| infuze z hovězího srdce (1) | 90,0 ml |
| koňské sérum (nezahřáté) | 20,0 ml |
| roztok kvasničného výtažku (250 g/l) | 10,0 ml |
| roztok octanu thallného (10 g/l) | 1,0 ml |
| roztok červeně fenolové (0,6 g/l) | 5,0 ml |
| roztok penicilinu (20 000 m.j./ml) | 0,25 ml |
| roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l) | 1,2 ml |
| pH se upraví na 7,8. |
Nejméně 1 ml zkoušeného přípravku se použije k dvojnásobnému naočkování, jak je popsáno v odstavci Postup zkoušky, na kulturu indikátorových buněk představující plochu nejméně 25 cm2 souvislé buněčné kultury.
Do zkoušky se zařadí negativní (neinfikovaná) kontrola a dvě pozitivní kontroly mykoplazmat, jako např. Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Pro pozitivní kontrolu se použije k očkování inokulum, které obsahuje nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie.
Jestliže pro virové suspenze je interpretace výsledků ovlivněna zřetelnými cytopatickými efekty, může se virus neutralizovat specifickým antisérem, které nemá inhibiční účinek na mykoplazmata, nebo se použije substrát buněčné kultury, který neumožní pomnožení viru. K průkazu nepřítomnosti inhibičního účinku v séru se provedou kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti antiséra.
Postup zkoušky
- 1. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2 · 104 až 2 · 105 buněk v mililitru, 4 · 103 až 2,5 · 104 buněk/cm2) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.
- 2. Odstraní se živná půda.
- 3. Nárůst se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,4 a potom směsí stejných objemových dílů tohoto tlumivého roztoku a vhodného fixačního roztoku a nakonec fixačním roztokem. Pokud se pro barvení používá bisbenzimid R, pak je vhodným fixačním roztokem čerstvě připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (1 +3).
- 4. Přidá se fixační roztok a nechá se 10 min stát.
- 5. Fixační roztok se odstraní.
- 6. Jestliže se nárůst bude barvit později, úplně se vysuší. Zvláštní péči potřebuje barvení na sklíčku po vysušení, protože mohou vznikat artefakty.
- 7. Jestliže se nárůst barví ihned, vymyje se fixační roztok dvakrát sterilní vodou, která se odstraní.
- 8. Přidá se bisbenzimid pracovní roztok R nebo nějaký jiný vhodný roztok barvící DNK a nechá se stát 10 min.
- 9. Odstraní se barvivo a nárůst se promyje vodou.
- 10. Každé podložní sklíčko, je-li to vhodné, se pokryje kapkou směsi stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku fosforečnan-citronanového o pH 5,5, přebytečná kapalina se odsaje z rohů podložního sklíčka.
- 11. Vyšetří se epifluorescencí (330 nm/380 nm excitační filtr, LP 440 nm clona) při 100 až 400 násobném zvětšení nebo větším.
- 12. Mikroskopický vzhled zkoušené kultury se porovná s negativní a pozitivní kontrolou a vyšetří na mimojadernou fluorescenci. Mykoplazmata se jeví jako body nebo vlákna v cytoplasmě a občas i v mezibuněčném prostoru.
Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže není prokázána přítomnost mykoplazmat v kulturách jím očkovaných. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozitivní kontroly ukážou přítomnost použitých zkušebních organismů.
Následující část se uvádí pro informaci a jeho návod, netvoří závaznou součást obecných metod.
Doporučené živné půdy pro kultivační metodu
Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku.
I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum.
- a) Tekutá půda
- b) Pevná půda
Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.