Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

zrušený předpis

U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý*.

  1. VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

    Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení organických látek.

    Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněž vliv anorganické redukční a oxidační látky.

    U některých cyklických sloučenin a u řady těkavých sloučenin (např. u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné oxidaci.

  1. VI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

    Připraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l-1.

    1. Poznámky:

      U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemně rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit přímo do experimentální aparatury s vodou.

    Často je výhodné, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnávačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení konvenční metodou obtížné – např. kyselinu octovou. Metoda však také selhává v případě pyridinu. Zvýší-li se koncentrace dichromanu draselného předepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se přímé navažování 5 – 10 mg látky, což je důležité pro stanovení CHSK látek obtížně rozpustných ve vodě (2).

    Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou.

  1. VI.2 DATA A HODNOCENÍ

    CHSK obsahu experimentální baňky se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na CHSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

  1. VI.3 ZPRÁVY

    Uvede se odkaz na použitou metodu.

    Chemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří měření. Jsou-li známy, musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkušební látky.

    Uvede se použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

  1. VI.4 LITERATURA

    (1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146.

    (2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

    1. Seznam příkladů normovaných metod:
      NBNT 91-201Determination of the chemical oxygen demand.
      ISBN O 11 7512494Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
      NF T 90-101Determination of the chemical oxygen demand.
      DS 217Water analysis —Determination of the chemical oxygen demand.
      DIN 38409-H-41Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
      NEN 3235 5.3Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik.
      ISO 6060Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.
  1. VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH – metoda C.7 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. VII.1 METODA

      Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

      1. VII.1.1 ÚVOD

        Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.

        Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.

        Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).

        Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku par dané látky.

        Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.

        Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 − 9).

      1. VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výměnou skupiny X za skupinu OH:
          (1)
        1. Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem:
          (2)
        1. Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem:
          (3)
        1. Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu:
          (4)
          1. kde
            1. t = čas,
            2. C0 = koncentrace látky v čase 0,
            3. Ct = koncentrace látky v čase t,
            4. 2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem.

        Koncentrace se vyjádří v g·l-1 nebo v mol·l-1.

        Konstanta kpozorov. má rozměr [čas]-1.

        „Poločas“ t½ je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %,

        (5)

        Z rovnic (4) a (5) plyne, že

        (6)
      1. VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

        1. Jako referenční látky byly použity následující látky (1):
          1. Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
          2. O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).
      1. VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.

        Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

        Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).

        Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.

      1. VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

        V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

        Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

      1. VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. VII.1.6.1 Reakční činidla
          1. VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky

            Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.

            K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.

            Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.

            Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.

          1. VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky

            Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

            Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.

            Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.

        1. VII.1.6.2 Aparatura

          Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.

          Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.

        1. VII.1.6.3 Analytická metoda

          Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.

          Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.

        1. VII.1.6.4 Zkušební podmínky

          Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.

          U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).

        1. VII.1.6.5 Zkušební postup
          1. VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška

            U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.

            V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.

          1. VII.1.6.5.2 Zkouška 1

            Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.

            Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.

            Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.

            Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:

            Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.

            Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.

            Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).

          1. VII.1.6.5.3 Zkouška 2
            1. Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
              1. — buď při teplotě nižší než 40 °C,
              2. — nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

            Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.

            Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

            Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t½).

          1. VII.1.6.5.4 Zkouška 3
            1. Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
              1. — buď při teplotě nižší než 40 °C,
              2. — nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

            Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta kpozorov. a poločas t½.

    1. VII.2 DATA
      1. Jde-li o reakci pseudoprvního řádu, lze vypočítat hodnoty konstanty kpozorov. pro každé pH a každou zkušební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice:
        (7)

      Dále je možné z rovnice (6) vypočítat t½.

      Podle potřeby se s použitím Arrheniovy rovnice stanoví k25 °C.

      Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního řádu, viz bod 3.1.

    1. VII.3 ZPRÁVA
      1. VII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
          1. — specifikaci látky;
          2. — všechny výsledky získané s referenčními látkami;
          3. — podstatu a podrobnosti použité analytické metody;
          4. — pro každou zkoušku: teplotu, pH, složení pufračního roztoku, tabulku se všemi údaji o koncentraci a čase;
          5. — u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty kpozorov. a t½, včetně metody jejich výpočtu;
          6. — u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, graf průběhu závislosti logaritmu koncentrace na čase;
          7. — všechny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků.
      1. VII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkušebních látek za předpokladu, že pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že lze důvodně očekávat, že aktivační energie zkušební látky je stejného řádu.

    1. VII.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

      (2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383-415.

    DODATEK

    Pufrační roztoky

    1. A. CLARK A LUBS

      Hodnoty pH uvedené v následujících tabulkách byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH jsou o 0,04 vyšší než hodnoty v tabulce.

      DODATEK Pufrační roztoky
      SloženípH
      kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml3,8
      kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml4,0
      3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml4,2
      dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml6,8
      29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml7,0
      35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml7,2
      H3BO3 (0,1 mol·l-1) v KCl (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
      16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml8,8
      21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml9,0
      26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml9,2
    1. B. KOLTHOFF A VLEESHOUWER
      DODATEK Pufrační roztoky
      SloženípH
      Monokalium-citrát(0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 18 °C
      (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně)
      2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml3,8
      9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,0
      16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,2
    1. C. SÖRENSEN

      Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1)

      DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1)
      SloženípH
      ml boraxuml HClSörensen
      18 °C      		Walbum
      10 °C40 °C70 °C
      8,02,08,918,968,778,59
      8,51,59,019,068,868,67
      9,01,09,099,148,948,74
      9,50,59,179,229,018,80
      10,00,09,249,309,088,86

      Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1)

      DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1)
      SloženípH
      ml boraxuml HClSörensen
      18 °C      		Walbum
      10 °C40 °C70 °C
      10,00,09,249,309,088,86
      9,01,09,369,429,188,94
      8,02,09,509,579,309,02
      7,03,09,689,769,449,12
  1. VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY – ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PŮDĚ – metoda C.8 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. VIII.1 METODA
      1. VIII.1.1 ÚVOD

        V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.

      1. VIII.1.2 JEDNOTKY A DEFINICE

        LC50: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.

      1. VIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKA

        Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.

        Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.

      1. VIII.1.4 PRINCIP ZKOUŠKY

        Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.

      1. VIII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.

      1. VIII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. VIII.1.6.1 Látky
          1. VIII.1.6.1.1 Substrát pro zkoušku
            1. Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.

              (a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):

              1. - 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),
              2. - 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,
              3. - asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,
              4. - asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO3), práškového, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 ± 0,5.

              (b) Substrát pro zkoušku:

              Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.

              Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 °C. Klíčovým kritériem je, že mělá půda musí být vlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu. působ uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.

              (c) Kontrolní substrát:

              Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního činidla.

          1. VIII.1.6.1.2 Nádoby pro zkoušku

            Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.

        1. VIII.1.6.2 Experimentální podmínky

          Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 ± 2 °C se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.

          Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.

        1. VIII.1.6.3 Pracovní postup

          Zkoušené koncentrace

          Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg-1).

          Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací

          Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.

          Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg-1 substrátu pro zkoušku (jako sušina).

          Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.

          Definitivní zkouška

          Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.

          Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC50 a jejích mezí spolehlivosti.

          V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.

          Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8, jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC50.

          Mísení základního substrátu a zkoušené látky

          Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to možné připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašovačem.

          Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).

          K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.

          Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná

          v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině).

          Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.

          Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní.

          Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyšetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.

          Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.

        1. VIII.1.6.4 Organizmy použité ve zkoušce

          Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)

    1. VIII.2 VÝSLEDKY
      1. VIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

        Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.

        Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC50 se udává v mg zkoušené lát ky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).

        V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro vý počet LC50 příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

        Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC50.

    1. VIII.3 ZPRÁVA
      1. VIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:
          1. - prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,
          2. - o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),
          3. - přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,
          4. - přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,
          5. - informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),
          6. - metoda použitá ke stanovení LC50,
          7. - výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,
          8. - popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,
          9. - úhyn v kontrolních zkouškách,
          10. - LC50 nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,
          11. - grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,
          12. - výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo dřívějších zkoušek kontroly jakosti.
    1. VIII.4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.

      (2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and all, London.

      (3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.

      (4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99

      (5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

      (6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag “Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

    PŘÍLOHA

    Chov žížal před zkouškou

    Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení, když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).

    Podmínky chovu

    Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2 °C, nejlépe s neustálým světlem (intenzita 400 - 800 lux).

    Chovné nádoby: vhodné mělké nádoby o objemu 10 až 20 l.

    Substrát: Eisenia foetida je možné chovat v různých zvířecích exkrementech. Jako chovné médium se doporučuje používat směs 50 % obj. rašeliny a 50 % obj.hovězího nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí).

    Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý.

    Vedle výše uvedené metody je možné používat i jiné úspěšné postupy.

  2. Poznámka:

    Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.

  1. IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZAHN-WELLENSOVA ZKOUŠKA – metoda C.9 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IX.1 METODA
      1. IX.1.1 ÚVOD

        Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.

        Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.

        Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.

        Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.

        Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.

        1. Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
          1. — jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
          2. — mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
          3. — neinhibují bakterie,
          4. — jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
          5. — pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.

        Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.

        Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.

      1. IX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:

          1. kde:
            1. DT = rozklad (%) v čase T,
            2. Ca = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1),
            3. CT = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l-1),
            4. CB = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku, (mg.l-1),
            5. CBA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1).

        Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.

        Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.

        Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).

      1. IX.1.3 STANDARDNÍ LÁTKY

        Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.

      1. IX.1.4 PRINCIP METODY

        Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 ° C

        v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.

        V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.

      1. IX.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.

        Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.

      1. IX.1.6 POSTUP ZKOUŠENÍ
        1. IX.1.6.1 Příprava
          1. IX.1.6.1.1 Reagencie

            Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l-1.Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol.l-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu.

            DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
            Kyselina sírová p. a. 50 g.l-1
            Hydroxid sodný p.a.40 g.l-1
            Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:
            Chlorid amonný NH4Cl p.a. 38,5 g
            NaH2PO4 . 2H2O p.a. 33,4 g
            KH2PO4 p.a. 8,5 g
            K2HPO4 p.a. 21,75 g
            Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.
          1. IX.1.6.1.2 Přístroje

            Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.

            Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.

            Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.

            Odstředivka (cca 3 550 g).

            pH-metr.

            Oximetr.

            Papírový filtr.

            Membránový filtrační přístroj.

            Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.

            Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.

          1. IX.1.6.1.3 Příprava inokula

            Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.

            Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).

            Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.

          1. IX.1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky

            Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1

            suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.

            Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.

        1. IX.1.6.2 Pracovní postup

          Kultivační nádoby se inkubují při difusním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1.

          V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.

          Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.

          Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK

          v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.

        2. Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.

          3. Funkční kontrola aktivovaného kalu

          Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.

          Adaptace

          V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.

          Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:

          Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.

          Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.

          Příprava pro analýzu

          Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).

          Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 μm).

          Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.

          CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.

    1. IX.2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY

      Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.

    2. Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
    1. IX.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. IX.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
          1. — počáteční koncentrace látky,
          2. — všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
          3. — koncentrace látky po 3 h,
          4. — inhibiční křivka s popisem,
          5. — datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
          6. — vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
      1. IX.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.

        V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.

        Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.

        Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.

        Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná.

        Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.

        Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených 14C. Jestliže je použita zkoušená látka s 14C, je možné stanovením 14CO2 prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.

        Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.

        Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.

    1. IX.4 LITERATURA

      (1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final

      (2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).

    PŘÍLOHA

    PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

    DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
    Organická látka: 4 - ethoxybenzoová kyselina
    Teoretická koncentrace ve zkoušce: 600 mg.l-1
    Teoretická DOC: 390 mg.l-1
    Inokulum: městská čistírna v......
    Koncentrace: 1 g sušiny.l-1
    Adaptace: bez adaptace
    Analytika: stanovení DOC
    Množství vzorku: 3 ml
    Referenční látka: diethylenglykol
    Toxicita zkoušené látky: žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l-1
    Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích
    DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
    Doba
    zkoušky    		Referenční látkaZkoušená látka
    sl. p.
    mg.l-1    		DOC
    mg.l-1    		DOCn
    mg.l-1    		Rozklad
    %    		DOC
    mg-l-1    		DOCn
    mg.l-1    		Rozklad
    %
    0--300--390-
    3 h4,0298,0294,02371,6367,66
    1 den6,1288,3282,36373,3367,26
    2 dny5,0281,2276,28360,0355,09
    5 dnů6,3270,5264,212193,8187,552
    6 dnů7,4253,3245,918143,9136,565
    7 dnů11,3212,5201,233104,593,276
    8 dnů7,8142,5134,75558,951,187
    9 dnů7,035,028,09118,111,197
    10 dnů18,037,019,09420,02,099
  2. Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.

    3. sl. p. = slepý pokus

    Obrázek 1

    Příklad křivek biologického rozkladu

    Obrázek

    Obrázek 2

    Příklad adaptace kalu

    Obrázek
  1. X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM – metoda C.10 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. X.1 METODA
      1. X.1.1 ÚVOD
        1. X.1.1.1 Obecné poznámky
          1. Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
            1. — jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
            2. — mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
            3. — neinhibují bakterie.

          Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.

        1. X.1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)

          Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg/l.

          Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.

        1. X.1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)

          Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky. (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).

          Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.

          Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

      1. X.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. X.1.2.1 Analýza DOC/CHSK
          1. Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
            DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1a)
            1. DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
            2. T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK,
            3. E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l-1,
            4. Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1.

          Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.

        1. X.1.2.2 Specifická analýza
          1. Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:
            DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1b)
            1. C1 = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou,
            2. C0 = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou.
      1. X.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

      1. X.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

        Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.

        Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.

        DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.

        Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.

        Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).

        Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

      1. X.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

      1. X.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. X.1.6.1 Příprava
          1. X.1.6.1.1 Přístroje
            1. Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:

              Potvrzující zkouška OECD

              Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).

              Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.

              Zařízení s porézní nádobkou

              Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.

              Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.

              Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.

              K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.

          1. X.1.6.1.2 Filtrace

            Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 μm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.

          1. X.1.6.1.3 Odpadní voda

            Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.

            1. Příklad syntetického média:
              1. V 1 l pitné vody se rozpustí:
                DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
                pepton160 mg,
                masový extrakt110 mg,
                močovina30 mg,
                NaCl7 mg,
                CaCl2 . 2 H2O4 mg,
                MgSO4 . 7 H2O2 mg,
                K2HPO428 mg.
            1. Komunální odpadní vody:
              1. Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.
          1. X.1.6.1.4 Zásobní roztok zkoušené látky

            Připraví se např. 1% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.

          1. X.1.6.1.5 Inokulum
          2. Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.

            3. Mohou se používat inokula z různých zdrojů.

            1. Příklady vhodného inokula:
              1. a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod

                Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.

              1. b) Směsné inokulum
                1. Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
                  1. Viz předchozí popis.
                1. Inokulum z půdy:
                  1. 100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                1. Inokulum z povrchové vody:
                  1. Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                  2. Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
            1. c) Inokulum z aktivovaného kalu

              Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.

        1. X.1.6.2 Postup

          Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.

          Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 ° C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.

          1. X.1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu

            Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky

            Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.

            Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.

            Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.

            Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.

            Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h-1 nebo 1/2 l.h-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.

            Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1.

            Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.

            Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.

            Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.

            1. Spřažená zařízení
              1. Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
          1. X.1.6.2.3 Analytika
            1. Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
              1. DOC a CHSK.
                1. Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
              1. Specifická analýza
                1. Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.
    1. X.2 DATA A VYHODNOCENÍ
      1. X.2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ

        Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.

        Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Drc, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.

        DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (2)
        DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (3)

        Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)

        DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (4)
        1. kde:
          1. sDRc = standardní odchylka,
          2. = průměr hodnot DRc,
          3. n = počet stanovení.
        1. Odlehlé hodnoty DRc se eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehlých hodnot Drc:
          1. Výsledek se vyjádří dle (5):
            DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (5)
            1. kde
              1. tn-1; α = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P(P=1-α), kde P = 95% (1).

        Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

        1. Např.
          1. DRc = 98,6 ± 2,3% úbytku DOC,
          2. s = 4,65% úbytku DOC,
          3. n = 18,
          4. x = počet odlehlých hodnot.
      1. X.2.2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
        1. Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:

        Vynášením denně naměřených úbytků do grafu se zdůrazní všechny trendy, např. adaptace.

        1. X.2.2.1 Využití stanovení CHSK/DOC

          Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypočítá procentuální úbytek DR.

          1. Z řady hodnot DR se spočítá jejich průměr a podle rovnice (6) standardní odchylka:
            DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (6)
            1. kde
              1. sDR = standardní odchylka hodnot Dri,
              2. = průměr hodnot Dri,
              3. n = počet stanovení.

          Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR.

          Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7)

          DODATEK Pufrační roztoky Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) Zkoušené koncentrace Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací Definitivní zkouška Mísení základního substrátu a zkoušené látky Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
          (7)
          1. kde
            1. tn-1; α - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95 % (l).

          Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

          1. Např.:
            1. Dr = (98,6 ± 2,3%) úbytku DOC,
            2. s = 4,65% úbytku DOC,
            3. n = 18,
            4. x = počet odlehlých hodnot.
        1. X.2.2.2 Použití výsledků specifické analýzy

          Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) v % se počítá podle 1. 2. 2.

    1. X.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. X.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:
          1. — provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;
          2. — druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);
          3. — způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;
          4. — druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;
          5. — druh inokula, datum a místo odběru;
          6. — popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;