Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Roztok pro rozlišení (validační směs somatropinu a desamidosomatropinu). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg. Zfiltruje se přes sterilní filtr nebo se přidá azid sodný R do koncentrace 0,1 mg v mililitru roztoku a nechá se 24 h stát při pokojové teplotě.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (velikost částic 5 μm a velikost pórů 30 nm), která je umístěna mezi pumpu a nástřikový ventil,
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (0,05 mol/l) (29 + 71); průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje na 45 °C.

Před použitím se kolona promývá 200 ml až 500 ml 0,1 % (V/V) roztokem kyseliny trifluoroctové R v 50% (V/V) acetonitrilu R. Je-li třeba, promývání se opakuje do ustálení kolony.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku. Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu R v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl asi 33 min.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Na chromatogramu se objeví malý pík (desamidosomatropin) s relativním retenčním časem k hlavnímu píku asi 0,85. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky somatropinu a desamidosomatropinu je nejméně 1,0 a hodnota faktoru symetrie píku somatropinu je 0,9 až 1,8.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 6,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků s retenčním časem kratším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než 4,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Distribuce izoforem. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený roztok se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,9 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,025 mol/l).

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Použije se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5, připravený podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (14,7 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H₃PO₄/I) a jako katodický roztok se použije roztok fialaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Fokusace se nechá probíhat 2,5 h při konstantním napětí a výkonu nepřevyšujícím 25 W. Potom se vrstva gelu ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a pak na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se zbarví ponořením na 10 min do 60 °C teplého roztoku modři kyselé 83 R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) odpovídá pokynům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem při asi 5 a kyselejší menší zóna při asi 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (5 %).

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li v miligramu nejvýše 5 m.j. endotoxinu.

Stanovení obsahu

Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného roztoku v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok. Obsah lahvičky somatropinu CRL se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 mol/l) na koncentraci 1,0 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Lahvička somatropinu CRL se nechá v sušárně při 50 °C po dobu (obvykle 12 h až 24 h) dostačující k vytvoření 1 % až 5 % dimeru. Obsah lahvičky se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 mol/l) na koncentraci 1,0 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 150 000,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů 2-propanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,063 mol/l) (3 + 97); průtoková rychlost je 0,6 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 12 min až 17 min a relativní retenční časy dimeru somatropinu a proteinů s vyšší molekulovou hmotností jsou 0,90 a 0,65, vztaženo k hlavnímu píku. Rozlišení dané poměrem výšky minima nad základní linií mezi píky monomeru a dimeru k výšce píku dimeru je nejvýše 0,4.

Nastřikuje se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku.

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě –20 °C. Je třeba vyhnout se opakovanému zmrazení a rozmražení roztoku. Je-li roztok sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - obsah somatropinu v miligramech v mililitru roztoku,
2. - název a množství jakýchkoliv pomocných látek,
3. - zda je roztok sterilní,
4. - zda je roztok prostý bakteriálních endotoxinů.

† Somatropinum

Somatropin

Je to bílkovina se strukturou (191 aminokyselinových zbytků) hlavní složky růstového hormonu produkovaného lidskou hypofýzou. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 91,0% až 105,0% somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇). Vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

1 mg bezvodého somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇) odpovídá 3,0 m.j. biologické účinnosti.

Výroba

Připravuje se metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK). Při vývoji přípravku se vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou prokáže, že výrobní postup dává látku, jejíž biologická účinnost je nejméně 2,5 m.j. v miligramu.

Zkoušená látka vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům.

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek schválí oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek schválí oprávněná autorita.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Distribuce izoforem, viz Zkoušky na čistotu. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
3. C. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku trometamolovém o pH7,5 (0,05 mol/l) tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) a 30 μl tohoto roztoku se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší, např. zmrazením. Je-li okamžitě použit automatický dávkovač, udržuje se teplota na 2 °C až 8 °C.

   Porovnávací roztok. Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok s tím rozdílem, že se zkoušená látka nahradí somatropinem CRL.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
   2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   3. - mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
   4. - mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
   5. - následujícího gradientu (je-li třeba, gradient nebo teplota kolony se nastaví tak, aby se dosáhlo požadovaného rozdělení produktů enzymatického štěpení):

      Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

      Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
      0 - 20	100 → 80	0 → 20
      20 - 40	80 → 75	20 → 25
      40 - 65	75 → 50	25 → 50
      65 - 70	50→ 20	50 → 80
      70 - 71	20 → 100	80 → 0
      71 - 85	100	0

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy obou roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného somatropinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. D. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Roztok pro rozlišení (validační směs somatropinu a desamidosomatropinu). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg. Zfiltruje se přes sterilní filtr nebo se přidá azid sodný R do koncentrace 0,1 mg v mililitru roztoku a nechá se 24 h stát při pokojové teplotě.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (velikost částic 5 pm a velikost pórů 30 nm), která se umístí mezi pumpu a nástřikový ventil,
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (0,05 mol/l) (29 + 71); průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje na 45 °C.

Před použitím se kolona promývá 200 ml až 500 ml 0,1% (V/V) roztoku kyseliny trifluoroctové R v 50% (V/V) roztoku acetonitrilu R. Je-li třeba, promývání se opakuje do ustálení kolony.

Nastříkne se 20 jíl porovnávacího roztoku. Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu R v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl asi 33 min.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Na chromatogramu se objeví malý pík (desamidosomatropin) s relativním retenčním časem k hlavnímu píku asi 0,85. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky somatropinu a desamidosomatropinu je nejméně 1,0 a hodnota faktoru symetrie píku somatropinu je 0,9 až 1,8.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 6,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků s retenčním časem kratším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než 4,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Distribuce izoforem. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,9 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,025 mol/l).

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Použije se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5, připravený podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (14,7 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H₃PO₄/I) a jako katodický roztok se použije roztok fialaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Fokusace se nechá probíhat 2,5 h při konstantním napětí a příkonu nepřevyšujícím 25 W. Potom se vrstva gelu ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a pak na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se zbarví ponořením na 10 min do 60 °C teplého roztoku modři kyselé 83 R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) odpovídá pokynům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem asi 5 a kyselejší menší zóna při asi 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (5 %).

Voda, mikrostanovení (2.5.32). Nejvýše 10,0 %.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li v miligramu nejvýše 5 m.j. endotoxinu.

Stanovení obsahu

Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok Obsah lahvičky somatropinu CRL se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na koncentraci 1,0 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Lahvička somatropinu CRL se nechá v sušárně při 50 °C po dobu (obvykle 12 h až 24 h) dostačující k vytvoření 1 % až 5 % dimeru. Obsah lahvičky se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na koncentraci 1,0 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 150 000,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů 2-propanolu R a tlumivé- ho roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,063 mol/l) (3 + 97); průtoková rychlost je 0,6 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 12 min až 17 min a relativní retenční časy dimeru somatropinu a proteinů s vyšší molekulovou hmotností jsou 0,90 a 0,65, vztaženo k hlavnímu píku. Rozlišení dané poměrem výšky minima nad základní linií mezi píky monomeru a dimeru k výšce píku dimeru je nejvýše 0,4.

Nastřikuje se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku.

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch píku na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

† Stannosi chloridum dihydricum

Dihydrát chloridu cínatého

Obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny SnCl₂ . 2H₂O.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly, zvětrávající na vzduchu. Je snadno rozpustný ve vodě (roztoky se stáním nebo ředěním kalí) a v lihu 96%. Rozpouští se ve zředěné kyselině chlorovodíkové.

Zkoušky totožnosti

1. A. K 1 ml roztoku S1, viz Zkoušky na čistotu, se přidá směs obsahující 5 ml vody R a 0,05 ml chloridu rtuťnatého RS; vznikne černošedá sraženina.
2. B. 1,0 g se rozpustí ve 3,0 ml vody R a k mírně zakalenému roztoku se přidá 0,5 ml hydroxidu sodného zředěného RS; vznikne nažloutlá vločkovitá sraženina. Přidá se 6,5 ml vody R. K 1,0 ml předem protřepané suspenze se přidá 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS; sraženina se rozpustí a vzniklý roztok je čirý a bezbarvý.
3. C. 10 mg se rozpustí ve 2 ml kyseliny dusičné zředěné RS. Roztok vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S1. K 0,40 g se přidá 1 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a zředí se vodou destilovanou R na 20 ml.

Roztok S2. 1,0 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové zředěné RS, zředí se jí na 30 ml a zahřeje se k varu. Přidá se 30 ml thioacetamidu RS a 15 min se vaří (roztok A). 5 ml tohoto roztoku se zfiltruje a filtrát se zahřeje k varu. Přidá se 5 ml thioacetamidu RS a 15 min se vaří. Pokud se tvoří sraženina, přidá se ke směsi zbytek roztoku A (roztok A'). Přidá se 10 ml thioacetamidu RS a vaří se. Opakuje se série operací počínaje “5 ml tohoto roztoku...“, dokud již delší dobu po přidání 5 ml thioacetamidu RS k filtrátu získanému z 5 ml roztoku A (resp. roztoku A’, roztoku A“...) nevzniká sraženina. Jestliže sraženina nevznikla nebo již nevzniká, spojí se získaný roztok se zbytkem roztoku A (resp. roztoku A', roztoku A“...), zfiltruje se a sraženina se promyje 10 ml vody R. Filtrát se zahřívá tak dlouho, dokud unikající páry nepřestanou barvit navlhčený kousek papíru s octanem olovnatým R černošedě. Nechá se vychladnout a zředí se vodou R na 50 ml.

Vzhled roztoku. 10,0 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové zředěné RS a zředí se jí na 20 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Látky nesrážející se thioacetamidem. 25 ml roztoku S2 se odpaří do sucha avyžíhá se při 600 °C. Zbytek váží nejvýše 1 mg (0,2 %).

Sírany (2.4.13). 15 ml roztoku S1 vyhovuje limitní zkoušce na sírany (500 μg/g).

Těžké kovy. 1,0 g se rozpustí ve 2 ml směsi objemových dílů kyseliny dusičné R a kyseliny chlorovodíkové R (1+3). Roztok se zahřívá na vodní lázni, dokud se nepřestanou vyvíjet páry oxidů dusíku. Zbytek se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml. K 5 ml tohoto roztoku se přidají 3 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a 2 ml vody R. Zahřívá se do získání čirého roztoku, ochladí se a přidá se 0,5 ml zkoumadla thioacetamidového R. Zbarvení roztoku není po 2 min intenzivnější než zbarvení směsi obsahující 1,0 ml základního roztoku olova (10 jug Pb/ml), 6 ml vody R, 3 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a 0,5 ml zkoumadla thioacetamidového R (50 μg/g).

Železo (2.4.9). 5 ml roztoku S2 se zředí vodou R na 10 ml; roztok vyhovuje limitní zkoušce na železo (100 μg/g).

Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí v 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zředí se vodou R na 50 ml. Přidá se 5 g vínanu draselno-sodného R, 10 g hydrogenuhličitanu sodného R a 1 ml škrobu RS a ihned se titruje jodem 0,05 mol/l VS. Provede se slepá zkouška.

1 ml jodu 0,05 mol/l VS odpovídá 11,28 mg SnCl₂ . 2H₂O.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech.

Separandum.

Stearinum

Stearin

Synonymum. Acidum stearicum

CAS 57-11-4

Je to směs obsahující hlavně kyselinu stearovou (C₁₈H₃₆O₂, M_r 284,48) a palmitovou (C₁₆H₃₂O₂,M_r 256,43).

Výroba

Je-li stearin vyráběn z tkání savců nebo z jiných materiálů získaných z teplokrevných živočichů, musí tato zvířata splňovat požadavky oprávněné autority na zdravá zvířata určená pro humánní konzumaci. Kromě toho tkáně nemají obsahovat žádné riziko definované odpovídajícími mezinárodními předpisy, nebo kde je to vhodné, národními předpisy.

Vlastnosti

Bílé voskovité vločky, bílá tvrdá hmota, na omak mastná, lomu zrnitě krystalického, nebo bílý nebo nažloutle bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96% a etheru petrolejovém (50 °C až 70 °C).

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: D.

Alternativní sestava zkoušek: A, B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 53 °C až 62 °C.
2. B. Číslo kyselosti (2.5.1). 198 až 210; stanoví se s 0,50 g zkoušené látky.
3. C. Směs ze zkoušky Tuk a parafiny, viz Zkoušky na čistotu, po ochlazení ztuhne v bílou hmotu.
4. D. Zkouška Podíl mastných kyselin, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1,0 g se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 20 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není intenzivněji zbarven než porovnávací barevný roztok Ž₅ (2.2.2, Metoda II).

Teplota tuhnutí (2.2.18). Nejméně 53 °C.

Číslo jodové (2.5.4). Nejvýše 3.

Tuk a parafiny. K 1,0 g se přidá 30 ml roztoku obsahujícího 0,5 g uhličitanu sodného bezvodého R a zahřeje se k varu. Ještě horká směs neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze II (2.2.1). Tato směs se použije ke zkoušce totožnosti C.

Kyseliny rozpustné ve vodě. 0,5 g se 2 min třepe s 10 ml horké vody prosté oxidu uhličitého R a po ochlazení se zfiltruje. Filtrát se po přidání 0,1 ml fenolftaleinu RS a 0,05 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS zbarví červeně.

Podíl mastných kyselin. Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. 0,100 g se zahřívá pod zpětným chladičem s 5,0 ml roztoku fluoridu boritého R (140 g/l) v methanolu R 15 min nebo do úplného rozpuštění. Po ochlazení se směs převede do dělicí nálevky pomocí 10 ml hexanu R. Roztok se protřepe s10 ml vody R a 10 ml chloridu sodného nasyceného RS. Po oddělení fází se spodní fáze odstraní. Horní fáze se vysuší síranem sodným bezvodým R a zfiltruje se. Filtrát se použije jako zkoušený roztok.

Porovnávací roztok. 25,0 mg methylpalmitatu R a 25,0 mg methylstearatu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii R (např. Chromosorb W, 80/100 mesh) impregnovanou 10 % vhodného dimethylsilikonu pro plynovou chromatografii (např. SE-30®),
2. - dusíku pro chromatografii R s průtokovou rychlostí 50 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 215 °C, teplota vstřikovacího prostoru a detektoru na 260 °C. Nastříkne se odděleně po 1 μl až 2 μl porovnávacího roztoku a zkoušeného roztoku.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku se identifikují píky methylpalmitatu a methylstearatu pomocí chromatogramu porovnávacího roztoku (methylstearat má delší retenční čas než methylpalmitat).

Součet ploch všech píků, kromě píku rozpouštědla, na chromatogramu zkoušeného roztoku je 100%. Podíl methylstearatu je nejméně 40,0% a celkové množství methylstearatu a methylpalmitatu je nejméně 90,0 %.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,0 g zkoušené látky.

Uchovávání

V dobře uzavřeném obalu.

Stearomacrogolum

Stearomakrogol

Synonymum. Macrogoli aetherum stearylicum

CAS 9005-00-9

Je to směs etherů získaná ethoxylací oktadekanolu (stearylalkoholu). Může obsahovat nějaké volné makrogoly a různá množství volného stearylalkoholu. Množství ethylenoxidu zreagovaného se stearylalkoholem je dvě ku dvaceti jednotkám na molekulu (nominální hodnota).

Výroba

Je-li stearomakrogol získáván z tkání savců nebo jiných materiálů teplokrevných zvířat, musí tato zvířata splňovat požadavky oprávněné autority, které se kladou na zvířata určená pro humánní konzumaci. Navíc tyto tkáně nesmí obsahovat specifický rizikový materiál, který je definován odpovídajícími mezinárodními, nebo kde je to vhodné, národními požadavky.

Vlastnosti

Bílá až žlutobílá voskovitá mastná hmota, tablety, mikrokuličky nebo vločky.

Stearomakrogol se dvěma jednotkami ethylenoxidu na molekulu je prakticky nerozpustný ve vodě, rozpustný v lihu 96% po zahřátí a v dichlormethanu. Stearomakrogol s deseti jednotkami ethylenoxidu na molekulu je dobře rozpustný ve vodě a v lihu 96%. Stearomakrogol s dvaceti jednotkami ethylenoxidu na molekulu je dobře rozpustný ve vodě, v lihu 96% a v dichlormethanu.

Po roztavení tuhne při asi 45 °C.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Číslo jodové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Zkouška Číslo zmýdelnění, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
4. D. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu R.

   Zkoušený roztok. 10,0 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R danethanoluR (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 75 ml. Přidá se 60 ml heptanu R a protřepává se 3 min. Tvorba pěny může být snížena přídavkem několika kapek lihu 96% R. Horní vrstva se filtruje přes síran sodný bezvodý R, filtr se promyje třikrát 10 ml heptanu R a spojené filtráty se odpaří do sucha. 50 mg vysušených heptanových extraktů se rozpustí v 10 ml methanoluR (roztok může opalizovat).

   Porovnávací roztok. 25 mg stearylalkoholu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 25 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 20 μl obou roztoků a vyvíjí se ethylacetatem R po dráze 15 cm. Vrstva se usuší a postříká vanilinem v kyselině sírové (0,5 g vanilinu R se rozpustí v 50 ml lihu 96% R a zředí se kyselinou sírovou R na 100 ml). Vrstva se usuší na vzduchu, zahřívá se 15 min při asi 130 °C a ochladí se na vzduchu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je několik skvrn; jedna z nich odpovídá hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. E. 0,1 g se rozpustí nebo disperguje v 5 ml lihu 96% R, přidají se 2 ml vody R, 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS, 10 ml chloridu barnatého RS1 a 10 ml roztoku kyseliny fosfomolybdenové R (100 g/l); vzniká sraženina.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 5,0 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 50 ml. Roztok není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₅ (2.2.2, Metoda II).

Zásaditě reagující látky. 2,0 g se rozpustí v horké směsi 10 ml lihu 96% R a 10 ml vody R. Přidá se 0,1 ml modři bromthymolové RS1. Ke změně zbarvení indikátoru do žlutá se spotřebuje nejvýše 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 1,0; stanoví se s 5,0 g zkoušené látky.

Hydroxylové číslo (2.5.3, Metoda A). Viz níže uvedená tabulka.

Číslo jodové (2.5.4). Nejvýše 2,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). Nejvýše 3,0; stanoví se s 10,0 g zkoušené látky.

Zbytkový ethylenoxid a dioxan (2.4.25). Nejvýše 1 μg/g zbytkového ethylenoxidu a nejvýše 10 μg/g zbytkového dioxanu. Při stanovení obsahu dioxanu se použije při výpočtu korekční faktor 1/5.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede počet ethylenoxidových jednotek zreagováných se stearylalkoholem (nominální hodnota).

§§ Sufentanili dihydrogenocitras

Sufentaniliumdihydrogencitrat

Synonymum. Sufentanili citras

Je to 4-[(N-fenyl)propanamido]-4-methoxymethyl-1-[2-(2-thienyl)ethyl]piperidinium-dihydrogencitrat. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C₂₈H₃₈N2O₉S.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je dobře rozpustný ve vodě a v lihu 96%, snadno rozpustný v methanolu.

Taje při asi 140 °C, za rozkladu.

Zkouška totožnosti

Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. sufentaniliumdihydrogencitratu.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,2 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Pro přípravu in šitu degradační sloučeniny (sufentanil nečistota E) se rozpustí 10 mg v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 4 h se zahřívá na vodní lázni pod zpětným chladičem. Pak se zneutralizuje 10,0 ml hydroxidu sodného zředěného RS a odpaří se do sucha na vodní lázni. Po ochlazení se zbytek rozpustí v 10 ml methanolu R a zfiltruje se. Porovnávací roztok (b). 5,0 ml zkoušeného roztoku se zředí methanolem R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min:
3. - mobilní fáze A - roztok uhličitanu amonného R (5 g/l) ve směsi objemových dílů tetrahydrofuranu R a vody R (10 + 90),
4. - mobilní fáze B - acetonitril R,
5. - gradientového programu za použití následujících podmínek:

   Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Stannosi chloridum dihydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Stearinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Stearomacrogolum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování §§ Sufentanili dihydrogenocitras Vlastnosti Zkouška totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   0 - 15	90 → 40	10 → 60	lineární gradient izokraticky
   15 - 20	40	60	přepnutí na původní
   			podmínky
   20 - 25	90	10	začátek nového
   25 = 0	90	10	gradientu

1. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Kolona se promývá do ustavení rovnováhy nejméně 30 min acetonitrilem R a pak nejméně 5 min mobilní fází o počátečním složení. Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) při nástřiku 10 μl byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: sufentanilu nečistoty E asi 12 min asufentanilu asi 13 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky sufentanilu a sufentanilu nečistoty E je nejméně 4,0. Pokud je to nutné, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo program lineárního gradientu.

Nastříkne se odděleně 10 μl methanolu R jako slepá zkouška, 10 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,0%). Nepřihlíží se k žádnému píku získanému ve slepé zkoušce, k žádnému píku, jehož relativní retenční čas vztažený k hlavnímu píku je 0,05 nebo méně, a k žádnému píku s plochou menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší ve vakuové sušárně při 60 °C.

Stanovení obsahu

0,400 g se rozpustí v 50 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a 2-butano- nu R (1 + 7). Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za použití 0,2 ml naftolbenzeinu RS jako indikátoru.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 57,87 mg C₂₈H₃₈N₂O₉S.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Omamná látka.

Nečistoty

1. A. N-fenyl-N-(4-methoxymethyl-4-piperidyl)propanamid,
   

1. B. cis-4-[(N-fenyl) propionylamino]-4-methosymethyl-1-[2-(2-thieny)ethyl]piperidin-1-oxid,
   

1. C. {4-fenylamino-1-[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidyl} methanol,
   

1. D. N-fenyl-{4-methoxymethyl-1-[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidyl]}acetamid,
   

1. E. N-fenyl-{4-methoxymethyl-1-[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidyl}amin,
   

1. F. N-fenyl-N-{4-methoxymethyl-1-[2-(3-thienyl)ethyl-4-piperidyl]}propionamid,

1. G. 4-{[(N-fenyl)propionylamino]-1 -[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidyl}methylpropionat,
   

1. H. N-fenyl-N-{4-methoxymethyl-1-[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidyl}butyramid,
   

1. I. trans-4-[(N-fenyl)propylamino]-4-methoxymethyl-1-[2-(2-thienyl)ethyl]piperidin-1-oxid.

Talcum

Mastek

Je to práškovaný vybraný přírodní hydratovaný křemičitan hořečnatý. Může obsahovat proměnlivá množství doprovodných minerálů, mezi kterými převažují chlority (hydrátované křemičitany hlinito-hořečnaté), magnézií (uhličitan hořečnatý), kalcit (uhličitan vápenatý) a dolomit (uhličitan vápenato-hořečnatý).

Výroba

Mastek získaný z ložisek známých obsahem azbestu není vhodný pro farmaceutické použití. Provede se zkouška na amfiboly a na serpentiny; výrobce je zodpovědný za prohlášení, že výrobek neobsahuje azbest. Přítomnost amfibolů a serpentinů se určí rentgenovou difrakcí nebo infračervenou spektrofotometru (viz A a B). Pokud jsou tyto látky detegovány, sledují se specifická morfologická kritéria azbestu vhodnou metodou optické mikroskopie, aby se zjistilo, zda se jedná o tremolitový azbest nebo chryzolit, jak je níže popsáno.

1. A. Provede se absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti (2.2.24) v rozmezí 740 cm^-1 až 760 cm_-¹ za použití rozšířené stupnice; absorpční pás při (758 ±1) cm^-1 může ukazovat přítomnost tremolitu nebo chloritu. Pokud se absorpční pás objeví i po vyžíhání při 850 °C (nejméně 30 min), je přítomen tremolit. V rozmezí 600 cm^-1 až 650 cm^-1 za použití rozšířené stupnice může absorpční pás nebo prodleva ukazovat přítomnost serpentinů. Měří se tablety zkoušené látky připravené za použití bromidu draselného R.
2. B. Provede se rentgenová difrakce za následujících podmínek:
   1. - Cu Ka monochromatické 40 kV záření, 24 mA až 30 mA,
   2. - vstupní štěrbina 1°,
   3. - výstupní štěrbina 0,2°,
   4. - rychlost goniometru: l/lO°20/min,
   5. - snímací rozmezí: 10° až 13° 20 a 24° až 26° 20,
   6. - vzorek není orientován.

   Vzorek se umístí do držáku; přikryje se vyleštěným mikroskopickým sklíčkem a zaznamenají se difraktogramy.

   Přítomnost amfibolů je dokázána difrakčním píkem při (10,5 ± 0,1)° 20 a přítomnost serpentinů je dokázána difrakčními píky při (24,3 ± 0,1)° 20 až (12,1 ± 0,1)° 20.

   Pokud byla jednou z těchto metod prokázána přítomnost amfibolů a/nebo serpentinů, zkouší se dále vhodnou metodou optické mikroskopie charakter azbestu.

   Přítomnost azbestu se prokáže za použití optické mikroskopie, pokud jsou splněna následující kritéria:

   1. - poměr délky a šířky se pohybuje v rozmezí 20 : 1 až 100 : 1 nebo je vyšší u vláken delších než 5 μm,
   2. - schopnost štěpení do velmi tenkých vláken, a pokud jsou splněna dvě nebo více z následujících čtyř kritérií:
   3. - rovnoběžná vlákna se vyskytují ve svazcích,
   4. - svazky vláken mají roztřepené konce,
   5. - vlákna jsou ve formě tenkých jehliček,
   6. - propletená jednotlivá vlákna a/nebo vlákna vykazují zakřivení.

Vlastnosti

Lehký homogenní bílý nebo téměř bílý prášek, mastný na dotek (neabrazivní). Je prakticky nerozpustný ve vodě, v lihu 96% a ve zředěných roztocích kyselin a alkalických hydroxidů.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky vykazuje absorpční pásy při (3677 ± 2) cm^-1, při (1018 ± 2) cm^-1 a při (669 ± 2) cm^-1. Tablety se připraví za použití bromidu draselného R.
2. B. Směs obsahující 0,2 g uhličitanu sodného bezvodého R a 2,0 g uhličitanu draselného R se taví v platinovém kelímku. K roztavené hmotě se přidá 0,1 g zkoušené látky a zahřívá se do úplného roztavení směsi. Po ochlazení se roztavená hmota přenese s 50 ml horké vody R do odpařovací misky a přidává se kyselina chlorovodíková R, dokud směs nepřestane šumět. Pak se přidá 10 ml kyseliny chlorovodíkové R a odpaří se do sucha na vodní lázni. Po ochlazení se přidá 20 ml vody R, zahřeje se k varu a zfiltruje se (zbytek se použije ve zkoušce totožnosti C). K 5 ml filtrátu se přidá 1 ml amoniaku 17,5% RS a 1 ml chloridu amonného RS a zfiltruje se. K filtrátu se přidá 1 ml hydrogenfosforečnanu sodného RS; vznikne bílá krystalická sraženina.
3. C. Zbytek získaný ve zkoušce totožnosti B vyhovuje zkoušce na křemičitany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S1. 10,0 g se naváží do kuželové baňky opatřené zpětným chladičem, postupně se přidává 50 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l RS za stálého míchání a zahřívání na vodní lázni po dobu 30 min. Po ochlazení se směs přenese do kádinky a nerozpuštěná látka se nechá sedimentovat. Supernatantní tekutina se zfiltruje přes středně rychlý filtrační papír do 100ml odměrné baňky tak, aby co nejvíce nerozpuštěné látky zůstalo v kádince. Zbytek a kádinka se třikrát promyjí 10 ml horké vody R, pak se promyje filtr 15 ml horké vody R, filtrát se ochladí a zředí se stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Roztok S2. 0,5 g se naváží do 100ml polytetrafluorethylenové misky, přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové R, 5 ml kyseliny dusičné prosté olova R, 5 ml kyseliny chloristé R, opatrně se zamíchá, pak se přidá 35 ml kyseliny fluorovodíkové R a pomalu se odpařuje do sucha na horké desce. Ke zbytku se přidá 5 ml kyseliny chlorovodíkové R, přikryje se hodinovým sklíčkem, zahřeje se k varu a nechá se ochladit. Hodinové sklíčko i miska se vypláchnou vodou R do odměrné baňky obsahující 5 ml roztoku chloridu česného R (25,34 g/l), miska se znovu vypláchne vodou R a obsah baňky se zředí stejným rozpouštědlem na 50,0 ml.

Hodnota pH (2.2.3). 7,0 až 9,0; měří se filtrát získaný ve zkoušce Látky rozpustné ve vodě. Hodnota se odečte 1 min po vložení elektrody.

Látky rozpustné ve vodě. K 10,0 g se přidá 50 ml vody prosté oxidu uhličitého R, zahřeje se k varu a 30 min se vaří pod zpětným chladičem. Po ochlazení se zfiltruje přes středně rychlý filtrační papír a zředí se vodou prostou oxidu uhličitého R na 50,0 ml. 25,0 ml tohoto filtrátu se odpaří do sucha a 1 h se zahřívá při 105 °C. Zbytek váží nejvýše 10 mg (0,2 %).

Hliník. Nejvýše 2,0 %; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. K 5,0 ml roztoku S2 se přidá 10 ml roztoku chloridu česného R (25,34 g/l), 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a zředí se vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Do čtyř stejných odměrných baněk obsahujících po 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a po 10 ml roztoku chloridu česného R (25,34 g/l), se převede 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml a 20,0 ml základního roztoku hliníku (100 μg Al/ml) a všechny roztoky se zředí vodou R na 100,0 ml.

Změří se absorbance při 309,3 nm za použití hliníkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene oxid dusný-acetylen.

Vápník. Nejvýše 0,9 %; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. K 5,0 ml roztoku S2 se přidá 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R, 10 ml chloridu lanthanitého RS a zředí se vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Do čtyř stejných odměrných baněk obsahujících po 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a po 10 ml chloridu lanthanitého RS se převede 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml a 4,0 ml základního roztoku vápníku (100 μg Ca/ml)(l) a všechny roztoky se zředí vodou R na 100,0 ml.

Změří se absorbance při 422,7 nm za použití vápníkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene oxid dusný-acetylen.

Železo. Nejvýše 0,25 %; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. K 2,5 ml roztoku S1 se přidá 50,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l RS a zředí se vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Do čtyř stejných odměrných baněk obsahujících po 50,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l RS se převedou 2,0 ml, 2,5 ml, 3,0 ml a 4,0 ml základního roztoku železa (250 μg Fe/ml) a všechny roztoky se zředí vodou R na 100,0 ml.

Změří se absorbance při 248,3 nm za použití železné lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen. Provede se korekce za použití deuteriové lampy.

Hořčík. 17,0 % až 19,5 %; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 0,5 ml roztoku S2 se zředí vodou R na 100,0 ml. K 4,0 ml tohoto roztoku se přidá 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R, 10 ml chloridu lanthanitého RS a zředí se vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Do čtyř stejných odměrných baněk obsahujících po 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a po 10 ml chloridu lanthanitého RS se převedou 2,5 ml, 3,0 ml, 4,0 ml a 5,0 ml základního roztoku hořčíku (10 μg Mg/ml)(l) a všechny roztoky se zředí vodou R na 100,0 ml.

Změří se absorbance při 285,2 nm za použití hořčíkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen.

Olovo. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. Roztok S1.

Porovnávací roztoky. Do čtyř stejných odměrných baněk obsahujících po 50,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l RS se převede 5,0 ml, 7,5 ml, 10,0 ml a 12,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml)(l) a všechny roztoky se zředí vodou R na 100,0 ml.

Změří se absorbance při 217,0 nm za použití olověné lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen.

Ztráta žíháním. Nejvýše 7,0 %; 1,000 g se žíhá při 1050 °C až 1100 °C do konstantní hmotnosti.

Mikrobiální znečištění. Pokud je látka určena pro lokální podání, celkový počet živých mikroorganismů (2.6.12) je nejvýše 10² aerobních bakterií a hub v gramu.

Pokud je látka určena pro perorální podání, celkový počet živých mikroorganismů (2.6.12) je nejvýše 10³ aerobních bakterií v gramu a nejvýše 10² hub v gramu.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka vhodná pro lokální nebo perorální podání.

† Terbutalini sulfas

Terbutaliniumsulfat

Je to bis {N-terc.butyl-[(2RS)-2-(3,5-dihydroxyfenyl)-2-hydroxyethyl]amonium} sulfát. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₂₄H₄₀N₂O₁₀S.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem terbutaliniumsulfatu CRL. Pokud se spektra získaná v pevném stavu liší, rozpustí se odděleně zkoušená látka i referenční látka v methanolu prostém aldehydů R, odpaří se do sucha a se zbytky se zaznamenají nová spektra.
2. B. 5 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, vyhovuje zkoušce (a) na sírany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 1,0 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1). Absorbance roztoku S (2.2.25) měřená při 400 nm v 2cm kyvetě je nejvýše 0,11.

Kysele reagující látky. K 10 ml roztoku S se přidá 0,05 ml červeně methylové RS. Ke změně indikátoru na žluté zbarvení se spotřebuje nejvýše 1,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Optická otáčivost (2.2.7). –0,10° až +0,10°. Měří se roztok S.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 75,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 7,5 mg terbutalinu nečistoty C CRL a 22,5 mg terbutaliniumsulfatu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 50,0 ml. 2 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je roztok 4,23 g hexansulfonanu sodného R v 770 ml roztoku mravenčanu amonného R (0,050 mol/l), který se připraví následovně: 3,15 g mravenčanu amonného R se rozpustí v 980 ml vody R, pH se upraví přidáním asi 8 ml kyseliny mravenčí bezvodé R na hodnotu 3,0 a zředí se vodou R na 1000 ml; potom se přidá 230 ml methanolu R; průtoková rychlost je 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % rozsahu celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: terbutaliniumsulfatu nečistoty C asi 9 min a terbutaliniumsulfatu asi 11 min.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem terbutalinu nečistoty C a pikem terbutaliniumsulfatu je nejméně 2,0. Je-li třeba, upraví se složení mobilní fáze. Zvýšením koncentrace methanolu se zvýší retenční čas.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku, 20 μl porovnávacího roztoku (a) a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající 2,5násobku retenčního času terbutaliniumsulfatu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, odpovídajícího píku terbutalinu nečistotě C, větší než dvojnásobek plochy odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,2 %); plocha žádného jiného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku odpovídajícího terbutalinu nečistotě C, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,4 %). Nepřihlíží se k píkům mobilní fáze a k píkům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší 3 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

0,400 g se zahřátím rozpustí v 70 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 54,87 mg C₂₄H₄₀N₂O₁₀S.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina 3,5-dihydroxybenzoová (kyselina α-resorcylová),
   

1. B. (4RS)-2-terc.butyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-4,6,8-triol,
   

1. C. (3,5-dihydroxyfenyl)-terc.butylaminomethylketon.

† Terconazolum

Terkonazol

Je to 1-{4-{[(2RS,4SR)-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-[(1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl]-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy}fenyl}-4-isopropylpiperazin. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C₂₆H₃₁CI₂N₅O₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dichlormethanu, dobře rozpustný v acetonu, mírně rozpustný v lihu 96%.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem terkonazolu CRL. Pokud se spektra získaná v pevném stavu liší, rozpustí se odděleně zkoušená látka i referenční látka v minimálním množství acetonu R, odpaří se do sucha v proudu vzduchu a se zbytky se zaznamenají nová spektra.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 30 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

   Porovnávací roztok (a). 30 mg terkonazolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

   Porovnávací roztok (b). 30 mg terkonazolu CRL a 30 mg ketokonazolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 5 μl každého roztoku. Vyvíjí se v nenasycené komoře mobilní fází, která je směsí objemových dílů octanu amonného RS, dioxanu R a methanolu R (20 + 40 + 40) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 15 min v proudu horkého vzduchu a pak se vystaví působení jodových par do objevení skvrn. Pozoruje se v denním světle; hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje polohou, barvou a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. C. K 30,0 mg v porcelánovém kelímku se přidá 0,3 g uhličitanu sodného bezvodého R, 10 min se zahřívá nad otevřeným plamenem a nechá se zchladnout. Zbytek se rozpustí v 5 ml kyseliny dusičné zředěné RS a zfiltruje se. K 1 ml filtrátu se přidá 1 ml vody R; roztok vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Optická otáčivost. –0,10° až +0,10°; měří se roztok připravený rozpuštěním 1,0 g v dichlormethanu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2,5 mg terkonazolu CRL a 2,0 mg ketokonazolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí methanolem R na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek R (3 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 2,0 ml/min:
3. - mobilní fáze A - roztok tetrabutylamoniumhydrogensulfatu R (3,4 g/l),
4. - mobilní fáze B - acetonitril R,
5. - gradientového programu za použití následujících podmínek:

   Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Stannosi chloridum dihydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Stearinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Stearomacrogolum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování §§ Sufentanili dihydrogenocitras Vlastnosti Zkouška totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Talcum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Označování † Terbutalini sulfas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Terconazolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   0 - 10	95 → 50	5 → 50	lineární gradient
   10 - 15	50	50	izokraticky
   15 - 20	95	5	přepnutí na původní
   			podmínky
   20 = 0	95	5	začátek dalšího
   			gradientu

1. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Kolona se promývá do ustavení rovnováhy nejméně 30 min acetonitrilem R při průtokové rychlosti 2 ml/min a pak nejméně 5 min mobilní fází o počátečním složení.

Nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) při nástřiku 10 μl byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 (0,1 porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: ketokonazolu asi 6 min a terkonazolu asi 7,5 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky ketokonazolu a terkonazolu je nejméně 13,0. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo program lineárního gradientu.

Nastříkne se odděleně 10 μl methanolu R jako slepá zkouška, 10 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,25 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Nepřihlíží se k žádnému píku získanému ve slepé zkoušce a k žádnému píku s plochou menší než 0,2násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %, 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí v 70 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a 2-butanonu R (1 + 7). Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence do druhého inflexního bodu (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 17,75 mg C₂₆H₃₁Cl₂N₅O₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 1-{4-{[(2RS,4RS)-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-[(1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl]-1,3-dioxolan-4-yl [methoxy} fenyl}-4-isopropylpiperazin,
   

1. B. 1-{4-{[(2RS,4SR)-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-[(4H-1,2,4-triazol-4-yl)methyl]-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy} fenyl}-4-isopropylpiperazin.

† Testosteronum

Testosteron

Je to 17β-hydroxy-4-androsten-3-on. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C₁₉H₂₈O₂.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé nebo nažloutle bílé krystaly. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96% a v dichlormethanu, prakticky nerozpustný v mastných olejích.

Taje při asi 155 °C.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem testosteronu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +106° až +114°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu F₂₅₄ pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,25 g se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí dichlormethanem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (b). 12,5 mg testosteronu CRL se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 5 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg testosteronu nečistoty A CRL se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí zkoušeným roztokem (a) na 5 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí stejných objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pak se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než hlavní skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Ztráta sušením (2.2.22). Nejvýše 1,0 %; 0,500 g se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

50,0 mg se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 241 nm.

Vypočítá se obsah C₁₉H₂₈O₂ za použití specifické absorbance, která má hodnotu 569.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 4-androsten-3,17-dion (androstendion),
   

1. B. 3-ethoxy-3,5-androstadien-17-on (enolether androstendionu).

†† Thiomersalum

Thiomersal

Je to natrium-2-(ethylhydrargyriothio)benzoat. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0 % až 101,0 % sloučeniny C₉H₉HgNaO₂S.

Vlastnosti

Bílý až slabě nažloutlý krystalický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96% a prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

1. A. 0,5 g se rozpustí v 10 ml vody a přidá se 0,5 ml kyseliny sírové zředěné RS. Vyloučená bílá sraženina se odfiltruje, promyje se malým množstvím vody R a překrystalizuje se z lihu 96% R. Vzniklé krystaly se odfiltrují a usuší se nad oxidem fosforečným R za sníženého tlaku nepřevyšujícího 2,7 kPa; taje (2.2.14) při 107 °C až 115 °C (za rozkladu).
2. B. Asi 0,1 g se rozpustí v 10 ml vody R a přidají se 2 ml dusičnanu stříbrného RS2; vzniká nažloutlá sraženina.
3. C. 50 mg se rozpustí v 5 ml kyseliny sírové R. Zelenožlutý roztok se zahřeje na vodní lázni; do 2 min vznikne sytě červené zbarvení.
4. D. 50 mg se spálí v kyslíku (2.5.10), při tom se plyny absorbují do směsi 50 ml vody R a 1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R. K získanému roztoku se přidá 5 ml kyseliny dusičné zředěné RS. 0,1 ml tohoto roztoku vyhovuje zkoušce (a) na rtuť (2.3.1). Ke zbytku roztoku se přidá 10 ml kyseliny chlorovodíkově zředěné RS a vzniklá sraženina se zfiltruje. 5 ml filtrátu vyhovuje zkoušce (a) na sírany (2.3.1) (bez přidání kyseliny chlorovodíkové zředěné RS).
5. E. 20 mg se rozpustí v 0,5 ml vody R. Roztok vyhovuje zkoušce (b) na sodík (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,0 až 7,4. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.

Cizí snadno zuhelnitelné organické látky. 20 mg se rozpustí ve 2 ml kyseliny sírové R. Roztok není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok ZŽ₁ (2.2.2, Metoda I).

Anorganické sloučeniny rtuti. Nejvýše 0,70 %.

Jodidové zkoumadlo. 33,2 g jodidu draselného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. Roztok se uchovává nejvýše 1 den dobře uzavřen a chráněn před světlem.

Zkoušený roztok (a). 0,500 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 10,0 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50,0 ml.

Zkoušený roztok (c). K 10,0 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 5 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se vodou R na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 0,1900 g chloridu rtuťnatého R se zředí vodou R na 200,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 50,0 ml (asi 95 μg chloridu rtuťnatého v mililitru).

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 5 ml jodidového zkoumadla a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Během stanovení absorbance musí být všechny roztoky chráněny před světlem.

Pět odměrných baněk o objemu 10 ml se označí A, B, C, D a E. Do baněk A a B se převede po 5,0 ml zkoušeného roztoku (b), do baněk C a D se převede po 5,0 ml zkoušeného roztoku (c) a do baňky E se převede 5,0 ml vody R. Baňky A a C se doplní vodou R a baňky B, D a E jodidovým zkoumadlem po značku.

Měří se absorpční maximum porovnávacího roztoku (b) (2.2.25) při vlnové délce asi 323 nm proti vodě R. Nakonec se změří absorbance roztoků ve zkumavkách A, B, C, D a E proti vodě R při stejné vlnové délce (A_A, A_B, A_C, A_D a A_E).

Obsah anorganických sloučenin rtuti v procentech se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

Látky rozpustné v etheru. 0,5 g se protřepává 10 min s 20 ml etheru R. Směs se zfiltruje a filtr s nerozpuštěnou látkou se promyje 5 ml etheru R a spojené filtráty se odpaří v předem vysušené a zvážené odpařovací misce do sucha. Zbytek se usuší nad oxidem fosforečným R za sníženého tlaku nepřevyšujícího 2,7 kPa; váží nejvýše 3 mg.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně 2 h při 105 °C.

Stanovení obsahu

Asi 0,500 g se ve spalovací Kjeldahlově baňce s vloženou nálevkou zahřívá s 5 ml kyseliny sírové R až do počínajícího uhelnatění. Pak se v zahřívání pokračuje a zároveň se opatrně přidává po kapkách peroxid vodíku koncentrovaný R do vzniku čirého roztoku. Po přidání 10 ml vody R se roztok zahřívá do vzniku bílého dýmu. Potom se přidá 10 ml vody R, nechá se ochladit a po přidání 2 ml síranu amonno-železitého RS2 se titruje thiokyanatanem amonným 0,1 mol/l VS do červenohnědého zbarvení.

1 ml thiokyanatanu amonného 0,1 mol/l VS odpovídá 20,24 mg C₉H₉HgNaO₂S.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

Threoninum ¹)

Threonin

Je to kyselina (2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C₄H₉NO₃.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je dobře rozpustný ve vodě, prakticky nerozpustný v lihu 96% a v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety threoninu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. 1 ml roztoku zkoušené látky (2 g/l) se smíchá s 1 ml roztoku jodistanu sodného R (20 g/l). Přidá se 0,2 ml piperidinu R a 0,1 ml roztoku nitroprussidu sodného R (25 g/l); vznikne modré zbarvení, které se po několika minutách mění na žluté.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 100 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a. bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,0 až 6,5; měří se roztok S.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). –27,6° až –29,0°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 1,50 g ve vodě R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové zředěné RS a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg threoninu CRL se rozpustí v roztoku kyseliny chlorovodíkové R 1% (V/V) a zředí se jím na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg threoninu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí v roztoku kyseliny chlorovodíkové R 1% (V/V) a zředí se jím na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, usuší se na vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Chloridy (2.4.4). 10 ml roztoku S se zředí vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Sírany (2.4.13). 0,5 g se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium (2.4.1). 0,10 g vyhovuje limitní zkoušce B na amonium (200 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 0,2 ml základního roztoku amonia (100 μg NH/ml).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; suší se 1,000 g v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí v 5 ml kyseliny mravenčí bezvodé R, přidá se 30 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 11,91 mg C₄H₉NO₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Thymi etheroleum

Tymiánová silice

Synonyma. Oleum thymi, Thymi aetheroleum

CAS 8007-46-3

Je to silice získaná z čerstvé kvetoucí natě druhu Thymus vulgaris L., Thymus zygis LOEFL. ex L. nebo směsi obou druhů destilací s vodní párou.

Vlastnosti

Čirá žlutá nebo velmi tmavá červenohnědá těkavá kapalina, charakteristického aromatického kořeněného pachu, připomínajícího thymol, mísitelná s ethanolem, etherem a etherem petrolejovým.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodné vrstvy silikagelu.

   Zkoušený roztok. 0,2 g zkoušené látky se rozpustí v pentanu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok. 0,15 g thymolu R, 25 μl terpinen-4-olu R a 40 μl linalolu R se rozpustí v pentanu R a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 20 μl každého roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (5 + 95) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se anisaldehydem RS a suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C. Pozoruje se v denním světle. Tři skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou a zbarvením skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku: fialová skvrna odpovídá terpinen-4-olu, další fialová skvrna odpovídá linalolu a hnědorůžová skvrna odpovídá thymolu. Bezprostředně pod těmito skvrnami je bleděfialová skvrna odpovídající karvakrolu. Velká fialová skvrna v čele chromatogramu odpovídá uhlovodíkům.

1. B. Hodnotí se chromatogramy ve zkoušce Chromatografický profil, viz Zkoušky na čistotu. Retenční časy hlavních píků na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají retenčním časům hlavních píků na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Relativní hustota (2.2.5). 0,915 až 0,935.

Index lomu (2.2.6). 1,490 až 1,505.

Chromatografický profil. Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Zkoušená látka.

Porovnávací roztok 0,15 g β-myrcenu R, 0,1 g γ-terpinenu R, 0,1 g p-cymenu R, 0,1 g linalolu R, 0,2 g terpinen-4-olu R, 0,2 g thymolu R a 0,05 g karvakrolu R se rozpustí v 5 ml hexanu R.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 25 m až 60 m a vnitřního průměru asi 0,3 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R,
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu,
3. - plamenoionizačního detektoru,
4. - dělicího poměru 1/100.

Teplota kolony se udržuje 15 min na 60 °C, pak se zvyšuje rychlostí 3 °C za min až na 180 °C, při níž se udržuje; teplota nástřikového prostoru je 200°C a detektoru 220°C.

Nastříkne se 0,2 μl porovnávacího roztoku. Při dodržení předepsaných podmínek eluují jednotlivé látky v pořadí uvedeném ve složení porovnávacího roztoku. Zaznamenají se retenční časy těchto látek.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že počet teoretických pater je nejméně 30 000, počítáno pro pík p-cymenu při 80 °C, a je-li rozlišení píků thymolu a karvakrolu nejméně 1,5. Nastříkne se 0,2 μl zkoušeného roztoku. Porovnáním retenčních časů píků na chromatogramu zkoušeného roztoku s retenčními časy píků na chromatogramu porovnávacího roztoku se identifikují látky, které jsou přítomny ve zkoušeném roztoku (nepřihlíží se k píku odpovídajícímu hexanu). Obsah jednotlivých látek v procentech se stanoví obvyklým postupem (metoda normalizace). Obsah látek v procentech se pohybuje v rozmezí:

Uchovávání

Ve zcela naplněných, vzduchotěsných obalech, chráněna před světlem a teplem.

Následující vzor chromatogramu je pouze pro informaci a tato část není součástí požadavků článku.

Obr. 1. Vzorový chromatogram tymiánové silice pro zkoušku Chromatografický profil

† Tinzaparinum natricum

Sodná sůl tinzaparinu

n = 1 až 25, R = H nebo SO₃Na, R¹ = H nebo SO₃Na nebo COCH₃

R² = H a R³= COONa nebo R² = COONa a R³ = H

Je to sodná sůl nízkomolekulárního heparinu, která se získává enzymatickou depolymerizací heparinu z prasečí střevní sliznice heparinasou z Flavobacterium heparinum. Většina složek má na neredukujícím konci řetězce strukturu kyseliny 2-0-sulfo-4-enpyranosuronové a na redukujícím konci řetězce strukturu 2-N,6-0-disulfo-D-ghikosaminu.

Sodná sůl tinzaparinu vyhovuje požadavkům článku Heparina massae molecularis minoris s následujícími změnami a doplňky.

Průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 5500 až 7500 s charakteristickou hodnotou asi 6500.

Stupeň sulfatace je 1,8 až 2,5 na disacharidovou jednotku.

Účinnost je 70 m.j. až 120 m.j. účinnosti protifaktoru Xa v miligramu, počítáno na vysušenou látku. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa je v rozmezí 1,5 až 2,5.

Zkouška totožnosti

Provede se zkouška totožnosti C uvedená v článku Heparina massae molecularis minoris s následujícími požadavky:

Průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 5500 až 7500. Podíl řetězců s molekulovou hmotností nižší než 2000 je nejvýše 10,0%. Podíl řetězců s molekulovou hmotností v rozmezí 2000 až 8000 je 60,0 % až 72,0 %. Podíl řetězců s molekulovou hmotností nad 8000 je v rozmezí 22,0 % až 36,0 %.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1,0 g se rozpustí v 10 ml vody R. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než stupeň 5 nejpodobnějšího porovnávacího barevného roztoku (2.2.2, Metoda II)

Absorbance (2.2.25) 50,0 mg se rozpustí v 100 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Měří se absorbance při 231 nm; specifická absorbance je 8,0 až 12,5, počítáno na vysušenou látku.

Uchovávání

Separandum.

Tocoferoli alfa acetas

Tokoferolacetat alfa

Synonyma. a-Tocopheroli acetas, Tocoferolum aceticum, Tocoferoli acetas, octan vitaminu E

Je to (2RS)-2,5,7,8-tetramethyl-2-[(4RS,8RS)-4,8,12-trimethyltridecyl]chroman-6-ylacetat. Obsahuje 96,0 % až 102,0 % sloučeniny C₃₁H₅₂O₃.

Vlastnosti

Čirá slabě zelenožlutá viskózní olejovitá kapalina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v ethanolu, v etheru a v mastných olejích, dobře rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B, D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. 10 mg se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100 ml. Měří se absorbance tohoto roztoku při 230 nm až 350 nm (2.2.25). Absorpční maximum roztoku je při 284 nm, prodleva při 278 nm a minimum při 254 nm.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem tokoferolacetatu alfa CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu HF₂₅₄ R.

   Zkoušený roztok (a). Asi 10 mg se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Zkoušený roztok (b). Ve zkumavce se zabroušenou zátkou se rozpustí asi 10 mg ve 2 ml kyseliny sírové v lihu 2,5 mol/l RS a 5 min se zahřívá na vodní lázni. Po ochlazení se přidají 2 ml vody R, 2 ml cyklohexanu R a 1 min se protřepává. Po oddělení se použije horní vrstva.

   Porovnávací roztok (a). Asi 10 mg tokoferolacetatu alfa CRL se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Porovnávací roztok (b). Připraví se, jak je popsáno u zkoušeného roztoku (b). Namísto zkoušené látky se použije tokoferolacetat alfa CRL.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) jsou dvě skvrny: skvrna s vyšší hodnotou R_F je skvrna tokoferolacetatu alfa a odpovídá skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a); skvrna o nižší hodnotě R_F je skvrna tokoferolu alfa. Vrstva se pak postříká směsí objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R, roztoku chloridu železitého R (2,5 g/l) v lihu 96% R a roztoku fenantroliniumchloridu R (10 g/l) v lihu 96% R (10 + 40 + 40); na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) je skvrna tokoferolu alfa zbarvena oranžově.

1. D. Zkouška Optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Optická otáčivost (2.2.7). -0,01° až +0,01°; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,50 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Absorbance (2.2.25). 0,150 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml (roztoka). 20,0 ml původního roztoku se zředí na 50,0 ml ethanolem R (roztok b). Změří se absorbance roztoku (a) v maximu při 284 nm a absorbance roztoku (b) v minimu při 254 nm. Specifická absorbance v maximu je 42,0 až 45,0 a v minimu je 7,0 až 9,0.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Volný tokoferol. Nejvýše 1,0%; 0,500 g se rozpustí ve 100 ml roztoku kyseliny sírové v lihu 0,25 mol/l RS. Přidá se 20 ml vody R a 0,1 ml roztoku difenylaminu R (2,5 g/l) v kyselině sírové R atitruje se tetrasulfatoceričitanem amonným 0,01 mol/l VS do modrého zbarvení, které vydrží alespoň 5 s. Provede se slepá zkouška.

1 ml tetrasulfatoceričitanu amonného 0,01 mol/l VS odpovídá 2,154 mg volného tokoferolu.

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce D na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dotriakontanu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 1,0 g dotriakontanu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 100,0 ml. Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí v 10,0 ml roztoku vnitřního standardu, zředí se hexanem R na 50,0 ml a promíchá se.

Porovnávací roztok. 0,100 g tokoferolacetatu alfa CRL se rozpustí v 10,0ml roztoku vnitřního standardu, zředí se hexanem R na 50,0 ml a promíchá se.

Chromatografícký postup se obvykle provádí za použití:

1. - silanizované skleněné kolony délky 2,0 m až 3,0 m a vnitřního průměru 2,2 mm až 4,0 mm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii R (125 μm až 150 μm nebo 150 μm až 180 μm) impregnovanou 1 % až 5 % polydimethylsiloxanu R; na obou koncích kolony je zátka silanizované skleněné vaty,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 25 ml/min až 90 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje konstantní v rozmezí 245 °C až 280 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru je v rozmezí 270 °C až 320 °C. Teplota kolony a průtoková rychlost nosného plynu se nastaví tak, aby se dosáhlo požadovaného rozlišení.

Nastřikuje se přímo do kolony nebo prostřednictvím nástřikového prostoru (přednostně vyloženého sklem) za použití automatického nastřikovacího zařízení nebo nějaké jiné reprodukovatelné nastřikovací metody. Plochy píků se měří elektronickým integrátorem.

Rozlišení. Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku. Postup se opakuje, až odezvový faktor (RF), stanovený, jak je popsáno dále, je konstantní s odchylkou do ±2 %. Rozlišení (R_s) musí být větší než 1,4.

Zkouška na rušící látky. 0,100 g zkoušené látky se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Nastříkne se 1 μl a zaznamená se chromatogram. Nastaví se citlivost tak, aby výška píku tokoferolacetatu alfa byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Během zaznamenávání se změní citlivost tak, aby pík se stejnou hodnotou t_R jako dotriakontan se zaznamenal s citlivostí nejméně osmkrát větší než pík tokoferolacetatu alfa. Jestliže se na registračním papíru šířky 250 mm zaznamená nějaký pík výšky alespoň 5 mm stejné hodnoty t_R jako pík dotriakontanu, použije se, je-li to nutné, pro konečný výpočet korigovaná plocha píku Sˈ_D(_kor) podle vzorce:

v němž značí:

1. Sʹ_d - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
2. S_I - plochu rušícího píku (stejné hodnoty t_R, jako má vnitřní standard) na chromatogramu získaném při zkoušce na rušící látky,
3. Sʹ_t - plochu píku tokoferolacetatu alfa na chromatogramu zkoušeného roztoku,
4. S_TI - plochu píku tokoferolacetatu alfa na chromatogramu získaném při zkoušce na rušící látky,
5. f - faktor vyjadřující změnu citlivosti.

Po ověření rozlišení kolony se nastříkne 1 μl porovnávacího roztoku a zaznamená se chromatogram, přičemž se nastaví taková citlivost, aby pík tokoferolacetatu alfa byl nejméně 50 % rozsahu stupnice zapisovače. Změří se plochy píků tokoferolacetatu alfa (S_T) a dotriakontanu (S_D) a stanoví se odezvový faktor (RF), jak je popsáno níže. Stejným způsobem se nastříkne 1 μl zkoušeného roztoku. Změří se plochy píků tokoferolacetatu alfa (S՛_T a dotriakontanu (S՛_D).

Stanoví se odezvový faktor (RF) pro tokoferolacetat alfa na chromatogramu porovnávacího roztoku z ploch píku tokoferolacetatu alfa a píku dotriakontanu podle vzorce:

Obsah tokoferolacetatu alfa v procentech se vypočítá podle vzorce:

V nich značí:

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Tocoferoli alfa DL hydrogenosuccinas

Tokoferolhydrogensukcinat alfa DL

Synonymum. DL-a-Tocopheroli hydrogenosuccinas

Je to 2,5,7,8-tetramethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)-6-chromanylhydrogensukcinat. Obsahuje 96,1 % až 102,0 % sloučeniny C₃₃H₅₄O₅.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v acetonu, v ethanolu a v etheru, velmi snadno rozpustný v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B a D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Absorbance, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem tokoferolhydrogensukcinatu alfa RRR CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu HF₂₅₄ R.

   Zkoušený roztok (a). 10 mg se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Zkoušený roztok (b). 10 mg se rozpustí v zábrusové zkumavce ve 2 ml kyseliny sírové v lihu 2,5 mol/l RS. Zahřívá se na vodní lázni 5 min, ochladí se a přidají se 2 ml vody R a 2 ml cyklohexanu R. Třepe se 1 min. Použije se horní vrstva.

   Porovnávací roztok (a). 10 mg tokoferolhydrogensukcinatu alf a RRR CRL se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Porovnávací roztok (b). Připraví se stejným způsobem jako zkoušený roztok (b) za použití tokoferolhydrogensukcinatu alfa RRR CRL místo zkoušené látky.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí obsahující 0,2 ml kyseliny octové ledové R ve směsi objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se suší v proudu vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá svou polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) jsou dvě skvrny: skvrna s vyšší hodnotou R_F je skvrna tokoferolu alfa; skvrna s nižší hodnotou R_F je skvrna tokoferolhydrogensukcinatu alfa a odpovídá skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). V závislosti na stupni hydrolýzy může být skvrna s nižší hodnotou R_F slabá nebo může dokonce chybět. Vrstva se postříká směsí objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R, roztoku chloridu železitého R (2,5 g/l) v lihu 96 % R a roztoku fenanthroliniumchloridu R (10 g/l) v lihu 96% R (10 + 40 + 40). Na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) je skvrna tokoferolu alfa zbarvena oranžově.

1. D. Zkouška Optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Optická otáčivost (2.2.7). –0,01° až +0,01°; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,50 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Absorbance (2.2.25). 0,150 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml (roztok a). 20,0 ml původního roztoku se zředí ethanolem R na 50,0 ml (roztok b). Změří se absorbance roztoku (a) v maximu při 284 nm a absorbance roztoku (b) v minimu při 254 nm. Specifická absorbance v maximu je 35,0 až 38,0 a v minimu 6,0 až 8,0.

Číslo kyselosti (2.5.1). 101 až 108; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Volný tokoferol. Nejvýše 1,0 %; 0,500 g se rozpustí ve 100 ml kyseliny sírové v lihu 0,25 mol/l RS. Přidá se 20 ml vody R a 0,1 ml roztoku difenylaminu R (2,5 g/1) v kyselině sírové R a titruje se tetrasulfatoceričitanem amonným 0,01 mol/l VS do vzniku modrého zbarvení, které vydrží nejméně 5 s. Provede se slepá zkouška.

1 ml tetrasulfatoceričitanu amonného 0,01 mol/l VS odpovídá 2,154 mg volného tokoferolu.

Těžké kovy (2.4.8). 0,50 g vyhovuje limitní zkoušce D na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 1 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky. Použije se kyselina sírová R místo kyseliny sírové zředěné RS.

Stanovení obsahu

Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití dotriakontanu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,300 g dotriakontanu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. K 30,0 mg ve 20ml lahvičce se pipetou převede 2,0 ml methanolu R, 1,0 ml dimethoxypropanu R a 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R. Lahvička se těsně uzavře, obsah se promíchá v ultrazvukové lázni a ponechá se stát ve tmě 1 h (±5 min). Vzorek se na 10 min přemístí ze tmy na parní lázeň pod ochrannou dusíkovou atmosférou, pak se přidá pipetou 10,0 ml roztoku vnitřního standardu a promíchá se vířivým míchadlem.

Porovnávací roztok. K 30,0 mg tokoferolhydrogensukcinatu alfa RRR CRL ve 20ml lahvičce (zváženo s přesností na 0,01 mg) se pipetou převedou 2,0 ml methanolu R, 1,0 ml dimethoxypropanu R a 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R. Lahvička se těsně uzavře, obsah se promíchá v ultrazvukové lázni a ponechá se stát ve tmě 1 h (±5 min). Porovnávací roztok se na 10 min přemístí ze tmy na parní lázeň pod ochrannou dusíkovou atmosférou, pak se přidá pipetou 10,0 ml roztoku vnitřního standardu a promíchá se vířivým míchadlem.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 15 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřními stěnami pokrytými 0,25 μm vrstvou polydimethylsiloxanu R,
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 3 ml/min až 6 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota nástřikového prostoru se udržuje na 300 °C a teplota detektoru na 330 °C. Dělicí poměr se nastaví mezi 1 : 10 až 1 : 20. Teplota kolony je 200 °C a zvyšuje se rychlostí 5 °C/min do 250 °C, při nichž se udržuje 10 min.

Nastřikuje se přímo na kolonu nebo prostřednictvím skleněné vstřikovací trubice za použití automatického nástřikového zařízení nebo jiné reprodukovatelné nastřikovací metody. Plochy píků se měří elektronickým integrátorem. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku je rozlišení mezi píky dotriakontanu a tokoferolhydrogensukcinatu alfa nejméně 12,0.

Zkouška na rušící látky. 0,100 g zkoušené látky se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Nastříkne se 1 μl tohoto roztoku a zaznamená se chromatogram. Jestliže je na něm zaznamenán pík se stejnou hodnotou t_R jako dotriakontan, vypočítá se relativní plocha tohoto píku vzhledem k ploše píku tokoferolsukcinatu alfa. Jestliže je relativní plocha píku větší než 0,5 %, použije se pro konečný výpočet korigovaná plocha píku S´D_(kor) vypočítaná podle vzorce:

v němž značí:

Po vhodném nastavení systému se nastříkne 1 μl porovnávacího roztoku a zaznamená se chromatogram. Změří se plochy píků tokoferolhydrogensukcinatu alfa (S_T) a dotriakontanu (S_D) a vypočítá se odezvový faktor (RF) podle vzorce:

Stejným způsobem se nastříkne 1 μl zkoušeného roztoku. Změří se plochy píků tokoferolhydrogensukcinatu alfa (S՛_t) a dotriakontanu (S՛_D).

Obsah tokoferolhydrogensukcinatu alfa v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Tocoferoli alfa RRR acetas

Tokoferolacetat alfa RRR

Synonymum. RRR-a-Tocopheroli acetas

Je to (2R)-2,5,7,8-tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-6-chromanylacetat. Obsahuje 96,0 % až 102,0 % sloučeniny C₃₁H₅₂O₃.

Vlastnosti

Čirá světle zelenožlutá viskózní olejovitá kapalina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, snadno rozpustný v acetonu, v ethanolu, v etheru a v mastných olejích.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B a D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1. 2).

1. A. Zkouška Absorbance, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem tokoferolacetatu alfa RRR CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu HF₂₅₄ R.

   Zkoušený roztok (a). 10 mg se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Zkoušený roztok (b). 10 mg se rozpustí v zábrusové zkumavce ve 2 ml kyseliny sírové v lihu 2,5 mol/l RS. Zahřívá se na vodní lázni 5 min, ochladí se a přidají se 2 ml vody R a 2 ml cyklohexanu R. Třepe se 1 min. Použije se horní vrstva.

   Porovnávací roztok (a). 10 mg tokoferolacetatu alfa RRR CRL se rozpustí ve 2 ml cyklohexanu R.

   Porovnávací roztok (b). Připraví se stejným způsobem jako zkoušený roztok (b) za použití tokoferolacetatu alfa RRR CRL místo zkoušené látky.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů etheru R a cyklohexanu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se suší v proudu vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) jsou dvě skvrny: skvrna s vyšší hodnotou R_F je skvrna tokoferolacetatu alfa a odpovídá skvrnĕ na chromatogramu porovnávacího roztoku (a); skvrna s nižší hodnotou R_F je skvrna tokoferolu alfa. Vrstva se postříká směsí objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R, roztoku chloridu železitého R (2,5 g/l) v lihu 96% R a roztoku fenanthroliniumchloridu R (10 g/l) v lihu 96% R (10 + 40 + 40). Na chromatogramech zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) je skvrna tokoferolu alfa zbarvena oranžově.

1. D. Po zmýdelnění je vzniklý tokoferol alfa RRR pravotočivý (2.2.7). Specifická optická otáčivost po oxidaci na chinonovou formu je nejméně +24°.

   Zkouška se provádí za ochrany před aktinickým světlem. 1,0 g se ve 250ml zábrusové baňce s kulatým dnem rozpustí ve 30 ml ethanolu R a 3 min se zahřívá pod zpětným chladičem. Do vroucího roztoku se přidá chladičem 20 ml hydroxidu draselného v lihu 2 mol/l RS, zahřívá se pod zpětným chladičem dalších 20 min a bez ochlazení se přidají chladičem po kapkách 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové R. Ochladí se, chladič se opláchne 10 ml ethanolu R, obsah baňky se převede do 500ml dělicí nálevky a baňka se vypláchne čtyřikrát 25 ml vody R a čtyřikrát 25 ml etheru R. Všechny promývací roztoky se převedou do dělicí nálevky a 2 min se intenzivně protřepávají. Po oddělení vrstev se každá vrstva převede do samostatné dělicí nálevky. Vodná vrstva se dvakrát protřepe 50 ml etheru R a spojené extrakty se přidají k hlavnímu etherovému extraktu. Spojené etherové podíly se promyjí čtyřikrát 100 ml vody R a promývací vodné vrstvy se odstraní.

   K etherovému roztoku se přidá 40 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného (100 g/l) v roztoku hydroxidu sodného R (8 g/l) a třepe se 3 min. Etherový roztok se promyje čtyřikrát 50 ml vody R, promývací vodné vrstvy se odstraní, etherová vrstva se vysuší nad síranem sodným bezvodým R. Ether se odpaří na vodní lázni za sníženého tlaku nebo v atmosféře dusíku na zbytek několika mililitrů, potom se bez zahřátí zcela odstraní poslední stopy etheru. Zbytek se ihned rozpustí v 25,0 ml trimethylpentanu R a změří se optická otáčivost.

   Vypočítá se specifická optická otáčivost látky ve zkoušeném roztoku, přičemž c je počet gramů odpovídajících tokoferolu alfa (faktor 0,911) v 1000 ml.

Zkoušky na čistotu

Absorbance (2.2.25). 0,150 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml (roztoka). 20,0 ml původního roztoku se zředí ethanolem R na 50,0 ml (roztok b). Změří se absorbance roztoku (a) v maximu při 284 nm a absorbance roztoku (b) v minimu při 254 nm. Specifická absorbance v maximu je 42,0 až 45,0 a v minimu 7,0 až 9,0.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Volný tokoferol. Nejvýše 1,0%; 0,500 g se rozpustí ve 100 ml kyseliny sírové v lihu 0,25 mol/l RS. Přidá se 20 ml vody R a 0,1 ml roztoku difenylaminu R (2,5 g/l) v kyselině sírové R a titruje se tetrasulfatoceričitanem amonným 0,01 mol/l VS do vzniku modrého zbarvení, které vydrží nejméně 5 s. Provede se slepá zkouška.

1 ml tetrasulfatoceričitanu amonného 0,01 mol/l VS odpovídá 2,154 mg volného tokoferolu.

Těžké kovy (2.4.8). 0,50 g vyhovuje limitní zkoušce D na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 1 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky. Použije se kyselina sírová R místo kyseliny sírové zředěné RS.

Stanovení obsahu

Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití dotriakontanu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 1,0 g dotriakontanu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí v 10,0 ml roztoku vnitřního standardu, zředí se hexanem R na 50,0 ml a promíchá se.

Porovnávací roztok. 0,100 g tokoferolacetatu alfa CRL se rozpustí v 10,0 ml roztoku vnitřního standardu, zředí se hexanem R na 50,0 ml a promíchá se.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 15 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřními stěnami pokrytými 0,25 μm vrstvou polydimethylsiloxanu R,
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 3 ml/min až 6 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota nástřikového prostoru se udržuje na 300 °C a teplota detektoru na 330 °C. Dělicí poměr se nastaví mezi 1 : 10 až 1 : 20. Teplota kolony je 200 °C a zvyšuje se rychlostí 5 °C/min do 250 °C, při nichž se udržuje 10 min.

Nastřikuje se přímo na kolonu nebo prostřednictvím skleněné vstřikovací trubice za použití automatického nástřikového zařízení nebo jiné reprodukovatelné nastřikovací metody. Plochy píků se měří elektronickým integrátorem. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku je rozlišení mezi píky dotriakontanu a tokoferolacetatu alfa nejméně 4,0.

Zkouška na rušící látky. 0,100 g zkoušené látky se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Nastříkne se 1 μl tohoto roztoku a zaznamená se chromatogram. Jestliže je na něm zaznamenán pík se stejnou hodnotou t_R jako dotriakontan, vypočítá se plocha tohoto píku vzhledem k ploše píku tokoferolacetatu alfa. Jestliže je relativní plocha píku větší než 0,5 %, použije se pro konečný výpočet korigovaná plocha píku S՛_D(kor) vypočítaná podle vzorce:

v němž značí: