- B. Metoda diagnózy, detekce a identifikace původce hnědé hniloby
V příloze jsou popsány různé postupy pro diagnózu, detekci a identifikaci hnědé hniloby.
V dodatcích je podrobně vysvětlena příprava materiálů k testům, tzn. živných médií, pufrů, roztoků a reagencií.
ODDÍL I: Použití schématu testování
- 1. Diagnóza hnědé hniloby
Testovací postup je určen pro hlízy bramboru, které vykazují typické příznaky hnědé hniloby bramboru nebo příznaky vyvolávající podezření z jejího výskytu, a pro rostliny bramboru a rajčete, které vykazují typické příznaky bakteriálního vadnutí nebo příznaky vyvolávající podezření z jeho výskytu. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci původce nemoci z infikovaného vodivého pletiva na diagnostických médiích a - při pozitivním nálezu - identifikaci kultury
Postupový diagram
- Poznámky k postupovému diagramu:
(1) Popis příznaků je v Oddíle II.1.
(2) Rychlé screeningové testy ulehčující předběžnou diagnózu.
- Vhodnými testy jsou:
- - test na výtok slizu ze svazků cévních (oddíl II.2.),
- - test na přítomnost granulí poly-β -hydroxybutyrátu (oddíl II.2),
- - IF-test (oddíl III.2),
- - ELISA-test (oddíl III.3),
- - PCR-test (oddíl III.4).
(3) Ačkoli je izolace původce hnědé hniloby z rostlinného materiálu s typickými symptomy metodou zřeďovacích roztěrů relativně jednoduchá, může v pokročilých stadiích infekce zakládání kultur ztroskotat. Saprofytické baktérie, které rostou na nemocném pletivu, mohou původce nemoci na izolačním médiu přerůst nebo inhibovat. Je-li izolační test negativní, ale příznaky onemocnění jsou typické, pak je nutno izolaci opakovat, a to přednostně kultivací na selektivních živných půdách.
(4) Čistá kultura původce hnědé hniloby je spolehlivě identifikována minimálně jedním z testů uvedených v oddíle II.4.1 v kombinaci s testem patogenity (oddíl II.4.3). Stanovení kmenů patogena není povinné, avšak doporučuje se je provést pro každý nový případ.
- Vhodnými testy jsou:
- Poznámky k postupovému diagramu:
- 2. Detekce a identifikace hnědé hniloby ve vzorcích hlíz bramboru
Postup je určen k detekci latentní infekce v hlízách bramboru pomocí jednoho nebo raději více screeningových testů, které jsou při pozitivním nálezu doplněny izolací původce hnědé hniloby a v případě izolace typických kolonií jeho identifikací v čisté kultuře.
Postupový diagram
- Poznámky k postupovému diagramu:
(1) Velikost vzorku
Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, metoda je však vhodná i pro vzorky s méně než 200 hlízami.
(2) Screeningový(é) test(y)
Pouze jeden test nemusí být dostatečně citlivý nebo spolehlivý k detekci původce hnědé hniloby ve vzorku. Proto se doporučuje provádět více testů, které se zakládají pokud možno na různých biologických principech.
(3) Imunofluorescenční test (IF test)
IFtest je osvědčeným screeningovým testem. To je výhoda proti jiným typům testů, které ještě nejsou zcela vyvinuty nebo ověřeny. Test se používá u mnoha jiných karanténních bakterií, např.u původce kroužkovitosti. Podle parametrů uváděných pro tuto metodu se jedná o citlivý test (hranice detekovatelnosti 103 - 104 buněk v jednom mililitru pelety z bramborového extraktu).
Pro spolehlivost výsledku testu je rozhodující kvalita antiséra. Přijatelné je pouze antisérum s vysokým titrem (minimálně 2 000 pro surové antisérum) a všechny testy musí být prováděny při titru antiséra nebo při jednom zředění pod úroveň titru. Upřednostňuje se nepřímá metoda. Přímou metodu lze použít, pokud je citlivost a specifičnost testu stejná jako u nepřímé metody.
IF test má výhodu subjektivního vyhodnocení buněčné morfologie a intenzity fluorescence, které vypovídají o specifičnosti reakce. Časté jsou křížové reakce se sérologicky příbuznými baktériemi stejné buněčné morfologie jako má původce hnědé hniloby, které se vyskytují na povrchu hlízy nebo pocházejí z okolní půdy. IFtest lze provádět jako jediný kontrolní test, avšak existuje-li podezření na výskyt křížových reakcí, měl by být proveden další test spočívající na jiném biologickém principu. V takovém případě je nejvhodnější kultivace na selektivních živných médiích.
(4) Kultivace na selektivních živných médiích
S modifikovaným médiem SMSA a metodologií testování používanou při této metodě se jedná o citlivý a selektivní test na hnědou hnilobu. Výsledek je k dispozici za 3 - 6 dnů po přípravě vzorku. Původce choroby se získá přímo v kultuře a lze ho snadno identifikovat. Má-li být potenciál testu plně využit, musí být /pupkové části hlíz pečlivě připraveny, aby byly vyloučeny sekundární baktérie z hlíz, které si na živném médiu s hnědou hnilobou konkurují a mohou tak vývoj patogena ovlivňovat. Některé kmeny mohou špatně růst, protože složky živného média mohou ovlivnit cílový organismus. Je třeba též pečlivě postupovat při odlišení hnědé hniloby od jiných baktérií, které se na médiu mohou vyvíjet. Selektivní plotnový roztěr lze použít jako jediný screeningový test, avšak při negativním výsledku, u nějž je podezření, že k němu došlo inhibicí hnědé hniloby jinými bakteriemi v médiu, je třeba vzorek znovu testovat při použití odlišného testu, aby se diagnóza potvrdila nebo vyvrátila. Nejvhodnější je v takových případech IF-test.
(5) ELISAtest
ELISA test je v zásadě méně citlivý než IF-test (hranice detekovatelnosti 104 - 105 baktérií na jeden mililitr pelety z bramborového extraktu). Je levný a rychlý, avšak všeobecně častěji vykazuje falešné pozitivní výsledky (křížové reakce) a falešné negativní výsledky (inhibice fenolovými molekulami v bramborovém extraktu). Požadavky na specifičnost antiséra jsou neobyčejně vysoké. ELISAtest nelze provádět samostatně jako jediný screeningový test.
(6) PCRtest
PCRtest je potenciálně velice citlivý detekční test, i když může být snadno ovlivněn některými složkami extraktu z rostlin nebo z hlíz, které vedou k falešným negativním výsledkům testu. Některé odrůdy brambor obsahují více inhibitorů než jiné. Proto musí být tyto inhibitory nejprve odstraněny. Jednou z možností je zředění, avšak přitom dojde i ke zředění populací původce hnědé hniloby. Ve všech fázích přípravy vzorku a testu musí být postupováno neobyčejně obezřetně, aby se zabránilo kontaminacím, které vedou k získání falešně pozitivních výsledků. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytnout i díky homologním sekvencím u jiných organismů. Proto nelze ani PCR test používat jako jediný screeningový test.
(7) Obohacovací testy
Inkubace vzorků pelety z bramborového extraktu v semiselektivním bujónu, jako je např. modifikovaný SMSA-bujón, umožňuje rozmnožení původce hnědé hniloby. Ještě důležitější je možná skutečnost, že tímto způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů ELISA testu a PCR testu. Původce hnědé hniloby lze tak detekovat v obohaceném bujónu pomocí IF, ELISA a PCR testů. Přímé kultivace z obohaceného bujónu se nedoporučují. Tyto obohacovací metody však nebyly dostatečně důkladně vyzkoušeny a otestovány. Jsou sem zahrnuty pouze díky jejich vysokému potenciálu. Protože je však doposud k dispozici málo zkušeností s těmito postupy, nelze je použít jako jediné detekční metody.
(8) Biotest
Tento test se používá pro izolaci původce hnědé hniloby z pelet bramborového extraktu selektivním obohacením na hostitelské rostlině a lze jej provést na rostlinách rajčete nebo lilku vejcoplodého. Vyžaduje optimální inkubační podmínky podle údajů této metody. Bakterie, které na médiu SMSA inhibují původce hnědé hniloby, s nejvyšší pravděpodobností výsledky tohoto testu neovlivní.
(9) Ověřovací test(y)
Čistou kulturu původce hnědé hniloby lze spolehlivě identifikovat minimálně jedním z testů uvedených v oddílu II.4.1 v kombinaci s testem patogenity (oddíl II.4.3). Charakteristika kmene není povinná, doporučuje se však u každého nového případu.
- Poznámky k postupovému diagramu:
- 1. Diagnóza hnědé hniloby
