Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.

Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně-chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.

K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.

Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce).

Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):

Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.

(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).

(3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.

(4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.

(5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.

(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.

1. XI.1 METODA
   1. XI.1.1 ÚVOD

      Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.

      Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.

      Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.

      Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.

      Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.

      U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC₅₀.

      Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,

      1. Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
         1. — rozpustnost ve vodě,
         2. — tlak par,
         3. — strukturní vzorec,
         4. — čistota zkoušené látky.
      1. Doporučení:
         1. Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.
   1. XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

      Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O₂ na 1 mg kalu za hodinu.

      1. Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:
         1. kde:
            1. R_s = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,
            2. Rc₁ = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1,
            3. Rc₂ = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.
            4. EC₅₀ v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.
   1. XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

      Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC₅₀ u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

   1. XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

      Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC₅₀ se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

   1. XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY
      1. Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
         1. — respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
         2. — EC₅₀ (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l^-1.
   1. XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
      1. XI.1.6.1 Činidla
         1. XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky

            Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l^-1.

         1. XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky

            Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H₂SO₄ do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H₂SO₄) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

         1. XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
            1. Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
               1. — 16 g peptonu,
               2. — 11 g masového extraktu,
               3. — 3 g močoviny,
               4. — 0,7 g NaCl,
               5. — 0,4 g CaCl₂.2H₂O,
               6. — 0,2 g MgSO₄.7H₂O,
               7. — 2,8 g K₂HPO₄.
         2. Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
         3. Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat

         v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

      1. XI.1.6.2 Aparatura

         Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.

         1. Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
            1. — měřicí přístroje,
            2. — provzdušňovací zařízení,
            3. — měřič pH a monitorovací zařízení,
            4. — kyslíková elektroda.
      1. XI.1.6.3 Příprava inokula

         Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.

         Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.

         Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).

         Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal

         v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l^-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l^-1.

         Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.

         Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

      1. XI.1.6.4 Provedení zkoušky

         PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

         Trvání/doba kontaktu:	30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
         Voda:	Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
         Přívod vzduchu:	Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
         Měřicí aparatura:	Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
         Měřič obsahu kyslíku:	Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
         Živný roztok:	Syntetická odpadní voda (viz výše).
         Zkoušená látka:	Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
         Referenční látka:	např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
         Kontrolní zkouška:	Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
         Teplota:	20 ± 2 °C

         1. Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:

            Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).

            Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.

            V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C₁).

            Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l^-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l^-1.

            V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.

            Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.

            Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.

            Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.

            Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).

            Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

1. XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

   Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l^-1 a 2,5 mg.l^-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.

   Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC₅₀ (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l^-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.

   Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC₅₀.

   Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC₅₀ 95% meze spolehlivosti.

1. XI.3 ZPRÁVA
   1. XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
      1. Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
         1. — zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
         2. — systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
         3. — experimentální podmínky:
            1. – pH reakční směsi před měřením respirace,
            2. – teplota při zkoušce,
            3. – ba trvání zkoušky,
            4. – referenční látka a její změřená EC₅₀,
            5. – abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
         1. — výsledky:
            1. – veškeré naměřené hodnoty,
            2. – křivka inhibice a metoda výpočtu EC₅₀,
            3. – EC₅₀ a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC₂₀ a EC₈₀,
            4. – veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.
   1. XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      Hodnotu EC₅₀ je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

1. XI.4 LITERATURA

   (1) International Standard ISO 8192-1986.

   (2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

   (3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

   (4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

   (5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

   (6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

   (7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

1. XII.1 METODA
   1. XII.1.1 ÚVOD

      Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 °C. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)

      Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.

      V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.

      Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)

      V této metodě se používá k hodnocení výsledné biologické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl C_celk. - C_anorg.

      Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury).

      1. Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:
         1. — jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),
         2. — mají zanedbatelnou tenzi par,
         3. — nepůsobí inhibičně na bakterie,
         4. — významně se neadsorbují ve zkušebním systému,
         5. — neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.

      Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.

      Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku

      Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.

   1. XII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

      C_T = koncentrace zkoušené látky na začátku provzdušňovací periody, vyjádřená jako množství organického uhlíku přítomného nebo přidaného k usazené odpadní vodě (mg.l^-1),

      C_t = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l^-1),

      C_c= koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l^-1).

      Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku.

      1. Biologický rozklad je možné vyjádřit jako:
         1. 1. Procentický úbytek D_da množství denně přidávané látky:

            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

            (1)

            1. kde D_ds = rozklad/denní přídavek
         1. 2. Procentický úbytek D_ssd množství látky přítomného na začátku každého dne:

            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

            (2a))

            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

            (2b))

            1. kde D_red = rozklad/denní přídavek;
            2. indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.

      Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.

   1. XII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
   2. XII.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

      Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin. Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.

      Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.

      Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.

      Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).

   1. XII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

      Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)

      Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.

   1. XII.1.6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU
      1. XII.1.6.1 Příprava

         Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.

         Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.

         Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l^-1 jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l^-1 uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.

         Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.

         Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.

      1. XII.1.6.2 Experimentální podmínky

         Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 °C. Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l^-1 suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.

      1. XII.1.6.3 Provedení zkoušky

         Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.

         Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.

         Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l^-1). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.

         Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.

         Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.

         V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 µm membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 °C.

         Doba trvání zkoušky pro látky, u kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.

1. XII.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

   Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.

   Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (D_da nebo D_red, viz 1. 2).

1. XII.3 ZPRÁVA
   1. XII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
      1. Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
         1. — veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,
         2. — teplotu,
         3. — křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),
         4. — datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,
         5. — vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,
         6. — podpis a datum.
   1. XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.

      Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.

      Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).

      Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.

      Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

      Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené ¹⁴C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem ¹⁴C se zachycením ¹⁴CO₂ potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.

      Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.

      Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

1. XII.4 LITERATURA

   (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

PŘÍLOHA 2

Příklad zkušební aparatury

1. XIII.1 METODA

   Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).

   1. XIII.1.1 Úvod

      V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou-li splněna kritéria validace.

      V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log P_ov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log P_ov > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCF_ss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log P_ov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k₁), rychlostní konstanta vylučování (k₂) a BCF_ss.

      Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.

      V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.

   1. XIII.1.2 Definice a jednotky

      Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.

      Bioakumulační faktor (BCF nebo K_B) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (C_f v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (C_w v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.

      Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCF_SS nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.

      Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (C_f) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy C_f vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.

      Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k₁/k₂) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCF_k).

      Rozdělovací koeficient oktanol-voda (P_ov) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako K_ow. Logaritmus hodnoty P_ov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.

      Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.

      Rychlostní konstanta příjmu (k₁) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k₁ se vyjadřuje ve jednotce den^-1).

      Po-expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).

      Rychlostní konstanta vylučování (k₂) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k₂ se vyjadřuje ve jednotce den^-1).

   1. XIII.1.3 Princip zkušební metody

      Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po-expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.

      Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCF_ss), tj. poměr koncentrace v rybách (C_f) a ve vodě (C_w) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCF_k), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k₁) a vylučování (k₂) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).

      Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.

      Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log P_ov ^> 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.

      Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.

   1. XIII.1.4 Informace o zkušební látce
      1. Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:
         1. a) rozpustnost ve vodě,
         2. b) rozdělovací koeficient oktanol-voda P_ov (označovaný také jako K_ow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),
         3. c) hydrolýza,
         4. d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),
         5. e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log P_ov),
         6. f) tlak par,
         7. g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.

      Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC₅₀ (tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkušební látka značená ¹⁴C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.

   1. XIII.1.5 Platnost zkoušky
      1. Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:
         1. — kolísání teploty je menší než ±2 °C,
         2. — koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,
         3. — koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,
         4. — mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.
   1. c1.6 Referenční sloučeniny

      Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.

   1. XIII.1.7 Popis zkušební metody
      1. XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky

         V případě všech částí zařízení je třeba se důsledně vyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potřebné silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.

      1. XIII.1.7.2 Voda

         Ve zkoušce se používá přírodní voda a měla by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuštěných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladkovodní a mořské vody.

         Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ±0,5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkušební látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO₄), pesticidů (např. celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by měl být proveden každé tři měsíce, je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

         Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkušební látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha II). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkušební látky a z rozpouštědla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %).

      1. XIII.1.7.3 Zkušební roztoky

         Zásobní roztok zkušební látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkušební látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; může však být v některých případech nezbytné pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkušební látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98%).

         Pro průtokové zkoušky je pro zajištění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ředí zásobní roztok zkušební látky (např. dávkovací čerpadlo, proporcionální dávkovač, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semi-statická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.

      1. XIII.1.7.4 Výběr druhů

         Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze II. Mohou být použity jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

      1. XIII.1.7.5 Chov ryb

         Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.

         1. Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se následující kritéria:
            1. — úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
            2. — úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů;
            3. — úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá násada se vymění.

         Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny nemoci u ryb.

   1. XIII.1.8 Provedení zkoušky
      1. XIII.1.8.1 Předběžná zkouška

         Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.

      1. XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu

         Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol-voda pro zkušební látku (viz příloha 3).

         Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.

         1. XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování

            Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.

         1. XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb

            Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.

            Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.

            V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.

         1. XIII.1.8.2.4 Násada

            Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace C_w způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.

            Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.

         1. XIII.1.8.2.5 Krmení

            Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.

            Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1).

            Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.

         1. XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota

            Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.

         1. XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace

            Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC₅₀ a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC₅₀ příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC₅₀ nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené ¹⁴C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.

            Je-li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek.

         1. XIII.1.8.2.8 Kontroly

            Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.

      1. XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody

         V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.

      1. XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody
         1. XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody

            Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.

            Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.

            Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty P_ov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.

            V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.

         1. XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků

            Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log P_ov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.

            Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.

            Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.

            Nedojde-li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.

         1. XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody

            Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.

            Hodnoty C_w a C_f se podle potřeby korigují podle výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).

         1. XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb

            Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou-li produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.

            Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).