Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Popsaná metoda „třepací lahve“ je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

1. VII.1.1 ÚVOD

   Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, disociační konstantě, rozpustnosti ve vodě, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanolu (oktan-1-olu) a o povrchovém napětí.

   U disociujících látek by měla být měření prováděna pouze s nedisociovanou formou (volná kyselina nebo volná báze), získanou při použití vhodného pufru o pH nejméně o 1 nižším (volná kyselina) nebo vyšším (volná báze) než pK.

   Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu třepací lahve a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). První metodu lze použít, leží-li hodnota log P_o/v (definice viz níže) v rozmezí -2 až 4, a druhou metodu, leží-li hodnota log P_o/v v rozmezí 0 až 6. Před provedením kteréhokoli z experimentálních postupů by měl být nejdříve získán předběžný odhad rozdělovacího koeficientu.

   Metoda třepací lahve je použitelná pouze pro v podstatě čisté látky, které jsou rozpustné ve vodě a n-oktanolu. Nelze ji použít pro povrchově aktivní látky (pro které by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n-oktanolu a vodě).

   Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, povrchově aktivní látky a látky, které reagují s eluentem. Pro tyto látky by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech v n-oktanolu a vodě.

   Metoda HPLC je méně citlivá na přítomnost nečistot ve zkušební látce než metoda třepací lahve. Někdy však mohou nečistoty ztížit interpretaci výsledků, protože přiřazení píků se stává nejistým. U směsí, které dávají nerozlišitelný pás, by měly být uvedeny spodní a horní mez hodnoty log P.

1. VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
   1. Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací (c_i) rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:

   Rozdělovací koeficient (P) je tedy podílem dvou koncentrací a udává se obvykle ve formě svého dekadického logaritmu (log P).

1. VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

   Metoda třepací lahve

   Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provádění metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

   Metoda HPLC

   Za účelem korelace hodnot naměřených pro danou sloučeninu metodou HPLC s její hodnotou P je nutné sestrojit kalibrační graf závislosti log P na chromatografických datech tvořený nejméně šesti referenčními body. Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Pokud je to možné, měla by mít alespoň jedna referenční látka P_o/v vyšší než zkušební látka a jiná referenční látka P_o/v nižší než zkušební látka. U hodnot log P nižších než 4 může být kalibrace založena na údajích získaných metodou třepací lahve. U hodnot log P vyšších než 4 může být kalibrace založena na ověřených hodnotách z literatury, pokud jsou v souladu s vypočtenými hodnotami. Za účelem dosažení vyšší přesnosti je vhodnější volit látky, které mají podobnou strukturu jako zkušební látka.

   Rozsáhlé seznamy hodnot P_o/v pro mnoho skupin chemických látek jsou dostupné v literatuře (2, 3). Nejsou-li k dispozici údaje o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, lze použít obecnější kalibraci s jinými referenčními látkami.

   Seznam doporučených referenčních látek a jejich hodnot P_o/v je uveden v doplňku 2.

1. VII.1.4 PODSTATA METOD
   1. VII.1.4.1 Metoda třepací lahve

      Pro stanovení rozdělovacího koeficientu musí být dosaženo rovnováhy mezi všemi vzájemně působícími složkami systému a musí být stanoveny koncentrace látek rozpuštěných v obou fázích. Ze studia literatury vztahující se k této otázce vyplývá, že k řešení tohoto problému lze použít několik různých postupů, např. důkladné promíchání obou fází a jejich následné oddělení za účelem stanovení rovnovážných koncentraci vyšetřované látky.

   1. VII.1.4.2 Metoda HPLC

      HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C₈, C₁₈) chemicky vázané na oxid křemičitý. Chemické látky nastříknuté do této kolony se v ní pohybují různou rychlostí v důsledku různých stupňů rozdělení mezi mobilní fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi. Směsi chemikálií se eluují v pořadí své hydrofobnosti, přičemž se látky rozpustné ve vodě eluují jako první a látky rozpustné v olejích jako poslední, úměrně svému rozdělovacímu koeficientu uhlovodíky-voda. To umožňuje určit vztah mezi retenčním časem v této koloně (s reversními fázemi) a rozdělovacím koeficientem n-oktan/voda. Rozdělovací koeficient se odvodí z kapacitního faktoru k, daného výrazem:

      1. v němž t_R = retenční čas zkušební látky, t_o = průměrná doba, kterou molekula rozpouštědla potřebuje k průchodu kolonou (mrtvá doba).

      Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení elučních dob.

1. VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
   1. VII.1.5.1 Opakovatelnost

      Metoda třepací lahve

      S cílem zaručit správnost hodnoty rozdělovacího koeficientu se provedou opakovaná stanovení při třech různých zkušebních podmínkách, přičemž lze měnit jak množství dané látky, tak poměr objemů obou rozpouštědel. Dekadické logaritmy stanovených hodnot rozdělovacího koeficientu by měly ležet v rozmezí ±0,3.

      Metoda HPLC

      S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena opakovaná stanovení. Hodnoty log P získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

   1. VII.1.5.2 Citlivost

      Metoda třepací lahve

      Měřicí rozsah metody je určen mezí detekce analytické metody. Ta by měla umožnit stanovení hodnot log P_o/v v oblasti od -2 do 4 (pokud to podmínky dovolí, lze tuto oblast rozšířit až do hodnoty log P_o/v rovné 5), není-li koncentrace rozpuštěné látky v žádné z fází vyšší než 0,01 mol·l^–1.

      Metoda HPLC

      Metoda HPLC umožňuje stanovení rozdělovacích koeficientů v rozsahu log P_o/v od 0 do 6.

      Obvykle je možné určit rozdělovací koeficient dané látky s přesností ±1 řádu vzhledem k hodnotě získané metodou třepací lahve. Typické korelace lze nalézt v literatuře (4, 5, 6, 7, 8). Vyšší přesnosti lze obvykle dosáhnout, je-li korelační závislost založena na referenčních látkách podobné struktury (9).

   1. VII.1.5.3 Specifičnost

      Metoda třepací lahve

      Nernstův rozdělovací zákon platí pro zředěné roztoky jen při konstantní teplotě a konstantním tlaku a pH. Platí pouze pro čistou látku rozdělenou mezi dvě čistá rozpouštědla. Je-li současně v jedné nebo obou fázích přítomno více rozpuštěných látek, může tím být výsledek ovlivněn.

      Disociace nebo asociace rozpuštěných molekul vede k odchylkám od Nernstova rozdělovacího zákona. Tyto odchylky se projevují tím, že se rozdělovací koeficient stává závislým na koncentraci roztoku.

      V důsledku existujících mnohonásobných rozdělovacích rovnováh by tato metoda neměla být použita bez korekcí na disociovatelné sloučeniny. Pro tyto sloučeniny by mělo být zváženo použití pufračních roztoků namísto vody; pH pufračního roztoku by se mělo lišit od pK_a látky nejméně o 1, přičemž se zohlední význam tohoto pH s ohledem na životní prostředí.

1. VII.1.6 POPIS METODY
   1. VII.1.6.1 Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

      Hodnotu rozdělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz doplněk 1) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkušební látky v čistých rozpouštědlech (10).

   1. VII.1.6.2 Metoda třepací lahve
      1. VII.1.6.2.1 Příprava

         n-Oktanol: Stanovení rozdělovacího koeficientu by mělo být provedeno s n-oktanolem (oktan-1-olem) čistoty p.a.

         Voda: měla by být použita destilovaná voda nebo redestilovaná voda ve skleněné nebo křemenné aparatuře. V případě potřeby by měly být u disociovatelných látek použity místo vody pufrační roztoky.

      2. Poznámka:
         1. Neměla by být použita voda pocházející přímo z měniče iontů.
      1. VII.1.6.2.1.1 Předběžné nasycení rozpouštědel

         Před stanovením rozdělovacího koeficientu se fáze rozpouštědlového systému vzájemně nasytí třepáním při teplotě experimentu. K dosažení tohoto cíle je vhodné 24 h třepat na mechanické třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích vysoce čistý n-oktanol nebo vysoce čistou vodu, obojí s dostatečným množstvím druhého rozpouštědla, a poté nechat rozpouštědla stát tak dlouho, dokud se obě fáze neoddělí a dokud není dosaženo nasycení.

      1. VII.1.6.2.1.2 Příprava zkoušky

         Celkový objem dvoufázového systému by měl téměř naplňovat zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek v důsledku odpařování. Poměry objemů a množství látek, které mají být použity, jsou dány

         1. — předběžným odhadem rozdělovacího koeficientu (viz výše),
         2. — minimálním množstvím zkušební látky nezbytným pro postup analýzy, a
         3. — omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol·l^–1.

         Provedou se tři zkoušky. Při první se použije vypočtený poměr objemů n-oktanolu a vody; při druhé se tento poměr dělí dvěma a při třetí se tento poměr násobí dvěma (např. 1 : 1, 1 : 2, 2 : 1).

      1. VII.1.6.2.1.3 Zkušební látka

         Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu předem nasyceném vodou. Koncentrace tohoto zásobního roztoku by měla být před jeho použitím ke stanovení rozdělovacího koeficientu přesně stanovena. Tento roztok by měl být uchováván za podmínek, které zajistí jeho stálost.

      1. VII.1.6.2.2 Zkušební podmínky

         Zkušební teplota by měla být konstantní (±1 °C) a měla by ležet v rozmezí 20 a 25°C.

      1. VII.1.6.2.3 Postup měření
         1. VII.1.6.2.3.1 Ustavení rovnováhy rozdělení

            Pro každou ze zkušebních podmínek by měly být připraveny dvě zkušební nádoby obsahující potřebná přesně odměřená množství obou rozpouštědel spolu s nezbytným množstvím zásobního roztoku.

            Fáze n-oktanolu je nutné odměřit objemově. Zkušební nádoby by měly být umístěny do vhodné třepačky, nebo by měly být třepány ručně. Při použití centrifugační kyvety spočívá doporučený postup v tom, že se kyveta rychle otáčí kolem své příčné osy o 180°, takže případný zachycený vzduch stoupá vzhůru oběma fázemi. Ze zkušenosti vyplývá, že k ustavení rovnovážného rozdělení obvykle stačí 50 takových otočení. Pro jistotu se doporučuje 100 otočení během pěti minut.

         1. VII.1.6.2.3.2 Oddělení fází

            V případě potřeby lze oddělení fází provést odstředěním směsi. Odstředění by mělo být provedeno laboratorní odstředivkou udržovanou při laboratorní teplotě, nebo, je-li použita odstředivka bez regulace teploty, by měly být centrifugační kyvety za účelem ustavení rovnováhy udržovány alespoň jednu hodinu před analýzou při zkušební teplotě.

      1. VII.1.6.2.4 Analýza

         Za účelem stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné stanovit koncentrace zkušební látky v obou fázích. To lze provést odebráním alikvotního podílu každé z obou fází z každé kyvety a pro každou zkušební podmínku a jejich analýzou zvoleným postupem. Celkové množství látky přítomné v obou fázích by mělo být vypočteno a porovnáno s původně dodaným množstvím látky.

         Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem minimalizujícím riziko znečištění stopami n-oktanolu: k odběru vzorků vodné fáze lze použít skleněnou injekční stříkačku s vyměnitelnou jehlou. Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Vzduch se při průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrně vypudí. Do stříkačky se natáhne dostatečný objem vodné fáze. Stříkačka se z roztoku rychle vytáhne a jehla se sejme. Obsah stříkačky lze poté použít jako vzorek vodné fáze. Koncentrace v obou od sebe oddělených fázích by měla být stanovena nejlépe metodou, která je specifická pro danou látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou

         1. — fotometrické metody,
         2. — plynová chromatografie,
         3. — vysokoúčinná kapalinová chromatografie.
   1. VII.1.6.3 Metoda HPLC
      1. VII.1.6.3.1 Příprava

         Aparatura

         Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měla mít minimální podíl polárních skupin (11). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reversními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.

         Mobilní fáze

         K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC, které se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Doporučuje se použít směsi methanol/voda s minimálním obsahem vody 25 %. Obvykle vyhovuje pro eluci sloučenin o log P = 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml·min^-1 směs methanol / voda 3 : 1 (obj.). U sloučenin s vysokou hodnotou log P může být nutné zkrátit eluční dobu (stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.

         Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci při použití metody HPLC vykazovat abnormálně nízké hodnoty log P_o/v; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby bylo dosaženo rovnováhy za dobu, po kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty může být v takovém případě účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru methanol/voda.

         Zkušební i referenční látka by měly být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech mohou být u směsi methanol/voda použita aditiva, neboť aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatogramů získaných při použití aditiv, musí být použita samostatná kolona téhož typu. Nevyhovuje-li směs methanol-voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol-voda nebo acetonitril-voda.

         Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle 2 až 8. Doporučuje se použití pufračních roztoků. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.

         Rozpouštěné látky

         Referenční látky by měly mít nejvyšší dostupnou čistotu. Sloučeniny, které se mají používat pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.

         Zkušební podmínky

         Teplota by během měření neměla kolísat o více než ±2 K.

      1. VII.1.6.3.2 Měření

         Výpočet mrtvé doby t₀

         1. Mrtvou dobu t₀ je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n-alkylmethylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvé doby t₀ s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy t_r(n_c+1)se vynesou jako funkce t_r(n_c) a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:

         1. (n_c = počet atomů uhlíku). Mrtvá doba t₀ je dána vztahem:

         Kalibrační křivka

         Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti hodnot log k na log P pro příslušné referenční látky. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních látek, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce hodnot log P stanovených metodou třepací lahve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech nejméně jednou denně, aby bylo možné zohlednit případné změny činnosti kolony.

         Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky

         Zkušební látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolací získat rozdělovací koeficient zkušební látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní křivky.

1. VII.2 DATA

   Metoda třepací lahve

   Spolehlivost stanovených hodnot P je možné prověřit srovnáním středních hodnot z opakovaných stanovení s celkovou střední hodnotou.

1. VII.3 ZPRÁVY
   1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
      1. — přesnou specifikaci látky (identitu a nečistoty),
      2. — nejsou-li metody použitelné (např. u povrchově aktivní látky), měla by být uvedena vypočtená hodnota nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech látky v n-oktanolu a vodě,
      3. — všechny informace a poznámky, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
   1. Pro metodu třepací lahve:
      1. — výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
      2. — teplotu stanovení,
      3. — údaje o analytických postupech použitých ke stanovení koncentrací,
      4. — dobu a rychlost odstřeďování, pokud se použilo,
      5. — koncentrace naměřené při každém stanovení v obou fázích (tzn. uvede se celkem 12 koncentrací),
      6. — hmotnost zkušební látky, objem každé fáze použité v každé zkušební nádobě a vypočtené celkové množství zkušební látky, obsažené v jednotlivých fázích po dosažení rovnováhy,
      7. — vypočtené hodnoty rozdělovacího koeficientu (P) a střední hodnotu je nutné uvést pro každý soubor zkušebních podmínek, stejně tak střední hodnotu ze všech stanovení. Pokud existují náznaky závislosti rozdělovacího koeficientu na koncentraci, mělo by to být uvedeno ve zprávě,
      8. — měla by být uvedena směrodatná odchylka jednotlivých hodnot P od střední hodnoty,
      9. — měl by být také uveden dekadický logaritmus střední hodnoty P ze všech stanovení,
      10. — vypočtená teoretická hodnota P_o/v, byla-li stanovena nebo je-li naměřená hodnota > 10⁴,
      11. — pH použité vody a vodné fáze během experimentu,
      12. — pokud byly použity pufry, zdůvodnění jejich použití místo vody, jejich složení, koncentrace a pH, pH vodné fáze před a po experimentu.
   1. Pro metodu HPLC:
      1. — výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
      2. — zkušební látka a referenční látky, jejich čistota,
      3. — teplotní rozmezí při stanoveních,
      4. — pH, při kterém se prováděla stanovení,
      5. — podrobnosti o analytické a ochranné koloně, o mobilní fázi a o způsobu detekce,
      6. — retenční data a hodnoty log P z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,
      7. — podrobnosti o proložené regresní přímce (log k versus log P),
      8. — průměrná retenční data a interpolovaná hodnota log P pro zkušební sloučeninu,
      9. — popis zařízení a pracovních podmínek,
      10. — eluční křivky,
      11. — množství zkušební látky a referenčních látek zavedených do kolony,
      12. — mrtvý čas a způsob jeho měření.

1. VII.4 LITERATURA

   (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107. Decision of the Council C(81) 30 final.

   (2) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

   (3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.): Dostupné: Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

   (4) L. Renberg, G. Sundstrӧm, K. Sundh-Nygärd. Chemosphere, 1980, 80, 683.

   (5) H. Ellgehausen, C. D' Hondt, R. Fuerer. Pestic. Sci., 1981, 12, 219 (1981).

   (6) B. McDuffie. Chemosphere, 1981, vol 10, 73.

   (7) W. E. Hammers et al., J. Chromatogr. 1982, 247, 1.

   (8) J. E. Haky, A. M. Young. J. Liq. Chromat., 1984, 7. 675.

   (9) S. Fujisawa, E. Masuhara. J. Biomed. Mat. Res., 1981, 15, 787.

   (10) O. Jubermann. Verteilen und Extrahieren. V: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (ed. E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

   (11) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Euro. J. Med. Chem. 1979, vol 14, 479.

   (12) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

   (13) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant. Elsevier, Amsterdam, 1977.

   (14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

   (15) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

   (16) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

   (17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani, E. J. Lien, J. Med Chem. 1973, 16, 1207.

   (18) W. B. Neely, D. R. Branson, G. E. Blau. Environ. Sci. Technol. 1974, 8, 1113.

   (19) D. S. Brown, E. W. Flagg. J. Environ. Qual. 1981, 10, 382.

   (20) J. K. Seydel, K. J. Schaper. Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

   (21) R. Franke. Theoretical Drug Design Methods. Elsevier, Amsterdam 1984.

   (22) Y. C. Martin. Quantitative Drug Design. Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

   (23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor. J. Med. Chem. 1976, 19, 615.

DODATEK 1

Metody výpočtu nebo odhadu

ÚVOD

Obecný úvod do výpočtových metod, data a příklady jsou uvedeny v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).

1. Vypočtené hodnoty P_o/v lze použít
   1. — k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná (rozsah u třepací lahve: log P_o/v: –2 až 4, rozsah u HPLC: log P_o/v: 0 až 6),
   2. — k volbě vhodných zkušebních podmínek (např. referenčních látek pro postupy HPLC, poměr objemů n-oktanol/voda pro metodu třepací lahve),
   3. — jako vnitřní laboratorní kontrolu možných experimentálních chyb,
   4. — k získání odhadu P_o/v v případech, kdy zkušební metody nelze z technických důvodů použít.

METODA ODHADU

Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

1. Hodnotu rozdělovacího koeficientu je možné odhadnout s použitím rozpustnosti zkušební látky v čistých rozpouštědlech:
   1. Pro tento případ platí:

VÝPOČTOVÉ METODY

1. Podstata výpočtových metod
   1. Všechny výpočtové metody jsou založeny na formálním dělení molekul do vhodných podstruktur, pro něž jsou známy spolehlivé hodnoty přírůstků log P_o/v. Hodnota log P_o/v celé molekuly se poté vypočte jako součet hodnot pro příslušné fragmenty plus součet korekčních členů pro intramolekulární interakce.
   2. Existují seznamy konstant fragmentů a korekčních členů (b, c, d, e). Některé se pravidelně aktualizují (b).

Kritéria jakosti

Spolehlivost výpočtové metody obecně klesá s rostoucí složitostí zkoumané sloučeniny. V případě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností a jednou nebo dvěma funkčními skupinami lze očekávat, že odchylky hodnot log P_o/v získaných různými fragmentačními metodami od naměřené hodnoty budou v rozmezí od 0,1 do 0,3. U složitějších molekul může být rozpětí chyby větší. Závisí to na spolehlivosti a dostupnosti konstant pro fragmenty a rovněž na schopnosti zjistit intramolekulární interakce (např. vodíkové vazby) a na správném používání korekčních členů (což není obtížné při použití počítačového programu CLOGP-3) (b). V případě disociujících látek je důležité správně zohlednit náboj nebo stupeň disociace.

Postupy výpočtu

Hanschova π-metoda

1. Původní konstanta hydrofobnosti substituentu π zavedená Fujitou et al. (f) je definována jako
   1. kde P_o/v (PhX) je rozdělovací koeficient aromatického derivátu a P_o/v (PhH) rozdělovací koeficient výchozí sloučeniny

Ze své definice je π-metoda použitelná především u aromatických substituentů. Hodnoty π byly pro velký počet substituentů uspořádány do tabulek (b, c, d). Používají se k výpočtu log P_o/v aromatických molekul nebo substruktur.

Rekkerova metoda

1. Podle Rekkera (g) se hodnota log P_o/v vypočte takto:
   1. kde f_i představuje konstanty různých molekulárních fragmentů a a_i četnost jejich výskytu ve vyšetřované molekule. Korekční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty C_m (tzv. „magické konstanty“). Konstanty pro molekulární fragmenty f_i a C_m byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot P_o/v (pro 825 sloučenin) pomocí vícenásobné regresní analýzy (c, h). Interakční členy se určí podle stanovených pravidel popsaných v literatuře (e, h, i).

Hanschova-Leova metoda

1. Podle Hansche a Lea (c) se hodnota log P_o/v vypočte z výrazu:
   1. kde f_i představuje konstanty různých molekulárních fragmentů, F_j korekční členy a a_i, b_j odpovídající četnosti výskytů. Na základě experimentálních hodnot P_o/v byl pokusně sestaven seznam hodnot pro atomové a skupinové fragmenty a seznam korekčních členů F_j (tzv. „faktorů“). Korekční členy byly setříděny do několika různých tříd (a, c). Zohlednění všech pravidel a korekčních členů je poměrně složité a časově náročné. Byly vyvinuty sady softwaru (b).

Kombinovaná metoda

1. Výpočet log P_o/v složitých molekul lze značně zdokonalit, jestliže se molekula rozdělí do větších podstruktur, pro něž existují spolehlivé hodnoty pocházející buď z tabulek (b, c), nebo z vlastních měření. Tyto fragmenty (např. heterocykly, antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými π-hodnotami nebo s Rekkerovými nebo Leovými konstantami pro fragmenty.

Poznámky

1. i) Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úplně disociované sloučeniny pouze tehdy, lze-li vzít v úvahu nezbytné korekční faktory.
2. ii) Pokud lze předpokládat přítomnost intramolekulárních vodíkových vazeb, je nutné přičíst odpovídající korekční členy (přibližně 0,6 až 1,0 logaritmu P_o/v) (a). O přítomnosti těchto vazeb lze usuzovat z prostorových modelů nebo ze spektroskopických dat molekuly.
3. iii) Může-li existovat několik tautomerních forem, měla by být jako základ pro výpočet použita nejpravděpodobnější forma.
4. iv) Pečlivě by měly být sledovány přepracované seznamy konstant fragmentů.

Protokol o zkoušce

1. Při použití výpočtové metody nebo metody odhadu by měl protokol o zkoušce pokud možno obsahovat následující údaje:
   1. — popis látky (směs, nečistoty atd.),
   2. — známky přítomnosti intramolekulárních vodíkových vazeb, disociace, nábojů a dalších neobvyklých efektů (např. tautomerie),
   3. — popis výpočtové metody,
   4. — označení nebo uvedení databáze,
   5. — zvláštnosti při volbě fragmentů,
   6. — vyčerpávající dokumentaci výpočtů.

LITERATURA

(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). Pomona College. Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA.

(c) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev. 1971, 71, 525

(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Eur. S. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch. J. Amer. Chem. Soc., 1964, 86, 5175.

(g) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library. Elsevier, New York, 1977, 1.

(h) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

(i) R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.

DODATEK 2

Doporučené referenční látky pro metodu HPLC

1. VIII. METODA PRO STANOVENÍ VÝBUŠNÝCH VLASTNOSTÍ – metoda A.14 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
   1. VIII.1 METODA
      1. VIII.1.1 ÚVOD

         Metoda pro zjišťování výbušnosti látky stanovuje zkušební postup pro zjištění, zda látka je z hlediska výbuchu citlivá na působení tepla, na náraz nebo na tření, a to za podmínek uvedených v této metodě.

         Metoda poskytuje údaje pro ohodnocení možnosti vyvolání výbuchu působením uvedených podnětů; neslouží však ke zjištění, zda je látka schopna vybuchovat za jakýchkoliv podmínek.

         1. Látka se podrobí následujícím zkouškám
            1. a) zkoušce citlivosti na působení tepla,
            2. b) zkoušce citlivosti na náraz,
            3. c) zkoušce citlivosti na tření,

         Při uvedených zkouškách lze použít i alternativní přístroje, a to za podmínky, že jsou mezinárodně uznávané a že jimi získané výsledky odpovídají výsledkům získaným na přístrojích uvedených v příloze.

         Zkoušky se neprovádějí, lze-li u látky na základě odborného posouzení vyslovit jednoznačný závěr, že se látka nemůže rychle rozkládat za vývoje plynů a uvolňování tepla a nepředstavuje tedy nebezpečí výbuchu.

      1. VIII.1.2 DEFINICE A REFERENČNÍ LÁTKY

         Pro účely této vyhlášky se považuje za výbušnou látku taková chemická látka nebo chemický přípravek, která je schopna vybuchnout působením tepla nebo která z hlediska možnosti vybuchnout je citlivá na náraz nebo na tření v přístroji uvedeném v příloze nebo je citlivější na náraz nebo na tření než 1,3-dinitrobenzen v alternativním přístroji,

         1. Za referenční látku se považuje
            1. a) krystalický 1,3-dinitrobenzen, který prochází sítem o velikosti oka 0,5 mm, a to pro zkoušení citlivosti na náraz a na tření,
            2. b) perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (označovaný jako RDX nebo hexogen nebo cyklonit - CAS 121-82-4) rekrystalovaný z vodného cyklohexanonu, prosátý za mokra na sítě 250 μm a zachycený na sítě 150 μm, sušený při 103 ± 2 °C po dobu 4 hodin, pro druhou sérii zkoušek.
      1. VIII.1.3 PRINCIP METODY
         1. VIII.1.3.1 Předběžná zkouška

            Před provedením zkoušek se pro zajištění bezpečnosti provádí předběžná zkouška.

            Předběžná zkouška se provádí s velmi malými vzorky látky, přibližně 10 mg, a to zahříváním neuzavřené látky v plameni plynového hořáku, nárazem v jakémkoliv zařízení a třením za použití paličky proti podložce nebo v jiném zařízení pro zkoušení citlivosti na tření. Účelem předběžné zkoušky je zjistit, zda látka není tak citlivá a výbušná, že předepsanou zkoušku citlivosti, zvláště zkoušku citlivosti na působení tepla, je nutné provádět za použití ochranných opatření, která by zamezila poranění osoby provádějící zkoušku.

            Výsledky předběžné zkoušky neslouží k hodnocení výbušnosti látky.

         1. VIII.1.3.2 Zkouška citlivosti na působení tepla

            Při této zkoušce se látka zahřívá v ocelové trubce uzavřené clonami. Při této zkoušce se zjišťuje, zda je látka náchylná k výbuchu za podmínek intenzivního zahřívání a předepsaného utěsnění.

         1. VIII.1.3.3 Zkouška citlivosti na náraz

            Při této zkoušce se látka zkouší závažím předepsané hmotnosti, které se spouští z předepsané výšky.

         1. VIII.1.3.4 Zkouška citlivosti na tření

            Při této zkoušce se pevná nebo pastovitá látka zkouší třením mezi standardními povrchy za předepsaných podmínek zatížení a vzájemného pohybu. U kapalin se zkouška třením neprovádí.

      1. VIII.1.4 POPIS METODY
         1. VIII.1.4.1 Zkouška citlivosti na působení tepla
            1. VIII.1.4.1.1 Zařízení

               Zařízení je tvořeno ocelovou trubkou k jednomu použití se znovupoužitelným uzavíracím zařízením (obrázek 1) instalovanou v ohřívacím a ochranném zařízení. Každá trubka je hlubokotažená z ocelového plechu. Její vnitřní průměr je 24 mm, délka 75 mm a tloušťka stěny 0,5 mm. Na otevřeném konci trubky je příruba sloužící k uzavření trubky sestavou clony. Sestava je tvořena clonou se středovým otvorem odolnou vůči tlaku připevněnou k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitová příruba). Matice a závitová příruba jsou zhotoveny z chrom-manganové oceli, která je do 800 °C nejiskřivá. Clony mají tloušťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli a tvoří řadu podle velikosti otvorů.

            1. VIII.1.4.1.2 Podmínky zkoušky

               Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém je dodána. V některých případech, např. když je lisovaná, litá nebo jiným způsobem zhutněná, může být zkoušena po rozdrcení.

               U pevných látek se hmotnost látky použité v každé zkoušce určí ve dvou etapách. V první etapě se zvážená trubka naplní 9 cm³ látky a po celém průřezu trubky se látka stlačí silou 80 N. Z bezpečnostních důvodů nebo v případech, kdy stlačováním může dojít ke změně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný způsob plnění; například je-li látka velmi citlivá na tření, není vhodné její stlačování. Je-li látka stlačitelná, přidá se další množství této látky a stlačuje se, až je trubka zaplněna do vzdálenosti 55 mm od horního okraje. Zjistí se celkové množství látky použité pro naplnění do úrovně 55 mm od horního okraje a přidají se další 2 podíly látky, přičemž každý se stlačí silou 80 N. Látka se pak podle potřeby buď přidá a stlačí, nebo odebere tak, aby trubka byla naplněna do úrovně 15 mm od horního okraje. Zjištěná celková hmotnost látky je základem pro provedení druhé etapy. Při ní se nejprve vnese do trubky třetina z hmotnosti zjištěné v první etapě a stlačí se. Vnesou se další 2 podíly, stlačí se silou 80 N a podle potřeby se přidá nebo odebere látka v trubce na úroveň 15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjištěné ve druhé etapě se použije pro každý pokus; naplnění se provede se 3 stejnými množstvími a každé z nich se stlačí na objem 9 cm³ bez ohledu na to, jaké síly bude zapotřebí. Pro usnadnění lze k tomu použít rozpěrné kroužky.

               Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm. Zvláštní pozornost je třeba věnovat gelům, aby nedošlo k tvorbě dutin. Zezdola se na trubku navleče závitová příruba, vloží se vhodná clona a po nanesení mazadla na bázi disulfidu molybdeničitého se matice utáhne. Je nutné se přesvědčit, zda nějaká látka nezůstala zachycena mezi přírubou a clonou nebo v závitech.

               Naplněná a uzavřená trubka se zahřívá propanem odebíraným přes průtokoměr z průmyslové tlakové láhve s regulátorem tlaku seřízeným na rozmezí 6 až 7 kPa. Propan se rozděluje rozdělovacím potrubím stejnoměrně do 4 hořáků, což se ověří vizuálně pozorováním plamenů hořáků. Hořáky jsou umístěny kolem zkušební trubky (obrázek 1). 4 hořáky mají celkovou spotřebu přibližně 43,2 dm³ propanu za minutu. Lze použít alternativní palivo a hořáky, avšak rychlost ohřevu musí být stejná, jak je uvedeno na obrázku 3. U všech zařízení se musí pravidelně kontrolovat rychlost ohřevu za použití trubek naplněných dibutylftalátem (obrázek 3).

            1. VIII.1.4.1.3 Provedení zkoušky

               Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo až doba ohřevu dosáhne 5 minut. Nejprve se provede série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 6 mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 2 mm. Dojde-li k výbuchu u kterékoliv zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.

               Projevem výbuchu je roztržení trubky na 3 nebo více částí, z nichž některé mohou být vzájemně spojeny úzkými proužky kovu (obrázek 2). Zkouška, při níž se vytvoří méně částí nebo nevzniknou žádné části, se považuje za zkoušku, při níž nedošlo k výbuchu.

            1. VIII.1.4.1.4 Vyhodnocení zkoušky

               Zkouška se považuje za pozitivní, pokud dojde k výbuchu u kterékoliv zkušební série.

      1. VIII.1.4.2 Zkouška citlivosti na náraz
         1. VIII.1.4.2.1 Zařízení

            Základními částmi obvyklých zařízení s padacím kladivem je blok z šedé litiny s podstavcem, podložka (kovadlina), sloup, vodicí lišty, padací závaží (kladivo), zadržovací a uvolňovací zařízení a držák vzorku (obrázek 4). Ocelová podložka (kovadlina) o průměru 100 mm a výšce 70 mm je přišroubována k horní straně ocelo-litinového bloku o délce 230 mm, šířce 250 mm a výšce 200 mm se základovou (litinovou) deskou o délce 450 mm, šířce 450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvořený bezešvou taženou ocelovou trubkou je připevněn držákem přišroubovaným na zadní stranu ocelo-litinového bloku. 4 šrouby ukotvují zařízení k betonovému bloku o rozměrech 60 x 60 x 60 cm takovým způsobem, že vodicí lišty jsou přesně kolmo a padací závaží padá volně. Vhodné je použít závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné oceli. Úderová hlava každého závaží je z tvrzené oceli HRC 60 až 63 o minimálním průměru 25 mm.

            Zkoušený vzorek se uzavře do zkušebního přípravku tvořeného 2 souosými ocelovými válci umístěnými nad sebou a vodicím pouzdrem tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o průměru mezi 10 - 0,003 mm a 10 - 0,005 mm a výšce 10 mm mají vyleštěné plochy, zakulacené hrany s poloměrem zakřivení 0,5 mm a tvrdost HRC 58 až 65. Dutý válec musí mít vnější průměr 16 mm, vyleštěný vyvrtaný otvor o průměru mezi 10 + 0,005 mm a 10 + 0,010 mm a výšku 13 mm. Sestavený zkušební přípravek se umístí na výměnnou mezipodložku o průměru 26 mm a výšce 26 mm, který je vystředěn středícím kroužkem s otvory pro odvod dýmů.

         1. VIII.1.4.2.2 Podmínky zkoušky
            1. Objem vzorku činí 40 mm³ nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:
               1. a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,
               2. b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se jako reprezentativní vzorek původní látky použije prosetý podíl o velikosti částic od 0,5 mm do 1 mm.

            Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu nebo po odstranění nejvýše možného množství ředidla. Kapalné látky se zkoušejí s mezerou 1 mm mezi horním a dolním ocelovým válcem.

         1. VIII.1.4.2.3 Provedení zkoušky

            U série 6 zkoušek se pustí závaží o hmotnosti 10 kg z výšky 0,40 m (40 J). Dojde-li během těchto 6 zkoušek při 40 J k výbuchu, musí se provést další série 6 zkoušek s puštěním závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15 m (7,5 J). V jiných zařízeních se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).

         1. VIII.1.4.2.4 Vyhodnocení zkoušky

            Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se při kterékoliv zkoušce nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk nebo plamen), nebo při zkouškách v jiných zařízeních je zkoušená látka citlivější než 1,3-dinitrobenzen nebo RDX.

      1. VIII.1.4.3 Zkouška citlivosti na tření
         1. VIII.1.4.3.1 Provedení

            Třecí zařízení (obrázek 5) je tvořeno základovou deskou z lité oceli, na které je upevněno třecí zařízení. To je tvořeno nepohyblivým porcelánovým kolíkem a pohyblivou porcelánovou destičkou. Porcelánová destička je upevněna na saních vedených 2 vodícími lištami. Saně jsou připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou vačkou a vhodným ozubeným převodem tak, že porcelánová destička vykonává pod porcelánovým kolíkem pohyb tam a zpět na délce dráhy 10 mm. Porcelánový kolík se může zatížit silou buď 120 N, nebo 360 N.

            Rovné porcelánové destičky jsou vyrobeny z bílého technického porcelánu o drsnosti 9 až 32 μm o délce 25 mm, šířce 25 mm a výšce 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovněž vyroben z bílého technického porcelánu a má délku 15 mm a průměr 10 mm a zdrsněné kulové plochy s poloměrem zakřivení 10 mm.

         1. VIII.1.4.3.2 Podmínky zkoušky
            1. Objem vzorku činí 10 mm³ nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:
               1. a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,
               2. b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se použije prosetý podíl o velikosti částic menší než 0,5 mm.

            Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu. Není-li možné připravit látku v suchém stavu, zkouší se pasta, a to po odstranění nejvýše možného množství ředidla, ve formě proužku o tloušťce 0,5 mm, šířce 2 mm a délce 10 mm připraveného v tvarovací formě.

         1. VIII.1.4.3.3 Provedení zkoušky

            Porcelánový kolík se přiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. Při provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové destičce příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík zůstal na vzorku, aby pod kolíkem zůstalo ležet dostatečné množství vzorku a také aby se destička pohybovala správně pod kolíkem. U pastovitých látek se pro nanesení látky na destičku používá měrka 0,5 mm silná s otvorem 2 x 10 mm. Porcelánová destička se musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam a zpět za 0,44 s. Každá část povrchu destičky a kolíku se smí použít pouze jednou; 2 konce každého kolíku slouží pro 2 pokusy a každá ze 2 stran destičky slouží pro 3 pokusy.

            Série 6 zkoušek se provádí se zatížením 360 N. Získá-li se pozitivní výsledek během těchto 6 zkoušek, musí se provést další série 6 zkoušek se zatížením 120 N. U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).

         1. VIII.1.4.3.4 Vyhodnocení zkoušky.

            Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk, praskání, jiskření nebo plamen) při kterékoliv zkoušce nebo zkoušená látka splňuje ekvivalentní kritéria v jiných zkouškách.

   1. VIII.2 DATA

      Zkoušená látka se považuje za výbušnou ve smyslu zákona, pokud se při její zkoušce citlivosti na působení tepla, náraz nebo tření získá pozitivní výsledek.

   1. VIII.3 ZPRÁVA
      1. Zpráva o zkoušce obsahuje, pokud je to možné, zejména následující informace:
         1. a) identifikaci, chemické složení, čistotu a vlhkost zkoušené látky,
         2. b) fyzikální formu vzorku a informace, zda se vzorek drtil, mlel nebo proséval,
         3. c) údaje zjištěné při zkoušce citlivosti na působení tepla, například hmotnost vzorku a počet úlomků,
         4. d) pozorované jevy při zkoušce citlivosti na náraz nebo při zkoušce citlivosti na tření, například tvorba značného množství dýmu nebo úplný rozklad, plameny, jiskry, třesk nebo praskání,
         5. e) výsledky každého typu zkoušky,
         6. f) zdůvodnění použití alternativního přístroje a důkaz srovnatelnosti získaných výsledků s výsledky získanými s přístrojem uvedeným v této metodě,
         7. g) poznámky, které mohou mít význam pro správné hodnocení výsledků, například odkazy na zkoušky podobných látek,
         8. h) další poznámky, které mají vztah k interpretaci výsledků.

      Ve zprávě o zkoušce se uvádí také všechny výsledky, které jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Jestliže byly některé hodnoty vyřazeny, je nutné podat vysvětlení a uvést všechny výsledky náhradních nebo doplňkových zkoušek. Pokud není možno anomální výsledek kvalifikovaně vysvětlit, je třeba jej přijmout tak, jak byl dosažen, a látku ohodnotit způsobem odpovídajícím dosaženému výsledku.

   1. VIII.4 LITERATURA

      (1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

      (2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.

      (3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6 – 13 a 30 – 42.

      (4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosive risk.

   Obrázek 1

   Zařízení na zkoušku citlivosti na působení tepla

   (všechny rozměry v mm)

   

   Obr. 1a

   Ocelová trubka a příslušenství

2. (1) trubka
3. (2) prstenec se závitem; závit pro nízké tření
4. (3) clona o průměru a=2,0 nebo 6,0 mm
5. (4) matice s otvorem o průměru b=10 mm
6. (5) zkosená hrana
7. (6) 2 rovné plošky pro klíč 41
8. (7) 2 rovné plošky pro klíč 36


Obr. 1b

Ohřívací a ochranné zařízení

9. (8) ochranný kryt odolný vůči střepinám
10. (9) 2 tyčinky nesoucí trubku
11. (10) sestavená trubka
12. (11) poloha zadního hořáku, ostatní hořáky jsou viditelné
13. (12) zapalovací hořáček

Obrázek 2

Zkouška citlivosti na působení tepla

Příklady roztržení trubky



Obrázek 3

Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla



Obrázek 4

Přístroj pro zkoušku citlivosti na náraz

(všechny rozměry v mm)



Obr. 4a

Padací kladivo, čelní a boční celkový pohled

14. (1) základová deska 450x450x60
15. (2) ocelo-litinový blok 230x250x200
16. (3) kovadlina, průměr 100x70
17. (4) sloup
18. (5) střední nosník
19. (6) dvě vodicí lišty
20. (7) ozubená tyč
21. (8) měřítko


Obr. 4a

Padací kladivo, spodní část

22. (9) padací kladivo
23. (10) zadržovací a uvolňovací zařízení
24. (11) středící objímka
25. (12) mezipodložka (výměnná), o průměru 26x26
26. (13) středící kroužek s otvory
27. (14) zkušební přípravek


Obr. 4c

Zařízení pro zkoušku citlivosti práškových a pastovitých látek vůči mechanickému podnětu na úder

28. (1) ocelové válečky
29. (2) vodící pouzdro pro ocelové válečky
30. (3) středící kroužek s otvory
    1. a) svislý řez
    2. b) průmět


Obr. 4d

Zařízení pro zkoušku citlivosti kapalné látky vůči mechanickému podnětu na úder

(4) pryžový prstenec

(5) kapalná látka (40 mm³)

(6) prostor bez kapaliny



Obr. 4e

Kladivo (závaží 5 kg)

31. (1) upínací čep
32. (2) polohová značka
33. (3) vodící drážky
34. (4) úderník
35. (5) aretační zařízení

Obrázek 5

Přístroj pro zkoušku citlivosti na tření



Obr. 5a

Třecí přistroj; boční a půdorysný pohled

36. (1) ocelový podstavec
37. (2) pohyblivé sáně
38. (3) porcelánová destička 25x25x5 mm, upevněná na saních
39. (4) upevněný porcelánový kolík, průměr 10 mm, délka 15 mm
40. (5) zkoušený vzorek, 10 mm³


Obr. 5b

Výchozí poloha válečku na vzorku

41. (6) držák kolíku
42. (7) zatěžovací rameno
43. (8) vyrovnávací závaží
44. (9) vypínač
45. (10) kolečko pro nastavení saní do výchozí polohy
46. (11) směr k elektromotoru

1. IX. METODA PRO STANOVENÍ ČÍSELNĚ STŘEDNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ – metoda A.18 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po čtyřiadvacáté přizpůsobuje technickému pokroku směrnici Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 98/73/ES“)
   1. IX.1. METODA

      Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze 1.

   1. IX.1.1 Úvod

      Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

      Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

   1. IX.1.2 Definice a jednotky
      1. Číselně střední molekulová hmotnost M_n a hmotnostně střední molekulová hmotnost M_w se stanoví pomocí následujících rovnic:

         Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Aparatura Mobilní fáze Rozpouštěné látky Zkušební podmínky Výpočet mrtvé doby t0 Kalibrační křivka Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky Metoda třepací lahve DODATEK 1 Metody výpočtu nebo odhadu ÚVOD METODA ODHADU VÝPOČTOVÉ METODY Kritéria jakosti Postupy výpočtu Poznámky Protokol o zkoušce LITERATURA DODATEK 2 Doporučené referenční látky pro metodu HPLC Obrázek 1 Zařízení na zkoušku citlivosti na působení tepla (všechny rozměry v mm) Obr. 1a Ocelová trubka a příslušenství Obr. 1b Ohřívací a ochranné zařízení Obrázek 2 Zkouška citlivosti na působení tepla Příklady roztržení trubky Obrázek 3 Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla Obrázek 4 Přístroj pro zkoušku citlivosti na náraz (všechny rozměry v mm) Obr. 4a Padací kladivo, čelní a boční celkový pohled Obr. 4a Padací kladivo, spodní část Obr. 4c Zařízení pro zkoušku citlivosti práškových a pastovitých látek vůči mechanickému podnětu na úder Obr. 4d Zařízení pro zkoušku citlivosti kapalné látky vůči mechanickému podnětu na úder Obr. 4e Kladivo (závaží 5 kg) Obrázek 5 Přístroj pro zkoušku citlivosti na tření Obr. 5a Třecí přistroj; boční a půdorysný pohled Obr. 5b Výchozí poloha válečku na vzorku

         1. kde
            1. H_i je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem V_i,
            2. M_i je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem V_i, a n je počet dat.

      Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem M_w/M_n.

   1. IX.1.3 Referenční látky

      Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi M_n a M_w a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

      Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

   1. IX.1.4 Princip zkušební metody

      Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (M_n, M_w) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

      Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

      V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

      Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

   1. IX.1.5 Kritéria kvality

      Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).

      Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

      Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Metoda HPLC Metoda třepací lahve Aparatura Mobilní fáze Rozpouštěné látky Zkušební podmínky Výpočet mrtvé doby t0 Kalibrační křivka Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky Metoda třepací lahve DODATEK 1 Metody výpočtu nebo odhadu ÚVOD METODA ODHADU VÝPOČTOVÉ METODY Kritéria jakosti Postupy výpočtu Poznámky Protokol o zkoušce LITERATURA DODATEK 2 Doporučené referenční látky pro metodu HPLC Obrázek 1 Zařízení na zkoušku citlivosti na působení tepla (všechny rozměry v mm) Obr. 1a Ocelová trubka a příslušenství Obr. 1b Ohřívací a ochranné zařízení Obrázek 2 Zkouška citlivosti na působení tepla Příklady roztržení trubky Obrázek 3 Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla Obrázek 4 Přístroj pro zkoušku citlivosti na náraz (všechny rozměry v mm) Obr. 4a Padací kladivo, čelní a boční celkový pohled Obr. 4a Padací kladivo, spodní část Obr. 4c Zařízení pro zkoušku citlivosti práškových a pastovitých látek vůči mechanickému podnětu na úder Obr. 4d Zařízení pro zkoušku citlivosti kapalné látky vůči mechanickému podnětu na úder Obr. 4e Kladivo (závaží 5 kg) Obrázek 5 Přístroj pro zkoušku citlivosti na tření Obr. 5a Třecí přistroj; boční a půdorysný pohled Obr. 5b Výchozí poloha válečku na vzorku

      Mp < 2 000	Mw/Mn < 1,20
      2000 = MP =106	Mw/Mn < 1,05
      Mp > 106	Mw/Mn < 1,20

      (M_p je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

   1. IX.1.6 Popis zkušební metody
      1. IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

         Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

         Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

      1. IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

         Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

         Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

      1. IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky
         1. — zásobník rozpouštědla,
         2. — odplynovací zařízení (podle potřeby),
         3. — čerpadlo,
         4. — tlumič rázů (podle potřeby),
         5. — vstřikovací systém,
         6. — chromatografické kolony,
         7. — detektor,
         8. — průtokoměr (podle potřeby),
         9. — zapisovač,
         10. — nádoba na odpad.

         Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

      1. IX.1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

         Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

      1. IX.1.6.5 Kolona

         Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

      1. IX.1.6.6 Teoretická patra

         Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

         1. kde
            1. N je počet teoretických pater,
            2. V_e je eluční objem v maximu píku,
            3. W šířka základny píku,
            4. W_½ šířka píku v polovině výšky.
      1. IX.1.6.7 Separační účinnost
         1. Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:
            1. kde
               1. V_e,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností M_x,