Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Jako anodický roztok se použije anolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R a jako katodický roztok se použije katolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R. Prefokusace probíhá 1 h při konstantním výkonu 10 W s nastaveným nejvyšším napětím 2000 V a proudem 100 mA.

Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Fokusace pokračuje za stejných podmínek dalších 30 min. Gel se vyjme z fokusační komory a umístí se do 200 ml roztoku obsahujícího kyselinu sulfosalicylovou R (35 g/l) a kyselinu trichloroctovou R (100 g/l) v odbarvovacím roztoku RS. Za mírného pohybu se odbarvuje 30 min při pokojové teplotě. Roztok se odstraní a přidá se opět 200 ml odbarvovacího roztoku RS. Za pohybu se odbarvuje 1 h a pak se gel vysuší a přidá se 200 ml barvicího roztoku modři kyselé RS, nechá se stát 30 min a pak se odbarvuje pasivní difúzí v odbarvovacím roztoku RS, dokud nejsou dobře zřetelné zóny na čirém pozadí.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramú; porovnávacího roztoku (b) odpovídá požadavkům výrobce na kalibraci izoelektrického bodu a elektroforeogram porovnávacího roztoku (a) odpovídá referenčnímu elektroforeogramú Ph. Eur. izoforem erytropoetinu. Je-li to nutné, nastavování a trvání napětí se může měnit tak, aby došlo k optimálnímu rozdělení izoforem. Identifikují se zóny odpovídající izoformám 2 až 7.

Rozsah pH pásů na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Hlavní zóny odpovídají izoformám 4, 5 a 6. Slabší zóny odpovídající izoformám 2, 3 a 7 mohou být též přítomny. Jiné zóny mohou být přítomny ve stopovém množství.

1. C. Provede se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2.2.31) a imunoblot (2.7.1).

   Zkouška se provede na polyakrylamidovém gelu o síle 0,75 mm a ploše asi 16 cm². Rámeček na gel se složí podle návodu výrobce.

   Separační gel. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 8,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 5 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,8 (1,5 mol/l), 6,6 ml vody R a 0,2 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 8 μl tetramethylethylendiaminu R a 0,2 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

   Separační gel se nanese do sestaveného zařízení a nechá se dostatečný prostor pro zaostřovací gel. Gelový roztok se překryje 2-propanolem R a nechá se zpolymerovat.

   Zaostřovací gel V lahvi s postranním tubusem se smíchá 1,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 0,75 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 6,8 (1 mol/l), 4,1 ml vody R a 0,06 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 6 pl tetramethyle- thylendiaminu R a 0,06 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

   2-propanol R se odstraní ze zpolymerovaného separačního gelu a na separační gel se naleje roztok zaostřovacího gelu. Dobře se uzavře a nechá se polymerovat.

   Roztok pro vzorky. Smíchají se stejné objemové díly SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS a vody R.

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí ve vodě R tak, aby výsledná koncentrace byla 1,0 mg/ml. K jednomu objemovému dílu tohoto roztoku se přidá stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.

   Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky. Porovnávací roztok (a). Obsah jedné ampule erytropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Přidá se stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.

   Porovnávací roztok (b). K 0,1 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky.

   Porovnávací roztok (c). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD do 70 kD.

   Porovnávací roztok (d). Použije se roztok předbarvených standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD až 70 kD a vhodných pro přenos elektronů na vhodnou membránu.

   Připravený gel se vloží do přístroje a přidá se přiměřený objem SDS-PAGE elektrodového roztoku RS. Zkoušené a porovnávací roztoky uchovávané v dobře uzavřených zkumavkách se na 2 min vloží do vroucí vodní lázně. Po 20 jíl každého roztoku se nanese do jamek zaostřovacího gelu v následujícím pořadí: porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a), zkoušený roztok (a), prázdná jamka, porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b), porovnávací roztok (d).

   Elektroforéza probíhá za podmínek doporučených výrobcem zařízení. Na konci separace se vyjme rámeček a gel se rozdělí na dvě části. První část obsahuje porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a) a zkoušený roztok (a); druhá část obsahuje porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b) a porovnávací roztok (d).

   První část gelu se umístí do barvicího roztoku modři kyselé RS a pohybuje se jim 1 h. Pak se gel přenese do odbarvovacího roztoku RS a nechá se v něm odbarvovat za pohybu, dokud nejsou zřetelně viditelné zóny bílkoviny na čirém pozadí. Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardů molekulových hmotností jsou rozděleny do zřetelně oddělených zón, s přibližně

   lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti. Elektroforeogram zkoušeného roztoku (a) ukazuje jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou jediné zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

   Druhá část gelu se vloží na membránu, která slouží k imobilizaci bílkovin, použije se komerčně dostupné zařízení pro elektroblot a postupuje se podle návodu výrobce. Po elektroblotu se membrána inkubuje 1 h až 2 h v neutrálním izotonickém tlumivém roztoku obsahujícím vhodné srážecí činidlo, např. sušené mléko (50 g/l) nebo fetální telecí sérum 10% (V/V), a poté následuje inkubace 1 h až 14 h ve stejném srážecím roztoku s vhodně naředěnou polyklonální nebo monoklonální anti-erytropoetinovou protilátkou. Erytropoetin vázaný na protilátku se deteguje za použití vhodné protilátky značené enzymem nebo radioaktivně vázaným zkoumadlem (např. alkalická fosfatasa konjugovaná s druhou protilátkou). Přesné detaily o srážecích činidlech, koncentracích a inkubačních dobách by se měly optimalizovat za použití základních údajů popsaných v Imunochemických metodách (2.7.1).

   Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) rozděleny zóny standardů molekulových hmotností do přesných zón, s přibližně lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti.

   Elektroforeogram zkoušeného roztoku (b) tvoří jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b).

1. D. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trisacetatovým o pH 8,5 na koncentraci 1,0mg/ml. Rovnováha roztoku se upraví za použití tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 vhodným postupem (např. dialýza do tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 nebo membránová filtrace, která je popsána v odstavci Zkoušky totožnosti B, ale odsolený vzorek se rozpustí v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5). Dialyzovaný roztok se převede do polypropylenové zkumavky na odstřeďování. 5 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) ve vodě R se přidá k 0,25 ml zkoušeného roztoku. Zkumavka se uzavře a vloží se na 18 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se vzorek vyjme z vodní lázně a reakce se ihned přeruší zmrazením.

   Porovnávací roztok. Obsah jedné ampule erythropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Dále se tento roztok zpracovává současně stejnými postupy a za stejných podmínek jako zkoušený roztok.

   Oba enzymaticky štěpené roztoky se zkouší kapalinovou chromatografií (2.2.29). Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (5 Jim až 10 (μm),
   2. - mobilních fází:
      1. - mobilní fáze A - roztok kyseliny trifluoroctové R 0,06 % (V/V),
      2. - mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 0,6 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
   1. - elučních podmínek, které jsou uvedeny v následující tabulce (je-li nutné, gradient může být změněn, aby se zlepšilo rozdělení hydrolyzátu):

      Čas (min)	Průtoková rychlost (ml/min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
      0 - 10	0,75	100	0	izokraticky
      10 - 125	0,75	100 → 39	0 → 61	lineární gradient
      125 - 135	1,25	39 → 17	31 → 83	lineární gradient
      135 - 145	1,25	17 → 0	83 → 100	lineární gradient
      145 - 150	1,25	100	0	ustalování

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje za počátečních podmínek. Provede se slepá zkouška za výše zmíněného gradientu.

   Nastříkne se 50 μ zkoušeného roztoku a 50 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného erythropoetinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. E. Provede se N-terminální sekvenční analýza.

   Provede se Edmanovo odbourávání za použití automatického sekvetátoru v pevné fázi v souladu s návodem výrobce.

   Odsolí se množství odpovídající 50 μg erytropoetinu, např. zředí se takový objemový díl zkoušeného přípravku odpovídající 50 μg účinné látky v 1 ml roztoku kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V). Nejdříve se promyje preparativní kolona C18 reverzní fází podle doporučení výrobce a ustálí se v kyselině trifluoroctové R 0,1% (V/V). Přidá se vzorek na kolonu a promývá se postupně řadou směsí kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V) s acetonitrilem R (0% (V/V), 10% (V/V) a 50% (V/V)) podle doporučení výrobce. 50% acetonitrilový eluát se lyofilizuje.

   Odsolený vzorek se opět rozpustí v 50 μl kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V) a převede se do dělicí kolony podle návodu výrobce. Nechá se probíhat 15 cyklů rozdělování, při druhém a třetím cyklu se použijí reakční podmínky pro prolin.

   Při každém rozdělovacím cyklu se provede zkouška totožnosti aminokyselin uvolněných fenylthiohydantoinem (dále PTH-aminokyselin) reverzně fázovou kapalinovou chromatografií. Postup může být proveden za použití kolon a zkoumadel doporučených výrobcem zařízení na separaci PTH-aminokyselin.

   Separační postup by měl být kalibrován za použití:

   1. - směsi PTH-aminokyselin dodávaných výrobcem za podmínek gradientu nastavených, jak je uvedeno, k optimálnímu rozlišení všech aminokyselin,
   2. - vzorku získaného ze slepého separačního cyklu podle doporučení výrobce zařízení.

   Prvních 15 aminokyselin je:

   1. alanin - prolin - prolin - arginin - leucin - isoleucin - (nereprodukovatelný pík) - kyselina asparagová - serin - arginin - valin - leucin - kyselina glutamová - arginin - tyrosin.

Zkoušky na čistotu

Bílkoviny. Stanoví se absorpční spektrofotometru v ultrafialové oblasti (2.2.25).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (4 g/l) na výslednou koncentraci 1 mg/ml.

Měří se absorbance při 250 nm až 400 nm. Roztok vykazuje absorpční maximum při 276 nm až 280 nm. Pro korekci možného rozptylu světla se měří zákal při 400 nm. Koncentrace erytropoetinu se vypočítá s použitím specifické absorbance, jejíž hodnota je 7,43. Koncentrace erytropoetinu je 80 % až 120 % deklarované koncentrace.

Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází na koncentraci 0,2 mg/ml.

Porovnávací roztok. K 0,02 ml zkoušeného roztoku se přidá 0,98 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydro- filním pro c hro máto g rafii R, jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin o molekulové hmotnosti 20 000 až 200 000,
2. - mobilní fáze připravené následujícím způsobem: 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 23,4 g chloridu sodného R se rozpustí v 11 vody R [dihydrogenfosforečnan draselný (1,5mmol/l), hydrogenfosforečnan sodný (8,1 mmol/l), chlorid sodný (0,4 mol/l), pH 7,4], je-li nutno, pH se upraví na hodnotu 7,4; průtoková rychlost je 0,5 ml/min
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Chromatogram se zaznamenává nejméně 1 h. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluováných před hlavním píkem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku je 1,5 % až 2,5 % plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku.

Kyselina sialová.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností, na koncentraci 0,3 mg/ml.

Zkoušený roztok (b). K 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,5 ml mobilní fáze, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností.

Porovnávací roztok (a). Vhodné množství kyseliny sialové R se rozpustí ve vodě R na koncentraci 0,1 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). K 0,8 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,2 ml vody R.

Porovnávací roztok (c). K 0,6 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,4 ml vody R.

Porovnávací roztok (d). K 0,4 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,6 ml vody R.

Porovnávací roztok (e). K 0,2 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,8 ml vody R.

Porovnávací roztok (f). Použije se voda R.

Provede se trojí stanovení. Převede se 100 μl každého zkoušeného a porovnávacího roztoku do 10ml skleněných zkumavek. Do každé zkumavky se přidá 1,0 ml zkoumadla resorcinolového R. Zkumavky se uzavřou a nechají se 30 min při teplotě 100 °C. Po ochlazení ledem se do každé zkumavky přidají 2,0 ml směsi objemových dílů butanolu R a octanu butylnatého R (12 + 48). Intenzivně se promíchá a nechají se oddělit dvě fáze. Pokud je horní fáze zcela čirá, opatrně se oddělí spodní fáze a odstraní se. Měří se absorbance (2.2.25) všech roztoků při 580 nm. Z kalibrační křivky vytvořené porovnávacími roztoky se stanoví obsah kyseliny sialové v obou zkoušených roztocích a vypočítá se průměrná hodnota. Při výpočtu počtu molů kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu se bere v úvahu, že:

1. - molekulová hmotnost erytropoetinu je 30 600,
2. - molekulová hmotnost kyseliny sialové je 309.

Zkoušený přípravek obsahuje nejméně 10 mol kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže jednotlivé stanovení je v rozsahu ±10 % a pokud hodnota porovnávacího roztoku (a) je 1,5násobek až 2,5násobek zkoušeného roztoku (a).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 20 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 100 000 m.j. erytropoetinu.

Stanovení účinnosti

Účinnost přípravku se porovnává s účinností erytropoetinu BRP a vyjadřuje se v mezinárodních jednotkách (m.j.).

Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Meze spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) jsou 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Stanovení účinnosti se provede metodou A nebo B.

1. A. Na polycytémických myších

   Účinnost přípravku se stanoví v daných podmínkách hodnocením jeho působení na stimulaci příjmu ⁵⁹Fe červených krvinek myší, které byly vystaveny sníženému atmosférickému tlaku a staly se polycytémickými.

   Následující plán, užívající podtlakovou komoru, se ukázal být vhodným.

   Polycytémie se vyvolá u samic myší stejného kmene a hmotnosti 16 g až 18 g. Samice myší se umístí do podtlakové komory o tlaku 0,6 atm. Po 3 dnech při 0,6 atm se tlak sníží na 0,4 atm až 0,5 atm, při kterém se zvířata nechají dalších 11 dní. (Částečné vakuum je denně přerušeno na maximálně 1 h okolo 11.00 h k zajištění úklidu klecí a potravy pro zvířata.) Po skončení tohoto specifického období se myši vrátí do normálních atmosférických podmínek. Namátkově se rozdělí do klecí po šesti zvířatech a označí se.

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.

   Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.

   Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (c) Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Radioaktivně značený roztok chloridu železitého (koncentrovaný) ⁵⁹Fe. Použije se vyráběný ⁵⁹Fe-chlorid železitý (o specifické aktivitě 100 MBq až 1000 MBq na miligram Fe).

   Radioaktivně značený roztok chloridu železitého ⁵⁹Fe. Radioaktivně značený koncentrovaný roztok chloridu železitého se zředí tlumivým roztokem citronanovým o pH 7,8 na aktivitu 3,7 x 10⁴Bq/ml.

   Koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.

   Tři dny po návratu zvířat do atmosférického tlaku se každému zvířeti podkožně vstříkne 0,2 ml jednoho roztoku. Ze šesti zvířat v každé kleci se každému zvířeti podá jeden ze šesti různých roztoků (3 zkoušené roztoky a 3 porovnávací roztoky) a pořadí injekcí by mělo být pro každou klec náhodně určeno. Nejméně se doporučuje n = osm (osm klecí).

   Dva dny po injekci zkoušeného nebo porovnávacího roztoku se každému zvířeti intraperitonálně vstříkne 0,2 ml radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého ⁵⁹Fe. Pořadí injekcí je stejné jako při podání erytropoetinu a doba mezi podáním erytropoetinu a radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého je pro každé zvíře stejná.

   Za dalších 48 h se každé zvíře uspí injekcí vhodného anestetika, zaznamená se tělesná hmotnost a z rozvětvení aorty se odeberou vzorky krve (0,65 ml) do hematokritových kapilár. Po určení objemu sražených buněk se změří radioaktivita každého vzorku.

   Pro každou myš se vypočítá odezva (% ⁵⁹Fe v celkovém krevním oběhu) podle vztahu:

   v němž značí:

   1. A_s - radioaktivitu vzorku,
   2. A_t - celkovou podanou aktivitu,
   3. 7,5 - celkový objem krve v procentech tělesné hmotnosti,
   4. M - tělesnou hmotnost v gramech,
   5. V_s - objem vzorku.

   Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami vhodnými pro model rovnoběžnosti. Z výpočtu se vyloučí zvíře, jehož objem sražených buněk je méně než 54 % nebo tělesná hmotnost je více než 24 g.

1. B. Na normocytémických myších

   Zkouška je založena na měření stimulace tvorby retikulocytů u normocytémických myší. Zkouška se může provést následujícím postupem:

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem fosforečnan-albuminovým o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.

   Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.

   Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Přesné koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.

   Na začátku zkoušení se náhodně rozdělí myši vhodného věku a kmene (jsou vhodné 8 týdnů staré myši B6D2F1) do šesti klecí. Doporučuje se nejméně n = 8 (počet myší v kleci). Každému zvířeti se podkožně vstříkne 0,5 ml příslušného roztoku (1 roztok na klec) a zvíře se umístí v nové kleci. Myši se střídají tak, aby každá klec obsahovala šest myší, z nichž každé byl podán jiný roztok (tj. jeden ze tří zkoušených nebo tří porovnávacích roztoků).

   Za 4 dny po injekci se odeberou vzorky krve zvířat a stanoví se počet retikulocytů vhodným způsobem. Může se použít následující metoda:

   Objem krve, postup ředění a fluorescenční látka mohou být změněny k dosažení maximální a stabilní fluorescence.

   Barvicí roztok (koncentrovaný). Použije se roztok thiazolové oranže vhodné pro stanovení retikulocytů. Připraví se dvojnásobná koncentrace, než je třeba pro analýzu.

   Provádí se následující ředění. Plná krev se 500krát zředí tlumivým roztokem použitým k přípravě barvicího roztoku. Tento roztok se koncentrovaným barvicím roztokem zředí na dvojnásobný objem. Po 3 min až 10 min barvení se stanoví mikrofluorimetricky počet retikulocytů v průtokovém cytometru. Procento retikulocytů se určí použitím biparametrického histogramu: počet buněk a červená fluorescence F1 (620 nm).

   Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.

Uchovávání

Uchovává se ve vzduchotěsných obalech při teplotě pod –20 °C. Je třeba se vyvarovat opakovaného zmrazení a rozmražení.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - obsah erytropoetinu v miligramech na mililitr,
2. - účinnost v mezinárodních jednotkách na mililitr,
3. - název a koncentrace pomocných látek.

†† Estriolum

Estriol

Je to 1,3,5(10)-estratrien-3,16a,17p-triol. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0% až 103,0 % sloučeniny C₁₈H₂₄O₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96%.

Taje při asi 282 °C.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem estriolu CRL.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 10 mg estriolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 mg estradiolu hemihydrátu CRL se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 5 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů lihu 96% R a toluenu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a potom se postříká kyselinou sírovou v lihu RS. Deska se pak při 100 °C zahřívá 10 min nebo do objevení skvrn. Po ochlazení se pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se při pozorování v denním světle shoduje polohou, barvou a velikostí a při pozorování v ultrafialovém světle při 365 nm fluorescencí a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +60° až +65°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 80 mg v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Směs rozpouštědel. Směs objemových dílů 2-propanolu R1 a heptanu R (20 + 80).

Zkoušený roztok. 20,0 mg se rozpustí v 5 ml 2-propanolu R1 a zředí se směsí rozpouštědel na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 5 mg estriolu CRL a 2,0 mg estriolu nečistoty A CRL se rozpustí v 5 ml 2-propanolu R1 a zředí se směsí rozpouštědel na 10 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí rozpouštědel na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí rozpouštědel na 10,0 ml.

1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí rozpouštědel na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,0 mm naplněné silikagelem pro chromatografie diolem R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,2 ml/min:
   1. - mobilní fáze A - heptan R,
   2. - mobilní fáze B - 2-propanol Rl.

1. - gradientového programu za použití následujících podmínek:

   Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označování †† Estriolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   0 - 10	95 → 88	5 → 12	lineární gradient
   10 - 20	88	12	izokraticky
   20 - 30	88 → 95	12 → 5	přepnutí na původní podmínky
   30 - 35	95	5	ustavení rovnováhy
   35 = 0	95	5	začátek dalšího chromatogramu

1. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se ustaluje 20% směsí 2-propanolu R1 v heptanu R, dokud se nezíská stabilní základní linie.

Nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) při nástřiku 20 μl byla asi 25 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: estriolu asi 19 min a estriolu nečistoty A asi 21 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem estriolu a píkem estriolu nečistoty A je nejméně 2,2. Jestliže se retenční časy zvyšují nebo rozlišení klesá, promyje se kolona nejprve acetonem R a potom heptanem R.

Nastříkne se odděleně 20 μl směsi rozpouštědel jako slepá zkouška, 20 μl zkoušeného roztoku, 20 μl porovnávacího roztoku (a) a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha píku estriolu nečistoty A není větší než polovina plochy píku estriolu nečistoty A na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %) a plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku odpovídajícího estriolu nečistotě A, není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Nepřihlíží se k pikům odpovídajícím slepé zkoušce a pikům s plochou menší, než je 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší 3 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

25,0 mg se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 50,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 50,0 ml. Změří se absorbance (2.2.25) v maximu při 281 nm. Vypočítá se obsah C₁₈H₂₄O₃. Specifický absorpční koeficient je 72,5.

Uchovávání

Venenum.

Nečistoty

1. A. 9,11-didehydroestriol,

1. B. estron,

1. C. 3-methylether estradiolu,

1. D. R¹ = R² = R³ = H, R⁴=OH: estradiol,
2. E. R¹ = R³ = OH, R²= R⁴=H: 17-epi-estriol,
3. F. R¹ = R³= H, R² = R⁴ = OH: 16-epi-estriol,
4. G. R¹ = R⁴ = H, R² = R³ = OH: 16,17-epi-estriol.

† Etamsylatum

Etamsylat

Je to diethylamonium-2,5-dihydroxybenzensulfonat. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₀H₁₇NO₅S.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu, dobře rozpustný v ethanolu a prakticky nerozpustný v dichlormethanu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.74) je 127 °C až 134 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety etamsylatu CRL.
3. C. 0,100 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 200,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. Měří se ihned absorbance roztoku (2.2.25) při 210 nm až 350 nm; roztok vykazuje dvě absorpční maxima, při 221 nm a 301 nm. Specifická absorbance v maximu při 301 nm je 145 až 151.
4. D. K 2 ml čerstvě připraveného roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se ve zkumavce přidá 0,5 g hydroxidu sodného R. Směs se zahřívá a k otevřenému konci zkumavky se umístí navlhčený proužek papíru lakmusového červeného R; zbarvení papíru se změní na modré.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 10,0 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 100 ml.

Vzhled roztoku. Čerstvě připravený roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II). Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 5,6; měří se roztok S.

Hydrochinon. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok. 2,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok. 10 mg hydrochinonu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku, při nanášení se skvrny na startu suší proudem chladného vzduchu. Vyvíjí se směsí objemových dílů dichlormethanu R, methylacetatu R a ethylacetatu R (20 + 30 + 50) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší proudem horkého vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Skvrna odpovídající hydrochinonu na chromatogramu zkoušeného roztoku není intenzivnější než hlavní skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,1 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (15 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Železo (2.4.9). 10 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší ve vakuové sušárně při 60 °C.

Síranový popel (2.4.14), Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,200 g se rozpustí ve směsi 10 ml vody R a 40 ml kyseliny sírové zředěné RS a titruje se síranem ceričitým 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1,0 ml síranu ceričitého 0,1 mol/l VS odpovídá 13,16 mg C₁₀H₁₇NO₅S.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 1,4-benzendiol (hydrochinon).

Ethanolum 96% (V/V)

Ethanol 96% (V/V)

Synonyma. Spiritus 96% (V/V), líh 96% (V/V)

Obsahuje 95,1 % (V/V) až 96,9 % (V/V) (odpovídá 92,6 % (m/m) až 95,2 % (m/m)) sloučeniny C₂H₆O při 20 °C a vodu.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá těkavá snadno zápalná kapalina. Je hygroskopický, mísitelný s vodou a dichlormethanem. Hoří modrým bezdýmým plamenem.

Teplota varu je asi 78 °C.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Relativní hustota, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. bezvodého ethanolu.
3. C. Ve zkumavce se smíchá 0,1 ml s 1 ml roztoku manganistanu draselného R (10 g/l) a s 0,2 ml kyseliny sírové zředěné RS. Ihned se přikryje filtračním papírem navlhčeným čerstvě připraveným roztokem obsahujícím 0,1 g nitroprussidu sodného R a0,5g piperazinu hexahydrátu R v 5 ml vody R. Po několika minutách se na papíře objeví intenzivně modré zbarvení, které zbledne po 10 min až 15 min.
4. D. K 0,5 ml se přidá 5 ml vody R, 2 ml hydroxidu sodného zředěného RS a potom pomalu 2 ml jodu 0,05 mol/l RS; během 30 min se vytvoří žlutá sraženina.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a bezbarvá (2.2.2, Metoda II) v porovnání s vodou R. 1,0 ml se zředí vodou R na 20 ml; po 5 min zůstává roztok čirý v porovnání s vodou R (2.2.1).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. K 20 ml se přidá 20 ml vody prosté oxidu uhličitého R a 0,1 ml fenolftaleinu RS; roztok je bezbarvý. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; roztok je růžový (30 μg/ml, vyjádřeno jako kyselina octová).

Relativní hustota (2.2.5). 0,8051 až 0,8124.

Absorbance. Měří se absorbance zkoušené látky při 235 nm až 340 nm (2.2.25) v5cmkyvetě za použití vody R jako kontrolní tekutiny. Při 240 nm je absorbance nejvýše 0,40, při 250 nm až 260 nm je nejvýše 0,30 a při 270 nm až 340 nm je nejvýše 0,10. Absorpční křivka má hladký průběh.

Těkavé nečistoty. Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok (a). Použije se zkoušená látka.

Zkoušený roztok (b). K 500,0 ml zkoušené látky se přidá 150 μl 4-methyl-2-pentanolu R. Porovnávací roztok (a). 100 μl methanolu bezvodého R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 50 μl methanolu bezvodého R a 50 μl acetaldehydu R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 150 μl acetalu R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 100 μl benzenu R se zředí zkoušenou látkou na 100,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřními stěnami pokrytými póly [(feny l)(kyanopropyl)] [dimethyl] siloxanem R (tloušťka filmu 1,8 μm),
2. - helia pro chromátografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru,

   s následujícím programem:

   Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označování †† Estriolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etamsylatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 96% (V/V) Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   	Čas (min)	Teplota (°C)	Rychlost (°C/min)	Poznámka
   Kolona	0 - 12	40		izotermicky
   	12 - 32	40 → 240	10	lineární gradient
   	32 - 42	240		izotermicky
   Nástřikový prostor		280
   Detektor		280

Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost systému tak, aby výšky dvou píku eluujících před hlavním píkem (acetaldehyd, methanol) byly nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi prvním píkem (acetaldehyd) a druhým píkem (methanol) je nejméně 2,0. Je-li třeba, sníží se počáteční teplota kolony.

Nastříkne se po 1 μl každého roztoku. Plocha píku odpovídajícího methanolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) není větší než polovina plochy odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (200 μl/ml).

Vypočte se součet obsahů acetaldehydu a acetalu (μl/ml) z ploch odpovídajících píků na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) podle vztahu:

v němž značí:

1. A_E - plochu píku acetaldehydu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
2. A_T - plochu píku acetaldehydu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
3. C_E - plochu píku acetalu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
4. C_T - plochu píku acetalu na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).

Součet obsahů acetaldehydu a acetalu je nejvýše 10 μl /ml, vyjádřeno jako acetaldehyd.

Vypočte se obsah benzenu (μl/ml) z plochy odpovídajícího píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) podle vztahu:

v němž značí:

1. B_E - plochu píku benzenu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
2. B_T - plochu píku benzenu na chromatogramu porovnávacího roztoku (d).

Je-li třeba, totožnost benzenu může být potvrzena užitím jiného vhodného chromatografického systému (stacionární fáze s odlišnou polaritou).

Obsah benzenu je nejvýše 2 μl/ml.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píků odpovídajících methanolu, acetaldehydu, acetalu a benzenu, není větší než plocha píku odpovídajícího 4-methyl-2-pentanolu (300 μl /ml). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,03násobek píku odpovídajícího 4-methyl-2-pentanolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (b).

Zbytek po odpaření. 100,0 ml se odpaří na vodní lázni do sucha a suší se 1 h při 100 °C až 105 °C. Zbytek váží nejvýše 2,5 mg (25 μl /ml).

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. 1,1-diethoxyethan (acetal),
2. B. acetaldehyd,
3. C. aceton,
4. D. benzen,
5. E. cyklohexan,
6. F. methanol,
7. G. 2-butanon (ethylmethylketon),
8. H. 4-methyl-2-pentanon (isobutylmethylketon),
9. I. propanol,
10. J. 2-propanol,
11. K. butanol,
12. L. 2-butanol,
13. M. 2-methylpropanol (isobutanol),
14. N. 2-furankarbaldehyd (furfural),
15. O. 2-methyl-2-propanol (terč. butylalkohol),
16. P. 2-methyl-2-butanol,
17. Q. 2-pentanol,
18. R. pentanol,
19. S. hexanol,
20. T. 2-heptanol,
21. U. 2-hexanol,
22. V. 3-hexanol.

Následující vzor chromatogramu je pouze pro informaci a tato část není součástí požadavků článku.

Obr. 1. Těkavé nečistoty: směs ethanolu a 16 nečistot

Ethanolum 85%

Ethanol 85%

Synonyma. Spiritus concentratus, líh 85%

Obsahuje nejméně 83,5 % (88,3 % V/V) a nejvýše 86,5 % (90,7 % V/V) sloučeniny C₂H₆O.

Příprava

Množství ethanolu 96% (V/V) se upraví podle skutečného obsahu C₂H₆O.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá těkavá snadno zápalná kapalina.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hustota (2.2.5). ρ₂₀: 834,70 kg/m³ až 827,11 kg/m³ (: 0,8362 až 0,8286).
2. B. 2 ml se smíchají s 1 ml kyseliny octové R a 2 ml kyseliny sírové R; je cítit pach ethylacetatu.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a bezbarvá (2.2.2, Metoda II).

Stanovení obsahu

Ethanol. Stanoví se z hustoty, viz Zkoušky totožnosti, podle Tabulky závislosti hustoty na obsahu ethanolu (5.5).

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Ethanolum 60%

Ethanol 60%

Synonyma. Spiritus dilutus, líh 60%

Obsahuje nejméně 58,5 % (66,3 % V/V) a nejvýše 61,5 % (69,2 % V/V) sloučeniny C₂H₆O.

Příprava

Množství ethanolu 96% (V/V) se upraví podle skutečného obsahu C₂H₆O.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá těkavá snadno zápalná kapalina.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hustota (2.2.5). p₂₀: 894,59 kg/m³ až 887,60 kg/m³ (: 0,8962 až 0,8892).
2. B. 2 ml se smíchají s 1 ml kyseliny octové R a 2 ml kyseliny sírové R; je cítit pach ethylacetatu.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a bezbarvá (2.2.2, Metoda II).

Stanovení obsahu

Ethanol. Stanoví se z hustoty, viz Zkoušky totožnosti, podle Tabulky závislosti hustoty na obsahu ethanolu (5.5).

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Ethanolum anhydricum

Bezvodý ethanol

Synonyma. Spiritus absolutus, bezvodý líh

Obsahuje nejméně 99,5 % (V/V) (99,2 % (m/m)) sloučeniny C₂H₆O při 20 °C.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá těkavá snadno zápalná kapalina. Je hygroskopický, mísitelný s vodou a dichlormethanem. Hoří modrým bezdýmým plamenem.

Teplota varu je asi 78 °C.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Relativní hustota, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. bezvodého ethanolu.
3. C. Ve zkumavce se smíchá 0,1 ml s 1 ml roztoku manganistanu draselného R (10 g/l) a s 0,2 ml kyseliny sírové zředěné RS. Ihned se přikryje filtračním papírem navlhčeným čerstvě připraveným roztokem obsahujícím 0,1 g nitroprussidu sodného R a0,5g piperazinu hexahydrátu R v 5 ml vody R. Po několika minutách se na papíře objeví intenzivně modré zbarvení, které zbledne po 10 min až 15 min.
4. D. K 0,5 ml se přidá 5 ml vody R, 2 ml hydroxidu sodného zředěného RS a potom pomalu 2 ml jodu 0,05 mol/l RS; během 30 min se vytvoří žlutá sraženina.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a bezbarvá (2.2.2, Metoda II) v porovnání s vodou R. 1,0 ml se zředí vodou R na 20 ml; po 5 min zůstává roztok čirý v porovnání s vodou R (2.2.1).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. K 20 ml se přidá 20 ml vody prosté oxidu uhličitého R a 0,1 ml fenolftaleinu RS; roztok je bezbarvý. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; roztok je růžový (30 μg/ml, vyjádřeno jako kyselina octová).

Relativní hustota (2.2.5). 0,7907 až 0,7932.

Absorbance. Měří se absorbance zkoušené látky při 235 nm až 340 nm (2.2.25) v 5cm kyvetě za použití vody R jako kontrolní tekutiny. Při 240 nm je absorbance nejvýše 0,40, při 250 nm až 260 nm je nejvýše 0,30 a při 270 nm až 340 nm je nejvýše 0,10. Absorpční křivka má hladký průběh.

Těkavé nečistoty. Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok (a). Použije se zkoušená látka.

Zkoušený roztok (b). K 500,0 ml zkoušené látky se přidá 150 μl 4-methyl-2-pentanolu R. Porovnávací roztok (a). 100 μl methanolu bezvodého R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 50 μl methanolu bezvodého R a 50 μl acetaldehydu R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 150 μl acetalu R se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 100 μl benzenu R se zředí zkoušenou látkou na 100,0 ml. 100 μl tohoto roztoku se zředí zkoušenou látkou na 50,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřními stěnami pokrytými poly[(fenyl)(kyanopropyl)][dimethyl]siloxanem R (tloušťka filmu 1,8 μm),
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru,

   s následujícím programem:

   Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označování †† Estriolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etamsylatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 96% (V/V) Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 85% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum 60% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum anhydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   	Čas (min)	Teplota (°C)	Rychlost (°C/min)	Poznámka
   Kolona	0- 12	40		izotermicky
   	12-32	40 → 240	10	lineární gradient
   	32-42	240		izotermicky
   Nástřikový prostor		280
   Detektor		280

Nastříkne se 1 (μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost systému tak, aby výšky dvou píků eluujících před hlavním píkem (acetaldehyd, methanol) byly nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi prvním píkem (acetaldehyd) a druhým píkem (methanol) je nejméně 2,0. Je-li třeba, sníží se počáteční teplota kolony.

Nastříkne se po 1 μI každého roztoku. Plocha píku odpovídajícího methanolu nachromatogramu zkoušeného roztoku (a) není větší než polovina plochy odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (200 μl/ml).

Vypočte se součet obsahů acetaldehydu a acetalu (μl/ml) z ploch odpovídajících píků na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) podle vztahu:

v němž značí:

1. A_E - plochu píku acetaldehydu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
2. A_T - plochu píku acetaldehydu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
3. C_E - plochu píku acetalu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
4. C_T - plochu píku acetalu na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).

Součet obsahů acetaldehydu a acetalu je nejvýše 10 μl/ml, vyjádřeno jako acetaldehyd.

Vypočte se obsah benzenu (μl/ml) z plochy odpovídajícího píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) podle vztahu:

v němž značí:

1. B_E - plochu píku benzenu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a),
2. B_T - plochu píku benzenu na chromatogramu porovnávacího roztoku (d).

Je-li třeba, totožnost benzenu může být potvrzena užitím jiného vhodného chromatografického systému (stacionární fáze s odlišnou polaritou).

Obsah benzenu je nejvýše 2 μl/ml.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píků odpovídajících methanolu, acetaldehydu, acetalu a benzenu, není větší než plocha píku odpovídajícího 4-methyl-2-pentanolu (300 μl/ml). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,03násobek píku odpovídajícího 4-methyl-2-pentanolu na chromatogramu zkoušeného roztoku (b).

Zbytek po odpaření. 100,0 ml se odpaří na vodní lázni do sucha a suší se 1 h při 100 °C až 105 °C. Zbytek váží nejvýše 2,5 mg (25 μg/ml).

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. 1,1-diethoxyethan (acetal),
2. B. acetaldehyd,
3. C. aceton,
4. D. benzen,
5. E. cyklohexan,
6. F. methanol,
7. G. 2-butanon (ethylmethylketon),
8. H. 4-methyl-2-pentanon (isobutylmethylketon),
9. I. proI. panol,
10. J. 2-propanol,
11. K. butanol,
12. L. 2-butanol,
13. M. 2-methylpropanol (isobutanol),
14. N. 2-furankarbaldehyd (furfural),
15. O. 2-methyl-2-propanol (terč. butylalkohol),
16. P. 2-methyl-2-butanol,
17. Q. 2-pentanol,
18. R. pentanol,
19. S. hexanol,
20. T. 2-heptanol,
21. U. 2-hexanol,
22. V. 3-hexanol.

Následující vzor chromatogramu je pouze pro informaci a tato část není součástí požadavků článku.

Obr. 1. Těkavé nečistoty: směs ethanolu a 16 nečistot

Ethanolum benzino denaturatum

Ethanol denaturovaný benzinem

Synonymum. Líh denaturovaný benzinem

Je to ethanol 96% (V/V) s přídavkem lékařského benzinu jako denaturačního prostředku. Obsahuje 1,0 % až 1,2 % benzinu.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá tekutina páchnoucí po ethanolu a slabě po benzinu. Je těkavý a snadno zápalný, mísitelný s etherem a chloroformem.

Zkoušky totožnosti

1. A. 2 ml se smíchají s 1 ml kyseliny octové ledové R a 2 ml kyseliny sírové R; je cítit pach ethylesteru kyseliny octové.
2. B. 15 ml se smíchá s 35 ml vody R 30 °C teplé a protřepe se. Směs se zakalí. Je patrný slabý pach benzinu.
3. C. Relativní hustota, = 0,800 až 0,808.

Zkoušky na čistotu

Volné kyseliny. 10,0 ml se zředí 10 ml vody prosté oxidu uhličitého R, přidá se 0,1 ml fenolftaleinu RS a 0,5 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/lVS; vznikne červené zbarvení stálé nejméně 30 s (30 mg/l, počítáno jako kyselina octová).

Těžké kovy (2.4.8). 8 ml se zředí vodou R na 25 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje zkoušce A na těžké kovy (5 mg/l). Není-li roztok po naředění čirý, zfiltruje se vhodným filtrem a doplní se na předepsaný objem vodou R. K přípravě porovnávacího roztoku se použije základní roztok olova (2 μg Pb/ml).

Železo (2.4.9). 2 ml vyhovují zkoušce na železo (5 mg/l).

Methanol. Nejvýše 0,025 % (V/V). Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Poměr plochy píku odpovídajícího methanolu k ploše píku odpovídajícího 1-propanolu na chromatogramu zkoušené látky není větší než polovina téhož poměru na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zbytek po odpaření. 50 ml se odpaří v předem zvážené odpařovací misce na vodní lázni do sucha. Zbytek sušený 30 min při 105 °C váží nejvýše 0,001 g (20 mg/l).

Stanovení obsahu

Benzin. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití 1-propanolu R jako vnitřního standardu.

Zkoušený roztok. 1,0 ml 1-propanolu R se zředí zkoušenou látkou na 100,0 ml.

Porovnávací roztok. Do 100ml odměrné baňky se odměří 1,0 ml 1-propanolu R, 1,0 ml benzinu lékařského R a asi 80 ml lihu 96% R. Potom se přidá 25 μl methanolu R tak, aby konec jehly dávkovače byl ponořen pod hladinou. Obsah baňky se doplní lihem 96% R po značku a dobře se promíchá.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - skleněné kolony délky 2,5 m a vnitřního průměru 3 mm naplněné ethylvinylbenzen-divinylbenzenem kopolymerem R( 125 μm až 150 μm),
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 50 ml/min,
3. - teploty kolony 120 °C až 220 °C s teplotním nárůstem 6 °C/min,
4. - teploty nástřikového prostoru a teploty detektoru 240 °C,
5. - plamenoionizačního detektoru.

Nastříkne se odděleně 2,5 μl zkoušeného roztoku a 2,5 μl porovnávacího roztoku a při vhodné citlivosti se zaznamenají chromatogramy. Pořadí píků na chromatogramu porovnávacího roztoku je: methanol, ethanol, propanol a skupina píků odpovídajících benzinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi dvěma po sobě jdoucími píky je nejméně 2,0, s výjimkou píků odpovídajících benzinu (při vyhodnocování se sčítají), viz charakteristický chromatogram na obrázku 1.

Obsah benzinu v procentech (V/V) se vypočte podle vzorce:

v němž značí:

1. C_BL - koncentraci lékařského benzinu v procentech (V/V) v porovnávacím roztoku,
2. P_S - součet ploch všech píků, kromě píků odpovídajících ethanolu, 1-propanolu a methanolu, na chromatogramu zkoušeného roztoku,
3. P_P - plochu píku odpovídajícího propanolu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
4. P՛_S - součet ploch všech píků, kromě píků odpovídajících ethanolu, 1-propanolu a methanolu na chromatogramu porovnávacího roztoku,
5. P՛_P - plochu píku odpovídajícího 1-propanolu na chromatogramu porovnávacího roztoku. Chromatogramy se použijí také ke zkoušce Methanol.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech. Je to hořlavina I. nebezpečnostní třídy.

Obr. 1. Charakteristický chromatogram pro Stanovení obsahu benzinu a zkoušku na čistotu Methanol v ethanolu denaturovaném benzinem

Ethylis oleas

Ethyloleat

Synonymum. Ethylům oleicum

Je to směs ethylesterů mastných kyselin, hlavně kyseliny olejové. Může být přidána vhodná antioxidační přísada.

Výroba

Je-li ethyloleat získáván z tkání savců nebo jiných materiálů teplokrevných zvířat, musí tato zvířata splňovat požadavky oprávněné autority, které se kladou na zvířata určená pro humánní konzumaci. Navíc tyto tkáně nesmí obsahovat specifický rizikový materiál, který je definován odpovídajícími mezinárodními, nebo kde je to vhodné, národními požadavky.

Vlastnosti

Čirá světle žlutá nebo bezbarvá kapalina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mísitelný s lihem 96%, dichlormethanem a etherem petrolejovým (40 °C až 60 °C).

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Relativní hustota, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Číslo zmýdelnění, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Zkouška Obsah kyseliny olejové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 0,866 až 0,874.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 0,5; stanoví se s 10,0 g zkoušené látky.

Číslo jodové (2.5.4). 75 až 90.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 177 až 188; stanoví se s 2,0 g zkoušené látky.

Obsah kyseliny olejové. Provede se zkouška Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií (2.4.22). Frakce mastných kyselin obsahuje nejméně 60,0 % kyseliny olejové.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - název a koncentrace přidaného antioxidačního činidla, pokud bylo přidáno.

Ethylparabenum

Ethylparaben

Synonymum,. Ethylis parahydroxybenzoas

Je to ethyl-4-hydroxybenzoat. Obsahuje 99,0 % až 100,5 % sloučeniny C₉H₁₀O₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96% a v methanolu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 115 °C až 118 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem ethylparabenu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané při zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).
4. D. K asi 10 mg se ve zkumavce přidá 1 ml uhličitanu sodného RS, zahřeje se k varu na 30 s a ochladí (roztoka). K dalším asi 10 mg v podobné zkumavce se přidá 1 ml uhličitanu sodného RS; látka se částečně rozpustí (roztok b). K roztokům (a) a (b) se současně přidá 5 ml aminopyrazolonu RS a 1 ml hexakyanoželezitanu draselného RS a promíchá se; roztok (b) je žlutý až oranžově hnědý; roztok (a) je oranžový až červený a jeho zbarvení je zřetelně intenzivnější než zbarvení roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 1,0 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Kysele reagující látky. Ke 2 ml roztoku S se přidají 3 ml lihu 96% R, 5 ml vody prosté oxidu uhličitého R a 0,1 ml zeleně bromkresolové RS. Ke změně zbarvení indikátoru na modré se spotřebuje nejvýše 0,1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS.

Příbuzné látky. Stanoví se tenkovrstvou chromatografií (2.2.27) za použití vrstvy vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí acetonem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí acetonem R na 100 ml. Porovnávací roztok (b). 10 mg ethylparabenu CRL se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml. Porovnávací roztok (c). 10 mg methylparabenu R se rozpustí v 1 ml zkoušeného roztoku (a) a zředí se acetonem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 2 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R SimethanoluR (1 +30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

2,000 g se odváží do baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 40,0 ml hydroxidu sodného 1 mol/l VS a vaří se 1 h pod zpětným chladičem. Po ochlazení se zpětný chladič propláchne vodou R. Nadbytek hydroxidu sodného se titruje kyselinou sírovou 0,5 mol/l VS do druhého bodu inflexe za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20). Současně se provede slepá zkouška.

1 ml hydroxidu sodného 1 mol/l VS odpovídá 166,2 mg C₉H₁0₃.

Nečistoty

1. A. R = H: kyselina 4-hydroxybenzoová,
2. B. R = CH₃: methyl-4-hydroxybenzoat (methylparaben),
3. C. R = CH₂-CH₂-CH₃: propyl-4-hydroxybenzoat (propylparaben),
4. D. R = CH₂-CH₂-CH₂-CH₃: butyl-4-hydroxybenzoat (butylparaben).

† Etilefrini hydrochloridum

Etilefriniumchlorid

Je to [(RS)-2-hydroxy-2-(3-hydroxyfenyl)ethyl]ethylamoniumchlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₀H₁₆CINO₂.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystalky. Je snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96% a prakticky nerozpustný v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B, E.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.74). 118 °C až 122 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety etilefriniumchloridu CRL. Tablety se připraví za použití chloridu draselného R.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

   Roztoky se připravují za omezeného přístupu světla a chromatogramy se vyvíjejí chráněny před světlem.

   Zkoušený roztok. 25 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

   Porovnávací roztok (a). 25 mg etilefriniumchloridu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

   Porovnávací roztok (b). 10 mg fenylefriniumchloridu CRL se rozpustí ve 2 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se methanolem R na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 5μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, methanolu R a dichlormethanu R (5 + 25 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu teplého vzduchu, postříká se roztokem manganistanu draselného R (10 g/l) a po 15 min se pozoruje v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. D. K 0,2 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 1 ml vody R 0,1 ml síranu měďnatého RS a 1 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS; vznikne modré zbarvení. Po přidání 2 ml etheru R a protřepání je horní vrstva bezbarvá.
2. E. 1 ml roztoku S se zředí vodou R na 10 ml. Roztok vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,50 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se jí na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.7) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 4 ml roztoku S se zředí vodou prostou oxidu uhličitého R na 10 ml, přidá se 0,1 ml červeně methylové RS a 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; roztok je žlutý. Ke změně zbarvení indikátoru na červené se spotřebuje nejvýše 0,4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Optická otáčivost (2.2.7). –0,10° až +0,10°; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 mg etilefrinu nečistoty A CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). K 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 5,0 ml porovnávacího roztoku (b) a zředí se vodou R na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 um),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a roztoku laurylsíranu sodného R (1,1 g/l) (35 + 65), jejíž pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,3; průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (c). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek je retenční čas etilefrinu asi 9 min a etilefrinu nečistoty A asi 10 min. Nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku etilefrinu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky etilefrinu a etilefrinu nečistoty A je alespoň 2,5.

Nastříkne se po 20 μl zkoušeného roztoku, porovnávacího roztoku (a) a porovnávacího roztoku (b). Chromatogram zkoušeného roztoku se zaznamenává po dobu odpovídající trojnásobku retenčního času etilefrinu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha žádného píku odpovídajícího etilefrinu nečistotě A není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,4 %) a plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku etilefrinu nečistoty A, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,2 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku etilefrinu nečistoty A, není větší než pětinásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel a pikům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Sírany (2.4.13). 15 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce na sírany (200 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve 20 ml vody R. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije základní roztok olova (2 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí ve směsi 20 ml kyseliny octové ledové R a 50 ml acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 21,77 mg C₁₀H₁₆CINO₂.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. ethylaminomethyl-(3-hydroxyfenyl)keton (etilefiron),

1. B. R = CH3: (RS)-1-(3-hydroxyfenyl)-2-methylaminoethanol (fenylefrin),
2. C. R = H: (RS)-2-amino-1-(3-hydroxyfenyl)ethanol (norfenefrin).

† Etoposidum

Etoposid

Je to (5R,SaR,8aR,9S)9-[(4,6-0-(R)-ethyliden-β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f|[1,3]benzodioxol-6(5aH)-on. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₂₉H₃₂O₁₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v methanolu, těžce rozpustný v lihu 96% a v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem etoposidu CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H R.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 2 ml.

   Porovnávací roztok. 10 mg etoposidu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 2 ml.

   Na vrstvu se do proužků o délce 10 mm nanese odděleně po 5 μl každého roztoku a ihned se vyvíjí směsí objemových dílů vody R, kyseliny octové ledové R, acetonu R a dichlomethanu R (1,5 + 8 + 20 + 100) po dráze 17 cm. Vrstva se suší 5 min v proudu teplého vzduchu, postříká se směsí objemových dílů kyseliny sírové R a lihu 96% R (1 +9) a zahřívá se 15 min při 140 °C. Potom se vrstva ihned přikryje skleněnou deskou stejných rozměrů a pozoruje se v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. D. Asi 5 mg se ve zkumavce rozpustí v 5 ml kyseliny octové ledové R a přidá se 0,05 ml chloridu železitého RS1. Roztok se promíchá a opatrně se přidají 2 ml kyseliny sírové R tak, aby vznikly dvě vrstvy, a nechá se asi 30 min stát. Na rozhraní vrstev vzniká růžové až červenohnědé zbarvení a horní vrstva je žlutá.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,6 g se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 20 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž₆ nebo HŽ₍5 (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -106° až -114°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 50 mg ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředěním stejnou směsí na 10,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se odděleně 10 μl zkoušeného roztoku (a), 10 μl porovnávacího roztoku (a) a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy a pořadí eluovaných píků podobné jako na vzorovém chromatogramu (obrázek 1). Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); nejvýše dva píky mohou mít plochu větší, než je plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %) a součet ploch všech takových píků není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1%). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědla a pikům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použijí 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 3,0%; 0,500 g se suší 4h ve vakuové sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). 40 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (1 + 1) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 50 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (1 + 1) a zředí se stejnou směsí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (1 + 1) na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 4,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (1 + 1) na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 50 mg etoposidu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (1 + 1) a zředí se stejnou směsí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (d). K 10 ml zkoušeného roztoku (b) se přidá 0,1 ml roztoku kyseliny octové ledové R 4% (V/V) a 0,1 ml fenolftaleinu RS. Přidává se hydroxid sodný 1 mol/l VS do vzniku slabě růžového zbarvení (asi 0,15 ml). Po 15 min se přidá 0,1 ml roztoku kyseliny octové ledové R 4% (V/V).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   1. - mobilní fáze A - směs objemových dílů triethylaminu R, kyseliny mravenčí bezvodé R a vody R (1 + 1 +998),
   2. - mobilní fáze B - směs objemových dílů triethylaminu R, kyseliny mravenčí bezvodé R a acetonitrilu R (1 + 1 + 998),

1. - gradientového programu za použití následujících podmínek:

   Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označování †† Estriolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etamsylatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 96% (V/V) Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 85% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum 60% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum anhydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Ethanolum benzino denaturatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethylis oleas Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Ethylparabenum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Nečistoty † Etilefrini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etoposidum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   	75	25	ustalování
   0 - 7	75	25	izokraticky
   7 - 23	75 → 27	25 → 73	lineární gradient
   23 - 25	27 →75	73 → 25	lineární gradient
   25 - 40	75	25	ustalování

1. - spektrofotometrického detektoru, 285 nm,
2. - injektorové smyčky.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (d) a zaznamenává se chromatogram, dokud není eluován pík fenolftaleinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu jsou dva hlavní píky odpovídající etoposidu a cis-etoposidu (nečistota B) a rozlišení mezi těmito píky je nejméně 3,0; nepřihlíží se k píku fenolftaleinu. V případě potřeby se mírně zvýší podíl mobilní fáze A během izokratické fáze gradientu. Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) podobné těm na vzorovém chromatogramu (obrázek 2). Nastříkne se šestkrát 10 μl porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, je-li relativní směrodatná odchylka plochy píku etoposidu nejvýše 1,0 %. Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku (b) a 10 μl porovnávacího roztoku (c). Obsah C₂₉H₃₂O₁₃ v procentech se vypočítá z ploch píků a deklarovaného obsahu etoposidu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech.

Separandum.

Nečistoty

1. A. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(4,6-O-(R)-ethyliden-β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-{4-[(benzyloxykarbonyl)oxy]-3,5-dimethoxyfenyl}-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (4 ˊ-karbobenzoyloxyethylidenlignan P),

1. B. (5R,5aS,8aR,9S)-9-[(4,6-O-(R)-ethyliden-β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-(4-hydroxy-3,5-dimetho- xyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (pikroethylidenlignan P; cis-etoposid),

1. C. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(4,6-O-(R)-ethyliden-α-D-glukopyranosyl)oxy]-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (α-etoposid),

1. D. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (lignan P),

1. E. (5R,5aR,8aR,9S)-9-hydroxy-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][l,3]benzodioxol-6(5aH)-on (4ˊ-demethylepipodofylotoxin),

1. F. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(4,6-0-(R)-ethyliden-β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-{4-[(2-fenoxyacetyl)oxy]-3,5-dimethoxyfenyl}-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzo.furo[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (fe-noxyacetyl-4ˊ-etoposid),

1. G. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(2,3-diformyl-4,6-0-(R)-ethyliden-β-D-glukopyranosyl)oxy]-5-{4-[(benzyloxykarbonyl)oxy]-3,5-dimethoxyfenyl}-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f] [1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (4 ˊ-karbobenzoyloxydiformylethylidenlignan P),

1. H. (5R,5aR,8aR,9S)-9-ethoxy-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f] [1,3]benzodioxol-6(5aR)-on (4'-0-demethyl-l-0-ethylepipodofylotoxin),

1. I. (5R,5aR,8aR,9S)-9-[(4,6-0-(R)-ethyliden-β -D-glukopyranosyl)oxy]-5-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-H][1,3]benzodioxol-6(5aH-on (4-0-methylethylidenlignan P),

1. J. (5R,5aR,8aR,9S)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-9-methoxy-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][ ,3]benzodioxol-6(5aH)-on (4ˊ-O-demethyl-1 -O-methylepipodofylotoxin),

1. K. 9,9'-oxybis[(5R,5aR,8aR,9S)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on] (bis-4ˊ-O-demethylepipodofylotoxin),

1. L. (5R,5aR8aR,9S)-9-hydroxy-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (4ˊ-0-demethylpodofylotoxin),

1. M. (5R,5aR,8aR,9S)-9-hydroxy-5-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-5,8,8a,9-tetrahydroisobenzofuro[5,6-f][1,3]benzodioxol-6(5aH)-on (podofylotoxin).

Následující vzor chromatogramu je pouze pro informaci a tato část není součástí požadavků článku.

Obr. 1. Vzorový chromatogram pro zkoušku Příbuzné látky

Obr. 2. Vzorový chromatogram pro zkoušku Stanovení obsahu

Eucalypti folium

Eukalyptový list

Synonymum. Folium eucalypti

Je to celý nebo řezaný usušený list nebo starší výhonky druhu Eucalyptus globulus LABILLARDIERE. Neřezaná droga obsahuje nejméně 20 ml silice v 1 kilogramu drogy. Řezaná droga obsahuje nejméně 15 ml silice v 1 kilogramu drogy, obojí počítáno na bezvodou drogu.

Vlastnosti

Droga má aromatický pach po cineolu.

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

1. A. Listy jsou většinou šedozelené, poměrně silné, protáhlé, oválné, mírně srpovitě zahnuté, většinou až 25 cm dlouhé a až 5 cm široké. Rapík je zkroucený, silně vrásčitý, 2 cm až 3 cm, řidčeji 5 cm dlouhý. Kožovité tuhé listy jsou celokrajné, lysé, se žlutozelenou střední žilkou. Postranní žilky anastomozují v blízkosti okraje čepele. Čepel je rovná a poněkud ztlustlá. Na obou stranách čepele jsou drobounké, nepravidelně roztroušené, bradavčité, tmavě hnědé skvrny. V procházejícím světle mohou být patrné malé siličné žlázky.
2. B. Droga se upráškuje (355). Prášek je šedozelený. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky lysé čepele, buňky pokožky malé, ztlustlé, kryté silnou kutikulou, četné anomocytické průduchy (2.8.3) o průměru více než 80 μm, občas skupiny hnědých korkových buněk o průměru 300 μm, zbarvených uprostřed hnědočerně; úlomky isobilaterálního mezofylu na obou stranách čepele s dvěma až třemi řadami palisádového parenchymu, uprostřed víceřadý houbový parenchym z protáhlých buněk orientovaných stejně jako buňky palisádového parenchymu, obsahující krystaly a drúzy šťavelanu vápenatého; úlomky mezofylu s velkými schizogenními siličnými nádržkami.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 0,5 g čerstvě práškované drogy (355) se smíchá s 5 ml toluenu R, protřepává se 2 min až 3 min a pak se zfiltruje přes 2 g síranu sodného bezvodého R.

   Porovnávací roztok. 50 μl cineolu R se rozpustí v toluenu R a zředí se jím na 5 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl obou roztoků. Vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (10 + 90) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se anisaldehydem RS, suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C a pozoruje se v denním světle. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je ve střední části skvrna odpovídající cineolu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a zbarvením skvrně cineolu na chromatogramu porovnávacího roztoku. V blízkosti čela chromatogramu zkoušeného roztoku je intenzivní fialová skvrna (uhlovodíky), mohou zde být další méně intenzivní skvrny.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Nejvýše 3 % ztmavlých a hnědých listů, nejvýše 5 % stonků a nejvýše 2 % ostatních cizích příměsí. Nejsou přítomny srdčité nebo vejčité přisedlé listy z mladých výhonků, s četnými žlázkami na obou stranách, které jsou v procházejícím světle patrné jako body. Provede se s 30 g drogy.

Voda, stanovení destilací (2.2.13). Nejvýše 10,0 %; stanoví se z 20,0 g práškované drogy (355).

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 6,0 %.

Stanovení obsahu

Provede se Stanovení silic v rostlinných drogách (2.8.12). 10,0 g čerstvě řezané drogy se destiluje 2 h rychlostí 2 ml/min až 3 ml/min v 500ml baňce se směsí složenou z 200 ml vody R a 100 ml glycerolu R jako destilační tekutiny; do dělené trubice se přidá 0,5 ml xylenu R.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Eugenolum

Eugenol

Je to 2-methoxy-4-allylfenol.

Vlastnosti

Bezbarvá nebo světle žlutá čirá kapalina, na vzduchu tmavnoucí, výrazného pachu po hřebíčku. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 70% (V/V), prakticky nerozpustný v glycerolu, misitelný s kyselinou octovou, s lihem 96%, s etherem, s mastnými oleji a s dichlormethanem.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Index lomu, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem eugenolu CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.

   Zkoušený roztok. 50 μl se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 25 ml.

   Porovnávací roztok. 50 μl eugenolu CRL se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 25 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 5 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (10 + 90) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu studeného vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká anisaldehydem RS a suší se 10 min při 100 °C až 105 °C. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. D. 0,05 ml se rozpustí ve 2 ml lihu 96% R, přidá se 0,1 ml chloridu železitého RS1; vznikne tmavě zelené zbarvení, které se do 10 min změní na žlutavě zelené zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 1,066 až 1,070.

Index lomu (2.2.6). 1,540 až 1,542.

Dimerní a oligomerní složky. 0,150 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100,0 ml. Absorbance roztoku (2.2.25) měřená při 330 nm je nejvýše 0,25.

Příbuzné látky. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. 1,00 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 5,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 50 mg vanilinu R se rozpustí v 1,0 ml zkoušeného roztoku a zředí se ethanolem R na 5 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm s vnitřním povrchem pokrytým polyfenylmethylsiloxanem R (tloušťka filmu 0,25 μm),
2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru,
4. - dělicího poměru 1 : 40.

Nastříkne se po 1 μl zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků (a) a (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je relativní retenční čas vanilinu vzhledem k eugenolu nejméně 1,1. Vypočítá se obsah příbuzných látek v procentech z ploch píku na chromatogramu zkoušeného roztoku metodou vnitřní normalizace. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědla a k pikům s plochou menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Obsah příbuzných látek s relativním retenčním časem větším než 2,0 vzhledem k hlavnímu píku není větší než 1,0%; obsah jiných příbuzných látek není větší než 0,5 %; celkový obsah příbuzných látek není větší než 3,0 %.

Uhlovodíky. 1 ml se ve zkumavce se zátkou rozpustí v 5 ml hydroxidu sodného zředěného RS, přidá se 30 ml vody R a ihned se pozoruje; roztok je žlutý a čirý (2.2.1).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky. Uchovávání

Ve zcela naplněných dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. (E)-(1R,9S)-4,l 1,1 l-trimethyl-8-methylenbicyklo[7,2,0]undec-4-en (β-karyofylen),

1. B. (E,E,E)-2,6,6,9-tetramethyl-1,4,8-cykIoundekatrien (α-humulen, α-karyofylen),

1. C. (1R,4R,5S,9S)-4,5-epoxy-4,11,11-trimethyl-8-methylenbicyklo[7,2,0]undekan (β-karyofylenoxid),

1. D. R¹ = H, R²= H, R³ = CH_rCH=CH₂: 4-allylfenol,
2. E. R¹ = CH₃, R²= OCH₃, R³ = CH₂-CH=CH₂: 1,2-dimethoxy-4-allylbenzen (eugenolmethylether),
3. F. R¹ = H, R²= OCH₃, R³= CH=CH-CH₃(cis): 2-methoxy-4-[(Z)-1-propenyl]fenol (cis-isoeugenol),
4. G. R¹ = H, R²= OCH3, R³= CH=CH-CH₃(trans): 2-methoxy-4-[(E)-l-propenyl]fenol (trans-isoeugenol),
5. H. R¹ = H, R²= OCH₃, R³= CHO: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd (vanilin),
6. I. R¹ = CO-CH3, R²= OCH3, R³ = CH₂-CH=CH₂: 2-methoxy-4-allylfenylacetat (acetyleugenol),
7. J. R¹ = H, R² = OCH₃, R³ = CO-CH=CH₂: (4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-vinylketon,
8. K. R¹ = H, R²= OCH₃, R³= CH=CH-CHO: (E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-2-propenal (trans-koniferylaldehyd),

1. L. 2-methoxy-4-[3-methyl-5-allyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-2-yl]fenol (dehydrodiisoeugenol),

1. M. 3,3'-dimethoxy-5,5'-di(allyl)bifenyl-2,2'-diol,
2. N. O. dvě další neznámé dimerní sloučeniny,

1. P. toluen

† Fenbendazolum

Fenbendazol

Je to methyl-[5-fenylthio-1H-benzimidazol-2-yl]karbamat. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₅H₁₃N₃O₂S.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný vdimethylformamidu, velmi těžce rozpustný v methanolu.

Zkoušky totožnosti

Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety fenbendazolu CRL.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové v methanolu RS.

Porovnávací roztok (a). 50,0 mg fenbendazolu CRL se rozpustí v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové v methanolu RS. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 200,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou v methanolu RS na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b).10,0 mg fenbendazolu nečistoty A CRL se rozpustí ve 100,0 ml

methanolu R. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou v methanolu RS na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 10,0 mg fenbendazolu nečistoty B CRL se rozpustí ve 100,0 ml methanolu R. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou v methanolu RS na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10,0 mg fenbendazolu CRL a 10,0 mg mebendazolu CRL se rozpustí ve 100,0 ml methanolu R. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou v methanolu RS na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   1. - mobilní fáze A - směs objemových dílů kyseliny octové bezvodé R, methanolu R a vody R (1 +30 + 70),
   2. - mobilní fáze B - směs objemových dílů kyseliny octové bezvodé R, vody R a methanolu R (1 +30 + 70').

   Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označování †† Estriolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etamsylatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 96% (V/V) Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Ethanolum 85% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum 60% Příprava Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethanolum anhydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Ethanolum benzino denaturatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Ethylis oleas Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Ethylparabenum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Nečistoty † Etilefrini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Etoposidum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Eucalypti folium Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Eugenolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Nečistoty † Fenbendazolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
   0 - 10	100	0	izokraticky
   10 - 40	100 → 0	0 → 100	lineární gradient
   40 - 41	0	100	izokraticky
   41 - 50	0 → 100	100 → 0	ustalování

1. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas fenbendazolu asi 19 min. Nastříkne se odděleně po 10 μl každého roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) je rozlišení mezi píky fenbendazolu a mebendazolu nejméně 1,5.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha píků odpovídajících nečistotě A a nečistotě B větší než 2,5násobek plochy odpovídajících píků na chromatogramech porovnávacího roztoku (b) a porovnávacího roztoku (c) (0,5 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píků odpovídajících nečistotě A a nečistotě B, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než čtyřnásobek plochy hlavního píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (a) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,2násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použijí 2 ml základní roztoku olova (1μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0 %. 1,000 g se 3 h suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,3 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu