Platné znění

Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

vyhlášené znění

Účelem metody je stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek za určených standardizovaných laboratorních podmínek.

Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků je užitečné znát údaje o chemickém vzorci zkoušené látky (např. obsah halidů, organické sole železa nebo chlorované uhlovodíky).

  1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY

    Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky. Vyjadřuje se jako množství kyslíku oxidačního činidla, které spotřebuje oxidovaná látka za určených laboratorních podmínek.

    Výsledek zkoušky se udává v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.

  1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

    Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

  1. 1. 4. PRINCIP METODY

    Určité množství látky, rozpuštěné nebo rozptýlené ve vodě, se oxiduje zahříváním s dichromanem draselným v prostředí silné kyseliny sírové pod zpětným chladičem za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru. Přebytečný dichroman se stanoví titrací standardním roztokem síranu železnato-amonného.

    U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý.

  1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

    CHSK je „indikátorem oxidovatelnosti“ a jako taková je využívána jako praktický nástroj ke stanovení obsahu organických látek

    Výsledek zkoušky mohou zkreslit chloridy. Rovněž anorganické redukující nebo oxidující látky mohou stanovení chemické spotřeby kyslíku zkreslit.

    Některé cyklické sloučeniny a mnoho sloučenin těkavých (např. nižší mastné kyseliny) se v této zkoušce neoxidují úplně.

  1. 1. 6 POPIS METODY

    Nejprve se připraví roztok nebo disperze zkoušené látky tak, aby se dosáhlo CHSK mezi 250 a 600 mg. l-1.

  2. Poznámka:
    1. V případě špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek je možné odvážit a vnést přímo do zkušební baňky s vodou množství práškovité nebo kapalné látky odpovídající přibližně 5 mg CHSK.
    2. CHSK je často možné s výhodou, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit variantní metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnavačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto modifikací se obvykle úspěšně stanoví i látky obtížně stanovitelné konvenční metodou - např. kyselina octová. Metoda vyhovuje i v případě pyridinu. Jestliže se koncentrace dichromanu draselného zvýší na 0,0416 mol.l-1 (0,25 N), může se zvýšit přímo navažované množství látek na 5 - 10 mg, což usnadňuje stanovení látek obtížně rozpustných ve vodě.

    3. V ostatních případech se CHSK stanoví vhodnou národní nebo mezinárodní metodou.

  1. 2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ

    Experimentálně zjištěná hodnota CHSK se vypočítá pomocí příslušné standardizované metody a vyjádří se v g chemické spotřeby kyslíku na g zkoušené látky.

  1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    Mělo by se uvést, která referenční metoda byla použita.

    Chemickou spotřebu kyslíku je třeba určit nejméně ze tří výsledků měření. Zpráva má obsahovat všechny informace a poznámky důležité pro interpretaci výsledků, např. o nečistotách zkoušené látky nebo o fyzikálním stavu a složení látky, pokud tyto faktory ovlivňují výsledky.

    Je třeba uvést použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

  1. 4 LITERATURA

    (1) Kelkenberger, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

    (2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

    1. Seznam normovaných metod, např.:
      1. NBN T 91 - 201 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
      2. ISBN O 11 7512494 Chemical Oxygen Demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
      3. NF T 90 - 101 Determination of the Chemical Oxygen Demand.
      4. DS 217 = water analysis Determination of the Chemical Oxygen Demand
      5. DIN 38409 - H - 41 Determination of the Chemical Oxygen Demand (COD) within the range above 15 mg/l
      6. NEN 3235 5. 3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik
      7. ISO DP 6060 Water Quality: Chemical oxygen Demand Dichromate Methods
  1. VII ROZLOŽITELNOST - ABIOTICKÁ HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH
    1. 1 METODA

      Metoda je založena na doporučeních OECD (1).

      1. 1. 1 ÚVOD

        Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. U látek, které jsou jen málo biologicky rozložitelné má obvzláštní význam a může ovlivnit persistenci dané látky v životním prostředí.

        Většina hydrolýzních reakcí probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, takže poločasy jsou nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků z koncentrací použitých v laboratoři na podmínky životního prostředí.

        Mimo to byly u řady chemických sloučenin uvedeny příklady uspokojivé shody dat naměřených v čisté a v přírodní vodě (2).

        Pro používání této zkušební metody je užitečné znát již předem údaj o tenzi par dané látky.

        Metoda je vhodná jen pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty zpravidla ovlivňují výsledky.

        Chování látek při hydrolýze je nutno zkoumat při hodnotách pH obvykle se vyskytujících v životním prostředí (pH 4 - 9).

      1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou, která se dá znázornit výměnou skupiny X za skupinu OH:

          RX + HOH = ROH + HX (1)

        1. Rychlost, kterou ubývá koncentrace RX, je dána vztahem:

          rychlost = k.[ H2O ].[ RX ] (2)

        1. Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce v přebytku, popisuje se tento typ reakce obvykle jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je zjištěná rychlostní konstanta dána výrazem:

          kobs = k.[ H2O ] (3)

          1. a lze ji určit pro dané pH a teplotu T z výrazu:

            (4)

            1. kde
              1. t = čas,
              2. Co = koncentrace látky v čase nula,
              3. Ct = koncentrace látky v čase t,
              4. 2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a logaritmem při základu 10.

        Koncentrace je možné udávat v g.l-1 nebo v mol.l-1.

        Jednotkou konstanty kobs je (čas)-1.

        1. „Poločas“, t1/2, je definován jako doba, po jejímž uplynutí je počáteční množství látky sníženo o 50 %:

          Ct = 1/2.Co (5)

        1. Z rovnic (4) a (5) plyne, že

          t1/2 = 0,693/kobs (6)

      1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

        Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

        1. Jako standardní látky byly použity (1):
          1. Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
          2. 0, 0 - diethyl - 0 - (6 - methyl-2-(1methylethyl)- 4 - pyrimidinyl) - ester kyseliny thiofosforečné (Dimpylat, Diazinon).
      1. 1. 4 PRINCIP METODY

        Látka se rozpustí v malé koncentraci ve vodě; kontrolují se pH a teplota.

        Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

        Logaritmy koncentrace se vynesou proti času. Je-li získaná závislost lineární, je možné získat rychlostní konstantu 1. řádu ze směrnice přímky (viz odst.2).

        Není -li možné rychlostní konstantu zjistit při zadané teplotě přímo, je obvykle možné ji odhadnout podle Arrheniova vztahu, který udává teplotní závislost rychlostních konstant. Za tím účelem se vynesou logaritmy rychlostních konstant získaných při jiných teplotách proti reciproké hodnotě absolutní teploty (K). Z lineárního průběhu je možné extrapolovat nebo interpolovat hodnoty těch rychlostních konstant, které nebyly určeny přímo.

      1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

        V literatuře (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

        Reprodukovatelnost závisí zejména na kontrole pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve zvláštních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

      1. 1. 6 POPIS METODY
        1. 1. 6. 1 Činidla
          1. 1. 6. 1. 1 Tlumivé roztoky

            Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0; 7,0 a 9,0.

            Pro tento účel je třeba připravit tlumivé roztoky za použití chemikálií čistoty pro analýzu a destilované nebo deionizované vody. V příloze jsou uvedeny některé příklady těchto systémů.

            Použitý tlumivý roztok může ovlivnit rychlost hydrolýzy. Při tomto zjištění je třeba zvolit jiný tlumivý roztok. V literatuře (2) se doporučuje použít místo fosforečnanových boritanové a acetátové tlumivé roztoky.

            Není -li známo pH tlumivých roztoků pro příslušnou teplotu zkoušky, je nutné ho stanovit cejchovaným pH - metrem při zvolené teplotě s přesností na 0,1 jednotek pH.

          1. 1. 6. 1. 2 Zkoušené roztoky

            Zkoušená látka se rozpustí ve zvoleném tlumivém roztoku. Koncentrace by neměla překročit 0,01 mol.l-1 nebo polovinu nasycené koncentrace, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

            Používání organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen pro látky s nižší rozpustností ve vodě. Množství látky zprostředkující rozpouštění má být menší než 1 % a nemá ovlivnit průběh hydrolýzy.

        1. 1. 6. 2 Aparatura

          Používají se skleněné baňky se zátkami (bez tuku).

          Pokud jsou látka nebo složky tlumivého roztoku těkavé, nebo pracuje-li se při vyšších teplotách, měly by se přednostně používat zkušební nádoby utěsněné nebo uzavřené septem, s co nejmenším objemem plynu nad kapalinou v nádobě.

        1. 1. 6. 3 Analytická metoda

          Použitá analytická metoda je dána druhem zkoušené látky. Musí být dostatečně přesná a citlivá, aby dokázala zjistit úbytek počáteční koncentrace o 10 %. Musí být dostatečně specifická, aby umožnila stanovení zkoušené látky v koncentraci zkušebního roztoku a může být tvořena kombinací vhodných analytických technik.

        1. 1. 6. 4 Zkušební podmínky

          Zkoušky se provádějí za použití zařízení s kontrolou teploty nebo s použitím termostatované lázně, nastavené na 0,5 °C přesně. Vhodnými opatřeními je nutné zabránit fotolytickým vlivům.

          Dále je nutné učinit veškerá vhodná opatření, aby se odstranil rozpuštěný kyslík (např. se po 5 minut před přípravou roztoku nechá procházet dusík nebo argon).

        1. 1. 6. 5 Metoda měření
          1. 1. 6. 5. 1 Předběžná zkouška

            Pro všechny látky se musí provést předběžná zkouška při 50 ± 0,5 °C a při každé ze tří hodnot pH 4,0; 7,0 a 9,0. Je třeba provést dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH rozhodnout, zda při 50 °C je poločas (t1/2) menší než 2,4 hodiny nebo zda po 5 dnech zhydrolyzuje méně než 10 %. (Je možné odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den nebo delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu prokáže, že při 50 °C se za 2,4 hodiny zhydrolyzuje 50 % nebo více zkoušené látky nebo po 5 dnech méně než 10 % při všech třech hodnotách pH (4,0; 7,0; 9,0), nejsou další experimenty nutné. V ostatních případech a v případech jednotlivých hodnot pH, pro která tomu tak není, se provede zkouška č. 1.

          1. 1. 6. 5. 2 Zkouška č. 1

            Při hodnotách pH, pro které se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek, provede se zkouška č. 1. Pracuje se při jedné teplotě, nejlépe při 50 °C ± 0,5 °C a pokud možno ve sterilních podmínkách.

            Za účelem prověření průběhu reakce podle pseudo prvního řádu se pro každou zvolenou hodnotu pH bere pro pokrytí oblasti mezi 20 % a 70 % hydrolýzy dostatečný počet vzorků (ne méně než 4).

            Pro každé pH, při kterém se provádí zkouška č. 1, se stanoví řád reakce.

            Odhad rychlostních konstant při 25 °C:

            Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda ze zkoušky č. 1 lze usuzovat na reakci pseudoprvního řádu nebo ne.

            Pokud ze zkoušky č. 1 nelze s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky č. 2.

            Vyplývá-li ze zkoušky č. 1 s jistotou reakce pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky č. 3 (alternativně je možné za zvláštních okolností vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím údajů ze zkoušky č. 1, viz odstavec 3. 2).

          1. 1. 6. 5. 3 Zkouška č. 2
            1. Tato zkouška se provádí při každém pH, pro které se to na základě výsledků zkoušky č. 1 ukázalo potřebným:
              1. - buď při teplotě nižší než 40 °C,
              2. - nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

            Při každém pH a každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 2, je třeba provést v nejméně 6 přiměřených časových intervalech měření v oblasti stupně hydrolýzy 20 až 70 %

            Při každém pH se provede opakované měření při jedné teplotě. Pokud se zkouška č. 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, je vhodné opakovat měření nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

            Pro každé pH a každou teplotu, pro které se provádí zkouška č. 2, je třeba, pokud je to možné, provést grafický odhad poločasu (t1/2).

          1. 1. 6. 5. 4 Zkouška č. 3
            1. Zkouška se provede při každém pH, pro které se to ukázalo potřebným na základě výsledků zkoušky č. 1:
              1. - buď při teplotě nižší než 40 °C,
              2. - nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

            Při každém pH a při každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 3 se zvolí tři měřicí body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; spočítá se konstanta kobs a t1/2.

    1. 2 ÚDAJE
      1. Při reakčním chování podle pseudoprvního řádu je možné konstanty reakční rychlosti kobs vypočítat pro každé pH a každou teplotu regresní analýzou nebo je zjistit graficky vynesením logaritmů koncentrací proti času, přičemž se použije výrazu:

        kobs = - směrnice.2,303

      Dále je možné vypočítat t1/2 z rovnice (6).

      Je-li to možné, stanovit k25 (pro 25 °C) použitím Arrheniovy rovnice.

      Pokud chování neodpovídá pseudoprvnímu řádu, viz 3. 1.

    1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. 3. 1 ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
        1. Zpráva o průběhu pokusu by měla pokud možno obsahovat tyto údaje:
          1. - popis látky,
          2. - výsledky získané s referenčními látkami,
          3. - princip a detaily použité analytické metody,
          4. - pro každý experiment: teplotu, pH, složení tlumivého roztoku, tabulku se všemi údaji koncentrace - čas,
          5. - u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty kobs a t1/2 včetně metody výpočtu,
          6. - u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, grafické znázornění vztahu logaritmu koncentrace proti času,
          7. - všechny údaje a pozorování potřebné pro interpretaci výsledků.
      1. 3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkoušených látek za předpokladu, že pro podobné třídy látek již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že je možné očekávat, že aktivační energie zkoušené látky je stejné velikosti.

    1. 4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

      (2) W. Mabey and T. Mill, „Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions“, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1978, vol. 7 (2), 383 - 415

PŘÍLOHA

TLUMIVÉ ROZTOKY

  1. A. CLARK A LUBS

    Hodnoty pH, uvedené v tabulkách, byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH leží o 0,04 jednotky nad hodnotami v tabulce.

    TLUMIVÉ ROZTOKY
    SloženípH
    hydrogenftalát draselný (0,1 mol. l -1) a HCl (0,1 mol. l -1) při 20 °C
    2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml    		3,8
    hydrogenftalát draselný (0,1 mol. l -1) a NaOH (0,1 mol. l -1) při 20 °C
    0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml
    3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml    		4,0
    4,2
    dihydrogenfosforečnan draselný(0,1 mol. l-1) a NaOH (0,1 mol. l-1) při 20 °C
    23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml
    9,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml
    35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml    		6,8
    7,0
    7,2
    H3BO3 (0,1 mol. l-1) v KCl (0,1 mol. l-1) a NaOH (0,1 mol. l-1) při 20 °C
    16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml
    21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml
    26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml    		8,8
    9,0
    9,2
  1. B. KOLTHOFF A VLEESCHOUWER
    1. Složení:
      1. Monokaliumcitrát ((0,1 mol. l-1) a NaOH (0,1 mol. l-1) při 18 °C (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby se předešlo tvorbě plísní):
        TLUMIVÉ ROZTOKY
        2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml3,8
        9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,0
        16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,2
  1. C. SÖRENSEN

    Borax (0,05 mol. l -1) a HCl (0,1 mol. l -1)

    TLUMIVÉ ROZTOKY
    SloženípH
    ml boraxuml HClSörensen 18 °CWalbum
    10 °C40 °C70 °C
    8,002,008,918,968,778,59
    8,501,509,019,068,868,67
    9,001,009,099,148,948,74
    9,500,509,179,229,018,80
    10,000,009,249,309,088,86

    Borax (0,05 mol. l-1) a NaOH (0,1 mol. l-1)

    TLUMIVÉ ROZTOKY
    SloženípH
    ml boraxuml HClSörensen
    18 °C    		Walbum
    10 °C40 °C70 °C
    10,000,009,249,309,088,86
    9,001,009,369,429,188,94
    8,002,009,509,579,309,02
    7,003,009,689,769,449,12
  1. VIII TOXICITA PRO ŽÍŽALY - ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PUDĚ
    1. 1 METODA
      1. 1. 1 ÚVOD

        V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.

      1. 1. 2 JEDNOTKY A DEFINICE

        LC50: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.

      1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKA

        Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.

        Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.

      1. 1. 4 PRINCIP ZKOUŠKY

        Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.

      1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

        Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.

      1. 1. 6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. 1. 6. 1 Látky
          1. 1. 6. 1. 1 Substrát pro zkoušku

            Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.

            (a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):

            1. - 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),
            2. - 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,
            3. - asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,
            4. - asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO3), práškového, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 ± 0,5.

            (b) Substrát pro zkoušku:

            Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.

            Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 °C. Klíčovým kritériem je, že umělá půda musí být zvlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu. Způsob uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.

            (c) Kontrolní substrát:

            Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního činidla.

          1. 1. 6. 1. 2 Nádoby pro zkoušku

            Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.

        1. 1. 6. 2 Experimentální podmínky

          Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 ± 2 °C se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.

          Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.

        1. 1. 6. 3 Pracovní postup
          1. Zkoušené koncentrace

            Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg-1).

          1. Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací

            Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.

            Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg-1 substrátu pro zkoušku (jako sušina).

            Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.

          1. Definitivní zkouška

            Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.

            Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC50 a jejích mezí spolehlivosti.

            V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výsledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.

            Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8, jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC50.

          1. Mísení základního substrátu a zkoušené látky

            Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to možné připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašovačem.

            Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).

            K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.

            Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině). Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.

            Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní.

            Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyšetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.

            Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.

        1. 1. 6. 4 Organizmy použité ve zkoušce

          Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)

    1. 2 VÝSLEDKY
      1. 2. 1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

        Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.

        Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC50 se udává v mg zkoušené látky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).

        V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro výpočet LC50 příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

        Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC50.

    1. 3 ZPRÁVA
      1. 3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:
          1. - prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,
          2. - o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),
          3. - přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,
          4. - přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,
          5. - informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),
          6. - metoda použitá ke stanovení LC50,
          7. - výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,
          8. - popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,
          9. - úhyn v kontrolních zkouškách,
          10. - LC50 nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,
          11. - grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,
          12. - výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo z dřívějších zkoušek kontroly jakosti.
    1. 4 LITERATURA

      (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.

      (2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London.

      (3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.

      (4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99

      (5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

      (6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag „Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

PŘÍLOHA

Chov žížal před zkouškou

Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).

Podmínky chovu

Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2 °C, nejlépe s neustálým světlem (intenzita 400 - 800 lux).

Chovné nádoby: vhodné mělké nádoby o objemu 10 až 20 l.

Substrát: Eisenia foetida je možné chovat v různých zvířecích exkrementech. Jako chovné médium se doporučuje používat směs 50 % obj. rašeliny a 50 % obj.hovězího nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí).

Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý.

Vedle výše uvedené metody je možné používat i jiné úspěšné postupy.

  • Poznámka:
    1. Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.
    1. IX BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST - ZAHN - WELLENSOVA METODA
      1. 1 METODA
        1. 1. 1 ÚVOD

          Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.

          Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.

          Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.

          Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.

          Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této medodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.

          1. Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
            1. - jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
            2. - mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
            3. - neinhibují bakterie,
            4. - jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
            5. - pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.

          Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.

          Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.

        1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
          1. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:

            1. kde:
              1. DT = rozklad ( %) v čase T,
              2. Ca = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1),
              3. CT = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l-1),
              4. CB = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku (mg.l-1),
              5. CBA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1).

          Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.

          Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.

          Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).

        1. 1. 3 STANDARDNÍ LÁTKY

          Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.

        1. 1. 4 PRINCIP METODY

          Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 °C v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.

          V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.

        1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

          Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.

          Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.

        1. 1. 6 POSTUP ZKOUŠENÍ
          1. 1. 6. 1 Příprava
            1. 1. 6. 1. 1 Reagencie

              Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l-1
              Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionzovanou nebo destilovanou vodu.

              TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
              Kyselina sírová p.a.50g.l-1
              Hydroxid sodný p.a.40 g.l-1
              1. Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:
                TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
                Chlorid amonný NH4Cl p.a. 38,5 g
                NaH2PO4 . 2H2O p.a.33,4 g
                KH2PO4 p.a.8,5 g
                K2HPO4 p.a.21,75 g

              Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.

            1. 1. 6. 1. 2 Přístroje

              Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.

              Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.

              Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.

              Odstředivka (cca 3 550 g).

              pH - metr.

              Oximetr.

              Papírový filtr.

              Membránový filtrační přístroj.

              Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 µm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.

              Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.

            1. 1. 6. 1. 3 Příprava inokula

              Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.

              Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).

              Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.

            1. 1. 6. 1. 4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky

              Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1 suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.

              Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.

          1. 1. 6. 2 Pracovní postup

            Kultivační nádoby se inkubují při difuzním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba see provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1.

            V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.

            Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.

            Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní. Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.

            Funkční kontrola aktivovaného kalu

            Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.

            Adaptace

            V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.

            Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:

            Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.

            Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.

            Příprava pro analýzu

            Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).

            Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 µm).

            Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.

            CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.

      1. 2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY

        Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1.2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.

      2. Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
      1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
        1. 3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
          1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
            1. - počáteční koncentrace látky,
            2. - všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
            3. - koncentrace látky po 3 h,
            4. - inhibiční křivka s popisem,
            5. - datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
            6. - vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
        1. 3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

          Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.

          V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.

          Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.

          Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.

          Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná. Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zakalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.

          Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených 14C. Jestliže je použita zkoušená látka s 14C, je možné stanovením 14CO2 prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.

          Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.

          Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.

      1. 4 LITERATURA

        (1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final

        (2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).

    PŘÍLOHA

    PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

    Organická látka: 4 - ethoxybenzoová kyselina

    Teoretická koncentrace ve zkoušce: 600 mg.l-1

    Teoretická DOC: 390 mg.l-1

    Inokulum: městská čistírna v .....

    Koncentrace: 1 g sušiny.l-1

    Adaptace: bez adaptace

    Analytika: stanovení DOC

    Množství vzorku: 3 ml

    Referenční látka: diethylenglykol

    Toxicita zkoušené látky: žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l-1

    1. Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích
    TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
    Doba zkouškyReferenční látkaZkoušená látka
    sl. p.
    mg.l-1    		DOC
    mg.l-1    		DOCn
    mg.l-1    		Rozklad
    %    		DOC
    mg-l-1    		DOCn
    mg.l-1    		Rozklad
    %
    0--300--390-
    3h4,0298,0294,02371,6367,66
    1 den6,1288,3282,36373,3367,26
    2 dny5,0281,2276,28360,0355,09
    5 dnů6,3270,5264,212193,8187,552
    6 dnů7,4253,3245,918143,9136,565
    7 dnů11,3212,5201,233104,593,276
    8 dnů7,8142,5134,75558,951,187
    9 dnů7,035,028,09118,111,197
    10 dnů18,037,019,09420,02,099
  • Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.
    1. sl. p. = slepý pokus

    • Obrázek 1

    Příklad křivek biologického rozkladu

    Obrázek

    Obrázek 2

    Příklad adaptace kalu

    Obrázek
    1. X BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST - SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM
      1. 1 METODA
        1. 1. 1 ÚVOD
          1. 1. 1. 1 Obecné poznámky
            1. Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
              1. - jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
              2. - mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
              3. - neinhibují bakterie.

            Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.

          1. 1. 1. 2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)

            Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg /1.

            Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.

          1. 1. 1. 3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)

            Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).

            Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.

            Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

        1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
          1. 1. 2. 1 Analýza DOC/CHSK
            1. Úbytek látky je vyjádřen vztahem:

              (1a)

              1. DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
              2. T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK,
              3. E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l-1,
              4. Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1.

            Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.

          1. 1. 2. 2 Specifická analýza
            1. Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:

              (1b)

              1. C1 = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou,
              2. C0 = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou.
        1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

          Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

        1. 1. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

          Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.

          Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.

          DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.

          Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.

          Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).

          Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

        1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY

          Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

        1. 1. 6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
          1. 1. 6. 1 Příprava
            1. 1. 6. 1. 1 Přístroje

              Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:

              Potvrzující zkouška OECD

              Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).

              Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.

              Zařízení s porézní nádobkou