Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí, 299/1998 Sb., účinné od 1. 1. 1999

Předchozí stránka

Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkoušených látek za předpokladu, že pro podobné třídy látek již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že je možné očekávat, že aktivační energie zkoušené látky je stejné velikosti.

4 LITERATURA
(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.
(2) W. Mabey and T. Mill, „Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions“, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1978, vol. 7 (2), 383 - 415

PŘÍLOHA

TLUMIVÉ ROZTOKY

A. CLARK A LUBS

Hodnoty pH, uvedené v tabulkách, byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH leží o 0,04 jednotky nad hodnotami v tabulce.

TLUMIVÉ ROZTOKY
Složení	pH
hydrogenftalát draselný (0,1 mol. l ^-1) a HCl (0,1 mol. l ^-1) při 20 °C 2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	3,8
hydrogenftalát draselný (0,1 mol. l ^-1) a NaOH (0,1 mol. l ^-1) při 20 °C 0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	4,0 4,2
dihydrogenfosforečnan draselný(0,1 mol. l^-1) a NaOH (0,1 mol. l^-1) při 20 °C 23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 9,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	6,8 7,0 7,2
H₃BO₃ (0,1 mol. l^-1) v KCl (0,1 mol. l^-1) a NaOH (0,1 mol. l-1) při 20 °C 16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	8,8 9,0 9,2

B. KOLTHOFF A VLEESCHOUWER
1. Složení:
  1. Monokaliumcitrát ((0,1 mol. l^-1) a NaOH (0,1 mol. l^-1) při 18 °C (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby se předešlo tvorbě plísní):
    
    TLUMIVÉ ROZTOKY
    2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,8
    9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,0
    16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,2

TLUMIVÉ ROZTOKY
2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	3,8
9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,0
16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,2

C. SÖRENSEN

Borax (0,05 mol. l ^-1) a HCl (0,1 mol. l ^-1)

TLUMIVÉ ROZTOKY
Složení		pH
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	10 °C	40 °C	70 °C
8,00	2,00	8,91	8,96	8,77	8,59
8,50	1,50	9,01	9,06	8,86	8,67
9,00	1,00	9,09	9,14	8,94	8,74
9,50	0,50	9,17	9,22	9,01	8,80
10,00	0,00	9,24	9,30	9,08	8,86

Borax (0,05 mol. l^-1) a NaOH (0,1 mol. l^-1)

TLUMIVÉ ROZTOKY
Složení		pH
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	10 °C	40 °C	70 °C
10,00	0,00	9,24	9,30	9,08	8,86
9,00	1,00	9,36	9,42	9,18	8,94
8,00	2,00	9,50	9,57	9,30	9,02
7,00	3,00	9,68	9,76	9,44	9,12

VIII TOXICITA PRO ŽÍŽALY - ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PUDĚ
1. 1 METODA
  1. 1. 1 ÚVOD
    V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.
  1. 1. 2 JEDNOTKY A DEFINICE
    LC₅₀: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.
  1. 1. 3 REFERENČNÍ LÁTKA
    Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.
    Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.
  1. 1. 4 PRINCIP ZKOUŠKY
    Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.
  1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY
    Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.
  1. 1. 6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
    1. 1. 6. 1 Látky
      1. 1. 6. 1. 1 Substrát pro zkoušku
        Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.
        (a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):
        - 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),
        - 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,
        - asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,
        - asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO₃), práškového, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 ± 0,5.
        (b) Substrát pro zkoušku:
        Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.
        Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 °C. Klíčovým kritériem je, že umělá půda musí být zvlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu. Způsob uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.
        (c) Kontrolní substrát:
        Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního činidla.
      1. 1. 6. 1. 2 Nádoby pro zkoušku
        Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.
    1. 1. 6. 2 Experimentální podmínky
      Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 ± 2 °C se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.
      Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.
    1. 1. 6. 3 Pracovní postup
      1. Zkoušené koncentrace
        Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg^-1).
      1. Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací
        Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.
        Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg^-1 substrátu pro zkoušku (jako sušina).
        Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.
      1. Definitivní zkouška
        Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.
        Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC₅₀ a jejích mezí spolehlivosti.
        V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výsledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.
        Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8, jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC₅₀.
      1. Mísení základního substrátu a zkoušené látky
        Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to možné připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašovačem.
        Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).
        K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.
        Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině). Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.
        Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní.
        Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyšetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.
        Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.
    1. 1. 6. 4 Organizmy použité ve zkoušce
      Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)
1. 2 VÝSLEDKY
  1. 2. 1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
    Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.
    Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC₅₀ a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC₅₀ se udává v mg zkoušené látky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).
    V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro výpočet LC₅₀ příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.
    Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC₅₀.
1. 3 ZPRÁVA
  1. 3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
    1. Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:
      1. - prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,
      2. - o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),
      3. - přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,
      4. - přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,
      5. - informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),
      6. - metoda použitá ke stanovení LC₅₀,
      7. - výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,
      8. - popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,
      9. - úhyn v kontrolních zkouškách,
      10. - LC₅₀ nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,
      11. - grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,
      12. - výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo z dřívějších zkoušek kontroly jakosti.
1. 4 LITERATURA
  (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.
  (2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London.
  (3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.
  (4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99
  (5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
  (6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag „Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

PŘÍLOHA

Chov žížal před zkouškou

Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).

Podmínky chovu

Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2 °C, nejlépe s neustálým světlem (intenzita 400 - 800 lux).

Chovné nádoby: vhodné mělké nádoby o objemu 10 až 20 l.

Substrát: Eisenia foetida je možné chovat v různých zvířecích exkrementech. Jako chovné médium se doporučuje používat směs 50 % obj. rašeliny a 50 % obj.hovězího nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí).

Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý.

Vedle výše uvedené metody je možné používat i jiné úspěšné postupy.

Poznámka:

Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.

IX BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST - ZAHN - WELLENSOVA METODA
1. 1 METODA
  1. 1. 1 ÚVOD
    Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.
    Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.
    Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l^-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l^-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.
    Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.
    Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této medodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.
    1. Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
      1. - jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
      2. - mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
      3. - neinhibují bakterie,
      4. - jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
      5. - pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.
    Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.
    Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.
  1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
    1. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:
      1. kde:
        D_T = rozklad ( %) v čase T,
        C_a= hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1),
        C_T= hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l^-1),
        C_B = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku (mg.l^-1),
        C_BA= hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1).
    Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.
    Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.
    Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).
  1. 1. 3 STANDARDNÍ LÁTKY
    Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.
  1. 1. 4 PRINCIP METODY
    Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 °C v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.
    V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.
  1. 1. 5 KRITÉRIA KVALITY
    Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.
    Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.
  1. 1. 6 POSTUP ZKOUŠENÍ
    1. 1. 6. 1 Příprava
      1. 1. 6. 1. 1 Reagencie
        Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l^-1Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol^-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionzovanou nebo destilovanou vodu.
        
        TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
        Kyselina sírová p.a. 50g.l^-1
        Hydroxid sodný p.a. 40 g.l^-1
        
        Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:
        
        TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
        Chlorid amonný NH₄Cl p.a. 38,5 g
        NaH₂PO₄. 2H₂O p.a. 33,4 g
        KH₂PO₄p.a. 8,5 g
        K₂HPO₄ p.a. 21,75 g
        
        Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.
      1. 1. 6. 1. 2 Přístroje
        Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.
        Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.
        Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.
        Odstředivka (cca 3 550 g).
        pH - metr.
        Oximetr.
        Papírový filtr.
        Membránový filtrační přístroj.
        Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 µm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.
        Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.
      1. 1. 6. 1. 3 Příprava inokula
        Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.
        Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).
        Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.
      1. 1. 6. 1. 4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky
        Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l^-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l^-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l^-1 suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l^-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.
        Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.
    1. 1. 6. 2 Pracovní postup
      Kultivační nádoby se inkubují při difuzním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba see provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l^-1.
      V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.
      Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.
      Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní. Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.
      Funkční kontrola aktivovaného kalu
      Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.
      Adaptace
      V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.
      Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:
      Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.
      Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.
      Příprava pro analýzu
      Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).
      Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 µm).
      Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.
      CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.
1. 2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY
  Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1.2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.
2. Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
1. 3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
  1. 3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
    1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
      1. - počáteční koncentrace látky,
      2. - všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
      3. - koncentrace látky po 3 h,
      4. - inhibiční křivka s popisem,
      5. - datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
      6. - vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
  1. 3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
    Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.
    V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.
    Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.
    Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.
    Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná. Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zakalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.
    Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených ¹⁴C. Jestliže je použita zkoušená látka s ¹⁴C, je možné stanovením ¹⁴CO₂ prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.
    Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.
    Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.
1. 4 LITERATURA
  (1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final
  (2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).

TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
Kyselina sírová p.a.	50g.l^-1
Hydroxid sodný p.a.	40 g.l^-1

TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu
Chlorid amonný NH₄Cl p.a.	38,5 g
NaH₂PO₄. 2H₂O p.a.	33,4 g
KH₂PO₄p.a.	8,5 g
K₂HPO₄ p.a.	21,75 g

PŘÍLOHA

PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

Organická látka: 4 - ethoxybenzoová kyselina

Teoretická koncentrace ve zkoušce: 600 mg.l^-1

Teoretická DOC: 390 mg.l-1

Inokulum: městská čistírna v .....

Koncentrace: 1 g sušiny.l^-1

Adaptace: bez adaptace

Analytika: stanovení DOC

Množství vzorku: 3 ml

Referenční látka: diethylenglykol

Toxicita zkoušené látky: žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l^-1

Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích

TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
Doba zkoušky	Referenční látka				Zkoušená látka
Doba zkoušky	sl. p. mg.l^-1	DOC mg.l^-1	DOCn mg.l^-1	Rozklad %	DOC mg-l^-1	DOCn mg.l^-1	Rozklad %
0	-	-	300	-	-	390	-
3h	4,0	298,0	294,0	2	371,6	367,6	6
1 den	6,1	288,3	282,3	6	373,3	367,2	6
2 dny	5,0	281,2	276,2	8	360,0	355,0	9
5 dnů	6,3	270,5	264,2	12	193,8	187,5	52
6 dnů	7,4	253,3	245,9	18	143,9	136,5	65
7 dnů	11,3	212,5	201,2	33	104,5	93,2	76
8 dnů	7,8	142,5	134,7	55	58,9	51,1	87
9 dnů	7,0	35,0	28,0	91	18,1	11,1	97
10 dnů	18,0	37,0	19,0	94	20,0	2,0	99

Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.

sl. p. = slepý pokus

Obrázek 1

Příklad křivek biologického rozkladu

Obrázek 2

Příklad adaptace kalu

X BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST - SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM

1 METODA

1. 1 ÚVOD
1. 1. 1. 1 Obecné poznámky
  1. Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
    1. - jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
    2. - mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
    3. - neinhibují bakterie.
  Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.
1. 1. 1. 2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)
  Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l^-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l^-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg /1.
  Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.
1. 1. 1. 3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)
  Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).
  Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.
  Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
1. 1. 2. 1 Analýza DOC/CHSK
  1. Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
    (1a)
    1. DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
    2. T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l^-1 DOC nebo CHSK,
    3. E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l^-1,
    4. E_o = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l^-1.
  Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.
1. 1. 2. 2 Specifická analýza
  1. Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (R_w) během udaného času prodlení:
    (1b)
    1. C₁= koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l^-1) stanovená specifickou analýzou,
    2. C₀ = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l^-1) stanovená specifickou analýzou.

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

1. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD
Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.
Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.
DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.
Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.
Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).
Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

1. 6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1. 6. 1 Příprava

1. 6. 1. 1 Přístroje
Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:
Potvrzující zkouška OECD
Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).
Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.
Zařízení s porézní nádobkou
Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitří nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.
Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.
Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.
K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.

1. 6. 1. 2 Filtrace
Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 µm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.

1. 6. 1. 3 Odpadní voda

Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.

Příklad syntetického média:

V 1 l pitné vody se rozpustí:

TLUMIVÉ ROZTOKY Chov žížal před zkouškou Podmínky chovu Funkční kontrola aktivovaného kalu Adaptace Příprava pro analýzu PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
pepton	160 mg,
masový extrakt	110 mg,
močovina	30 mg,
NaCl	7 mg,
CaCl₂.2 H₂O	4 mg,
MgSO₄.7 H₂O	2 mg,
K₂HPO₄	28 mg.

Komunální odpadní vody:
1. Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.

1. 6. 1. 4 Zásobní roztok zkoušené látky
Připraví se např. 1% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.

1. 6. 1. 5 Inokulum
Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.

Mohou se používat inokula z různých zdrojů.

Příklady vhodného inokula:
1. a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod
  Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vyleje. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.
1. b) Směsné inokulum
  1. Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
    1. Viz předchozí popis.
  1. Inokulum z půdy:
    1. 100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minut dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vyleje. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
  1. Inokulum z povrchové vody:
    1. Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vyleje. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních pdomínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
    2. Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
1. c) Inokulum z aktivovaného kalu
  Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.

1. 6. 2 Postup
Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.
Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 °C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.
1. 1. 6. 2. 1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu
  Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky
  Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.
  Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.
  Na začátku zkušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.
  Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.
  Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h^-1 nebo 1/2 l.h^-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.
  Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l^-1.
  Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.
  Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.
  Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.
  Odtok ze sedimentační nádrže se shromažďuje v nádobách E nebo F po dobu 20 - 24 hod. Před odebráním vzorku se směs důkladně promíchá. Nádoby E a F se musí pečlivě čistit.
  Pro potřeby sledování účinnosti procesu a pro potřeby jeho řízení sestanoví nejméně dvakrát týdně CHSK nebo DOC zfiltrovaného průměrného vzorku výtoku ze zařízení a filtrované směsi dávkované do zařízení. K filtraci se používá membránový filtr s velikostí pórů 0,45 µm. Prvních 20 ml filtrátu se vyleje.
  Pokud se rozkladné procesy ustálí, vyrovnají se i poklesy CHSK nebo DOC.
  Sušina kalu v aerační nádobě se stanovuje dvakrát týdně (g.l^-1).
  Zařízení mohou být provozována dvěma způsoby: pokud je sušina kalu vyšší než 2,5 g.l^-1 přebytečný kal se vypustí nebo se denně odebere z každé nádoby 500 ml suspenze, takže střední doba zdržení kalu v zařízení je 6 dní.
  Jestliže jsou naměřené a hodnocené parametry (účinnost metody stanovená na základě úbytku CHSK nebo DOC, koncentrace kalu, schopnost sedimentace kalu, zákal kapalné fáze v sedimentační nádobě atd.) dvou jednotek dostatečně stabilní, může být zahájeno přidávání zkoušené látky dle kap. 1. 6. 2. 2 do nátoku do jedné z jednotek.
  Alternativně může být zkoušená látka přidávána na začátku fáze růstu kalu (1. 6. 2. 1), zvlášť tehdy, když je jako inokulum používán aktivovaný kal.
1. 1. 6. 2. 2 Pracovní postup
  Za dodržování podmínek pro rozběhovou fázi se do přítoku do zkušebního zařízení přidává zásobní roztok zkoušené látky (cca 1 %), aby obsah DOC v suspenzi byl v rozmezí 10 - 20 mg.l^-1 nebo CHSK 40 mg.l^-1.
  Zásobní roztok se buď denně přimíchává do odpadní vody nebo se přivádí pomocí čerpadla přímo do suspenze. Koncentrace se postupně zvyšuje až na požadovanou hodnotu. Vyzkoušeny mohou být i vyšší koncentrace než udává předchozí odstavec, pokud nemá zkoušená látka na aktivovaný kal toxické účinky.
  Do kontrolní jednotky se dávkuje pouze odpadní voda bez zkoušené látky. Z odtoku se odebírají vzorky pro analýzu a filtrují se na membránovém filtru s velikostí pórů 0,45 µm. Prvních 20 ml filtrátu se vylévá.
  Filtráty vzorků musí být analyzovány v den odběru nebo musí být konzerovány (např. přídavkem 0,05 ml 1% chloridu rtuťnatého na 10 ml filtrátu, uložením na 24 h při teplotě 2 - 4 °C nebo při -18 °C na delší dobu).
  Doba trvání rozběhové fáze od okamžiku přídavku zkoušené látky by neměla překročit 6 týdnů. Vyhodnocovací fáze by neměla být kratší než 3 týdny, aby bylo možné provést 14 - 20 stanovení nutných k vyhodnocení zkoušky.
  1. Spřažená zařízení
    1. Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
1. 1. 6. 2. 3 Analytika
  1. Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
    1. DOC a CHSK.
    2. Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
  1. Specifická analýza
    1. Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.

2 DATA A VYHODNOCENÍ
1. 2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
  Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.
  Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Dr_c, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.
  (2)
  (3)
  Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)
  (4)
  1. kde:
    1. s_DRc= standardní odchylka,
    3. n = počet stanovení.
  1. Odlehlé hodnoty DR_cse eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehých hodnot Dr_c:
    1. Výsledek se vjádří dle (5):
      (5)
      1. kde
        t_n- 1; α = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a E_oa statistickou mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95% (1).
    Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR_c bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.
    1. Např.
      1. DR_c = 98,6 ± 2,3% úbytku DOC,
      2. s = 4,65% úbytku DOC,
      3. n = 18,
      4. x = počet odlehlých hodnot.
1. 2. 2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
  1. Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:
  Vynášením denně naměřených úbytků do grafu se zdůrazní všechny trendy, např. adaptace.
  1. 2. 2. 1 Využití stanovení CHSK/DOC
    Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1. 2. 1 vypočítá procentuální úbytek DR.
    1. Z řady hodnot DR se spočítá jejich průměr a podle rovnice (6) standardní odchylka:
      (6)
      1. kde
        s_DR = standardní odchylka hodnot Dr_i,
        n = počet stanovení.
    Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR.
    1. Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7)
      (7)
      1. kde
        t_n - 1; α - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a E_o a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95% (l).
    Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.
    1. Např.:
      1. Dr = (98,6 ± 2,3%) úbytku DOC,
      2. s = 4,65% úbytku DOC,
      3. n = 18,
      4. x = počet odlehlých hodnot.
  1. 2. 2. 2 Použití výsledků specifické analýzy
    Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (R_w) v % se počítá podle 1. 2. 2.

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
1. 3. 1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
  1. V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:
    1. - provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;
    2. - druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);
    3. - způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;
    4. - druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;
    5. - druh inokula, datum a místo odběru;
    6. - popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;
    7. - grafické vyjádření závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozběhové a vyhodnocovací;
    8. - výsledek stanovení obsahu zkoušené látky prostřednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku;
    9. - při provádění specifické analýzy: grafické vyjádření procentuálního úbytku zkoušené látky z kapalné fáze během rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na čase;
    10. - střední úbytek DOC nebo CHSK zkoušené látky a standardní odchylka výsledků získaných během vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkoušené látky je konstantní;
    11. - grafické vyjádření koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na čase;
    12. - poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování přebytečného kalu ze zařízení, tvorba shluků, použití chloridu železitého atd.);
    13. - proměřované koncentrace zkoušené látky;
    14. - výsledky analýz kalu;
    15. - všechny informace o zkoušené látce a o referenční látce, pokud byla použita;
    16. - vědecké zdůvodnění všech odchylek a změn metody.
1. 3. 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
  Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.
  Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně-chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.
  K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.
  Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce).
  Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):
  Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.

4 LITERATURA
(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.
(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).
(3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.
(4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.
(5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.
(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch - chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius - Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.

PŘÍLOHA 1

Obrázek 1

A = zásobník

B = dávkovací zařízení

C = aerační komora (objem 3 litry)

D = sedimentační nádoba

E = mamutka

F = zásobník na výtok

G = aerátor

H = průtokoměr (nepovinně)

Obrázek 2

PŘÍLOHA 2

Obrázek 1

Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

A = zásobník

E = zásobník na výtok

B = dávkovací čerpadlo

F = vzduchovací kámen

C = porézní aerační nádobka

G = rotametr

D = vnější nepropustná nádoba

Obrázek 2

Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

PŘÍLOHA 3

Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

Označ v každé skupině

Zařízení:
1. průkazná zkouška OECD
2. zařízení s porézní nádobkou

Způsob provozu:
1. samostatná jednotka
2. spřažená zařízení
3. nespřažená zařízení

Přeočkování:
1. žádné
2. aktivovaným kalem
3. kapalnou fází vzniklou odsedimentováním

Střední doba zdržení:
1. 3 hodiny
2. 6 hodin

Živné médium:
1. komunální odpadní voda
2. syntetická odpadní voda

Inokulum:
1. z čistírny odpadních vod
2. směsné inokulum
3. aktivovaný kal

Přidávání zkoušené látky:
1. na začátku
2. postupně
3. po vytvoření kalu

Analýzy:
1. specifická
2. CHSK
3. DOC

XI BIOLOGICKÝ ROZKLAD - ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU
1. 1 METODA
  1. 1. 1 ÚVOD
    Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.
    Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.
    Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.
    Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.
    Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.
    U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC₅₀.
    Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,
    1. Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
      1. - rozpustnost ve vodě,
      2. - tenze par,
      3. - strukturní vzorec,
      4. - čistota zkoušené látky.
    1. Doporučení:
      1. Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.
  1. 1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
    Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O₂ na 1 mg kalu za hodinu.
    1. Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:
      1. kde:
        R_s = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,

Následující stránka

TLUMIVÉ ROZTOKY

Chov žížal před zkouškou

Podmínky chovu

Funkční kontrola aktivovaného kalu

Adaptace

Příprava pro analýzu

PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

Obrázek 1

Příklad křivek biologického rozkladu

Obrázek 2

Příklad adaptace kalu

Potvrzující zkouška OECD

Zařízení s porézní nádobkou

PŘÍLOHA 1

Obrázek 1

Obrázek 2

PŘÍLOHA 2

Obrázek 1

Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

Obrázek 2

Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

PŘÍLOHA 3

Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

Označ v každé skupině