Platné znění

Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby

Ministr:
Ing. Palas v. r.

Příloha č. 1

k vyhlášce č. 331/2004 Sb.
  1. A. Metody detekce a diagnózy původce kroužkovitosti
    1. 1. Získání výkrojků z pupkové části hlízy
      1. 1.1. Omyje se 200 hlíz pod tekoucí vodou a pomocí řádně vydezinfikovaného řezného nástroje se odstraní epidermis okolo pupkového konce každé hlízy; dezinfekci lze provést tak, že se nástroj smočí v 70 % roztoku etanolu a ožehne.
      2. 1.2. Pečlivě se nožem nebo škrabkou na brambory odeberou konické výkrojky pletiva z pupkových konců brambor. Omezí se na minimum nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin (viz odstavec 3) nebo konzervovány při –20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.
    1. 2. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitosti

      Po odebrání výkrojků z pupkových konců se každá hlíza rozřízne napříč a prohlédne, zda nevykazuje příznaky kroužkovitosti.

      Hlízy se zmáčknou a sleduje se, zda z vodivých pletiv vystupuje macerovaná hmota.

      Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlíz může mít nepatrně tmavší zbarvení než normálně. Prvním dobře identifikovatelným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a při jemném zmáčknutí hlízy sloupky sýrovité hmoty vystupující z cév. Tato hmota obsahuje milióny bakterií. V tomto stadiu mohou vodivá pletiva hnědnout. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkového konce a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se v tomto místě může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru.

    1. 3. Příprava vzorků pro Gramovo barvení, imunofluroscenční test (IF test) a test na lilku vejcoplodém
      1. 3.1. Homogenizují se pupkové konce hlíz až do úplné macerace v kapalině netoxické pro původce kroužkovitosti (např. 0,05 M fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS) pH 7,0) při teplotě nižší než 30 °C; doporučuje se přidat netoxický prostředek proti vločkování (deflokulant) a netoxický protipěnový prostředek (Dodatky 1 a 2).
      2. 3.2. Bakterie z homogenátu se extrahují jedním z následujících postupů (alternativní metodu extrakce uvádí Dinesen, 1984):
        1. A. a) Odstřeďuje se při zrychlení nejvýše 180 g po dobu 10 minut.
          1. b) Odstřeďuje se supernatant při zrychlení neklesajícím pod 4 000 g po dobu 10 min. Dekantuje se a odstraňuje supernatant.
        1. B. a) Macerát se nechá stát 30 min., aby se usadila drť pletiv. Dekantuje se supernatant, aniž by se rozvířil sediment.
          1. b) Supernatant se přefiltruje přes filtrační papír (Whatman No 1) umístěný v Buechnerové nálevce pomocí vodní vývěvy. Filtrát se sebere do centrifugačních zkumavek. Filtr se promyje sterilním PBS až do maximálního objemu filtrátu 35 ml.
          2. c) Filtrát se odstřeďuje při nejméně 4 000 g po dobu 20 minut.
      1. 3.3. Suspenduje se peleta ve sterilním 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,2 (Dodatek 2), aby se získal celkový objem přibližně 1 ml. Suspenze se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se uschová pro účely srovnávání (referenční vzorek) zmrazením při -20 °C1 nebo lyofilizací. Je prokázáno (Janse a Van Vaerenberg, 1987), že zmrazení může snížit životnost sledované bakterie. Tento problém lze vyřešit suspendováním pelety v 10% glycerolu. Druhá část suspenze se rozdělí na dvě poloviny. Jedna se použije na IF test a barvení podle Grama, druhá pro test na lilku vejcoplodém.
      2. 3.4. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky kroužkovitosti zacházelo odděleně, aby se předešlo zamoření. To se týká i sklíček na IF testy a testů na lilku vejcoplodém.
    1. 4. Gramovo barvení
      1. 4.1. Připraví Gramovo barvení pro všechna ředění pelety (5.2.1.) a pro všechny rozříznuté hlízy (2), které vykazují sklovitost, hnití nebo jiné podezřelé příznaky. Vzorky je třeba odebírat z okraje napadených pletiv.
      2. 4.2. Připraví se Gramovo barvení pro známé kultury původce kroužkovitosti a pokud možno i pro pletivo infikované přirozenou cestou (5.1.).
      3. 4.3. Zjistí se, které vzorky obsahují typické grampozitivní koryneformní buňky. Buňky původce kroužkovitosti jsou obvykle 0,8 až 1,2 μm dlouhé a 0,4 až 0,6 μm široké.

        Vhodná metoda barvení je uvedena v Dodatku 3.

        V preparátech z přirozených infekcí nebo z čerstvě izolovaných kultur často převládají kokovité tyčinky, které jsou poněkud menší než buňky ze starších agarových kultur. Buňky původce kroužkovitosti jsou na většině živých médií pleomorfní koryneformní tyčinky a mohou vykazovat proměnlivou reakci podle Grama. Buňky jsou jednotlivé, ve dvojicích s charakteristickými zahnutími do „V“ nebo „Y“ typickými pro dělení kroutivým ohybem a příležitostně v nepravidelných skupinách často označovaných jako palisády a čínská písmena.

    1. 5. Schéma pro IF test
      1. 5.1. Použije se antisérum proti známému kmenu kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Toto antisérum musí mít větší IF titr než 1 : 600. Zařadí se jedna kontrola PBS na testovací podložní sklíčko ke stanovení, zda nedojde k nespecifické kombinaci bakteriálních buněk s konjugátem fluorescenčního isothiokyanátu a antikráličího imunoglobulinu (FITC). Specifické kmeny původce kroužkovitopsti (ATCC 33113, NCPPB 2137, NCPPB 2140) se použijí jako homologická kontrola antigenů na jiném podložním sklíčku. Na stejném podložním sklíčku se pokud možno použije jako paralelní kontrola přirozeně infikované pletivo (uchované lyofilizací nebo zmrazením při -20°C ) (obr. 2).
      2. 5.2. Postup
        1. 5.2.1. Připraví se řada tří desetinásobných ředění (101,102,103) výsledné pelety v destilované vodě (obr. 1).
        2. 5.2.2. Do jamek vícejamkového sklíčka se napipetuje z každého ředění pelety nebo suspenze původce kroužkovitosti (přibližně 106 buněk/ml) změřený standardní objem dostačující k naplnění jamky (přibližně 25 μl) (obr. 1)

          Obrázek 1

          Sklíčko se vzorkem a kontrolním fosfátovým pufrem (PBS)

          Příloha č. 1
          neředěný vzorekředěný vzorek
          1:101:1001:1000
          OOOOOvzorek
          OOOOOduplikát vzorku
          PBS antisérum ve zvoleném ředění

          Obrázek 2

          Sklíčko s pozitivní kontrolou

          Příloha č. 1
          OOOOOpůvodce kroužkovitost 106/ml
          OOOOOpozitivní extrakt z bramboru
          1:2001:400 1:8001:16001:3200ředění antiséra
        1. 5.2.4. Naplní se příslušné jamky antisérem původcem kroužkovitosti v doporučených ředěních roztokem 0,01 M PBS pH 7,2 (Dodatek 2), jak je uvedeno na obrázku 1. (Použije se PBS pro kontrolu FITC). Pracovní ředění antiséra by mělo mít přibližně polovinu titru IF. Jestliže se má pracovat s jinými ředěními antiséra, musí se připravit pro každé ředění, s nímž se má pracovat, samostatná sklíčka.
        2. 5.2.5. Inkubuje se ve vlhké komůrce při pokojové teplotě po dobu 30 minut, není-li výrobcem stanoveno jinak.
        3. 5.2.6. Pečlivě se opláchne roztokem 0,01 M PBS pH 7,2. Promývá se po dobu pěti minut ve třech vždy vyměněných roztocích 0,01 M PBS pH 7,2.
        4. 5.2.7. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost.
        5. 5.2.8. Do každé jamky se přidá konjugát FITC ve zředění používaném ke stanovení titru a nechá se inkubovat ve tmavé vlhké komůrce při pokojové teplotě po dobu 30 minut, není-li výrobcem stanoveno jinak.
        6. 5.2.9. Opláchne se a omývá jako v předcházejícím případě.
        7. 5.2.10. Do každé jamky se přidá přibližně 5 - 10 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,6 s glycerinem (nebo podobnou látkou o pH neklesajícím pod 7,6) a přikryje krycím sklíčkem (Dodatek 2).
        8. 5.2.11. Prohlíží se pod mikroskopem, vybaveným zdrojem epifluorescenčního světla a filtry vhodnými pro práci s FITC. Vhodné je zvětšení od 400 do 1 000. Pečlivě se prohlédnou jamky v přímkách jdoucích v pravých úhlech středem a po obvodu jamky.

          Pozorují se fluoreskující buňky v pozitivních kontrolách a určí se titr. Pozorují se fluoreskující buňky v jamce s kontrolou FITC/PBS a pokud se zde nevyskytují, přejde se k jamkám testovacích vzorků. V nejméně 10 mikroskopových polích se určí průměrný počet morfologicky typických fluoreskujících buněk v jednom poli a vypočítá jejich počet na 1 ml neředěné pelety (dodatek 4).

          Existuje několik problémů podstatných pro imunofluorescenční test.

          1. – V peletách bramboru se pravděpodobně vyskytnou doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s rozměry a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.

          Vzhledem k možnosti křížových reakcí testují se vzorky s pozitivním imunofluorescenčním testem opětovně pomocí odlišného antiséra.

          1. – Technický limit zjištění touto metodou je mezi 103 a 104 buněk/ml neředěné pelety. Vzorky s počtem IF typických buněk na hranici detekčního limitu jsou obvykle na původce kroužkovitosti negativní, ale mohou být postoupeny do testu na lilku vejcoplodém.

          Imunofluorescenční test se považuje za negativní u kteréhokoliv vzorku, kde nebyly nalezeny morfologicky typické fluoreskující buňky. Tyto vzorky se považují za „nezamořené“ bakteriemi Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

          Test na lilku není požadován.

          Imunofluorescenční test se považuje za pozitivní u kteréhokoliv vzorku, kde byly nalezeny morfologicky typické fluoreskující buňky.

          Vzorky, u kterých byl pozitivní imunofluorescenční test u obou užitých antisér, se považují za „pravděpodobně zamořené“ bakteriemi Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

          Test na lilku je požadován pro všechny vzorky považované za pravděpodobně zamořené.

    1. 6. Test na lilku vejcoplodém

      Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v Dodatku 5.

      1. 6.1 Peleta podle 3.3. se rozdělí mezi alespoň 25 rostlin lilku vejcoplodého ve fázi tří listů (Dodatek 5) jednou z níže uvedených metod (6.2, 6.3 nebo 6.4).
      2. 6.2 Inokulace zářezem I
        1. 6.2.1. Každý květináč se horizontálně podepře (pro květináče o průměru 10 cm je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky). Pro každý testovaný vzorek se mezi stonek a blok umístí proužek sterilní hliníkové fólie. Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.
        2. 6.2.2. Pomocí skalpelu se provede mezi děložními lístky a prvním pravým listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.
        3. 6.2.3. Zářez se přidrží otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a nanese se do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským štětečkem namočeným do pelety. Zbytek petety se rozdělí mezi všechny testovací rostliny lilku.
        4. 6.2.4. Řez se překryje sterilní vazelínou aplikovanou injekční stříkačkou o objemu 2 ml.
      1. 6.3. Inokulace zářezem II
        1. 6.3.1. Na stonek rostliny držené dvěma prsty se napipetuje mezi děložními lístky a prvním pravým listem kapka (přibližně 5 až 10 μl) suspendované pelety.
        2. 6.3.2. Pomocí sterilního skalpelu se udělá sešikměný zářez (v úhlu přibližně 5°), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky stonku, přičemž s řezem se začne v místě kapky suspendované pelety.
        3. 6.3.3. Řez se zakryje sterilní vazelínou z injekční stříkačky.
      1. 6.4. Inokulace injekční stříkačkou
        1. 6.4.1. Pro snížení vnitřního napětí buněk (turgoru) se rostliny lilku den před inokulací nezalévají.
        2. 6.4.2. Stonky lilku vejcoplodého inokulujte těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Peleta se rozdělí mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.
      1. 6.5. Inokuluje se 25 rostlin stejnou inokulační metodou (6.2, 6.3 nebo 6.4) známou kulturou původce kroužkovitosti a kde je to možné i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru (5.1).
      2. 6.6. Inokuluje se 25 rostlin sterilním 0,05 M PBS stejnou inokulační metodou (6.2, 6.3 nebo 6.4).
      3. 6.7. Po inokulaci se rostliny nechají inkubovat ve vhodných podmínkách (Dodatek 5) po dobu 40 dní. Pravidelně po osmi dnech se spočítají rostliny vykazující příznaky. Původce kroužkovitost působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost (ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale před znekrotizováním zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do objevení se příznaků, tím je větší naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím původce kroužkovitosti než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní. Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených původcem kroužkovitosti, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny.
      4. 6.8. Připraví se Gramovo barvení (4) pro všechny partie lilku vejcoplodého vykazující příznaky napadení. Použijí se části zvadlých listových pletiv a pletivo ze stonků rostlin a izolují je na vhodných živných médiích (7). Listy a stonky lilku vejcoplodého se povrchově dezinfikují otřením 70% etanolem.
      5. 6.9. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že infekce zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého latentní dokonce i po 40 denní inkubaci. Takové infekce mohou mít za následek zakrnělost a ztrátu vitality inokulovaných rostlin. Pokud je IF test je považován za pozitivní, je nezbytné další testování. Je proto důležité porovnávat rychlost růstu všech testovacích rostlin lilku vejcoplodého s kontrolami inokulovanými sterilním 0,05 M PBS a sledovat podmínky prostředí ve skleníku.
        1. Pro další testování se stanoví tato doporučení:
          1. 6.9.1. Odříznou se stonky nad místem inokulace a odstraní se listy.
          2. 6.9.2. Stonky se macerují v roztoku 0,05 M PBS s pH 7,0, jak je uvedeno v bodech 3.1 až 3.2.
          3. 6.9.3. Polovina pelety se použije k provedení Gramova barvení (4) a testu IF (5).
          4. 6.9.4. Druhá polovina pelety se použije k provedení dalšího testu na lilku vejcoplodém (6), pokud je Gramovo barvení anebo IF test pozitivní. Jako kontrola se použijte známá kultura původce kroužkovitosti a sterilní 0,05 M PBS. Pokud v následující testu nejsou příznaky napadení pozorovány, považuje se vzorek za negativní.
    1. 7. Izolace původce kroužkovitosti

      Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li původce kroužkovitosti izolován a takto identifikován (8). Ačkoliv je původce kroužkovitosti náročným organismem, je možno ho izolovat z pletiv projevujících příznaky napadení. Mohou jej však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto se nedoporučuje provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.3). Lilek vejcoplodý je výtečným selektivním obohacovacím živným médiem pro růst původce kroužkovitosti a zároveň je také vhodný pro použití k potvrzujícímu testu pomocí hostitelské rostliny. Izolace je třeba provést ze všech hlíz bramboru a rostlin lilku vejcoplodého vykazujících příznaky napadení (4.6). Kde je to nezbytné, je třeba provést maceraci stonků lilku jako v bodech 3. a 6.9.

      1. 7.1. Rozetře se suspenze na jedno z následujících médií: (složení uvedena v Dodatku 6):
        1. živný dextrosový agar (pouze pro subkultury),
        2. kvasničný pepton glukosový agar,
        3. živný kvasničný dextrosový agar,
        4. agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.
        5. Inkubuje se po dobu maximálně 20 dní při teplotě 21 °C.

        Původce kroužkovitosti pomalu roste a obvykle vytváří za 10 dnů kolonie velikosti špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.

        Pro zaručení čistoty kultury se provede rekultivace novým roztěrem.

        U subkultur se zlepšuje rychlost růstu. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, jsou okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1 - 3 mm

        Identifikace

        Ze zdravých i nemocných rostlin bramboru a lilku je možné izolovat mnohé grampozitivní koryneformní bakterie se znaky kolonií podobnými jako u původce kroužkovitosti. V této souvislosti musí být původce kroužkovitosti identifikován následujícími testy:

        IF test (5.1),

        test na lilku vejcoplodém,

        nutriční a fyziologické testy (Dodatek 7),

        1. – oxidačně fermentační testy (O/F),
        2. – oxidasový test,
        3. – růst při 37 °C,
        4. – tvorba ureasy,
        5. – hydrolýza eskulinu,
        6. – hydrolýza škrobu,
        7. – tolerance k 7% roztoku NaCl,
        8. – indolový test,
        9. – katalasový test,
        10. – tvorba H2S,
        11. – využití citrátu,
        12. – hydrolýza želatiny,
        13. – tvorba kyseliny z: glycerolu, laktosy, rhamnosy a salicinu,
        14. – Gramovo barvení.

        Všechny testy musí zahrnovat zahrnovat kontrolu se známým kmenem původce kroužkovitosti. Nutriční a fyziologické testy musí být provedeny s inokulem ze subkultur na živném agaru. Morfologická srovnání se provádějí z kultur z živného dextrosového agaru.

        Pro IF test hustota populace buněk musí být upravena na 106 buněk/ml. IF titr musí být podobný titru známé kultury původce kroužkovitosti.

        Pro test na lilku vejcoplodém musí být hustota populace buněk upravena na 107 buněk/ml. Testy na lilku vejcoplodém musí zahrnovat 10 rostlin pro každý testovaný organismus, opět za použití kontrol tvořených známou kulturou kroužkovitosti a sterilní vodou. U čistých kultur by mělo během 20 dnů nastat typické vadnutí, avšak rostliny, které nevykazují žádné příznaky napadení po této době, je nutno inkubovat celkem 30 dní při teplotách příznivých pro růst lilku, ale nepřesahujících 30 °C (Dodatek 5). Jestliže se po 30 dnech příznaky napadení nevyskytují, nemůže být kultura považována za patogenní formu kroužkovitosti.

        Příloha č. 1
        TestPůvodce kroužkovitosti
        O/Finertní nebo slabě oxidační
        Oxidasa-
        Katalasa+
        Redukce nitrátů-
        Aktivitat ureasy-
        Tvorba H2S-
        Tvorba indolu-
        Využívání citrátu-
        Hydrolýza škrobu- nebo slabá
        Růst při 37 °C-
        Růst v 7% NaCl-
        Hydrolýza želatiny-
        Hydrolýza eskulinu+
        Tvorba kyseliny z:
        - glycerolu-
        - laktosy- nebo slabá
        - rhamnosy-
        - salicinu-

    SLOŽENÍ MACERAČNÍHO ROZTOKU DOPORUČENÉ LELLIOTEM A SELLAREM, 1976Dodatek 1

    Příloha č. 1 SLOŽENÍ MACERAČNÍHO ROZTOKU DOPORUČENÉ LELLIOTEM A SELLAREM, 1976
    D C silikonový protipěnivý prostředek MS A (Hopkins & Williams Ltd., kat. č. 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England)10 ml
    vločky Lubrol W (ICI Ltd)0,5 g
    pyrofosforečnan čtyřsodný1 g
    0,05 M fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS) pH 7,0 (dodatek 2)1 litr