| Typ přípravku | Množství v obalu | Minimální množství, které se použije pro každou půdu, není-li uvedeno a schváleno jinak |
|---|---|---|
| Parenterální přípravky | Tekutiny | |
| - méně než 1 ml | celý obsah obalu polovina obalu, ale nejvýše 20 ml | |
| - 1 ml a více | ||
| Pevé látky | ||
| - méně než 50 mg | celý obsah obalu | |
| - více než 50 mg, ale méně než 300 mg | polovina obalu 150 mg | |
| - 300 mg a více | ||
| Oční přípravky, ostatní neinjekční přípravky | Vodné roztoky | celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 2,5 ml |
| Ostatní přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu | celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g | |
| Nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat | celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g |
účinné od 1. 1. 2000Pokyny k použití zkoušky na sterilitu
účinné od 1. 1. 2000Účel zkoušky na sterilitu, jako ostatně všech lékopisných zkoušek, je poskytnout nezávislému kontrolujícímu analytikovi prostředky k ověření, že jednotlivý materiál splňuje požadavky lékopisu. Výrobci nejsou povinni provádět takové zkoušky, ani vyloučit užití modifikací nebo alternativ popsaných metod za předpokladu, že jsou přesvědčeni o tom, že bude-li přípravek zkoušen oficiálními metodami, vyhoví požadavkům lékopisu.
účinné od 1. 1. 2000Pokyny pro výrobce
účinné od 1. 1. 2000Stupeň jistoty získaný uspokojivým výsledkem zkoušky na sterilitu (nepřítomnost kontaminovaných jednotek ve vzorku) a vztažený na kvalitu celé šarže, je funkcí stejnorodosti podmínek výroby a efektivnosti přijatého systému odebírání vzorků. Pro účely tohoto textu je šarže definována jako homogenní soubor těsně uzavřených obalů připravených takovým způsobem, že riziko kontaminace je stejné pro každou jednotku v tomto souboru obsaženou.
účinné od 1. 1. 2000Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů. Podmínky, za kterých může být považováno za vhodné parametrické uvolnění, jsou popsány ve stati 5.1.1-Metody přípravy sterilních přípravků. Pro vyhodnocení postupu aseptické výroby může být použita metoda, při níž se tento postup napodobí za použití živných půd. Nehledě k tomu, že zkouška na sterilitu je jediná analytická metoda použitelná pro přípravky vyrobené v aseptických podmínkách, je to dále v každém případě jediná dostupná analytická metoda pro autority, které mají vzorky přípravků zkoušet na sterilitu.
účinné od 1. 1. 2000Pravděpodobnost detekce mikroorganismů zkouškou na sterilitu roste s jejich počtem ve zkoušeném vzorku a kolísá podle schopnosti růstu přítomných mikroorganismů. Pravděpodobnost odhalení velmi nízkého stupně kontaminace, i když je homogenní v celé šarži, je velmi malá. Interpretace výsledků zkoušky na sterilitu se opírá o předpoklad, že obsahy všech obalů v šarži, pokud by byly zkoušeny, daly by stejný výsledek. Jelikož je zřejmé, že každý obal nemůže být zkoušen, je třeba přijmout vhodný plán odběru vzorků. Vodítko pro minimální počet jednotek doporučených ke zkoušení ve vztahu k velikosti šarže je v tabulce 2.6.1-3 a vychází z předpokladu, že přípravek byl vyroben za podmínek určených k vyloučení kontaminace. Aplikace doporučení musí brát ohled na objem přípravku v obalu, na validaci sterilizační metody a na jiné speciální zřetele týkající se sterility přípravku.
účinné od 1. 1. 2000Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu
| Počet jednotek v šarži | Nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu pro každou půdu (*) |
|---|---|
| Parenterální přípravky | |
| - nejvýše 100 obalů | 10 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více |
| - více než 100, méně než 500 obalů | 10 obalů |
| - více než 500 obalů | 2 % nebo 20 obalů – podle toho, co je méně |
| Oční přípravky a ostatní neinjekční přípravky | |
| - nejvýše 200 obalů | 5 % nebo 2 obaly – podle toho, co je více |
| - více než 200 obalů | 10 obalů |
| Je-li přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky | |
| Nerozplněné pevné přípravky | |
| - do 4 obalů | každý obal |
| - více než 4, méně než 50 obalů | 20 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více |
| - více než 50 obalů | 2 % nebo 10 obalů – podle toho, co je více |
| 2.6.2 Mykobakterie |  |
účinné od 1. 1. 2000Podstata zkoušky. Nepřítomnost mykobakterií se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách.
účinné od 1. 1. 2000Postup zkoušky. Je-li zkoušený vzorek kontaminován jinými mikroorganismy, než jsou mykobakterie, ošetří se vhodným dekontaminačním roztokem, jako je např. roztok acetylcysteinu s hydroxidem sodným nebo roztok laurylsíranu sodného.
účinné od 1. 1. 2000Na dvě vhodné pevné půdy (za vhodnou se považuje Löwenstein-Jensenova půda a Middle-brookova 7H10 půda) se trojmo naočkuje po 0,2 ml vzorku a dále se do vhodné tekuté půdy trojmo naočkuje po 0,5 ml vzorku. Všechny půdy se inkubují 56 dnů při 37 °C.
účinné od 1. 1. 2000Růstové vlastnosti živných půd v přítomnosti zkoušeného přípravku se ověří naočkováním vhodného kmene Mycobacterium tuberculosis, jako je např. BCG, a je-li třeba, použije se vhodná neutralizační látka.
účinné od 1. 1. 2000Jestliže v prvních osmi dnech inkubace vyrostou kolonie kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a zároveň se provede bakteriologická zkouška na sterilitu.
účinné od 1. 1. 2000Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se na konci inkubační doby nezjistí nárůst mykobakterií v žádné zkumavce
| 2.6.7 Zkouška na mykoplazmata |  |
účinné od 1. 1. 2000Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních buněk, banku pracovních buněk, výchozí kulturu viru nebo kontrolní buňky, použije se metoda kultivační a metoda imunofluorescence v buněčné kultuře. Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň ve vakcíně před rozplněním nebo v šarži, použije se kultivační metoda. Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře se může také použít, je-li třeba, k ověření půd.
účinné od 1. 1. 2000KULTIVAČNÍ METODA
účinné od 1. 1. 2000Výběr kultivačních půd
účinné od 1. 1. 2000Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných, tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která mohou být přítomna ve zkoušeném přípravku.
účinné od 1. 1. 2000Tekuté živné půdy obsahují fenolovou červeň. Vybrané druhy živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti nejméně pro organismy uvedené dále. Živné vlastnosti každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné organismy uvedené na seznamu.
účinné od 1. 1. 2000Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární použití, při jejichž výrobě byla použita antibiotika)
účinné od 1. 1. 2000Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
účinné od 1. 1. 2000Mycoplasma hyorhinis (neaviární veterinární vakcíny)
účinné od 1. 1. 2000Mycoplasma orale (vakcíny pro humánní a veterinární užití)
účinné od 1. 1. 2000Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní užití) nebo jiný vhodný druh, fermentující glukózu
účinné od 1. 1. 2000Mycoplasma synoviae (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
účinné od 1. 1. 2000Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které neprošly více než patnácti subkultivacemi a jsou uchovávány zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu.
účinné od 1. 1. 2000Po klonování se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou, porovnáním se sbírkovými kulturami např.:
| Acholeplasma laidlawii | NCTC 10116 | CIP 75,27 | ATCC 23206 |
| Mycoplasma gallisepticum | NCTC 10115 | CIP 104967 | ATCC 19610 |
| Mycoplasma hyorhinis | NCTC 10130 | CIP 104968 | ATCC 17981 |
| Mycoplasma orale | NCTC 10112 | CIP 104969 | ATCC 23714 |
| Mycoplasma pneumoniae | NCTC 10119 | CIP 103766 | ATCC 15531 |
| Mycoplasma synoviae | NCTC 10124 | CIP 104970 | ATCC 25204 |
účinné od 1. 1. 2000Inkubační podmínky
účinné od 1. 1. 2000Naočkovaná živná půda se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se inkubuje za aerobních a druhá část za mikroaerofílních podmínek; pevné živné půdy se udržují v atmosféře s patřičnou vlhkostí, aby se zamezilo vysychání povrchu půd. Za aerobních podmínek se inkubuje v atmosféře vzduchu s odpovídající vlhkostí a obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Za mikroaerofilních podmínek se inkubuje v dusíkové atmosféře, obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého.
účinné od 1. 1. 2000Živné vlastnosti
účinné od 1. 1. 2000S každou novou šarži živé půdy se provede zkouška živných vlastnosti. Vybraná živná půda se naočkuje vhodnými zkušebními mikroorganismy; použije se nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie na misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné živné půdy a nejvýše 40 jednotek vytvářejících kolonie pro 100ml nádobu s odpovídající tekutou půdou; pro každý druh organismu se použije samostatná plotna a nádoba. Živné půdy se inkubují za podmínek, které budou použity ke zkoušce zkoušeného výrobku (aerobní, mikroaerofilní nebo obojí, v závislosti na požadavcích zkušebního organismu). Půdy vyhovují zkoušce na živné vlastnosti, dojde-li k přiměřenému růstu zkušebních organismů doprovázenému příslušnou barevnou změnou v tekutých živných půdách.
účinné od 1. 1. 2000Inhibiční látky
účinné od 1. 1. 2000Zkouška na živné vlastnosti se provede v přítomnosti zkoušeného přípravku. Je-li růst zkušebních organismů zřetelně menší než ten, který byl zjištěn bez přítomnosti zkoušeného přípravku, přípravek obsahuje inhibiční látky, které se před provedením zkoušky na mykoplazmata neutralizují (nebo se jejich účinek vyloučí jinak např. ředěním). Účinnost neutralizace nebo jiného postupu se kontroluje opakováním zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.
účinné od 1. 1. 2000Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku
účinné od 1. 1. 2000Pro pevné živné půdy se použijí misky o průměru 60 mm a obsahující 9 ml půdy. Každá z nejméně dvou misek s každou pevnou půdou se naočkuje 0,2 ml zkoušeného přípravku a 100 ml každé tekuté půdy se naočkuje 10 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek a současně se jako kontrola inkubuje nenaočkovaná dávka 100 ml každé tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného přípravku jakékoliv významné změny pH, původní hodnota pH se obnoví přidáním roztoku bud’ hydroxidu sodného, nebo kyseliny chlorovodíkové. První, druhý nebo třetí den po naočkování se vyočkuje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na dvě misky s každou pevnou půdou a inkubuje se nejméně 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek. Postup se opakuje šestý, sedmý nebo osmý den a znovu třináctý nebo čtrnáctý den zkoušky. Tekuté živné půdy se prohlížejí každý druhý nebo třetí den, a objeví-li se změna barvy, okamžitě se přeočkují. Pevné živné půdy se prohlížejí jednou týdně.
účinné od 1. 1. 2000Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Jestliže nejdříve za sedm dní po naočkování je nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo zničena, vyloučí se tato miska za předpokladu, že se při bezprostředním vyšetření neprokáže růst mykoplazmat. Pokud je v kterékoliv části v průběhu zkoušky více než jedna miska náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo rozbita, je zkouška neplatná a opakuje se.
účinné od 1. 1. 2000Do zkoušky se zařadí pozitivní kontrola připravená naočkováním nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie vhodného druhu, jako M. orale a M. pneumoniae.
účinné od 1. 1. 2000Na konci inkubační doby se všechny pevné naočkované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost mykoplazmat.
účinné od 1. 1. 2000Přípravek vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se růst mykoplazmat v žádné z naočkovaných půd. Zjistí-li se růst mykoplazmat, zkouška se může opakovat s použitím dvojnásobného množství inokula, půd a misek. Nezjistí-li se růst mykoplazmat, přípravek vyhovuje zkoušce. Zkouška není platná, jestliže pozitivní kontrola neprokáže růst zkušebního mikroorganismu.
účinné od 1. 1. 2000Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře
účinné od 1. 1. 2000Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem, které se váže na DNK. Mykoplazmata se zjistí pomocí fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých útvarů na povrchu buněk, a jestliže je kontaminace silná, i v okolním prostředí.
účinné od 1. 1. 2000Ověření substrátu
účinné od 1. 1. 2000Jako substrát se použije kultura buněk Vero, předem odzkoušená pomocí inokula, které neobsahuje více než 100 jednotek vytvářejících kolonie kmene rostoucího dobře v tekuté nebo pevné půdě a dokáže se schopnost metody prokázat případnou kontaminaci mykoplazmaty, např. vhodnými kmeny Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Mohou se použít různé buněčné substráty, např. produkční buněčná linie, jestliže se prokázalo, že poskytne přinejmenším stejnou citlivost pro důkaz možné kontaminace mykoplazmaty.
účinné od 1. 1. 2000Zkušební metoda
účinné od 1. 1. 2000Nejméně 1 ml zkoušeného přípravku se použije k dvojnásobnému naočkování, jak je popsáno v odstavci Postup zkoušky, na kulturu indikátorových buněk představující plochu nejméně 25 cm2 souvislé buněčné kultury.
účinné od 1. 1. 2000Do zkoušky se zařadí negativní (neinfikovaná) kontrola a dvě pozitivní kontroly mykoplazmat, jako např. Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Pro pozitivní kontrolu se použije k očkování inokulum, které obsahuje nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie.
účinné od 1. 1. 2000Jestliže pro virové suspenze je interpretace výsledků ovlivněna zřetelnými cytopatickými efekty, může se virus neutralizovat specifickým antisérem, které nemá inhibiční účinek na mykoplazmata, nebo se použije substrát buněčné kultury, který neumožní pomnožení viru. K průkazu nepřítomnosti inhibičního účinku v séru se provedou kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti antiséra.
účinné od 1. 1. 2000Postup zkoušky
- účinné od 1. 1. 20001. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2 · 104 až 2 · 105 buněk v mililitru, 4 · 103 až 2,5 · 104 buněk/cm2) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.
- účinné od 1. 1. 20002. Odstraní se živná půda.
- účinné od 1. 1. 20003. Nárůst se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,4 a potom směsí stejných objemových dílů tohoto tlumivého roztoku a vhodného fixačního roztoku a nakonec fixačním roztokem. Pokud se pro barvení používá bisbenzimid R, pak je vhodným fixačním roztokem čerstvě připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (1 +3).
- účinné od 1. 1. 20004. Přidá se fixační roztok a nechá se 10 min stát.
- účinné od 1. 1. 20005. Fixační roztok se odstraní.
- účinné od 1. 1. 20006. Jestliže se nárůst bude barvit později, úplně se vysuší. Zvláštní péči potřebuje barvení na sklíčku po vysušení, protože mohou vznikat artefakty.
- účinné od 1. 1. 20007. Jestliže se nárůst barví ihned, vymyje se fixační roztok dvakrát sterilní vodou, která se odstraní.
- účinné od 1. 1. 20008. Přidá se bisbenzimid pracovní roztok R nebo nějaký jiný vhodný roztok barvící DNK a nechá se stát 10 min.
- účinné od 1. 1. 20009. Odstraní se barvivo a nárůst se promyje vodou.
- účinné od 1. 1. 200010. Každé podložní sklíčko, je-li to vhodné, se pokryje kapkou směsi stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku fosforečnan-citronanového o pH 5,5, přebytečná kapalina se odsaje z rohů podložního sklíčka.
- účinné od 1. 1. 200011. Vyšetří se epifluorescencí (330 nm/380 nm excitační filtr, LP 440 nm clona) při 100 až 400 násobném zvětšení nebo větším.
- účinné od 1. 1. 200012. Mikroskopický vzhled zkoušené kultury se porovná s negativní a pozitivní kontrolou a vyšetří na mimojadernou fluorescenci. Mykoplazmata se jeví jako body nebo vlákna v cytoplasmě a občas i v mezibuněčném prostoru.
účinné od 1. 1. 2000Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže není prokázána přítomnost mykoplazmat v kulturách jím očkovaných. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozitivní kontroly ukážou přítomnost použitých zkušebních organismů.
účinné od 1. 1. 2000Následující část se uvádí pro informaci a jeho návod, netvoří závaznou součást obecných metod.
účinné od 1. 1. 2000Doporučené živné půdy pro kultivační metodu
účinné od 1. 1. 2000Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku.
účinné od 1. 1. 2000I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum.
- účinné od 1. 1. 2000a) Tekutá půda
účinné od 1. 1. 2000 Pokyny k použití zkoušky na sterilitu Pokyny pro výrobce Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu KULTIVAČNÍ METODA Výběr kultivačních půd Inkubační podmínky Živné vlastnosti Inhibiční látky Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře Ověření substrátu Zkušební metoda Postup zkoušky Doporučené živné půdy pro kultivační metodu infuze z hovězího srdce (1) 90,0 ml koňské sérum (nezahřáté) 20,0 ml roztok kvasničného výtažku (250 g/l) 10,0 ml roztok octanu thallného (10 g/l) 1,0 ml roztok červeně fenolové (0,6 g/l) 5,0 ml roztok penicilinu (20 000 m.j./ml) 0,25 ml roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l) 1,2 ml pH se upraví na 7,8.
- účinné od 1. 1. 2000b) Pevná půda
účinné od 1. 1. 2000Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.