množství látky přítomného na začátku každého dne:
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (2a))
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (2b))
            1. kde Dred = rozklad/denní přídavek;
            2. indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.

        Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.

      1. XII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
      2. XII.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

        Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin. Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.

        Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.

        Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.

        Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).

      1. XII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)

        Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.

      1. XII.1.6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU
        1. XII.1.6.1 Příprava

          Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.

          Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.

          Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l-1 jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l-1 uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.

          Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.

          Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.

        1. XII.1.6.2 Experimentální podmínky

          Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 °C. Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l-1 suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.

        1. XII.1.6.3 Provedení zkoušky

          Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.

          Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.

          Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l-1). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.

          Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.

          Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.

          V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 µm membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 °C.

          Doba trvání zkoušky pro látky, u kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.

    1. XII.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

      Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.

      Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (Dda nebo Dred, viz 1. 2).

    1. XII.3 ZPRÁVA
      1. XII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
          1. — veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,
          2. — teplotu,
          3. — křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),
          4. — datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,
          5. — vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,
          6. — podpis a datum.
      1. XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.

        Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.

        Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).

        Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.

        Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

        Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené 14C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem 14C se zachycením 14CO2 potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.

        Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.

        Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

    1. XII.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

    PŘÍLOHA 1

    Zkouška SCAS: příklad výsledků

    PŘÍLOHA 1 Zkouška SCAS: příklad výsledků
    LátkaCT
    (mg.l-1)    		C1 - Cc
    (mg.l-1)    		Procento biolog.
    rozkladu Dda    		Doba trvání
    zkoušky
    (dny)
    4 -acetylaminobenzen sulfonan17,22,08540
    tetrapropylenbenzen sulfonan17,38,451,440
    4 - nitrofenol16,90,895,340
    diethylenglykol16,50,298,840
    anilin16,91,795,940
    cyklopentantetra-karboxylát17,93,281,1120

    PŘÍLOHA 2

    Příklad zkušební aparatury

    Obrázek
  1. XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH – metoda C.13 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek
    1. XIII.1 METODA

      Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).

      1. XIII.1.1 Úvod

        V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou-li splněna kritéria validace.

        V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Pov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCFss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Pov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFss.

        Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.

        V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.

      1. XIII.1.2 Definice a jednotky

        Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.

        Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cf v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cw v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.

        Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFSS nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.

        Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (Cf) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cf vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.

        Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k1/k2) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCFk).

        Rozdělovací koeficient oktanol-voda (Pov) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako Kow. Logaritmus hodnoty Pov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.

        Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.

        Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

        Po-expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).

        Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

      1. XIII.1.3 Princip zkušební metody

        Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po-expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.

        Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFss), tj. poměr koncentrace v rybách (Cf) a ve vodě (Cw) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).

        Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.

        Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov > 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.

        Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.

      1. XIII.1.4 Informace o zkušební látce
        1. Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:
          1. a) rozpustnost ve vodě,
          2. b) rozdělovací koeficient oktanol-voda Pov (označovaný také jako Kow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),
          3. c) hydrolýza,
          4. d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),
          5. e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log Pov),
          6. f) tlak par,
          7. g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.

        Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkušební látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.

      1. XIII.1.5 Platnost zkoušky
        1. Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:
          1. — kolísání teploty je menší než ±2 °C,
          2. — koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,
          3. — koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,
          4. — mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.
      1. c1.6 Referenční sloučeniny

        Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.

      1. XIII.1.7 Popis zkušební metody
        1. XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky