Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

1. účinné od 1. 1. 2000- na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (R_s) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloleatu a methylstearatu nejméně 1,25 pro náplňové a 1,8 pro kapilární kolony a je-li předepsáno v článku, rozlišení mezi píky odpovídajícími methyllinolenatu (C_18:3) a methylarachidatu (C_20:0) nebo methylarachidatu (C_20:0) a methylikosenoatu (C_20:1) nejméně 1,8,
2. účinné od 1. 1. 2000- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylmyristatu nejméně 5.

účinné od 1. 1. 2000Vyhodnocení chromatogramů

účinné od 1. 1. 2000Je třeba se vyvarovat pracovních podmínek, které umožňují vznik maskovaných píků (přítomnost složek s malými rozdíly v retenčních časech, jako u kyseliny linolenové a kyseliny arachidové).

účinné od 1. 1. 2000Kvalitativní analýza. Sestrojí se kalibrační křivky za použití chromatogramů získaného s kalibračními látkami (porovnávací roztok (a)) a informací v tabulce 2.4.22-1:

1. účinné od 1. 1. 2000a) za izotermických podmínek vynesením logaritmů redukovaných retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastné kyseliny; identifikují se píky pomocí takto získané přímky a „ekvivalentní délky řetězce“ pro různé píky. Kalibrační křivka nasycených kyselin je přímka. Logaritmy redukovaných retenčních časů nenasycených kyselin jsou umístěny na této přímce v bodech odpovídajících necelým číslům, která se nazývají „ekvivalentní délky řetězce“,
2. účinné od 1. 1. 2000b) za podmínek lineárního teplotního programu vynesením retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastných kyselin; určení totožnosti se provede pomocí kalibrační křivky.

účinné od 1. 1. 2000Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky^*

účinné od 1. 1. 2000Kvantitativní analýza. Používá se metoda vnitřní normalizace, při níž součet ploch všech píků na chromatogramu, kromě píku rozpouštědla, je brán jako 100 %. Doporučuje se použití elektronického integrátoru. Obsah složky je vypočítán jako procentuální podíl plochy odpovídajícího píku z celkového součtu ploch všech píků. Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05 % celkové plochy.

účinné od 1. 1. 2000

Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky*

2.4.24 Totožnost a kontrola zbytkových rozpouštědel

účinné od 1. 1. 2000Zkušební postupy popsané v této obecné metodě mohou být použity:

1. účinné od 1. 1. 20001. Pro určení totožnosti většiny zbytkových rozpouštědel třídy 1 a třídy 2 v léčivých látkách a pomocných látkách, nebo léčivých přípravcích, nejsou-li zbytková rozpouštědla známa.
2. účinné od 1. 1. 20002. Jako limitní zkouška pro rozpouštědla třídy 1 a třídy 2 přítomná v léčivých látkách a pomocných látkách nebo léčivých přípravcích.
3. účinné od 1. 1. 20003. Pro kvantifikaci rozpouštědel třídy 2, jsou-li limitní hodnoty vyšší než 1000 μg/g (0,1 %), nebo třídy 3, je-li požadována kvantifikace.

účinné od 1. 1. 2000Třídy zbytkových rozpouštědel jsou uvedeny v obecné kapitole 5.4.

účinné od 1. 1. 2000Jsou popsána 3 rozpouštědla pro přípravu vzorků a použité podmínky pro head space nástřik plynných vzorků do chromatografického systému. Jsou předepsány 2 chromatograťické systémy, ale přednost je dávána systému A, zatímco systém B je normálně používán pro potvrzení totožnosti. Výběr postupu pro přípravu vzorku závisí na rozpustnosti zkoušené látky a v některých případech i analyzovaných zbytkových rozpouštědlech.

účinné od 1. 1. 2000Za popsaných podmínek head space nástřiku nebývají běžně detegována tato rozpouštědla: formamid, 2-ethoxyethanol, 2-methoxyethanol, ethylenglykol, N-methylpyrrolidon a sulfolan. Pro kontrolu těchto zbytkových rozpouštědel by měly být používány jiné vhodné postupy.

účinné od 1. 1. 2000Je-li postup zkoušky používán pro kvantitativní stanovení zbytkových rozpouštědel v látce, musí být validován.

účinné od 1. 1. 2000Pracovní postup

účinné od 1. 1. 2000Provede se plynová chromatografie se statickým head space nástřikem (2.2.28).

účinné od 1. 1. 2000Příprava vzorku 1. Je určena pro stanovení zbytkových rozpouštědel v látkách ve vodě rozpustných.

účinné od 1. 1. 2000Roztok vzorku (1). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20,0 ml.

účinné od 1. 1. 2000Příprava vzorku 2. Je určena pro stanovení zbytkových rozpouštědel v látkách ve vodě nerozpustných.

účinné od 1. 1. 2000Roztok vzorku (2). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v N,N-dimethyIformamidu R (DMF) a zředí se jím na 20,0 ml.

účinné od 1. 1. 2000Příprava vzorku 3. Je určena pro stanovení N,N-dimethylacetamidu a/nebo N,N-dimethylformamidu, je-li známo nebo lze předpokládat, že jeden z nich nebo oba budou přítomny ve zkoušené látce.

účinné od 1. 1. 2000Roztok vzorku (3). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v 1,3-dimethyl-2-imidazolidinonu R (DMI) a zředí se jím na 20,0 ml.

účinné od 1. 1. 2000V některých případech není pro přípravu vzorku vhodný ani jeden z uvedených postupů, v takovýchto případech musí být prokázáno, že rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku a podmínky statické head space analýzy jsou vhodné.

účinné od 1. 1. 2000Roztok rozpouštědla (a). 1,0 ml roztoku zbytkového rozpouštědla třídy 1 CRL se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml.

účinné od 1. 1. 2000Roztok rozpouštědla (b). Vhodná množství zbytkových rozpouštědel třídy 2 se rozpustí v dimelthylsulfoxidu R a zředí se vodou R na 100,0 ml. Zředění je takové, aby koncentrace odpovídala 1/20 limitní hodnoty uvedené v tabulce 2.

účinné od 1. 1. 2000Roztok rozpouštědla (c). 1,00 g rozpouštědla nebo rozpouštědel přítomných ve zkoušené látce se rozpustí v dimethylsulfoxidu R nebo ve vodě R, je-li to vhodné, a zředí se vodou R na 100,0 ml. Zředí se na koncentraci odpovídající 1/20 limitní hodnoty uvedené v tabulce 1 nebo 2.

účinné od 1. 1. 2000Kontrolní roztok. Připraví se jako roztok rozpouštědla (c), ale bez přídavku rozpouštědla (rozpouštědel) použitých k ověření nepřítomnosti interferujících píků.

účinné od 1. 1. 2000Zkoušený roztok. 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml kontrolního roztoku se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok (a) (Třída 1). 1,0 ml roztoku rozpouštědla (a) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok (a₁) (Třída 1). 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml roztoku rozpouštědla (a) se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok (b) (Třída 2). 1,0 ml roztoku rozpouštědla (b) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok (c). 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml roztoku rozpouštědla (c) se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok (d). 1,0 ml kontrolního roztoku a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.

účinné od 1. 1. 2000Lahvičky se vzduchotěsně uzavřou pryžovým šeptem pokrytým polytetrafluorethylenem a zajistí hliníkovým uzávěrem. Roztok se zhomogenizuje protřepáním.

účinné od 1. 1. 2000Mohou být použity tyto podmínky statického head space nástřiku:

účinné od 1. 1. 2000

Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup

Pracovní parametry	Postup pro přípravu vzorku
	1	2	3
Teplota pro ustavení rovnováhy (°C)	80	105	80
Doba ustavování rovnováhy (min)	60	45	45
Teplota přechodové kapiláry (°C)	85	110	105

účinné od 1. 1. 2000Nosný plyn: Dusík pro chromatografii R nebo helium pro chromatografii R, při vhodném tlaku

účinné od 1. 1. 2000

Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup

Doba tlakování (s)	30	30	30
Nastřikovaný objem (ml)	1	1	1

účinné od 1. 1. 2000Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

účinné od 1. 1. 2000Systém A

1. účinné od 1. 1. 2000- křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou zesíťovanými 6 % polykyanpropylfenylsiloxanu R a 94 % polydimethylsiloxanu R (tlouštka filmu: 1,8 μm nebo 3 μm),
2. účinné od 1. 1. 2000- dusíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu při lineární průtokové rychlosti asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5,
3. účinné od 1. 1. 2000- plamenoionizačního detektoru (může být použit též hmotnostní spektrometr nebo detektor elektronového záchytu pro chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).

účinné od 1. 1. 2000Teplota kolony se udržuje na 40 °C po dobu 20 min, potom se zvyšuje rychlostí 10 °C/min na 240 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 140 °C a teplota detektoru na 250 °C.

účinné od 1. 1. 2000Dochází-li k interferenci stanovovaných rozpouštědel s matricí, použije se:

účinné od 1. 1. 2000Systém B

1. účinné od 1. 1. 2000- křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R (tlouštka filmu: 0,25 μm),
2. účinné od 1. 1. 2000- dusíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu při lineární průtokové rychlosti asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5,
3. účinné od 1. 1. 2000- plamenoionizačního detektoru (může být použit též hmotnostní spektrometr detektor nebo detektor elektronového záchytu pro chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).

účinné od 1. 1. 2000Teplota kolony se udržuje na 50 °C po dobu 20 min, potom se zvyšuje rychlostí 6 °C/min na 165 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 140 °C a teplota detektoru na 250 °C.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohl být stanoven poměr signálu k šumu pro 1,1,1-trichlorethan. Tento poměr musí být nejméně 5. Typický chromatogram je ukázán na obrázku 2.4.24-1.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a₁) na kolonu popsanou v systému A. Píky odpovídající zbytkovým rozpouštědlům třídy 1 musí být ještě detegovatelné.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a dichlormethanu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-2 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a dichlormethanu je nejméně 1,0.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému A. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), musí být použit systém B.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohl být stanoven poměr signálu k šumu pro benzen. Tento poměr musí být nejméně 5. Typický chromatogram je ukázán na obrázku 2.4.24-3.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a₁) na kolonu popsanou v systému B. Píky odpovídající zbytkovým rozpouštědlům třídy 1 musí být ještě detegovatelné.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a trichlorethylenu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-4 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a trichlorethylenu je nejméně 1,0.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému B. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b) a potvrzuje závěr zkoušky za použití systému A, postupuje se takto:

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu popsanou pro systém A nebo systém B. Je-li nutné, nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku odpovídajícího určovanému zbytkovému rozpouštědlu (rozpouštědlům) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (d) na kolonu. Nesmí být pozorovatelný žádný interferující pík.

účinné od 1. 1. 2000Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku a 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu. Tyto nástřiky se opakují ještě dvakrát.

účinné od 1. 1. 2000

účinné od 1. 1. 2000Obr. 2.4.24-1 Typický chromatogram rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.

účinné od 1. 1. 20004: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1- trichlorethan.

účinné od 1. 1. 2000

účinné od 1. 1. 2000Obr. 2.4.24-2 Chromatogram rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.

účinné od 1. 1. 20003: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan, DMSO dimethylsulfoxid.

účinné od 1. 1. 2000

účinné od 1. 1. 2000Obr. 2.4.24-3 Chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.

účinné od 1. 1. 20004: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1-trichlorethan.

účinné od 1. 1. 2000

účinné od 1. 1. 2000Obr. 2.4.24-4 Typický chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.

účinné od 1. 1. 20003: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 23: 1,4-dioxan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen, ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan.

účinné od 1. 1. 2000Průměrná hodnota plochy píku zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu zkoušeného roztoku nesmí být větší než polovina průměrné hodnoty plochy píku odpovídajícího zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka rozdílů ploch píků analytu získaných ze tří párů opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku (a) a zkoušeného roztoku je nejvýše 15 %.

účinné od 1. 1. 2000Průběhový diagram postupu je ukázán na obrázku 2.4.24-5.

účinné od 1. 1. 2000Jsou-li zbytková rozpouštědla (třída 2 nebo třída 3) přítomna v koncentracích 0,1 % a větších, může být jejich obsah stanovován metodou standardního přídavku.

účinné od 1. 1. 2000

účinné od 1. 1. 2000Obr. 2.4.24-5 Průběhový diagram pro identifikaci zbytkových rozpouštědel a aplikaci limitní zkoušky

účinné od 1. 1. 2000

Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B

2.4.26 N,N-Dimethylanilin

1. účinné od 1. 1. 2000A. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití N,N-diethylanilinu R jako vnitřního standardu.

   účinné od 1. 1. 2000Roztok vnitřního standardu. 50 mg N,N-diethylanilinu R se rozpustí ve 4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100 ml. Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve zkumavce se zabroušenou zátkou ve 30,0 ml vody R. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Teplota roztoku se upraví na 26 °C až 28 °C. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a míchá se do úplného rozpuštění. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.

   účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok. 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se rozpustí ve 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 30,0 ml. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.

   účinné od 1. 1. 2000Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. účinné od 1. 1. 2000- křemenné kapilární kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřní stěnou pokrytou filmem síťovaného polyfenylmethylsiloxanu R (tlouštka filmu 0,52 μm),
   2. účinné od 1. 1. 2000- helia pro chromatografií R jako nosného plynu s dělicím poměrem 1 : 20, vstupním tlakem na koloně 50 kPa a průtokem na děliči 20 ml/min,
   3. účinné od 1. 1. 2000- plamenoionizačního detektoru,
   4. účinné od 1. 1. 2000- vstřikovací trubice se skládá z kolony dlouhé asi 1 cm naplněné křemelinou pro plynovou chro matografii R impregnovanou 10 % polydimethylsiloxanu R.

   účinné od 1. 1. 2000Teplota kolony se udržuje 5 min na 150 °C, pak se zvyšuje rychlostí 20 °C/min na 275 °C a při této teplotě se udržuje 3 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 220 °C a teplota detektoru na 300 °C.

   účinné od 1. 1. 2000Retenční časy jsou: pro N,N-dimethylanilin asi 3,6 min a pro N,N-diethylanilin asi 5,0 min.

   účinné od 1. 1. 2000Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.

1. účinné od 1. 1. 2000B. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití natalenu R jako vnitřního standardu.

   účinné od 1. 1. 2000Roztok vnitřního standardu. 50 mg naftalenu R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jím na 50 ml. 5 ml tohoto roztoku se zředí cyklohexanem R na 100 ml.

   účinné od 1. 1. 2000Zkoušený roztok. K 1,00 g zkoušené látky se přidá ve zkumavce se zabroušenou zátkou 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.

   účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztok. K 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové R a 20 ml vody R, třepe se do rozpuštění a zředí se vodou R na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 250,0 ml. K 1,0 ml se ve zkumavce se zabroušenou zátkou přidá 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.

   účinné od 1. 1. 2000Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. účinné od 1. 1. 2000- skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné křemelinou silanizovanou pro plynovou chromatografii R impregnovanou 3 % polyfenylmethylsiloxanu R,
   2. účinné od 1. 1. 2000- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 30 ml/min,
   3. účinné od 1. 1. 2000- plamenoionizačního detektoru.

   účinné od 1. 1. 2000Teplota kolony se udržuje na 120 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 150 °C.

   účinné od 1. 1. 2000Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.

1. účinné od 1. 1. 20002.5. Stanovení obsahu
   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B

   2.5.5 Číslo peroxidové

   účinné od 1. 1. 2000Číslo peroxidové I_P udává množství aktivního kyslíku v milimolech obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky, stanoví se metodami popsanými níže.

   účinné od 1. 1. 2000Jestliže není předepsáno jinak, použije se metoda A. Každá změna metody A na metodu B by měla být validována.

   účinné od 1. 1. 2000Metoda A

   účinné od 1. 1. 20005,00 g zkoušené látky (m) se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových dílů kyseliny octově ledové R a chloroformu R (3 + 2) a třepe se do rozpuštění látky. Potom se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, promíchá se a přesně za 1 min se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za rovnoměrného míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS po kapkách a za stálého míchání do odbarvení. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška, při níž spotřeba thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS není vyšší než 0,10 ml.

   účinné od 1. 1. 2000Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

   účinné od 1. 1. 2000

   účinné od 1. 1. 2000v němž značí:

   účinné od 1. 1. 2000n₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při titraci v ml,

   účinné od 1. 1. 2000n₂ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,

   účinné od 1. 1. 2000m - navážku zkoušené látky v g.

   účinné od 1. 1. 2000Metoda B

   účinné od 1. 1. 2000Postup se provede za chránění před aktinickým světlem.

   účinné od 1. 1. 2000Předepsané množství zkoušené látky (m), viz tabulka 2.5.5-1, se převede do kuželovité baňky opatřené zátkou. Přidá se 50 ml směsi objemových dílů trimethylpentanu R a kyseliny octové ledové R (2 + 3) a míchá se do rozpuštění zkoušené látky. Pipetou o vhodném objemu se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, baňka se uzavře a promíchá se. Roztok se nechá stát 1 min ± 1 s, nejméně třikrát se důkladně protřepe a potom se přidá 30 ml vody R.

   účinné od 1. 1. 2000Tab. 2.5.5-1

   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1

   Předpokládané číslo peroxidové	Navážka zkoušené látky (g)
   0 až 12	2,00 až 5,00
   12 až 20	1,20 až 2,00
   20 až 30	0,80 až 1,20
   30 až 50	0,500 až 0,800
   50 až 90	0,300 až 0,500

   účinné od 1. 1. 2000Roztok se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS, přidává se postupně za stálého intenzivního míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Přidá se asi 0,5 ml škrobu RS1 a pokračuje se v titraci za stálého míchání zvláště v blízkosti bodu ekvivalence, aby se uvolnil všechen jod z vrstvy rozpouštědla. Roztok thiosíranu sodného se přidává po kapkách až do odbarvení.

   účinné od 1. 1. 2000Pokud se při titraci spotřebuje méně než 0,5 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS, opakuje se stanovení za použití thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS za stálého intenzivního míchám.

   účinné od 1. 1. 2000Poznámka. K 15 s až 30 s zpoždění při neutralizaci škrobového indikátora dochází pro peroxidové číslo 70 a vyšší, trimethylpentan má sklon pěnit na povrchu vodného prostředí a v tomto případě je třeba přiměřeně míchat rozpouštědlo a odměrný roztok, až do uvolnění poslední stopy jodu. Doporučuje se použít thiosíran sodný 0,01 mol/l VS pro peroxidové číslo nižší než 150. Může se přidat malé množství (0,5 % až 1,0 %) vyšších HLB emulgátorů k reakční směsi, aby se zpomalilo dělení fází a zkrátilo se tak zpoždění při uvolnění jodu.

   účinné od 1. 1. 2000Provede se slepá zkouška. Jestliže spotřeba titračního činidla při slepé zkoušce je vyšší než 0,1 ml, odstraní se nečistoty činidel a opakuje se stanovení.

   účinné od 1. 1. 2000Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

   účinné od 1. 1. 2000

   účinné od 1. 1. 2000v němž značí:

   účinné od 1. 1. 2000c - koncentraci thiosíranu sodného v mol/l,

   účinné od 1. 1. 2000V₁ - spotřebu thiosíranu sodného při titraci v ml,

   účinné od 1. 1. 2000V₀ - spotřebu thiosíranu sodného při slepé zkoušce v ml,

   účinné od 1. 1. 2000m - navážku zkoušené látky v g.

   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1

   2.5.31 Ribosa v polysacharidových vakcínách

   účinné od 1. 1. 2000Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu pro přípravu roztoku přípravku obsahujícího asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah nádobky a zředí se vodou R na potřebný objem. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité při zkoušce obsahovaly 2,5 μg až 25 μg ribosy. Zředěný roztok se převede po 0,20 ml do tří zkumavek a po 0,40 ml do dalších tří zkumavek.

   účinné od 1. 1. 2000Porovnávací roztoky. 25 mg ribosy R se rozpustí ve vodě R a zředí se ji na 100,0 ml (základní roztok obsahující 0,25 g/l ribosy). Bezprostředné před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 10,0 ml (pracovní zředění: 25 mg/l ribosy). Do šesti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml tohoto roztoku.

   účinné od 1. 1. 2000Slepá zkouška. Použijí se 2 ml vody R.

   účinné od 1. 1. 2000Postup. Obsah každé zkumavky se doplní vodou R na objem 2 ml, protřepe se a do každé zkumavky se přidají 2 ml roztoku chloridu železitého R (0,5 g/l) v kyselině chlorovodíkové R. Po protřepání se přidá 0,2 ml roztoku orcinolu R (100 g/l) v ethanolu R. Zkumavky se vloží na 20 min do vodní lázně a potom se ochladí v ledové vodě. Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 670 nm proti kontrolnímu roztoku získanému při slepé zkoušce. Sestrojí se kalibrační křivka ze zjištěných absorbancí šesti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahu ribosy a odečte se množství ribosy pro každé zředění zkoušeného roztoku. Ze tří získaných hodnot pro každý objem se vypočítá průměr.

   1. účinné od 1. 1. 20002.5.32 Coulometrická titrace, mikrometoda
      účinné od 1. 1. 2000

      Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1

      Princip metody

      účinné od 1. 1. 2000Coulometrická titrace vody je založena na kvantitativní reakci vody s oxidem siřičitým a jodem v bezvodém prostředí za přítomnosti zásady s dostatečnou tlumicí kapacitou. Na rozdíl od odměrné metody uvedené ve stati (2.5.12) je jod produkován elektrochemicky v reakční nádobce oxidací jodidu. Jod generovaný na anodě reaguje okamžitě s vodou a oxidem siřičitým, které jsou obsaženy v reakční nádobce. Množství vody v látce je přímo úměrné množství elektrického náboje spotřebovaného do bodu ekvivalence titrace. Když všechna voda v nádobce (stanovené látce) zreagovala, je dosaženo bodu ekvivalence a objeví se nadbytek jodu. 1 mol jodu odpovídá 1 molu vody, množství elektrického náboje 10,71 C odpovídá 1 mg vody.

      účinné od 1. 1. 2000Vlhkost ze systému je odstraněna předchozí elektrolýzou. Jednotlivá stanovení se mohou provádět po sobě ve stejném roztoku zkoumadel za následujících podmínek:

      1. účinné od 1. 1. 2000- každá složka zkoušené směsi je kompatibilní s dalšími složkami,
      2. účinné od 1. 1. 2000- neprobíhají žádné další reakce,
      3. účinné od 1. 1. 2000- objem a vodní kapacita elektrolytového zkoumadla jsou dostatečné.

      účinné od 1. 1. 2000Coulometrická titrace je omezena na stanovení malých množství vody, nejlépe v rozmezí 10 μg až 10 mg.

      účinné od 1. 1. 2000Přesnost a správnost metody jsou podmíněny především tím, jak účinně lze vyloučit ze systému atmosférickou vlhkost. To lze monitorovat měřením velikosti posunu základní linie.

      účinné od 1. 1. 2000Zařízení

      účinné od 1. 1. 2000Zařízení se skládá z reakční nádobky, elektrod a elektromagnetické míchačky. Nádobka je tvořena větším prostorem anodovým a menším prostorem katodovým. V závislosti na tvaru elektrod mohou být oba prostory odděleny membránou a v každém prostoru je platinová elektroda. Kapalné nebo rozpuštěné vzorky jsou vnášeny přes septum injekční stříkačky. Alternativně může být použita technika odpařování, při níž je vzorek zahříván ve zkumavce (sušárně) a voda je odpařována a vedena do reakční nádobky proudem suchého inertního plynu. Obecně je třeba se vyhnout vnášení pevných vzorků do reakční nádobky. Avšak, je-li to nezbytné, provádí se to utěsněným vstupem. Je třeba učinit vhodná opatření, aby se zabránilo zanesení vlhkosti ze vzduchu, např. pracuje se v boxu opatřeném rukavicemi v atmosféře suchého inertního plynu. Postup analýzy je řízen vhodným elektronickým zařízením, které též zobrazuje výsledek.

      účinné od 1. 1. 2000Pracovní postup

      účinné od 1. 1. 2000Obě části nádobky se naplní elektrolytovým zkoumadlem pro mikrostanovení vody R podle návodu výrobce a provede se coulometrická titrace do trvalého konečného bodu. Předepsané množství zkoušené látky se vnese do reakční nádobky, 30 s se míchá, pokud není v článku uvedeno jinak, a znovu se titruje do trvalého konečného bodu. V případě, že je použito sušárny, předepsané množství vzorku se převede do zkumavky a zahřívá se. Po odpaření vody ze vzorku do reakční nádobky se začne titrovat. Hodnota se odečte z výstupu přístroje a vypočítá se, je-li to nutné, procentuální obsah nebo množství vody ve zkoušené látce. Pokud je to vhodné podle druhu vzorku a přípravku, provede se slepá zkouška.

      účinné od 1. 1. 2000Ověření správnosti

      účinné od 1. 1. 2000Mezi dvě po sobě následující titrace vzorku se vnese do nádobky přesně zvážené množství vody řádově stejné velikosti, jako je množství vody ve vzorku, buď jako voda R, nebo ve formě základního roztoku pro mikrostanovení vody a provede se coulometrická titrace. Výtěžnost se pohybuje v rozmezí 97,5 % až 102,5 % pro přidání 1000 μg H₂O, v rozmezí 90,0 % až 110,0 % pro přidání 100 μg H₂O.

1. účinné od 1. 1. 20002.6 Biologické zkoušky
   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti

   2.6.1 Zkoušky na sterilitu 1)

   účinné od 1. 1. 2000Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými prostředky, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Seznam dalších požadavků k prokázání sterility celé šarže je uveden na konci tohoto textu.

   účinné od 1. 1. 2000Opatření proti mikrobiálnímu znečištění

   účinné od 1. 1. 2000Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek, např. použitím laminárního boxu o třídě čistoty A umístěného v místnosti vyhovující třídě čistoty B, nebo v izolátoru. Opatření přijatá proti kontaminaci nepůsobí na mikroorganismy, které se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž je zkouška prováděna, se pravidelně monitorují vhodným vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné kontroly, jak jsou popsány v příslušných směrnicích Evropského společenství a v navazujících Notes for guidance on GMP.

   účinné od 1. 1. 2000Živné půdy

   účinné od 1. 1. 2000Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit také aerobní bakterie. Půda z hydrolyzátů soji a kaseinu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud prokazatelně podporují růst široké řady mikroorganismů.

   účinné od 1. 1. 2000Thioglykolanová půda

   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy

   L-cystin	0,5 g
   agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %)	0,75 g
   chlorid sodný	2,5 g
   glukosa monohydrát	5,5 g
   kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě)	5,0 g
   pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
   thioglykolan sodný nebo	0,5 g
   kyselina thioglykolová	0,3 ml
   roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený	1,0 ml
   voda R	1000 ml
   pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.

   účinné od 1. 1. 2000Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, kvasničný výtažek a pankreaticky hydrolyzát kaseinu s vodou a zahřívá se, dokud se nerozpustí. Přidá se thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová do roztoku a přidá se, je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok po sterilizaci měl pH 7,1 ± 0,2. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do konce inkubační doby nezměnilo pohlcováním kyslíku barevně víc, než horní třetina půdy. Používá se validovaný postup sterilizace. Uchovává se při teplotě 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, není-li určen a k okamžitému použití. Je-li třeba, regeneruje se půda těsně před použitím, např. 20 min zahříváním ve vodní lázni a rychlým ochlazením. Nesterilní vzduch se přitom nesmí dostat do nádoby.

   účinné od 1. 1. 2000Půda z hydrolyzátu sóji a kaseinu

   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy

   pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
   papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
   chlorid sodný	5,0 g
   hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
   glukosa monohydrát	2,5 g
   voda R	1000 ml

   účinné od 1. 1. 2000pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.

   účinné od 1. 1. 2000Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok měl po sterilizaci pH 7,3 ± 0,2. Je-li třeba, filtruje se do vyjasnění, rozplní se do vhodných nádob a sterilizuje se validovaným postupem. Uchovává se při teplotě mezi 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, pokud není určena pro okamžité použití.

   účinné od 1. 1. 2000Užité půdy, ať již ty výše popsané nebo jiné, vyhovují následujícím zkouškám provedeným před zkouškou zkoušeného přípravku nebo současně s ní.

   účinné od 1. 1. 2000Sterilita. Vzorky živné půdy se 14 dní inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1. Není pozorován růst mikroorganismů.

   účinné od 1. 1. 2000Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií a hub. Části vybrané půdy se naočkují malým počtem jednoho typu mikroorganismu (10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie), který je uveden v tabulce 2.6.1-1, a inkubují se za podmínek podle této tabulky nejdéle 3 dny v případě bakterií a nejdéle 5 dní v případě hub. Rody a kmeny uvedené v tabulce nejsou jediné, které lze použít; jiné mikroorganismy mohou být také vhodné.

   účinné od 1. 1. 2000Použije se metoda výchozí kultury (systému jednotné inokulace), takže živé mikroorganismy užité pro očkování nejsou vzdáleny o více než pět generací od původní výchozí kultury.

   účinné od 1. 1. 2000Půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný časný růst mikroorganismů.

   účinné od 1. 1. 2000Validační zkouška

   účinné od 1. 1. 2000Pro každý typ mikroorganismu uvedený v tabulce 2.6.1-1 se provede zkouška, jak je popsáno dále v odstavci Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku. Užije se přesně stejná metoda s výjimkou následujících modifikací.

   účinné od 1. 1. 2000Membránová filtrace

   účinné od 1. 1. 2000Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob na membránu se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie) do poslední části sterilního promývacího roztoku.

   účinné od 1. 1. 2000Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku

   účinné od 1. 1. 2000

   Vyhodnocení chromatogramů Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky* Pracovní postup Systém A Systém B Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku

   Živná půda	Mikroorganismus		Inkubace
   	druh	doporučený kmen	Teplota (°C) maximální doba
   	Aerobní bakterie		Pro všechny aeroby
   	Staphylococcus aureus	ATCC 6538P
   Thioglykolanová půda		CIP 53,156
   		NCTC 7447
   		CCM 2022
   		CNCTC Mau 28/58
   	Bacillus subtilis	ATCC 6633
   		CIP 52,62	32,5+ 2,5	3 dny
   		NCIB 8054
   		CCM 1999
   		CNCTC Bs 8/58
   	Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027
   		NCIMB 8626
   		CIP 82,118
   		CCM 1961
   		CNCTC Ps 37/65
   	Anaerobní bakterie		Pro všechny anaeroby
   	Clostridium sporogenes	ATCC 19404	32,5 ± 2,5	3 dny
   		CIP 79,3
   		CCM 4409
   		CNCTC Cl 66/79
   Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu*	Houby		Pro všechny houby
   	Candida albicans	ATCC 10231
   		IP 4872	22,5 ± 2,5	5 dní
   		ATCC 2091
   		IP 1180,79
   		CCM 8226
   		CNCTC 55/79
   	Aspergillus niger	ATCC 16404
   		CCM 8222

   účinné od 1. 1. 2000*v této půdě se pomnožuje též Baccilus subtilis (ATCC 6633 nebo CIP 52,62)

   účinné od 1. 1. 2000Přímé očkování

   účinné od 1. 1. 2000Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob do živné půdy se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie).

   účinné od 1. 1. 2000V obou případech se provede růstová zkouška jako pozitivní kontrola. Všechny nádoby s živnou půdou se inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1 po dobu nejvýše 3 dnů pro bakterie a 5 dnů pro houby.

   účinné od 1. 1. 2000Dojde-li k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému srůstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, potom přípravek nemá v podmínkách zkoušky žádný protimikrobní účinek nebo takový účinek byl uspokojivě vyloučen. Zkouška na sterilitu se pak může provést bez dalších modifikací.

   účinné od 1. 1. 2000Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného přípravku k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, přípravek má protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky uspokojivě vyloučen. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby byl protimikrobní účinek odstraněn a zkouška se opakuje.

   účinné od 1. 1. 2000Tato validace se provádí:

   1. účinné od 1. 1. 2000a) má-li se na sterilitu zkoušet nový přípravek,
   2. účinné od 1. 1. 2000b) kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.

   účinné od 1. 1. 2000Validace se může provést současně se zkouškou na sterilitu zkoušeného přípravku, ale před hodnocením výsledku této zkoušky.

   účinné od 1. 1. 2000Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku

   účinné od 1. 1. 2000Zkouška se může provést metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním zkoušeného přípravku do živné půdy. Vhodné negativní kontroly jsou obsaženy v každém případě. Všude tam, kde to povaha přípravku dovolí, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, se použije metoda membránové filtrace.

   účinné od 1. 1. 2000Membránová filtrace

   účinné od 1. 1. 2000Použijí se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky. Pro určité přípravky, např. antibiotika, mohou být zapotřebí speciální filtry.

   účinné od 1. 1. 2000Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do přístroje.

   účinné od 1. 1. 2000Vodné roztoky. Je-li to vhodné, přenese se na membránový filtr malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l) o pH 7,1 ± 0,2, a zfiltruje se. Tekutina může obsahovat vhodné neutralizační anebo inaktivační látky, např. v případě antibiotik.

   účinné od 1. 1. 2000Na membránový filtr nebo filtry se přenese obsah zkoušené nádoby nebo nádob, a je-li třeba, zředí se na asi 100 ml vybraným sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2 a ihned se zfiltruje. Membránový filtr se nejméně třikrát stejnou rychlostí promyje vybraným sterilním rozpouštědlem, jehož množství je stejné jako při validační zkoušce. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Užije se stejný objem půdy jako při validační zkoušce. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 32,5 °C ± 2,5 °C a půdy určené zejména k průkazu hub při 22,5 °C ± 2,5 °C a to vždy nejméně 14 dní.

   účinné od 1. 1. 2000Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), a dále se postupuje stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.

   účinné od 1. 1. 2000Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky. Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se bez ředění filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíhou a tlak nebo sání se nastavuje postupně. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), obsahující 1 g/l (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol nebo 10 g/l polysorbátu 80. Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.

   účinné od 1. 1. 2000Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit až na 1% koncentraci isopropylmyristatem, jak je popsáno výše, a zahřívat, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C. Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C. Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.

   účinné od 1. 1. 2000Přímé očkování do živných půd

   účinné od 1. 1. 2000Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jak je předepsáno v tabulce 2.6.1-2 tak, aby objem vzorku nečinil více než 10 % objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.

   účinné od 1. 1. 2000Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.

   účinné od 1. 1. 2000Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpouštědle, např. neutrálním roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.

   účinné od 1. 1. 2000Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinky, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přímo přidat k přípravku v jeho obalu.

   účinné od 1. 1. 2000Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované půdy nejméně 14 dní při teplotách uvedených v tabulce 2.6.1-1. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.

   účinné od 1. 1. 2000Odečítání a hodnocení výsledků

   účinné od 1. 1. 2000V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže zkoušený přípravek způsobí zakalení živné půdy, takže nelze určit přítomnost nebo absenci mikrobiálního růstu vizuálně po 14 dnech od začátku inkubace, přenese se vhodná část živné půdy do nové nádobky se stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci původního i nového vzorku nejméně 14 + 7 dní od původního očkování.

   účinné od 1. 1. 2000Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. Zkouška může být považována za neplatnou, je-li splněna jedna nebo více z následujících podmínek:

   1. účinné od 1. 1. 2000a) údaje o mikrobiologické kontrole prostředí, ve kterém jsou prováděny zkoušky na sterilitu, odhalí chybu,
   2. účinné od 1. 1. 2000b) prověření testovacího postupu užitého během předmětné zkoušky odhalí chybu,
   3. účinné od 1. 1. 2000c) mikrobiální růst se objeví v negativních kontrolách,
   4. účinné od 1. 1. 2000d) po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou může být růst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně připsán chybám materiálu nebo metody užitých při provádění zkoušky na sterilitu.

   účinné od 1. 1. 2000Je-li zkouška prohlášena za neplatnou, opakuje se se stejným množstvím jednotek jako původní zkouška.

   účinné od 1. 1. 2000Jestliže při opakování zkoušky není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li při opakované zkoušce zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.

   účinné od 1. 1. 2000Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita

   účinné od 1. 1. 2000Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Celkový objem filtrovaný jedním filtrem nepřesahuje 1000 ml, není-li uvedeno a schváleno jinak.

   účinné od 1. 1. 2000Použije-li se metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství podle tabulky 2.6.1-2. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo více nádob k naočkování různých půd.

   účinné od 1. 1. 2000Je-li obsah přípravku v obalu větší než 100 ml, použije se membránová metoda, není-li uvedeno a schváleno jinak

   účinné od 1. 1. 2000Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku